JP2016513461A - 出生前遺伝子分析システム及び方法 - Google Patents

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Abstract

本開示は、母親及び胎児のポリヌクレオチドを含む試料の遺伝子変異の試験及び分析のための組成物及び方法を提供する。概括的には、本開示の組成物及び方法は、一般的には母親由来である試料由来の、母親及び胎児のポリヌクレオチドの混合物の単離を提供する。ポリヌクレオチドは単離及び精製され、更に、上記試料中の１または複数の遺伝子座におけるコピー数多型または必然的変異型などの遺伝子変異の有無を特定するために試験される。

Description

（関連出願の相互参照）
本願は２０１３年３月１２日出願の米国仮特許出願第６１／７７８，１３１号に対する優先権を主張し、該出願は参照により本明細書に組み込まれる。
多くの場合、ゲノムにおける遺伝子変異は有害な健康上の影響をもたらす。遺伝子学の研究は、異常なコピー数で存在する、または変異していることが見出された多数の遺伝子及び特定の診断マーカーが、種々の疾患と関連することを識別してきた。例えば、出生前診断において、２１番染色体のトリソミーなどの、全染色体の過剰なまたは欠損したコピーがしばしば起こり、妊娠が期間満了まで進む前に検知することができる。他の例において、特定の変異の検知、すなわち染色体、染色体領域若しくはその他の遺伝子座の過剰または欠失の検知を、リスク評価、診断、または多くのガンのステージングにおいて用いることができる。
一般的に、遺伝子変異に関する情報は、蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）（ＦＩＳＨ）、定量的蛍光ＰＣＲ法（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ＰＣＲ）（ＱＦ−ＰＣＲ）及びアレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション法（ａｒｒａｙ−Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）（ａｒｒａｙ−ＣＧＨ)などの従来の遺伝子試験手法、並びに、より最近では次世代配列決定法を用いて分析されてきた。次世代配列決定法（Ｎｅｘｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）（ＮＧＳ）は、少量での、安価な、所要時間が数日であるゲノム配列決定を可能にする。しかしながら、一般的にＮＧＳが実施され解釈される際には、ゲノムの全ての領域または遺伝子座が概ね等しい確率で配列決定される、すなわち、潜在的な変異を判断するために機能が十分よく理解されている、比較的低い割合の領域由来の配列情報を収取するために、多量のゲノム配列が収取及び廃棄される。一般的に、当事者が着目する領域の試料の全ゲノムからの精製は、配列決定とは別個のステップとして行われる。現在の本技術分野の状況においては、該精製は通常数日を要する、低効率な過程である。
本技術分野においては、潜在的に有害な遺伝子変異と関連し得る、着目する領域または遺伝子座のゲノム配列を分析するための改良された方法及びシステムに対するニーズが存在する。
本開示は、概括的には、出生前の遺伝子分析システム及び方法を提供する。概括的には、本開示は、母親及び胎児のＤＮＡポリヌクレオチドの混合物を含む試料中の１または複数の遺伝子座における遺伝子変異の試験システム及び試験方法であって、試験試料中の母親及び胎児のポリヌクレオチドを得るステップと、母親及び胎児のポリヌクレオチドを含む上記試料中の、少なくとも１の着目する遺伝子座及び少なくとも１の上記着目する遺伝子座外の遺伝子座に対して複数のプローブをハイブリダイズさせるステップであり、少なくとも１または複数のプローブが識別子と結合している上記ステップと、任意選択で、ポリメラーゼを用いてプローブを伸長させるステップと、プローブを連結して連続したライゲーション生成物を生成させるステップと、結合したライゲーション生成物を非結合プローブより単離するステップと、上記ライゲーション生成物内に含まれる１または複数の領域を計数する（ｅｎｕｍｅｒａｔｉｎｇ）ステップであり、上記１または複数の領域が完全に未変化のプローブ以外のエレメントを含む上記ステップと、１または複数の遺伝子座における遺伝子変異の有無を特定するステップとを含む、上記試験システム及び試験方法を提供する。
いくつかの態様において、本開示は、母親及び胎児のＤＮＡポリヌクレオチドの混合物を含む試料中の１または複数の遺伝子座における遺伝子変異の試験方法であって、試験試料中の母親及び胎児のポリヌクレオチドを得るステップと、母親及び胎児のポリヌクレオチドを含む上記試料中の、少なくとも１の着目する遺伝子座及び少なくとも１の上記着目する遺伝子座外の遺伝子座に対して複数のプローブをハイブリダイズさせるステップであり、少なくとも１または複数のプローブが識別子と結合している上記ステップと、任意選択で、ポリメラーゼを用いてプローブを伸長させるステップと、プローブを連結して連続したライゲーション生成物を生成させるステップと、結合したライゲーション生成物を非結合プローブより単離するステップと、上記ライゲーション生成物由来の領域を増幅するステップと、上記識別子配列を含有する上記ライゲーション生成物由来の領域を計数するステップであり、計数することが完全に未変化のハイブリダイゼーション配列以外の配列の計数（ｅｎｕｍｅｒａｔｉｏｎ）を含む上記ステップと、１または複数の遺伝子座における遺伝子変異の有無を特定するステップとを含む、上記試験方法を提供する。
いくつかの態様において、本開示は、母親及び胎児のＤＮＡポリヌクレオチドの混合物を含む試料中の１または複数の遺伝子座における遺伝子変異の試験方法であって、試験試料中の母親及び胎児のポリヌクレオチドを得るステップと、母親及び胎児のポリヌクレオチドを含む上記試料中の、少なくとも１の着目する遺伝子座及び少なくとも１の上記着目する遺伝子座外の遺伝子座に対して相補的なハイブリダイゼーション配列を含む複数のプローブを、ポリヌクレオチドに対してハイブリダイズさせるステップであり、少なくとも１または複数のプローブが識別子配列と結合している上記ステップと、同一の遺伝子座中の２のハイブリダイゼーション配列間の領域に１または複数の架橋オリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせるステップと、任意選択で、ポリメラーゼ及びｄＮＴＰを用いて上記プローブ及び／または架橋オリゴヌクレオチド（複数可）を伸長させるステップと、上記プローブ及び架橋オリゴヌクレオチド（複数可）を連結して連続したライゲーション生成物を生成させるステップと、連続したライゲーション生成物を非結合プローブより単離するステップと、上記識別子配列及び完全に未変化のハイブリダイゼーション配列以外の配列を含有する上記ライゲーション生成物由来の領域を増幅するステップと、ステップ（ｇ）において増幅された上記領域を計数するステップであり、計数することが上記識別子配列及び完全に未変化のハイブリダイゼーション配列以外の配列の計数を含む上記ステップと、１または複数の遺伝子座における遺伝子変異の有無を特定するステップとを含む、上記試験方法を提供する。
いくつかの態様において、本開示は、母親及び胎児のＤＮＡポリヌクレオチドの混合物を含む試料中の１または複数の遺伝子座における遺伝子変異の検知方法であって、試験試料中の母親及び胎児のポリヌクレオチドを得るステップと、母親及び胎児のポリヌクレオチドを含む上記試料中の、少なくとも１の着目する遺伝子座及び少なくとも１の上記着目する遺伝子座外の遺伝子座に対して相補的なハイブリダイゼーション配列を含む複数のプローブを、ポリヌクレオチドに対してハイブリダイズさせるステップであり、少なくとも１または複数のプローブが識別子配列と結合している上記ステップと、同一の遺伝子座中の２のハイブリダイゼーション配列間の領域に１または複数の架橋オリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせるステップと、任意選択で、ポリメラーゼ及びｄＮＴＰを用いて上記プローブ及び／または架橋オリゴヌクレオチド（複数可）を伸長させるステップと、上記プローブ及び架橋オリゴヌクレオチド（複数可）を連結して連続したライゲーション生成物を生成させるステップと、連続したライゲーション生成物を非結合プローブより単離するステップと、上記ライゲーション生成物由来の領域を増幅するステップであり、上記領域が上記識別子及び完全に未変化のハイブリダイゼーション配列以外の配列を含む上記ステップと、上記識別子配列を計数するステップと、１または複数の遺伝子座における遺伝子変異の有無を特定するステップとを含む、上記検知方法を提供する。
いくつかの態様において、本開示は、母親及び胎児のポリヌクレオチドの混合物を含む試料中の遺伝子座の遺伝子変異の有無の特定方法またはそのためのアッセイシステムであって、上記アッセイシステムが、上記試料中の遺伝子座に接触するプローブと結合した識別子配列の計数を備える、上記特定方法またはアッセイシステムを提供する。
いくつかの態様において、本開示は、本明細書に記載の方法に従って試験される組成物を提供する。
いくつかの実施形態において、遺伝子変異はコピー数多型（ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）（ＣＮＶ）である。いくつかの実施形態において、遺伝子変異は必然的変異型である。
いくつかの実施形態において、上記識別子または識別子はバーコード配列である。いくつかの態様において、プローブは、１または複数の遺伝子座中の領域に対して相補的な、別個の固定された配列である。
いくつかの実施形態において、ハイブリダイゼーション配列は、１または複数の遺伝子座中の領域に対して相補的な、別個の固定された配列である。いくつかの実施形態において、プローブは、１または複数の遺伝子座中の領域に対して相補的な配列を有するプレサークルプローブを含む。
いくつかの実施形態において、上記ライゲーション生成物由来の領域を選択的に増幅することは、１または複数の増幅ステップを含む。いくつかの態様において、計数することは配列決定ステップを含む。
いくつかの実施形態において、未変化のハイブリダイゼーション配列はハイブリダイゼーション配列を含まない。いくつかの実施形態において、未変化のハイブリダイゼーション配列は、１００％未満の、遺伝子座に対して相補的なハイブリダイゼーション配列を含む。いくつかの実施形態において、計数することが、ハイブリダイゼーション配列を含有しない配列を計数することを含む。
いくつかの実施形態において、増幅することはユニバーサル増幅ステップによって行われる。いくつかの実施形態において、増幅することは、選択的増幅ステップによって行われる。いくつかの実施形態において、増幅することは、ハイブリダイゼーション配列を含有しない配列上で行われる。
いくつかの態様において、少なくとも１の遺伝子座が遺伝子変異に関して試験される。いくつかの態様において、少なくとも１００の遺伝子座が遺伝子変異に関して試験される。いくつかの態様において、少なくとも５００の遺伝子座が遺伝子変異に関して試験される。いくつかの態様において、少なくとも１０００の遺伝子座が遺伝子変異に関して試験される。いくつかの態様において、少なくとも１の遺伝子座が多型性を含むまたは多型性を含むことが想定される。
いくつかの態様において、増幅ステップは用いられない。
いくつかの態様において、少なくとも１の遺伝子座がコピー数に関して試験され、該少なくとも１の遺伝子座が多型性を含む別な遺伝子座とは異なる。いくつかの態様において、上記遺伝子座は染色体、染色体サブ領域、または単一座である。
いくつかの実施形態において、少なくとも１の架橋オリゴヌクレオチドは２のプローブ間の領域にハイブリダイズする。
いくつかの実施形態において、連続したライゲーション生成物を単離することは、非結合プローブの分解を含む。いくつかの実施形態において、分解はエキソヌクレアーゼを用いて行われる。
いくつかの実施形態において、連続したライゲーション生成物を単離することは、結合パートナーを用いたアフィニティーキャプチャーを含む。いくつかの態様において、ｄＮＴＰはアフィニティーキャプチャーのための残基と接合されている。いくつかの態様において、ｄＮＴＰはビオチンと接合されている。
いくつかの実施形態において、上記遺伝子変異は胎児の異数性である。
いくつかの実施形態において、医療上の意思決定または治療の推奨が、遺伝子変異の有無を特定することに基づいてなされる。
いくつかの実施形態において、上記計数するステップは統計的分析を用いて行われる、またはプロセッサー実行可能な指示を有するコンピュータ可読媒体によって行われる。いくつかの態様において、統計的分析がコンピュータアルゴリズムを用いて行われてもよい。
一態様において、本開示は、母親及び胎児のＤＮＡポリヌクレオチドの混合物を含む試料中の、１または複数の遺伝子座における遺伝子変異の試験方法を提供する。一実施形態において、該方法は、標的ポリヌクレオチドを断片化するステップと、上記断片化ポリヌクレオチドにアダプターオリゴヌクレオチドを連結するステップと、上記アダプターオリゴヌクレオチド由来の配列に特異的にハイブリダイズする増幅プライマーを用いて、改変されたポリヌクレオチドを増幅するステップと、増幅された標的ポリヌクレオチドを、固体表面に接続された複数の異なる結合されたオリゴヌクレオチドに対してハイブリダイズさせるステップであって、複数の上記結合されたオリゴヌクレオチドのそれぞれが、着目する遺伝子座を含む配列に対して相補的な３’末端配列、または着目する遺伝子座の２００ヌクレオチド以内の配列を含む上記ステップと、上記固体担体上で架橋増幅を行い、標的配列を特異的に増幅するステップと、１または複数の遺伝子座における遺伝子変異の有無を特定するステップとを含む。
（参照による組み込み）
本明細書中に記述される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、それぞれの個々の刊行物、特許、及び特許出願が具体的且つ個別に示され、参照により組み込まれるのと同様な程度に、参照により本明細に組み込まれる。
本開示の装置の新規な特徴は、添付の特許請求の範囲に詳細に述べられる。説明のための実施形態を述べる後述の詳細な説明を参照することにより、本開示の特徴及び利点のよりよい理解が得られることとなり、上記実施形態において本開示の装置の原理が利用され、該実施形態の添付の図面は以下の通りである。
１または複数の遺伝子座におけるＣＮＶ検知に関するフロースキーム例の概略図である。 ＭＩＰプローブを用いた、１または複数の染色体のＣＮＶ検知に関するフロースキーム例の概略図である。 ＳＮＰの検出及び対立遺伝子の頻度を用いるＭＩＰプローブを用いた１または複数の遺伝子座のＣＮＶ検知に関するフロースキーム例の概略図である。 ゲノムＤＮＡに結合したＭＩＰプローブ、ハイブリダイゼーション配列のライゲーション及び第２の連鎖合成の略図である。 ２のプローブ間の領域においてハイブリダイズした架橋プローブを伴うゲノムＤＮＡに結合したＭＩＰプローブの略図である。 ２のプローブ間のギャップを伴うゲノムＤＮＡに結合したＭＩＰプローブの略図である。プローブ間の該ギャップを埋めるために、プライマー伸長ステップにおいてポリメラーゼｉが用いられる。 ＭＩＰプローブ中のハイブリダイゼーション配列６００及び６５０、ユニバーサルプライマー部位６１０及び６２０、バーコード配列６６０及び制限部位６９９の構成の略図である（環状リンカー領域は図示せず）。ハイブリダイゼーション及び６９９部位における酵素的開裂の後、ユニバーサルプライマー部位がハイブリダイゼーション配列及びバーコード配列に隣接する。任意選択の増幅または配列決定のためのプライミング部位の例も示される。 図６Ａと同様の、ＭＩＰプローブの別な構成中の同一のエレメントを示す略図である（環状リンカー領域は図示せず）。ハイブリダイゼーション及び６９９部位における酵素的開裂の後、ユニバーサルプライマー部位がバーコード配列に隣接する。任意選択の増幅または配列決定のためのプライミング部位の例も示される。 直鎖状ＭＩＰプローブから図４に示すようにして生起され得る、二本鎖の環状の連続したライゲーション生成物の略図である。矢印は、この生成物由来の種々の領域若しくは領域の組み合わせの増幅または配列決定のいずれかのための種々のプライミング部位を示す。 インターネットを用いた、ゲノム情報すなわち配列決定情報の保存及び普及のための伝達不可の保存媒体を備えるコンピュータの略図及び流れ図である。配列決定及びゲノムデータの作成は、ユーザーの物理的場所とは異なる場所で行うことができる。 プローブの例、１対の増幅プライマーの例、及び該プローブの環化を説明する図である。 標的プローブ配列を増幅するためのプライマー伸長ステップの例を説明する図である。 接続されたオリゴヌクレオチドを含む固体担体の例の一部、及び標的ポリヌクレオチドを増幅するための架橋増幅過程の例における第１のステップを説明する図である。 標的の増幅、架橋増幅、及び配列決定の過程の例を説明する図である。
Ｉ．全般的な用語
本明細書記載の本開示のシステム及び方法は、別段の表示がない限りにおいて、（組換え技法を含む）分子生物学、細胞生物学、生化学、マイクロアレイ及び配列決定技術の従来の技法及び記述を用いることができ、該技法及び記述は当業者の技能の範囲内である。かかる従来の技法としては、ポリマーアレイ合成、オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション及びライゲーション、オリゴヌクレオチドの配列決定、並びに標識を用いたハイブリダイゼーションの検知が挙げられる。好適な技法の具体的な実例としては、本明細書の例を参照することにより得ることができる。但し、当然のことながら、同等の従来の手法もまた用いることができる。かかる従来の技法及び記述は、Ｇｒｅｅｎら編、Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｒｉｅｓ（第Ｉ〜ＩＶ巻)（１９９９）；Ｗｅｉｎｅｒら編、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｖａｒｉａｔｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２００７）；Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ、Ｄｖｅｋｓｌｅｒ編、ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２００３）；Ｂｏｗｔｅｌｌ及びＳａｍｂｒｏｏｋ、ＤＮＡ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ：Ａ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｍａｎｕａｌ（２００３）；Ｍｏｕｎｔ、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ（２００４）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌｌ、Ｃｏｎｄｅｎｓｅｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｒｏｍ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２００６）；並びにＳａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２００２）（全てＣｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓより）;Ｓｔｒｙｅｒ，Ｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（第４版）、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ、ニューヨーク（１９９５）；Ｇａｉｔ、「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ」、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、ロンドン（１９８４）；Ｎｅｌｓｏｎ及びＣｏｘ、Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第３版、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ Ｐｕｂ．、ニューヨーク（２０００）；並びにＢｅｒｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第５版、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ Ｐｕｂ．、ニューヨーク（２００２）などの標準的な実験室手引書に見ることができ、これらの全てが、全ての目的のために、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。本組成物、本研究手段及びシステム並びに本方法が記載される前に、本開示は、記載される特定のシステム及び方法、組成物、対象並びに使用に限定されるものではなく、従って、当然のことながら変化し得ることが理解されるべきである。また、本明細書で用いられる用語は、特定の態様を記載することのみを目的とするものであり、本開示の範囲を限定することは意図されず、本開示の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることとなることも理解されるべきである。
本明細書で用いられる用語は、特定の実施形態を記載することのみを目的とするものであり、本開示の装置の限定は意図されない。本明細書において用いられる単数形、「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈が明確に別段の表示をしない限りにおいて、複数形をも同様に包含することが意図される。更に、用語「包含する」（「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」、「ｉｎｃｌｕｄｅｓ」）、「有する」（「ｈａｖｉｎｇ」、「ｈａｓ」、「ｗｉｔｈ」）またはそれらの変化形が、詳細な説明及び／または特許請求の範囲のいずれかで用いられる範囲において、かかる用語は、用語「含む」（「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」）と同様の意味で包含することが意図される。
本開示のシステム及び方法のいくつかの態様は、説明のための応用例と関連して上述される。本開示が完全に理解されるように、多数の特定の細部、関連、並びにシステム及び方法が述べられことが理解されるべきである。但し、関連する技術分野の当業者は、本開示のシステム及び方法は、１または複数の上記特定の細部を用いることなく、あるいは他のシステムまたは方法を用いて実施することができることを容易に認識することとなる。いくつかの行為は、他の行為または事象と異なる順序で及び／または同時に行われてもよく、本開示は、例証される行為または事象の順序付けによって限定されない。更に、例証される行為または事象の全てが、本開示に従った方法論を満たすことが要求される訳ではない。
本明細書において、範囲は、「約」一つの特定の数値から及び／または「約」別な特定の数値までとして表すことができる。かかる範囲が表される場合、別な実施形態が、当該の一つの特定の数値から及び／または当該他の特定の数値までを含む。同様に、先行する「約」を用いることにより値が近似として表される場合、当該特定の値が別な実施形態を形成することが理解されよう。それぞれの範囲の終点は、もう一方の終点との関係において、及びもう一方の終点とは独立に重要であることが更に理解されよう。本明細書で用いられる用語「約」とは、当該の使用の文脈の範囲内において、記載された数値のプラスまたはマイナス１５％の範囲をいう。例えば、約１０は８．５〜１１．５の範囲を包含することとなる。
ＩＩ．概要
本開示は、母親及び胎児のポリヌクレオチドを含む試料の遺伝子変異の試験及び分析システム並びに方法を提供する。概括的には、本開示のシステム及び方法は、一般的には母親由来である試料由来の、母親及び胎児のポリヌクレオチドの混合物の単離を提供する。ポリヌクレオチドは単離及び精製され、更に、上記試料中の１または複数の遺伝子座における、コピー数多型または必然的変異型などの遺伝子変異の有無を特定するために試験される。
一般的に、図４に示すように、１または複数のプローブセットであって、それぞれが少なくとも２の、試料連鎖４１６中の配列に対して相補的なハイブリダイゼーション配列４０８及び４１０を含む上記プローブセットを、当該試料中の１または複数の着目する遺伝子座及び１または複数の、上記着目する遺伝子座外の遺伝子座に対してハイブリダイズさせる。プローブは一般的に、分子状バーコード配列４０４などの識別子分子が割り当てられる。いくつかの場合においてに、プローブセットは分子反転プローブ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ ｐｒｏｂｅ）（ＭＩＰ）４００を含んでいてもよく、該ＭＩＰは、ユニバーサルプライマー配列４０２及び４１４、制限部位４６０、及びリンカー配列４１２などの更なる配列から構築される。次に、２以上のプローブが連結され４１８、リゲーション部位４３２において単一の連続したリゲーション生成物を生成する。結合されたプローブはエキソヌクレアーゼによる処理によって単離することができ、該エキソヌクレアーゼは直鎖状のポリヌクレオチドの末端４０６を選択的に標的とし、試料ＤＮＡ鎖及び非結合プローブを消化する一方で、結合した環状プローブは未変化のまま残すことができる。識別子分子は、ユニバーサルプライミング部位４３４及び４３０、バーコード配列中の部位４２６、またはハイブリダイゼーション配列内の部位４３８及び４３６からのユニバーサル増幅を始めとする種々の手段を用いて識別され及び計数される。一般的に、特定のプローブセットに予め割り振られたバーコードの存在量は、上記特定のプローブセットが相補的である遺伝子座の存在量に略比例する。従って、バーコードの存在量は、試料中に当初存在した遺伝子座のコピー数に比例し得る。本開示のシステム及び方法は、種々の識別子の計数方法及び、１または複数の遺伝子座におけるＣＮＶの特定などの、試料中の遺伝子変異の有無の特定における、計数された識別子の使用を提供する。
更に、本開示のシステム及び方法は、全体的な染色体異常から、他の異常を暗示する他の僅かなゲノム異常までにわたる、母親及び胎児の試料における種々の遺伝子変異を検出するために特に有用であり得る。例えば、本開示のシステム及び方法は、トリソミー２１を検知すること、または嚢胞性線維症などの疾患に関する必然的変異型の検知の提供において有用であり得る。
ＩＩＩ．ポリヌクレオチドの単離及び抽出
Ａ．試験試料源
本開示のシステム及び方法は、種々のポリヌクレオチドの試験、操作、調製、識別及び／または定量を伴い得る。ポリヌクレオチドの例としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アンプリコン、ｃＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、コスミドＤＮＡ、高分子量（ｈｉｇｈ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｗｅｉｇｈｔ）（ＭＷ）ＤＮＡ、染色体ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ウィルスＤＮＡ、細菌ＤＮＡ、ｍｔＤＮＡ（ミトコンドリア（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ）ＤＮＡ）、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｎＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｃａＲＮＡ、ミクロＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、リボザイム、リボスイッチ及びウィルスＲＮＡ（例えば、レトロウィルスＲＮＡ）が挙げられるが、それらに限定されない。
上記試験試料は、母親及び胎児のポリヌクレオチドの混合物を含む、任意且つ適宜の生物学的出所由来であってよい。試料はヒト、哺乳類、非ヒト哺乳類、類人猿、猿、チンパンジー、爬虫類、両生類または鳥類などの種々の出所由来であってよい。いくつかの場合において、試験試料は組織試料、生体液、または細胞試料を含み得る。いくつかの場合において、試験試料はスワブ、スミア、生検材料、吸引物、またはイン・ビトロで培養された複数の細胞（すなわち、組織／細胞培養）を含み得る。いくつかの場合において、ポリヌクレオチドは細胞から抽出され、その後試験されてもよい。他の場合において、ポリヌクレオチドは、血液などの体液中で循環するポリヌクレオチドなどの無細胞の状態として存在し、その後試験されてもよい。生物学的出所の例としては、母親の臓器組織、胎児の臓器組織、血液、血漿、血清、汗、涙、痰、尿、耳分泌物、リンパ、唾液、脳脊髄液、骨、骨髄懸濁液、膣分泌物、大腿骨頸部灌流、脳流体、白血球フェレーシス試料、腹水、乳、気道分泌物、粘液、腸分泌物、羊水、絨毛膜絨毛試料、胎児の試料、臍の緒試料、または胎盤試料を挙げることができるが、それらに限定されない。
いくつかの場合において、試料は単一の出所より、または複数の出所の組み合わせより得ることができる。いくつかの場合において、母親及び胎児のポリヌクレオチドの混合物は同一の生物学的試料より得ることができる。いくつかの場合において、母親及び胎児のポリヌクレオチドの混合物は、母親の血液などの単一の母親の試料より得ることができる。いくつかの場合において、試料は別個の試料より得てもよい。例えば、試料は母親の組織由来のポリヌクレオチド及び別個の胎児の組織由来のポリヌクレオチドを含んでいてもよい。いくつかの場合において、母親及び胎児のポリヌクレオチドは試料採取の後に混合されてもよい。いくつかの場合において、試料は、異なる個体、同一若しくは異なる個体の異なる発育段階、異なる病態の個体（すなわち、ガン若しくは遺伝的障害を有する個体）、正常な、すなわち健常な個体、１または複数の病態にある個体、疾患に関して異なる治療を受けている個体、異なる環境因子に曝露されている個体、または異なる感染因子若しくは疾患因子（すなわち、ウィルス、細菌、病原体）に曝露されている個体由来であってもよい。一般的に、生物学的試料は妊娠中の女性（雌）由来であってよい。他の場合において、試料は胎芽（胚）または胎児に直接由来するものであってもよい。いくつかの場合において、試料は胎内の胎児由来であってもよい。他の場合において、試料は、胎芽（胚）由来、または、元々体外受精（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ）（ＩＶＦ）によって生み出され、それに続いて別個の母親の試料と組み合わされた、培養された胎芽（胚）の組織由来であってもよい。
試料はまた、イン・ビトロ培養された組織、培養された細胞または他の培養されたポリヌクレオチドを含む出所などの、細胞培養物中の細胞より得てもよい。イン・ビトロでの出所より得た試料は、それらに限定されないが、様々な種類の培地条件（すなわち、ｐＨ、温度、成長因子、栄養成分等々）、培養時間の長さ、または外因による処理（すなわち、医薬、医薬候補、化学薬剤、毒素等々）を始めとする様々な条件下で培養することができる。
試料が得られた後、本技術分野において公知の任意且つ適宜の技法を用いて、ポリヌクレオチドを抽出、単離及び精製することができる。例えば、いくつかの場合において、Ｑｉａｇｅｎ社のＱｉａｍｐ（登録商標）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｋｉｔなどの任意且つ適宜の市販のキットを用いてＤＮＡを単離、抽出及び調製することができる。他の例としては、Ｑｉａｇｅｎ Ｑｕｂｉｔ（商標）ｄｓＤＮＡ ＨＳ Ａｓｓａｙキットプロトコル、Ａｇｉｌｅｎｔ（商標）ＤＮＡ１０００キット、またはＴｒｕＳｅｑ（商標）Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、Ｐｒｏｍｅｇａ社、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社、ＩＢＩ社等により提供されるＬｏｗ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ（ＬＴ）または他のキットが挙げられるが、それらに限定されない。また、任意且つ適宜の非市販のキットも、本開示のシステム及び方法のためのポリヌクレオチドの単離及び精製に用いることができる。
精製の後、いくつかの場合において、ポリヌクレオチドを、１若しくは複数の薬剤などの１または複数の更なる物質と予備混合してもよい。薬剤としては、リガーゼ、プロテアーゼ、ポリメラーゼ、制限酵素、ｄＮＴＰ、塩、バルクポリヌクレオチド等を挙げることができるが、それらに限定されない。１または複数の薬剤は、後続のハイブリダイゼーションステップの前に、ポリヌクレオチドの調製のために添加することができる。
Ｂ．ポリヌクレオチドの断片化
単離及び精製の後、本開示のシステム及び方法は、ハイブリダイゼーションの前に、ポリヌクレオチドを断片化するための任意選択の調製ステップを提供する。いくつかの場合において、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドが分解された、すなわち短い配列（例えば、無細胞ポリヌクレオチド）として存在する場合におけるような断片として単離及び精製されてもよい。他の場合において、ポリヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）などの、未変化または実質的に未変化の配列として単離及び精製されてもよい。
ｇＤＮＡなどの試料連鎖の断片化は、いくつかの場合において特に有用となり得る。例えば、ポリヌクレオチドはハイブリダイゼーションの前に分割されてもよく、その場合、一本鎖または断片は、単一のウェル、単一の液滴または単一の乳化液中などで分離及び分割される。ｇＤＮＡは非オーバーラップの配列へと断片化されてもよく、該非オーバーラップの配列は分割され、分割物内で種々の他の薬剤と組み合わされてもよい。一例において、本明細書中で述べたバーコード配列が、分割物内でプローブ配列に割り当てられてもよい。
分割は任意且つ適宜の方法または装置を用いて行うことができる。例えば、試料または反応混合物の分配及びそれに続く薬剤の添加のために、微小流体装置が知られている。分配及び薬剤の組み合わせでの添加に用いられる種々の市販のプラットフォームを、本開示のシステム及び方法で用いることができる。例えば、Ｄｙｎａｍｉｃ Ａｒｒａｙ（商標）システム及びＡｃｃｅｓｓ Ａｒｒａｙ（商標）システム、並びに文献に記載のシステムを用いることができる（例えば、米国特許第７，６０４，９６５号、特許公開ＷＯ２０１０／０７７６１８、ＵＳ２００９／０３１７７９８、ＵＳ２００８／０２２３７２１、ＵＳ２００９／０２５７９２０、ＵＳ２００９／０２９１４３５、ＵＳ２０１１／０１２６９１０及び未公開の出願ＰＣＴ／ＵＳ１０／５８４５９を参照されたく、これらは全て参照により本明細書に組み込まれる。）。他の手法としては微小流体カードの使用が挙げられる。一つの有用な手法としては、反応混合物を、中で増幅反応を行うことができる微小液滴へ分配することを伴う（例えば、特許出願公開第ＵＳ２００９／００３５８３８、ＵＳ２０１０／００２２４１４、ＷＯ０１／８９７８８、ＷＯ２００６／０４０５５１、ＷＯ２００６／０４０５５４、ＷＯ２００４／００２６２７、ＷＯ２００８／０６３２２７、ＷＯ２００４／０９１７６３、ＷＯ２００５／０２１１５１、ＷＯ２００６／０９６５７１、ＷＯ２００７／０８９５４１、ＷＯ２００７／０８１３８５及びＷＯ２００８／０６３２２７を参照されたく、これらは全て参照により本明細書に組み込まれる。）。液滴に基づく手法の一つにおいて、試料を複数の液滴へと分割し、個々の同一の液滴を指定された薬剤を含む液滴と融合することができる。
いくつかの場合において、ポリヌクレオチドは、長さとして約１０〜５０、５０〜１００、１００〜５００、５００〜１０００、１０００〜３０００、または１０００〜３０００塩基対の大きさに断片化されてもよい。いくつかの場合において、ポリヌクレオチドは、長さとして少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、または５０００塩基対の大きさに断片化されてもよい。いくつかの場合において、ポリヌクレオチドは、長さとして最大で１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、または５０００塩基対の大きさに断片化されてもよい。
多くの断片化システム及び方法が本明細書に記載され、また本技術分野において公知である。例えば、断片化は、物理的、機械的または酵素的システム及び方法によって実施することができる。物理的断片化としては、標的ポリヌクレオチドを熱またはＵＶ光に曝露することをあげることができる。機械的分解は、標的ポリヌクレオチドを、超音波処理または噴霧化によるなどして、所望の範囲の断片へと機械的にせん断するために用いることができる。標的ポリヌクレオチドはまた、酵素的システム及び方法を用いて断片化することもできる。いくつかの場合において、酵素的消化は、制限酵素を用いるなどの酵素を用いることで、実施することができる。
制限酵素は、標的ポリヌクレオチドの特異的断片化または非特異的断片化を実施するために用いることができる。本開示のシステム及び方法は、一般的にＩ型酵素、ＩＩ型酵素、及び／またはＩＩＩ型酵素と表記される１または複数の制限酵素を用いることができる。ＩＩ型酵素及びＩＩＩ型酵素は一般に市販され、本技術分野において周知である。
ＩＶ．標的増幅及び配列決定
一態様において、本発明は試料中の複数の標的ポリヌクレオチドの配列決定方法を提供する。一実施形態において、該方法は、（ａ）標的ポリヌクレオチドを断片化して、断片化ポリヌクレオチドを生成させることと、（ｂ）上記断片化ポリヌクレオチドにアダプターオリゴヌクレオチド、但し該アダプターオリゴヌクレオチドのそれぞれは配列Ｄを含む、を連結し、両末端に、相補的な配列Ｄ’に対してハイブリダイズする配列Ｄを含む改変されたポリヌクレオチドを生成させることであって、任意選択で、配列Ｄ’は標的ポリヌクレオチドの３’末端の伸長によって作製される、上記改変されたポリヌクレオチドを生成させることと、（ｃ）配列Ｃ、配列Ｄ、及び試料に結合したバーコードを含む増幅プライマーを用いて、上記改変されたポリヌクレオチドを増幅することであって、配列Ｄが上記増幅プライマーの３’末端に位置する、上記改変されたポリヌクレオチドを増幅することと、（ｄ）増幅された標的ポリヌクレオチドを、固体表面に接続された複数の異なる第１のオリゴヌクレオチドに対してハイブリダイズさせることと、（ｅ）固体表面上で架橋増幅を行うことと、（ｆ）ステップ（ｅ）由来の複数のポリヌクレオチドを配列決定することとを含む。上記固体表面は複数のオリゴヌクレオチドを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、上記固体表面は、（ｉ）配列Ａ及び配列Ｂを含む、複数の異なる第１のオリゴヌクレオチドであって、配列Ａは全ての第１のオリゴヌクレオチド間に共通であり、更に、配列Ｂは、各異なる第１のオリゴヌクレオチドに対して異なり、各第１のオリゴヌクレオチドの３’末端にあり、着目する遺伝子座を含む配列、または着目する遺伝子座の２００ヌクレオチド以内の配列に対して相補的である、上記第１のオリゴヌクレオチド、（ｉｉ）各３’末端に配列Ａを含む複数の第２のオリゴヌクレオチド、及び（ｉｉｉ）各３’末端に配列Ｃを含む複数の第３のオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、１または複数の配列Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤは異なる配列である。いくつかの実施形態において、１または複数の配列Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤは、その他の１または複数の配列Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤとは、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、若しくはそれを超えて、それら未満、またはそれらを超えて異なる（例えば、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれを超えるもの未満の同一性を有する。）。いくつかの実施形態において、１または複数の配列Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤはそれぞれ、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０若しくはそれを超える、それら未満、またはそれらを超えるヌクレオチドを含む。
試料は、本明細書記載の方法などの適当な方法によって得ることができ、断片化することができる。いくつかの実施形態において、断片化に続いて、アダプターオリゴヌクレオチドの断片化ポリヌクレオチドへのライゲーションが行われる。アダプターオリゴヌクレオチドとしては、少なくともその一部が公知である、標的ポリヌクレオチドに連結することができる配列を有する任意のオリゴヌクレオチドが挙げられる。アダプターオリゴヌクレオチドはＤＮＡ、ＲＮＡ、ヌクレオチド類縁体、非標準ヌクレオチド、標識ヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、またはそれらの組み合わせを含むことができる。アダプターオリゴヌクレオチドは、一本鎖であり、二本鎖であり、または部分的に二重鎖であることができる。一般的に、部分的に二重鎖のアダプターは１または複数の一本鎖領域を含み、且つ１または複数の二本鎖領域を含む。二本鎖アダプターは、互いにハイブリダイズした２の別個のオリゴヌクレオチドを含むことができ（「オリゴヌクレオチド二重鎖」とも呼ばれる）、ハイブリダイゼーションは、１または複数のブラントエンド、１または複数の３’オーバーハング、１または複数の５’オーバーハング、ミスマッチの及び／若しくは非対のヌクレオチドに起因する１または複数のバルジ、あるいはこれらの任意の組み合わせを残し得る。いくつかの実施形態において、一本鎖アダプターは、互いにハイブリダイズすることができる２以上の配列を含む。一本鎖アダプター中に２のかかるハイブリダイズ可能な配列が含まれる場合は、ハイブリダイゼーションによりヘアピン構造が生成される（ヘアピンアダプター）。アダプターのハイブリダイズした２の領域が、非ハイブリダイズ領域によって互いに分離した場合、「バブル」構造が生じる。バブル構造を含むアダプターは、内部ハイブリダイゼーションを含む単一のアダプターオリゴヌクレオチドから構成されることができ、または、互いにハイブリダイズした２以上のアダプターオリゴヌクレオチドを含み得る。アダプター中の２のハイブリダイズ可能な配列間などの内部配列ハイブリダイゼーションは、一本鎖アダプターオリゴヌクレオチド中に二本鎖構造を生成させることができる。ヘアピンアダプターと二本鎖アダプター、または異なる配列の複数のアダプターなどの、異なる種類のアダプターを組み合わせて用いることができる。異なるアダプターを、逐次反応においてまたは同時に、標的ポリヌクレオチドに連結することができる。いくつかの実施形態において、同一のアダプターが標的ポリヌクレオチドの両末端に付加される。例えば、第１及び第２のアダプターを、同一の反応混合物に添加することができる。アダプターは標的ポリヌクレオチドと連結する前に操作することができる。例えば、末端リン酸基を付加または除去することができる。
いくつかの実施形態においては、アダプターが、２の部分的に相補的なポリヌクレオチド鎖を、該２の連鎖がアニールされた場合に、少なくとも１の二本鎖領域と少なくとも１の非対領域とを付与するようにアニールすることによって形成されるミスマッチのアダプターである。アダプターの「二本鎖領域」とは、２の部分的に相補的なポリヌクレオチド鎖のアニーリングによって形成される、一般的には５以上の連続する塩基対を含む短い二本鎖領域である。この用語は単に、核酸の二本鎖領域であって、その中では２の連鎖がアニールされている上記領域をいい、如何なる特定の構造的コンフォメーションを暗示するものではない。いくつかの実施形態において、上記二本鎖領域は、長さが約５、１０、１５、２０、２５、３０、若しくはそれを超える、それら未満、またはそれらを超えるヌクレオチドである。一般的に、ミスマッチのアダプターの上記二本鎖領域にとって、機能を失うことなく可能な限り短いことが有利である。この文脈において「機能」とは、酵素により触媒される核酸ライゲーション反応のための標準的な反応条件下において、上記二本鎖領域が安定な二重鎖を形成することを意味し、該反応条件は当業者に公知である（例えば、標的分子へのアダプターのライゲーションの間に、アダプターを形成する上記２の連鎖が部分的にアニールされたままになるような、当該酵素に対して適当なライゲーション緩衝液中、４℃〜２５℃の範囲の温度でのインキュベーション）。上記二本鎖領域にとって、プライマー伸長またはＰＣＲ反応のアニーリングステップにおいて一般的に用いられる条件下で安定であることは、絶対的に必要なことではない。一般的に、上記二本鎖領域は、アダプターの「連結可能な」末端、すなわち、ライゲーション反応において標的ポリヌクレオチドに連結する末端に隣接する。上記アダプターの連結可能な末端はブラントエンドであることができ、あるいは、他の実施形態においては、１または複数のヌクレオチドの短い５’または３’オーバーハングが存在して、ライゲーションを容易にする／促進することができる。上記アダプターの連結可能な末端における上記５’末端ヌクレオチドは、一般的にはリン酸化され、試料ポリヌクレオチド上の３’水酸基へのリン酸ジエステル結合を可能にする。用語「非対領域」とは、当該アダプターを形成する２のポリヌクレオチド鎖の配列が、プライマー伸長またはＰＣＲ反応のための標準的なアニーリング条件下において、該２の連鎖が互いにアニーリングすることができない程度の非相補性を示すアダプターの領域をいう。上記非対領域の２の連鎖は、アニーリング条件下で、該２の連鎖が一本鎖形態に戻るとの条件の下に、酵素により触媒されるライゲーション反応のための標準的な反応条件下で、ある程度のアニーリングを示し得る。
アダプターオリゴヌクレオチドは、それらに限定されないが、１または複数の増幅プライマーアニーリング配列若しくはそれらの補体、１または複数の配列決定プライマーアニーリング配列若しくはそれらの補体、１または複数のバーコード配列、多種の異なるアダプター若しくは異なるアダプターの部分集合間で共有される１または複数の共通配列、１または複数の制限酵素認知部位、１または複数の標的ポリヌクレオチドオーバーハングに対して相補的な１または複数のオーバーハング、１または複数のプローブ結合部位（例えば、本明細書記載の装置またはＩｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ．によって開発されたフローセルなどの、大規模並列配列決定（ｍａｓｓｉｖｅ ｐａｒａｌｌｅｌ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）のためのフローセルなどの、配列決定プラットフォームへの取り付けのための）１または複数のプローブ結合部位、１または複数のランダム若しくはランダムに近い配列（例えば、１または複数の位置において、２以上の異なるヌクレオチドの組より無作為に選択された１または複数のヌクレオチドであって、上記１または複数の位置において選択された異なるヌクレオチドのそれぞれが、上記ランダムな配列を含むアダプターのプール中に出現する（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｅｄ）上記ヌクレオチド）、及びそれらの組み合わせを始めとする、種々の配列エレメントの１または複数を含有することができる。２以上の配列エレメントは、互いに隣接しない（例えば、１または複数のヌクレオチドによって分離されている）、互いに隣接する、部分的にオーバーラップする、または完全にオーバーラップすることができる。例えば、増幅プライマーアニーリング配列もまた、配列決定プライマーアニーリング配列としての役目を果たすことができる。配列エレメントは３’末端若しくはその近傍、５’末端若しくはその近傍、またはアダプターオリゴヌクレオチドの内部に位置することができる。アダプターオリゴヌクレオチドがヘアピンなどの２次構造を形成することができる場合、配列エレメントは、部分的に若しくは完全に当該２次構造の外側に、部分的に若しくは完全に当該２次構造の内側に、または当該２次構造に関与する配列の間に位置することができる。配列エレメントは、長さとして約３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０若しくはそれを超える、それら未満、またはそれらを超えるヌクレオチドなどの、任意且つ適宜の長さとし得る。アダプターオリゴヌクレオチドは、少なくともそれらを構成する１または複数の配列エレメントを収容するために十分な、任意且つ適宜の長さを有することができる。いくつかの実施形態において、アダプターは、長さとして約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、９０、１００、２００、若しくはそれを超える、それら未満、またはそれらを超えるヌクレオチドである。
いくつかの実施形態において、１の試料由来の断片化ポリヌクレオチドに連結したアダプターオリゴヌクレオチドは、全てのアダプターオリゴヌクレオチド及び当該の特定の試料のポリヌクレオチドに連結したアダプターに固有のバーコードに共通な１または複数の配列を含む。これは、１の試料またはアダプター連結反応に由来するポリヌクレオチドを、別な試料またはアダプター連結反応に由来するポリヌクレオチドから区別ために、上記バーコード配列を用いることができるようにするためである。いくつかの実施形態において、アダプターオリゴヌクレオチドが、１または複数の標的ポリヌクレオチドオーバーハングに対して相補的な５’オーバーハング、３’オーバーハング、または両方を含む。相補的なオーバーハングは、それらに限定されないが、長さとして１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、またはそれを超えるヌクレオチドを始めとする長さの１または複数のヌクレオチドとすることができる。相補的なオーバーハングは固定された配列を含み得る。１または複数の位置において、１または複数のヌクレオチドが２以上の異なるヌクレオチドの組より無作為に選択されるように、アダプターオリゴヌクレオチドの相補的なオーバーハングは、１または複数のヌクレオチドのランダムな配列を含み得る。但し、上記１または複数の位置において選択された異なるヌクレオチドのそれぞれは、上記ランダムな配列を含む相補的なオーバーハングを有するアダプターのプール中に出現する。いくつかの実施形態において、アダプターオーバーハングは、制限エンドヌクレアーゼの消化によって生成する標的ポリヌクレオチドオーバーハングに対して相補的である。いくつかの実施形態において、アダプターオーバーハングは、アデニンまたはチミンからなる。
いくつかの実施形態において、アダプターオリゴヌクレオチドは、配列エレメント配列Ｄを含む１の連鎖を含む。いくつかの実施形態において、アダプターオリゴヌクレオチドは、相補的配列Ｄ’に対してハイブリダイズした配列Ｄを含み、ここで配列Ｄ’は配列Ｄと同一または異なる連鎖上に存在する。いくつかの実施形態において、標的ポリヌクレオチドの３’末端がアダプターオリゴヌクレオチドに沿って伸長され、相補的な配列Ｄ’を生起する。いくつかの実施形態において、断片化ポリヌクレオチド及びアダプターオリゴヌクレオチドが（例えば、ライゲーションにより及び任意選択で断片伸長により）組み合わされ且つ処理されて、両末端において、アダプターオリゴヌクレオチド配列に連結した断片化ポリヌクレオチド配列を含む二本鎖の、改変されたポリヌクレオチドを生成し、ここで該改変されたポリヌクレオチドの両末端は、配列Ｄ’に対してハイブリダイズした配列Ｄを含む。いくつかの実施形態において、アダプターの連結に供される断片化ポリヌクレオチドの量は、約５０ｎｇ、１００ｎｇ、２００ｎｇ、３００ｎｇ、４００ｎｇ、５００ｎｇ、６００ｎｇ、７００ｎｇ、８００ｎｇ、９００ｎｇ、１０００ｎｇ、１５００ｎｇ、２０００ｎｇ、２５００ｎｇ、５０００ｎｇ、１０μｇ、若しくはそれを超える（例えば閾値量）、それら未満、またはそれらを超える。いくつかの実施形態において、断片化ポリヌクレオチドの量はアダプターの連結を進める前に決定され、ここで上記量が閾値量を下回る場合には、アダプターの連結は実施されない。
アダプターオリゴヌクレオチド及び試料ポリヌクレオチドなどの２のポリヌクレオチドに関して本明細書で用いられる用語「連結」（ｊｏｉｎｉｎｇ）及び「ライゲーション」（ｌｉｇａｔｉｏｎ）とは、連続した骨格を有する、単一のより大きなポリヌクレオチドを生成する、２の別個のポリヌクレオチドの共有結合性の接続をいう。２のポリヌクレオチドの連結方法の非限定的な例としては、酵素的方法または非酵素的（例えば、化学的）方法が挙げられる。非酵素的なライゲーション反応の例としては、米国特許第５，７８０，６１３号及び第５，４７６，９３０号に記載の非酵素的ライゲーション技法が挙げられ、これらの特許は参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態において、アダプターオリゴヌクレオチドが、例えばＤＮＡリガーゼまたはＲＮＡリガーゼなどのリガーゼによって断片化ポリヌクレオチドに連結される。リガーゼの非限定的な例としては、それぞれ特徴付けされた反応条件を有するが、ｔＲＮＡリガーゼを始めとするＮＡＤ＋依存性リガーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ ＤＮＡリガーゼ、大腸菌ＤＮＡリガーゼ、Ｔｔｈ ＤＮＡリガーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ ＤＮＡリガーゼ（Ｉ及びＩＩ）、熱安定リガーゼ、Ａｍｐｌｉｇａｓｅ熱安定性ＤＮＡリガーゼ、ＶａｎＣ型リガーゼ、９°Ｎ ＤＮＡリガーゼ、Ｔｓｐ ＤＮＡリガーゼ、及び生物資源探査により発見された新規リガーゼ；Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、Ｔ３ ＤＮＡリガーゼ、Ｔ７ ＤＮＡリガーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡリガーゼ１、ＤＮＡリガーゼＩＩＩ、ＤＮＡリガーゼＩＶを始めとするＡＴＰ依存性リガーゼ、及び生物資源探査により発見された新規リガーゼ；並びにそれらの野生型、変異体イソ型、及び遺伝子操作された変異体が挙げられる。ライゲーションは、相補的なオーバーハングなどの、ハイブリダイズ可能な配列を有するポリヌクレオチド間に存在することができる。ライゲーションはまた、２のブラントエンドの間にも存在することができる。一般的に、５’リン酸がライゲーション反応に利用される。５’リン酸は断片化ポリヌクレオチド、アダプターオリゴヌクレオチド、またはそれらの両者により提供することができる。５’リン酸は、必要により、連結されるポリヌクレオチドに付加され、または該ポリヌクレオチドから除去することができる。５’リン酸の付加方法または除去方法としては本技術分野で公知であり、限定されることなく、酵素的過程及び化学的過程が挙げられる。５’リン酸の付加及び／または除去において有用な酵素としては、キナーゼ、ホスファターゼ、及びポリメラーゼが挙げられる。いくつかの実施形態において、ライゲーション反応において連結する２の末端の両方（例えば、アダプター末端及び断片化ポリヌクレオチド末端）が５’リン酸を提供し、その結果、上記２の末端が連結することにより、断片化ポリヌクレオチドの一方または両方の末端に２の共有結合が形成される。いくつかの実施形態において、３’リン酸はライゲーションに先立って除去される。いくつかの実施形態において、アダプターオリゴヌクレオチドが断片化ポリヌクレオチドの両末端に付加され、そこで、各末端の一方または両方の連鎖が、１または複数のアダプターオリゴヌクレオチドに連結する。いくつかの実施形態において、同時に分析されるべき１よりも多い試料の標的ポリヌクレオチドに対して、バーコード配列が連結されないように、各試料に対して少なくとも１の異なるバーコード配列を含む異なるアダプターオリゴヌクレオチドを用いて、異なる試料に対して別個のライゲーション反応が行われる。
アダプターオリゴヌクレオチドの非限定的な例としては、ＣＡＣＴＣＡＧＣＡＧＣＡＣＧＡＣＧＡＴＣＡＣＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧＴ（配列番号１７）をＧＴＧＡＧＴＣＧＴＣＧＴＧＣＴＧＣＴＡＧＴＧＴＣＴＡＣＡＣＡＴＡＴＴＣＴＣＴＧＴＣ（配列番号１８）に対してハイブリダイズすることによって形成される二本鎖アダプターが挙げられる。更なるアダプターオリゴヌクレオチドの非限定的な例としては、ＵＳ２０１１１０３１９２９０及びＵＳ２００７０１２８６２４に記載され、これらは参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態において、改変オリゴヌクレオチドは、試料中の標的ポリヌクレオチドを増幅する増幅反応に供される。いくつかの実施形態において、増幅は、配列Ｃ、配列Ｄ、及び試料に結合したバーコードを含むプライマーを用い、ここで配列Ｄは増幅プライマーの３’末端に位置する。増幅プライマーは、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、９０、１００、若しくはそれを超える、それら未満、またはそれらを超えるヌクレオチドなどの、任意且つ適宜の長さとすることができ、それらの任意の部分または全ては、上記プライマーがハイブリダイズする相当する標的配列に対して相補的であることができる（例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、若しくはそれを超える、それら未満、またはそれらを超えるヌクレオチド）。「増幅」とは、標的配列のコピー数がそれによって増加する任意の過程をいう。任意の適切な、標的ポリヌクレオチドのプライマーにより方向付けられた増幅方法を用いることができ、その例としては、限定されることなく、ポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）（ＰＣＲ）に基づく方法が挙げられる。ＰＣＲによる標的ポリヌクレオチドの増幅に有利な条件は、該過程中の種々のステップにおいて最適化することができ、標的の種類、標的濃度、増幅されるべき配列の長さ、標的及び／または１若しくは複数のプライマーの配列、プライマー長さ、プライマー濃度、用いるポリメラーゼ、反応量、１または複数の要素の１または複数の他の要素に対する比、及びその他などの、該反応における要素の特性に依存し得るが、それらの一部または全ては変えることができる。一般的に、ＰＣＲは、（二本鎖である場合は）増幅される標的の変性ステップ、標的に対する１または複数のプライマーのハイブリダイゼーションステップ、及びＤＮＡポリメラーゼによるプライマーの伸長ステップを伴い、該ステップは標的配列を増幅するために繰り返される（すなわち、循環される）。この過程におけるステップは、収率を向上させること、偽性生成物の形成を低減すること、及び／またはプライマーアニーリングの特異度を増加または減少させることなどの、種々の結果に関して最適化することができる。最適化方法としては、増幅反応における要素の種類若しくは量、及び／または、特定のステップの温度、特定のステップの期間、及び／またはサイクル数などの、該過程中の所与のステップの条件に対する調整が挙げられる。いくつかの実施形態において、増幅反応は、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、５０、またはそれを超えるサイクルを含む。いくつかの実施形態において、増幅反応は、５、１０、１５、２０、２５、３５、５０、またはそれを超える数以下のサイクルを含む。サイクルは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれを超えるなどの、任意の数のステップを含むことができる。ステップは、それらに限定されないが、連鎖の変性、プライマーアニーリング、及びプライマー伸長を始めとする所与のステップの目的を達成するために好適な、任意の温度または温度勾配を含むことができる。ステップは、それらに限定されないが、約１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１８０、２４０、３００、３６０、４２０、４８０、５４０、６００、若しくはそれを超える、それら未満、またはそれらを超える秒数を始めとする任意の期間とすることができる。異なるステップを含む任意の数のサイクルを、任意の順で組み合わせることができる。
いくつかの実施形態において、増幅は、増幅プライマーの３’末端の配列Ｄと改変ポリヌクレオチドの配列Ｄ’との間のハイブリダイゼーション、増幅プライマー由来の配列Ｄ及びプライマー伸長の間に生成する配列Ｄ’を含むプライマー伸長生成物を生成する、改変ポリヌクレオチドに沿った増幅プライマーの伸長を含む。いくつかの実施形態において、鋳型ポリヌクレオチドからのプライマー伸長生成物を変性すること、及びプライマー伸長生成物を更なるプライマー伸長反応のための鋳型として用いて該過程を繰り返すことによって、１または複数回増幅過程が繰り返される。いくつかの実施形態において、第１のプライマー伸長反応において用いられたプライマーと同一のプライマーを用いて、プライマー伸長の第１のサイクルが、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、５０、若しくはそれを超える、それら未満、またはそれらを超えるサイクルの間繰り返される。いくつかの実施形態において、（例えば、配列Ｃの補体またはその一部に対して相補的な）第１の増幅プライマーを用いた増幅により改変ポリヌクレオチドに付加された配列に対して相補的な配列を含む３’末端を有する第２の増幅プライマーを用いた、１又は複数の増幅サイクルが、増幅プライマーによる１または複数のプライマー伸長の後に行われる。いくつかの実施形態において、第２の増幅プライマーは、３’末端に配列Ｃまたはその一部を含む。第２の増幅プライマーの非限定的な例としては、ＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＴＣＧＣＧＣＣＡＴＣＡＧ（配列番号１９）が挙げられる。いくつかの実施形態において、第２の増幅プライマーによる増幅は、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、５０、若しくはそれを超える、それら未満、またはそれらを超えるサイクルを含む。いくつかの実施形態において、増幅に供される改変ポリヌクレオチドの量は、約５０ｎｇ、１００ｎｇ、２００ｎｇ、３００ｎｇ、４００ｎｇ、５００ｎｇ、６００ｎｇ、７００ｎｇ、８００ｎｇ、９００ｎｇ、１０００ｎｇ、１５００ｎｇ、２０００ｎｇ、２５００ｎｇ、５０００ｎｇ、１０μｇ、若しくはそれを超える（例えば閾値量）、それら未満、またはそれらを超える。いくつかの実施形態において、改変ポリヌクレオチドの量は増幅を進める前に決定され、ここで上記量が閾値量を下回る場合には、増幅は実施されない。
いくつかの実施形態において、増幅プライマーはバーコードを含む。一般的に、用語「バーコード」とは、当該バーコードが結合するポリヌクレオチドのいくつかの特徴を識別することを可能にする、公知の核酸配列をいう。いくつかの実施形態において、識別されるポリヌクレオチドの特徴は、当該ポリヌクレオチドが由来する試料である。いくつかの実施形態において、バーコードは、長さにおいて、約または少なくとも約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、またはそれを超えるヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、バーコードは、長さにおいて、１０、９、８、７、６、５、または４よりも短いヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、いくつかのポリヌクレオチドに結合したバーコードは、他のポリヌクレオチドに結合したバーコードとは長さが異なる。一般的に、バーコードは十分な長さを有し、当該ポリヌクレオチドが結合するバーコードに基づいて、該結合するポリヌクレオチドの特徴（例えば試料源）の識別が可能になる程度に十分に異なる配列を含む。いくつかの実施形態において、バーコード、及び当該バーコードが関連付けられる試料の出所は、当該バーコード配列における１または複数のヌクレオチドの変異、挿入、または欠失、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、若しくはそれを超えるヌクレオチドの変異、挿入、または欠失などの後に、正確に識別することができる。いくつかの実施形態において、複数のバーコード中の各バーコードは、複数の中の他の全てのバーコードと、少なくとも３のヌクレオチド位置、例えば少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれを超えるヌクレオチド位置において異なる。試料のプール中に、複数のバーコードが出現することができ、各試料は、当該プール中の他の試料に由来するポリヌクレオチド中に含まれるバーコードとは異なる１または複数のバーコードを含むポリヌクレオチドを含む。上記プール中の各バーコードに沿った１または複数の位置（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、若しくはそれを超える、または全てのバーコードの位置）において、４種のヌクレオチド塩基Ａ、Ｇ、Ｃ、及びＴの全てが略均等に出現するように、１または複数のバーコードを含むポリヌクレオチドの試料を、当該ポリヌクレオチドが連結するバーコード配列に基づいてプールすることができる。いくつかの実施形態において、本発明の方法は、標的ポリヌクレオチドが由来する試料を、当該標的ポリヌクレオチドが連結するバーコード配列に基づいて識別することを更に含む。
いくつかの実施形態において、バーコード配列が、２以上の試料のプール中の１を超える試料の標的ポリヌクレオチドに連結しないように、各試料に対して少なくとも１の異なるバーコード配列を含む増幅プライマーを用いて、別個の増幅反応が別個の試料に対して行われる。いくつかの実施形態において、後続のポリヌクレオチドの操作を進める前（例えば、固体担体上での増幅及び／または配列決定の前）に、異なる試料に由来し、且つ異なるバーコードを含む増幅されたポリヌクレオチドがプールされる。プールは、反応量全体を含む、構成する全増幅反応の任意の画分を含むことができる。試料は均等または不均等にプールすることができる。いくつかの実施形態において、標的ポリヌクレオチドは、該ポリヌクレオチドが連結するバーコードに基づいてプールされる。プールは、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、若しくはそれを超える、それら未満、またはそれらを超える異なる試料に由来するポリヌクレオチドを含み得る。試料は、当該バーコードに沿った１または複数の位置において、４種のヌクレオチド塩基Ａ、Ｇ、Ｃ、及びＴの全てを均等に出現させるために、例えば４、８、１２、１６、２０、２４、２８、３２、３６、４０、４４、４８、５２、５６、６０、６４、９６、１２８、１９２、２５６、３８４等の、４の倍数でプールすることができる。バーコードの非限定的な例としては、ＡＧＧＴＣＡ、ＣＡＧＣＡＧ、ＡＣＴＧＣＴ、ＴＡＡＣＧＧ、ＧＧＡＴＴＡ、ＡＡＣＣＴＧ、ＧＣＣＧＴＴ、ＣＧＴＴＧＡ、ＧＴＡＡＣＣ、ＣＴＴＡＡＣ、ＴＧＣＴＡＡ、ＧＡＴＣＣＧ、ＣＣＡＧＧＴ、ＴＴＣＡＧＣ、ＡＴＧＡＴＣ、及びＴＣＧＧＡＴが挙げられる。いくつかの実施形態において、バーコードは、増幅プライマーの配列Ｄと配列Ｃとの間、または配列Ｃ及び配列Ｄの後で５’から３’への方向（「下流」）に位置する。いくつかの実施形態において、増幅プライマーは、配列ＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＴＣＧＣＧＣＣＡＴＣＡＧＸＸＸＸＸＸＣＡＣＴＣＡＧＣＡＧＣＡＣＧＡＣＧＡＴＣＡＣ(配列番号２１)を含むまたは該配列から構成され、ここで「Ｘ」はゼロ、１、またはそれを超えるバーコード配列のヌクレオチドを表わす。
増幅プライマーの非限定的な例を表１に示す。
いくつかの実施形態において、標的ポリヌクレオチドは固体担体に接続された複数のオリゴヌクレオチドに対してハイブリダイズされる。ハイブリダイゼーションは、アダプター連結及び増幅などの、１または複数の試料の加工ステップの前または後であってよい。いくつかの実施形態において、標的ポリヌクレオチドは、アダプター連結及び１または複数の増幅反応の両方の後に、固体担体上のオリゴヌクレオチドに対してハイブリダイズされる。固体担体上のオリゴヌクレオチドは、ランダムポリヌクレオチド配列、多数の異なる標的ポリヌクレオチドに共通な特定の配列（例えば、配列Ｄ、Ｄ’、若しくはそれらの一部などの、アダプターオリゴヌクレオチド由来の１若しくは複数の配列；配列Ｃ、Ｃ’、若しくはそれらの一部などの、増幅プライマー由来の１若しくは複数の配列；またはそれらの組み合わせ）、異なる標的ポリヌクレオチドに特異的な配列（配列Ｂに代表されるなどの）、あるいはこれらの組み合わせに対してハイブリダイズし得る。いくつかの実施形態において、上記固体担体は配列Ａ及び配列Ｂを含む、複数の異なる第１のオリゴヌクレオチドを含み、ここで配列Ａは全ての第１のオリゴヌクレオチド間で共通であり、更に、配列Ｂは、各異なる第１のオリゴヌクレオチドに対して異なり、各第１のオリゴヌクレオチドの３’末端に存在する。いくつかの実施形態において、複数の第１のオリゴヌクレオチドは、約５、１０、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、３００、４００、５００、７５０、１０００、２５００、５０００、７５００、１００００、２００００、５００００、若しくはそれを超える、それら未満、またはそれらを超える異なるオリゴヌクレオチドであって、それぞれが異なる配列Ｂを含む上記オリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、配列Ｂまたは配列Ｂが特異的にハイブリダイズする標的配列は、着目する遺伝子座を含む。いくつかの実施形態において、配列Ｂまたは配列Ｂが特異的にハイブリダイズする標的配列は、約１、２、３、４、５、６、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、５００若しくはそれを超える数以内、それら未満、またはそれらを超える、着目する遺伝子座のヌクレオチドである。上記固体担体は、本明細書に記載のように各第２のオリゴヌクレオチドの３’末端に配列Ａを含む複数の第２のオリゴヌクレオチド、及び各第３のオリゴヌクレオチドの３’末端に配列Ｃを含む複数の第３のオリゴヌクレオチドを更に含んでもよい。
いくつかの実施形態において、本方法は上記固体担体上で架橋増幅を行うことを更に含む。一般的に、架橋増幅は、プライマーの鋳型へのアニーリング、プライマー伸長、及び伸長されたプライマーの鋳型からの分離のステップの繰り返しを用いる。これらのステップは一般的に、ＰＣＲ（または逆転写酵素プラスＰＣＲ）技法における当業者に公知の薬剤及び条件を用いて行うことができる。従って、核酸ポリメラーゼをヌクレオシド三リン酸分子（または、修飾ヌクレオシド三リン酸などの、ＤＮＡ／ＲＮＡ中に存在するヌクレオチドの前駆体として作用する他の分子）の供給と共に、適宜の鋳型の存在下でプライマーを伸長させるために用いることができる。望ましくは、過剰なデオキシリボヌクレオシド三リン酸が供給される。代表的なデオキシリボヌクレオシド三リン酸は、略記されるｄＴＴＰ（デオキシチミジンヌクレオシド三リン酸）（ｄｅｏｘｙｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ｄＡＴＰ（デオキシアデノシンヌクレオシド三リン酸）（ｄｅｏｘｙａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ｄＣＴＰ（デオキシシトシンヌクレオシド三リン酸）（ｄｅｏｘｙｃｙｔｏｓｉｎｅ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）及びｄＧＴＰ（デオキシグアノシンヌクレオシド三リン酸）（ｄｅｏｘｙｇｕａｎｏｓｉｎｅ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）である。代表的なリボヌクレオシド三リン酸はＵＴＰ、ＡＴＰ、ＣＴＰ及びＧＴＰである。但し、代替物が可能である。これらは天然産または非天然産であってよい。ＰＣＲ反応において一般的に用いられる種類の緩衝液もまた提供され得る。プライマー伸長の間にヌクレオチドを組み込むために用いられる核酸ポリメラーゼは、数回使用することができるためには、利用される反応条件下で安定であることが好ましい。従って、新たに合成された核酸鎖をその鋳型から分離するために加熱が用いられる場合は、上記核酸ポリメラーゼは、用いられる温度において熱安定性であることが好ましい。かかる熱安定性ポリメラーゼとしては、好熱性微生物より得ることができ、Ｔａｑポリメラーゼとして知られるＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、またその熱安定性誘導体が挙げられる。
一般的に、プライマーのその鋳型へのアニーリングは２５〜９０℃の温度で行われる。この範囲の温度はまた、プライマー伸長の間においても一般的に用いられることとなり、アニーリング及び／または変性の間に用いられる温度と同様または異なることができる。アニーリングを進めるため、また所望の程度のプライマー伸長を起こさせるために十分な時間が経過した後、所望ならば、温度を上昇させて連鎖を分離させることができる。この段階においては、温度は一般的に６０〜１００℃の温度に上昇させることとなる。アニーリングの前の非特異的なプライミングの問題を低減するため、及び／または増幅開始のタイミングを制御するため、例えば、多数の試料に対する増幅開始を同調させるために、高温を用いることもできる。あるいは、低塩且つ高ｐＨ（＞１２）の溶液を用いた処理により、またはカオトロピック塩（例えばグアニジン塩酸塩）を用いることにより、または有機溶媒（例えばホルムアミド）により、連鎖を分離することができる。
（例えば加熱による）連鎖の分離後に、洗浄ステップを行ってもよい。洗浄ステップは、固定化されたプライマーの近傍に同一の鋳型を保持することを所望する場合などには、アニーリング、プライマー伸長及び連鎖分離の初期の繰り返しの間には割愛されてもよい。これにより、鋳型を数回使用してコロニー形成を開始することが可能となる。固体担体上での増幅により生成するコロニーの大きさは、例えば、行うアニーリング、プライマー伸長及び連鎖分離のサイクル数の制御により、制御することができる。コロニーの大きさに影響する他の因子もまた制御することができる。該因子としては、固定化されたプライマーの表面上の数及び配置、その上にプライマーが固定化される担体の構造、鋳型及び／またはプライマー分子の長さ及び剛直性、温度、並びにその中で上記サイクルを行うことができる流体のイオン強度及び粘度が挙げられる。
本開示の方法に従った増幅過程の非限定的な例を図１１に図解し、以下に説明する。まず、固体担体に接続され、その３’末端に配列Ｂを含む第１のオリゴヌクレオチドが、複数の異なる標的ポリヌクレオチド中の特定の標的ポリヌクレオチドに特有な配列などの相補的な標的配列Ｂ’（例えば特定のゲノムＤＮＡ配列）に対してハイブリダイズする。図１１の標的ポリヌクレオチドは、アダプターオリゴヌクレオチド由来の配列（例えば配列Ｄ及びＤ’）及び増幅プライマー由来の配列（例えばＣ及びＣ’）を含む。第１のオリゴヌクレオチドの伸長は固体担体に接続された第１の伸長生成物を生成し、該第１の伸長生成物は、５’から３’に向かって、配列Ａ、Ｂ、Ｃ’、及びＤ’を含み、ここで配列Ｃ’は配列Ｃに対して相補的であり、配列Ｄ’は配列Ｄに対して相補的である。次に、第１の伸長生成物は、標的ポリヌクレオチド鋳型から（例えば熱変性または化学変性により）分離される。第１の伸長生成物の配列Ｃ’は、次に、固体担体に接続された複数の第３のオリゴヌクレオチドの１に対してハイブリダイズし、該第３のオリゴヌクレオチドはその３’末端に配列Ｃを含む。第３のオリゴヌクレオチドの伸長は、固体担体に接続された第２の伸長生成物を生成し、該第２の伸長生成物は、５’から３’に向かって、配列Ｃ、Ｄ、Ｂ’、及びＡ’を含み、ここで配列Ｂ’は配列Ｂに対して相補的であり、配列Ａ’は配列Ａに対して相補的である。上記２の伸長生成物は、一方の連鎖が両末端において固体担体に接続された、二本鎖のポリヌクレオチドの「架橋」を形成する。次に、第１及び第２の伸長生成物は変性され、それに続く、上記伸長生成物とその後伸長された他のオリゴヌクレオチドとの間のハイブリダイゼーションが、第１及び第２の伸長生成物を複製する。例えば、各第１の伸長生成物が更なる第３のオリゴヌクレオチドに対してハイブリダイズし、第２の伸長生成物の更なるコピーを生成し得る。加えて、第２の伸長生成物が、固体担体に接続された複数の第２のオリゴヌクレオチドの１に対してハイブリダイズし、該第２のオリゴヌクレオチドはその３’末端に配列Ａを含む。第２のオリゴヌクレオチドの伸長は第１の伸長生成物の配列を含む伸長生成物を生成する。伸長生成物に沿った伸長の連続的な繰り返しは、初期の第１の伸長生成物から外側に向かって放射状に拡がり、第１の伸長生成物及び単一の標的ポリヌクレオチドに由来する、第１の伸長生成物に相補的な第２の伸長生成物のクラスターすなわち「コロニー」を生成する。この過程は、異なる配列または配列の配置を含むオリゴヌクレオチド、異なる標的ポリヌクレオチドまたは標的ポリヌクレオチドの組み合わせ、固体担体の種類、及び特定の架橋増幅反応に応じた他の考慮すべき事項を適応させるために、変更してもよい。一般的に、この過程は、固体担体上での、標的ポリヌクレオチド及び非標的ポリヌクレオチドを含む試料ポリヌクレオチドからの、特定の標的ポリヌクレオチドの増幅を提供する。一般的に、標的ポリヌクレオチドは選択的に増幅される一方、試料中の非標的ポリヌクレオチドは増幅されない、または例えば、１又は複数の標的ポリヌクレオチドよりも約１／１０、１／１００、１／５００、１／１０００、１／２５００、１／５０００、１／１００００、１／２５０００、１／５００００、１／１０００００、１／１００００００、若しくはそれ未満、またはそれらを超えて、非常に低い程度でしか増幅されない。
いくつかの実施形態において、その前の増幅ステップ由来の増幅されるポリヌクレオチドであって、架橋増幅に供される該ポリヌクレオチドの量は、約５０ｎｇ、１００ｎｇ、５００ｎｇ、１μｇ、２μｇ、３μｇ、４μｇ、５μｇ、６μｇ、７μｇ、８μｇ、９μｇ、１０μｇ、１１μｇ、１２μｇ、１３μｇ、１４μｇ、１５μｇ、２０μｇ、２５μｇ、２６μｇ、２７μｇ、２８μｇ、２９μｇ、３０μｇ、４０μｇ、５０μｇ、若しくはそれを超える（例えば閾値量）、それら未満、またはそれらを超える。いくつかの実施形態において、その前の増幅ステップ由来の増幅されるポリヌクレオチドの量は架橋増幅を進める前に決定され、ここで上記量が閾値量を下回る場合には、架橋増幅は実施されない。
いくつかの実施形態において、架橋増幅に続いて、固体担体に接続された複数のオリゴヌクレオチドの配列決定が行われる。いくつかの実施形態において、配列決定はシングルエンド配列決定を含むまたは該配列決定からなる。いくつかの実施形態において、配列決定はペアエンド配列決定を含むまたは該配列決定からなる。配列決定は任意且つ適宜の配列決定技法を用いて行うことができ、ここでヌクレオチドは連続的に遊離の３’水酸基に付加され、５’から３’の方向にポリヌクレオチド鎖が合成される。付加されたヌクレオチドのアイデンティティーは、好ましくはそれぞれのヌクレオチドの付加の後に特定される。あらゆる連続した塩基が配列決定されるわけではないライゲーションによる配列決定を用いる配列決定技法、及び表面上の連鎖に塩基が付加されるのではなく、該連鎖から塩基が除去される、大規模並列処理特徴配列決定（ｍａｓｓｉｖｅｌｙ ｐａｒａｌｌｅｌ ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）（ＭＰＳＳ）などの技法もまた、ピロリン酸放出の検知を用いる技法（ピロシーケンシング）であり、本発明の範囲内である。かかるピロシーケンシングに基づく技法は、ライブラリー分子由来の単一の鋳型が各ビーズ上で増幅されるように、ビーズが乳化液中で増幅された配列決定ビーズアレイに対して特に適用可能である。
本発明の方法において用いることができる特定の配列決定方法の一つは、可逆的チェインターミネーターとして作用することができる修飾ヌクレオチドの使用に基づく。かかる可逆的チェインターミネーターは、例えばＷＯ０４０１８４９７及びＵＳ７０５７０２６に記載の、除去可能な３’保護基を含む。かかる修飾ヌクレオチドが、配列決定中の鋳型の領域に対して相補的な、生長するポリヌクレオチド鎖中に組み込まれると、更なる配列伸長に向けるために利用可能な遊離の３’−ＯＨ基が存在せず、従ってポリメラーゼは更にヌクレオチドを付加することができない。生長するポリヌクレオチド鎖中に組み込まれた塩基のアイデンティティーが特定された後、上記３’保護基が除去され、次に続くヌクレオチドの付加を可能にすることができる。これらの修飾ヌクレオチドを用いて誘導される生成物を整えることにより、ＤＮＡ鋳型のＤＮＡ配列を推定することができる。上記修飾ヌクレオチドのそれぞれが、特定の塩基に対応することが知られている、各組み込みステップにおいて付加される塩基間の区別を容易にするための、該修飾ヌクレオチドに接続された異なる標識を有する場合、かかる反応は単一の実験で行うことができる。好適な標識の非限定的な例がＷＯ／２００７／１３５３６８に記載され、その内容の全体が参照により本明細書に組み込まれる。あるいは、個々に添加された上記修飾ヌクレオチドのそれぞれを含み、別個の反応が行われてもよい。
上記修飾ヌクレオチドは、それらの検知を容易にするための標識を有していてもよい。特定の実施形態において、上記標識は蛍光標識である。各ヌクレオチドの種類が異なる蛍光標識を有する。但し、上記検知可能な標識は蛍光標識である必要はない。当該ヌクレオチドのＤＮＡ配列中への組み込みの検知を可能にする任意の標識を用いることができる。蛍光標識されたヌクレオチドの検出方法の一つは、標識されたヌクレオチドに特異的な波長のレーザー光を用いること、または他の適宜の照射源の使用を含む。組み込まれたヌクレオチド上の標識からの蛍光は、ＣＣＤカメラまたは他の適宜の検知手段によって検知することができる。好適な検知手段がＷＯ／２００７／１２３７４４に記載され、その内容の全体が参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態において、第１の配列決定反応は、固体担体に接続されたオリゴヌクレオチド中に含まれる開裂部位における開裂によって生じる３’末端から進行し、該オリゴヌクレオチドは架橋増幅の間に伸長されている。いくつかの実施形態において、上記開裂した連鎖は、上記接続されたオリゴヌクレオチドの伸長による配列決定の前に、その相補的な連鎖から分離される。いくつかの実施形態において、新たな連鎖が伸長されながら開裂した連鎖が置換されるように、開裂によって生じた、新たに遊離となった３’末端を有する接続されたオリゴヌクレオチドが、連鎖置換活性を有するポリメラーゼを用いて伸長される。いくつかの実施形態において、接続されたオリゴヌクレオチドの伸長は、増幅反応由来の鋳型伸長生成物の全長に沿って進行し、いくつかの実施形態において、該伸長は、最後に識別されたヌクレオチドを超える伸長を含む。いくつかの実施形態において、次に、上記鋳型伸長生成物は、固体担体に接続されたオリゴヌクレオチド中に含まれる開裂部位において開裂され、配列決定反応の間に伸長されたオリゴヌクレオチドは直線化され、遊離の第１の配列決定伸長生成物を生成する。次に、第１の配列決定生成物の５’末端は、第２の配列決定反応のための鋳型の役目を果たし、第２の配列決定反応は（本明細書記載の配列決定プライマーなどの）配列決定プライマーの伸長により、または開裂部位における開裂によって生じた３’末端からの伸長により進行することができる。いくつかの実施形態において、配列決定中の鋳型ポリヌクレオチドに沿って識別されるヌクレオチドの平均またはメジアン数は、約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、若しくはそれを超える、それら未満、またはそれらを超える。
いくつかの実施形態において、配列決定は、少なくとも部分的に一本鎖である鋳型を生起させるために、架橋増幅生成物を処理して、実質的に全ての「架橋」構造中の固定化された連鎖の１の全てを除去する、または該連鎖の１の少なくとも一部を除去若しくは置換することを含む。従って、一本鎖である鋳型の一部は、配列決定プライマーとのハイブリダイゼーションに利用可能となる。架橋された二本鎖核酸構造中の１の固定化された連鎖の全てまたは一部を除去する過程は、本明細書において「直線化」と呼んでもよく、ＷＯ０７０１０２５１に更に詳細に記載され、その内容の全体が参照により本明細書に組み込まれる。
架橋された鋳型構造は、制限エンドヌクレアーゼを用いた一方若しくは両方の連鎖の開裂によって、またはニッキングエンドヌクレアーゼを用いた一方の連鎖の開裂によって直線化し得る。化学的開裂（例えば、過ヨウ素酸塩を用いたジオール結合の開裂）、エンドヌクレアーゼ（例えば、ＮＥＢ社より供給される「ＵＳＥＲ」、製品番号Ｍ５５０５Ｓ）を用いた開裂によるまたは熱若しくはアルカリへの曝露による脱塩基部位の開裂、その他の部分がデオキシリボヌクレオチドから構成される増幅生成物中に組み込まれたリボヌクレオチドの開裂、光化学的開裂、あるいはペプチドリンカーの開裂を始めとする他の開裂方法を、制限酵素またはニッキング酵素に対する代替手段として用いることができるが、それらに限定されない。いくつかの実施形態において、固相増幅反応が、共有結合で固定化された１種のみの増幅オリゴヌクレオチドと、それとは別の溶液中に遊離した増幅オリゴヌクレオチドとを用いて実施される場合などには、直線化ステップは回避されてもよい。開裂ステップに続いて、開裂に用いられた方法の如何に依らず、固体担体に接続されていない、開裂した連鎖（複数可）の一部分（複数可）を除去するために、開裂反応の生成物が変性条件に供されてもよい。例えば、標準的な分子生物学のプロトコル（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ａｕｓｕｂｅｌら編）に記載されるものなどの、水酸化ナトリウム溶液、ホルムアミド溶液、または熱などの好適な変性条件は本技術分野で公知である。変性によって、部分的にまたは実質的に一本鎖である配列決定鋳型が生成する。次に、配列決定プライマーの上記鋳型の上記一本鎖部分に対するハイブリダイゼーションにより、配列決定反応を開始することができる。このように、本開示は、核酸配列決定反応が、配列決定プライマーを直線化された増幅生成物の一本鎖領域に対してハイブリダイズすること、逐次的に、１又は複数のヌクレオチドを、配列決定される増幅された鋳型鎖の当該領域に対して相補的なポリヌクレオチド鎖中に組み込むこと、１又は複数の上記組み込まれたヌクレオチド（複数可）中に存在する塩基を識別すること、及びそれによって、鋳型鎖の領域の配列を決定することを含む方法を包含する。
いくつかの実施形態において、配列決定プライマーはアダプターオリゴヌクレオチド、増幅プライマー、固体担体に接続されたオリゴヌクレオチド、またはこれらの組み合わせに由来する１又は複数の配列に対して相補的な配列を含む。いくつかの実施形態において、配列決定プライマーは配列Ｄまたはその一部を含む。いくつかの実施形態において、配列決定プライマーは配列Ｃまたはその一部を含む。配列決定プライマーは、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、９０、１００、若しくはそれを超える、それら未満、またはそれらを超えるヌクレオチドなどの、任意且つ適宜の長さとすることができ、上記配列決定プライマーの任意の部分または全ては、上記プライマーがハイブリダイズする相当する標的配列（例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、若しくはそれを超える、それら未満、またはそれらを超えるヌクレオチド）に対して相補的であり得る。いくつかの実施形態において、配列決定プライマーは配列ＣＡＣＴＣＡＧＣＡＧＣＡＣＧＡＣＧＡＴＣＡＣＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧ（配列番号２０）を含む。
一般的に、配列決定プライマーの伸長により配列決定伸長生成物が生成する。配列決定過程において識別される配列決定伸長生成物に付加されるヌクレオチドの数は、鋳型配列、反応条件、用いる薬剤、及び他の因子を始めとする多数の因子に依存し得る。いくつかの実施形態において、生長する配列決定プライマーに沿って識別されるヌクレオチドの平均またはメジアン数は、約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、若しくはそれを超える、それら未満、またはそれらを超える。いくつかの実施形態において、配列決定プライマーは、増幅反応由来の鋳型プライマー伸長生成物の全長に沿って伸長し、いくつかの実施形態において、該配列決定プライマーは、最後に認識されたヌクレオチドを超える伸長を含む。
いくつかの実施形態において、配列決定伸長生成物を、該配列決定伸長生成物がハイブリダイズする接続された鋳型鎖から除去するために、及び上記鋳型を部分的に又は完全に一本鎖とし、第２の配列決定プライマーとのハイブリダイゼーションに利用可能とするために、該配列決定伸長生成物が変性条件に供される。第２の配列決定プライマーは第１の配列決定プライマーと同一であってもまたは異なってもよい。いくつかの実施形態において、第２の配列決定プライマーは、第１の配列決定プライマーがハイブリダイズする配列よりも、標的核酸の５’末端により近接して位置する配列に対してハイブリダイズする。いくつかの実施形態において、第２の配列決定プライマーは、第１の配列決定プライマーがハイブリダイズする配列よりも、標的核酸の３’末端により近接して位置する配列に対してハイブリダイズする。いくつかの実施形態において、第１及び第２の配列決定プライマーの一方のみがバーコード配列に沿って伸長され、それによって当該バーコード配列中のヌクレオチドを識別する。いくつかの実施形態において、一方の配列決定プライマー（例えば第１の配列決定プライマー）が、（この配列決定プライマーの伸長が当該バーコードに相補的な配列を生起しないように）バーコード由来の５’に位置する配列にハイブリダイズし、別な配列決定プライマー（例えば第２の配列決定プライマー）が、（この配列決定プライマーの伸長が当該バーコードに相補的な配列を生起するように）バーコード由来の３’に位置する配列にハイブリダイズする。いくつかの実施形態において、第２の配列決定プライマーは配列番号１９を含む。
本開示は、ポリヌクレオチド鎖へのヌクレオチドの連続的な組み込みに基づく多種多様な配列決定の方法論を用いることができ、上記に概説した配列決定方法の使用に限定されることが意図されるものではない。好適な技法としては、例えば、ＵＳ６３０６５９７、ＵＳ２００９０２３３８０２、ＵＳ２０１２００５３０７４、及びＵＳ２０１１０２２３６０１記載の技法が挙げられ、これらの特許はそれらの全体が参照により組み込まれる。連鎖の再合成が採用される場合においては、両方の連鎖は、後続の固定化された連鎖の一部の放出を可能にする方法で、表面に固定化されなければならない。これは、ＷＯ０７０１０２５１に記載の多数の機構により達成することができ、該公報の内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。例えば、一つのプライマーがウラシルヌクレオチドを含むことができ、これは当該鎖が、当該ヌクレオチド塩基を除去する酵素ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ｕｒａｃｉｌ ＤＮＡ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ）（ＵＤＧ）、及び該脱塩基ヌクレオチドを切除するエンドヌクレアーゼＶＩＩＩを用いて、ウラシル塩基において開裂することができることを意味する。この酵素の組み合わせは、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社よりのＵＳＥＲ（商標）（ＮＥＢ社製品番号Ｍ５５０５）として利用可能である。第２のプライマーは８−オキソグアニンヌクレオチドを含むことができ、これはその後酵素ＦＰＧ（ＮＥＢ社製品番号Ｍ０２４０）により開裂可能である。このプライマーの設計は、どのプライマーが過程のどの時点で開裂するか、また、クラスター中のどこで開裂が起こるかについて完全な制御を提供する。上記プライマーはまた、例えば、特定の位置における化学的開裂を可能にするジスルフィドまたはジオールによる修飾により、化学的に修飾することができる。
いくつかの実施形態において、配列決定データは、約５、１０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、７５０、１０００、２５００、５０００、７５００、１００００、２００００、５００００、若しくはそれを超える、それら未満、またはそれらを超える、単一の反応容器（例えばフローセル中のチャンネル）中の試料由来の異なる標的ポリヌクレオチドに対して作成される。いくつかの実施形態において、配列決定データは、約２、３、４、５，６，７、８、９、１０、１１、１２、１３，１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２４、４８、９６、１９２、３８４、７６８、１０００、若しくはそれを超える、それら未満、またはそれらを超える試料などの、同時に複数の試料に関して作成される。いくつかの実施形態において、配列決定データは、約２、３、４、５，６，７、８、９、１０、１１、１２、１３，１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２４、４８、９６、１９２、３８４、７６８、１０００、若しくはそれを超える、それら未満、またはそれらを超える試料などの、単一の反応容器（例えばフローセル中のチャンネル）中の複数の標的ポリヌクレオチドに対して作成され、配列決定データはその後、配列決定されたポリヌクレオチドの出所である試料により分類される。単一の反応において、配列決定データは、約１０６、１０７、１０８、２×１０８、３×１０８、４×１０８、５×１０８、１０９、１０１０、若しくはそれを超える、または少なくともそれらの標的ポリヌクレオチドあるいは架橋増幅反応由来のクラスターに対して作成することができ、これらの配列決定データは、約１０４、１０５、１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、１０７、１０８、若しくはそれを超える、それら未満、またはそれらを超える、上記反応における各試料に関する標的ポリヌクレオチドあるいはクラスターに対する配列データを含み得る。いくつかの実施形態において、試料に対して、約５、１０、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、３００、４００、５００、７５０、１０００、２５００、５０００、７５００、１００００、２００００、５００００、若しくはそれを超える、それら未満、またはそれらを超える、必然的遺伝子変異型の存在、非存在、または遺伝子型が、上記配列決定データに基づいて特定される。１又は複数の必然的遺伝子変異体の存在、非存在、または遺伝子型が、約８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、９９％、９９．５％、９９．９％若しくはそれよりも高い、またはそれらを超える精度で特定され得る。
いくつかの実施形態において、本発明の方法における１若しくは複数、または全てのステップは、１又は複数の自動装置の使用によるなど、自動化される。一般的に、自動装置は人間の指示なしで稼働することができる装置であり、自動システムは、人間が、例えばコンピュータに指示を入力することにより、作用を推進するための任意の行動をとることを完了した後、ある期間作用を行うことができ、その後、自動装置は、更なる人間の操作なしで１又は複数のステップを行う。本発明の実施形態を実施するコードを始めとするソフトウェア及びプログラムを、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＯＭ、テープ、フラッシュドライブ、若しくはディスケット、またはその他の適当なコンピュータ可読の媒体などの何らか形式のデータ保存媒体に保存することができる。本発明の種々の実施形態も、ハードウェア、またはソフトウェア及びハードウェアの組み合わせにおいて、専らに実施することができる。例えば、一実施形態において、従来のパーソナルコンピュータよりもむしろ、プログラマブルロジックコントローラ（Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ Ｌｏｇｉｃ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ）（ＰＬＣ）が用いられる。当業者に公知であるように、ＰＬＣは、多目的コンピュータの費用が不要な様々なプロセス制御用途においてしばしば用いられる。ＰＬＣは１または様々な制御プログラムを実行するための公知の様式で構成することができ、パーソナルコンピュータと類似の様式で、ユーザーまたは別の装置からの入力を受け入れること及び／またはユーザーまたは別の装置へ出力を提供することができる。従って、本発明の実施形態は多目的コンピュータの見地から記載されているが、他の構成を用いることができ、多目的コンピュータの使用は代表的なものに過ぎないことが認識されるべきである。
いくつかの実施形態において、自動操作は１又は複数のリキッドハンドラー及び関連するソフトウェアの使用を含む。いくつかの市販の液体取扱いシステムを利用して、これらの過程の自動操作を行うことができる（例えば、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社、Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社、Ｔｅｃａｎ社、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社、Ａｐｒｉｃｏｔ Ｄｅｓｉｇｎ社、Ｖｅｌｏｃｉｔｙ １１社を例として参照されたい。）。いくつかの実施形態において、自動化されるステップとしては、断片化、末端修復、Ａ−テーリング（アデニンオーバーハングの付加）、アダプター連結、ＰＣＲ増幅、試料の定量（例えば、ＤＮＡの量及び／または純度）、並びに配列決定の１又は複数が挙げられる。いくつかの実施形態において、増幅されたポリヌクレオチドの固体担体に接続されたオリゴヌクレオチドに対するハイブリダイゼーション、鋳型としての増幅されたポリヌクレオチドに沿った伸長、及び／または架橋増幅が自動化される（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ社のｃＢｏｔの使用により）。架橋増幅を行うための装置の非限定的な例がＷＯ２００８００２５０２に記載される。いくつかの実施形態において、配列決定が自動化される。多種多様な自動配列決定機が市販され、それらとしてはＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（ＳＯＬｉＤプラットフォーム、及びｐＨに基づく検知）、Ｒｏｃｈｅ社（４５４プラットフォーム）、Ｉｌｌｕｍｉｎａ社（例えば、Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ、ＨｉＳｅｑ、またはＭｉＳｅｑシステムなどのフローセルに基づくシステム）が挙げられる。２、３、４、５、またはそれを超える自動装置間（例えば、１又は複数のリキッドハンドラー、架橋増幅装置、及び配列決定装置間）の移動は、手動または自動とすることができる。いくつかの実施形態において、本発明の方法における１又は複数のステップ（例えば、全てのステップまたは全ての自動化ステップ）は、約７２、４８、２４、２０、１８、１６、１４、１２、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１時間、若しくはそれより短い、またはそれらよりも少ない時間で完了する。いくつかの実施形態において、試料の受け入れ、ＤＮＡ抽出、断片化、アダプター連結、増幅、または架橋増幅から配列決定データの提供までの時間は、約７２、４８、２４、２０、１８、１６、１４、１２、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１時間、若しくはそれより短い、またはそれらよりも少ない時間である。
アダプターの付加、第１のプライマーの伸長、一対のプライマーを用いる増幅、標的ポリヌクレオチドの架橋増幅、及び配列決定を含む過程の実施形態の例が図１２に図解される。更なる標的ポリヌクレオチドの増幅及び配列決定のための方法及び組成物がＵＳ２０１４００２４５３６及びＷＯ２０１４０１５８４Ａ２に記載され、これらの両方の全体が参照により組み込まれる。
Ｖ．プローブ設計
本開示のシステム及び方法は、概括的には、本明細書において「プローブセット」として知られる、少なくとも２のプローブすなわちハイブリダイゼーション配列のセットの使用を提供する。プローブは、ポリヌクレオチド配列の遺伝子座の少なくとも２の相補的な領域に対して選択的にアニールまたはハイブリダイズする配列を含有するように設計される。一般的に、プローブセットの複数のプローブは同じ、すなわち同一のポリヌクレオチド鎖に対してアニールするように設計される。いくつかの場合において、２を超えるプローブを用いてもよい。本開示において、２のプローブが用いられる場合、プローブは「第１のプローブ」及び「第２のプローブ」と記載される。一般的に、プローブは、試料ポリヌクレオチドに対するハイブリダイゼーションの前には、別個の、非連続のオリゴヌクレオチドとして存在していてもよい。他の場合には、試料ポリヌクレオチドに対するハイブリダイゼーションの前の分子反転プローブ（ＭＩＰ）または錠型プローブに見られるように、１または複数のプローブがリンカー配列によって繋がれていてもよい。一般的に、プローブは一本鎖のポリヌクレオチド分子を含む。いくつかの場合において、プローブはＤＮＡを含む。一般的に、プローブは人工的な配列、または試料ポリヌクレオチド中には元々存在しないヌクレオチド種を含む配列である。
２のハイブリダイゼーション配列のプローブセットの場合、第１及び第２のプローブは一般的に、試験される遺伝子座または領域に対応するポリヌクレオチド配列中の標的エレメントに対してハイブリダイズまたはアニールするように設計される。いくつかの場合において、上記標的エレメントは、遺伝子座配列のｇＤＮＡ中に見られるような配列であってよい。いくつかの場合において、上記標的エレメントは、ｍＲＮＡ転写物またはｃＤＮＡ配列中に見られる配列であってよい。いくつかの場合において、上記標的エレメントは、アダプター配列であってよく、該アダプター配列はポリヌクレオチドの末端に接続されて（すなわち、連結されて、接合されて等々）いてもよく、当該ポリヌクレオチドの配列中に元々は存在しないものであってよい。アダプター配列は、ハイブリダイゼーションに先立つステップにおいて、本明細書記載の本技術分野で公知の任意且つ適宜の方法を用いて、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの断片に接続されてもよい。一例において、第１または第２のプローブは、遺伝子座に対応するポリヌクレオチドに接続された１または複数のアダプター配列に対してアニールまたはハイブリダイズするように設計されてもよい。
いくつかの場合において、１または複数のプローブは、遺伝子座中の配列に対して、約１０％〜３０％、３０％〜６０％、６０％〜９０％、または９０％〜９９．９９％相補的であってよい。いくつかの場合において、１または複数のプローブは、遺伝子座中の配列に対して、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、９９．９％、９９．９９％相補的であってよい。いくつかの場合において、プローブは、遺伝子座中の配列に対して、最大で約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、９９．９％、９９．９９％相補的であってよい。
いくつかの場合において、１または複数のプローブは、一塩基多型（ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）（ＳＮＰ）を選択的に検知するように設計されてもよい。いくつかの場合において、２の異なるプローブセット（本明細書記載のように、各プローブセットは異なるバーコードが割り当てられる）が、同じ遺伝子座中の同一の領域に用いられてもよい。上記２のプローブセットは、１の異型ＳＮＰ配列を含む一方のプローブセットが上記遺伝子座に対してハイブリダイズすることができる一方で、別な異型ＳＮＰ配列を含有する他方のプローブセットは当該遺伝子座に対してハイブリダイズすることができないように、遺伝座中の想定されるＳＮＰを検知するように設計されてもよい。上記多型は、上記ＳＮＰを有するプローブセット中の特定のプローブがうまくハイブリダイズすること、及びそれぞれのプローブセットに割り当てられたバーコード配列の計数を通じて検知することができる。いくつかの場合において、ＳＮＰの検知のための１または複数の可変の塩基は、第１のプローブ、第２のプローブまたは両方のプローブの３’末端に位置することができる。いくつかの場合において、ＳＮＰの検知のための１または複数の可変の塩基は、第１のプローブと第２のプローブとの間の意図するライゲーション点の近傍に位置することができる。
更に、本開示のシステム及び方法は、全ゲノム全体にわたる最適なプローブの選択を可能にし得る任意且つ適宜のアルゴリズムを提供する。アルゴリズムは、遺伝子座内での最適な配列を推奨すること、該プローブ配列の長さを推奨すること、並びにハイブリダイゼーションに関する一般的な最適パラメータ（すなわち、温度、塩濃度等々）を提供することなどの、プローブの設計またはプローブの選択を支援する。いくつかの場合において、アルゴリズムは、染色体中の特定の遺伝子座、または複数の染色体中の１若しくは複数の着目する遺伝子座を選択するために用いてもよい。
いくつかの場合において、第１及び第２のプローブは、長さにおいて、約５〜５０、５０〜１００、１００〜２００、２００〜３００、３００〜４００、または４００〜５００塩基対であってよい。いくつかの場合において、第１及び第２のプローブは、長さにおいて、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、３００、４００または５００塩基対であってよい。いくつかの場合において、第１及び第２のプローブは、長さにおいて、最大で約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、３００、４００または５００塩基対であってよい。
更に、第１及び第２のプローブは、ポリヌクレオチド配列の同一の連鎖上の隣接する部位を結合するように設計されてもよい。いくつかの場合において、ギャップ、すなわちプローブがそこにアニールまたはハイブリダイズしていない一本鎖の試料配列の領域が、第１及び第２のプローブの間に存在する。いくつかの場合において、第１及び第２のプローブが、本明細書に記載のように直接連結され得るように、第１及び第２のプローブの結合部位の間にギャップが存在しない。いくつかの場合において、上記ギャップは、長さにおいて、約１〜２５ｂｐ、２５〜５０ｂｐ、５０〜１００ｂｐ、１００〜５００ｂｐ、５００〜１Ｋｂ、ｌＫｂ〜２Ｋｂ、２Ｋｂ〜３Ｋｂ、３Ｋｂ〜４Ｋｂ、または４Ｋｂ〜５Ｋｂであってよい。いくつかの場合において、上記ギャップは、長さにおいて、少なくとも約１ｂｐ、２ｂｐ、３ｂｐ、４ｂｐ、５ｂｐ、１０ｂｐ、１５ｂｐ、２０ｂｐ、２５ｂｐ、３０ｂｐ、３５ｂｐ、４０ｂｐ、４５ｂｐ、５０ｂｐ、７５ｂｐ、１００ｂｐ、１２５ｂｐ、１５０ｂｐ、１７５ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１Ｋｂ、２Ｋｂ、３Ｋｂ、４Ｋｂ、５Ｋｂ、または１０Ｋｂであってよい。いくつかの場合において、上記ギャップは、長さにおいて、最大で約１ｂｐ、２ｂｐ、３ｂｐ、４ｂｐ、５ｂｐ、１０ｂｐ、１５ｂｐ、２０ｂｐ、２５ｂｐ、３０ｂｐ、３５ｂｐ、４０ｂｐ、４５ｂｐ、５０ｂｐ、７５ｂｐ、１００ｂｐ、１２５ｂｐ、１５０ｂｐ、１７５ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、または１０ｋｂであってよい。
一般的に、用いられるプローブセットの数は、試料中の試験される遺伝子座の数によって特定することができる。いくつかの場合において、約２〜１００、１００〜５００、５００〜１０００、１０００〜２０００、２０００〜３０００、３０００〜４０００、４０００〜５０００、５０００〜６０００、６０００〜７０００、７０００〜８０００、８０００〜９０００、または９０００〜１００００のプローブセットを用いることができる。いくつかの場合において、少なくとも約２、３、４、５，６，７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、または１００００のプローブセットを用いることができる。いくつかの場合において、最大で、約２、３、４、５，６，７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、または１００００のプローブセットを用いることができる。
更に、いくつかの場合において、約２〜１００、１００〜５００、５００〜１０００、１０００〜２０００、２０００〜３０００、３０００〜４０００、４０００〜５０００、５０００〜６０００、６０００〜７０００、７０００〜８０００、８０００〜９０００、または９０００〜１００００のプローブを、単一の遺伝子座を試験するために用いることができる。いくつかの場合において、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、または１００００のプローブを、単一の遺伝子座を試験するために用いることができる。いくつかの場合において、最大で、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、または１００００のプローブを、単一の遺伝子座を試験するために用いることができる。
ＶＩ．着目する遺伝子座及び遺伝子変異
本開示のシステム及び方法は、ゲノム中の１または複数の遺伝子座の試験を提供する。一般的に、遺伝子座は試料中の任意の着目する配列を含んでもよい。いくつかの場合において、遺伝子座は「着目する遺伝子座」と記載してもよく、これは一般的に、本明細書で更に述べるように、遺伝子変異を有することが想定される遺伝子座をいう。本開示のいくつかの態様において、少なくとも１の着目する遺伝子座及び該着目する遺伝子座外の遺伝座が試験される。いくつかの場合において、遺伝子座または着目する遺伝子座は、試料中の任意且つ適宜の配列であってよい。遺伝子座または着目する遺伝子座としては、染色体、遺伝子、エキソン、イントロン、イントロン−エキソン境界、プロモーター、ターミネーター、高度に反復性の配列、ＬＴＲ、ＵＴＲ、サテライト配列、動原体反復配列、テロメア、非コード配列、コード配列、レギュレーター、プラスミド、転写因子結合部位、リボソーム結合部位、５’キャップ、ポリｄ（Ｔ）配列後成的配列、可動要素、トランスポゾンまたはそれらの組み合わせを挙げることができるが、それらに限定されない。いくつかの場合において、遺伝子座は細胞中の任意のポリヌクレオチド配列中に存在してもよい。ヒトなどのいくつかの場合において、遺伝子座は、ミトコンドリアｇＤＮＡ、１番染色体、２番染色体、３番染色体、４番染色体、５番染色体、６番染色体、７番染色体、８番染色体、９番染色体、１０番染色体、１１番染色体、１２番染色体、１３番染色体、１４番染色体、１５番染色体、１６番染色体、１７番染色体、１８番染色体、１９番染色体、２０番染色体、２１番染色体、２２番染色体、Ｘ染色体またはＹ染色体の全配列または部分的配列を含むことができる。
いくつかの場合において、約２〜１００、１００〜５００、５００〜１０００、１０００〜２０００、２０００〜３０００、３０００〜４０００、４０００〜５０００、５０００〜６０００、６０００〜７０００、７０００〜８０００、８０００〜９０００、または９０００〜１００００の遺伝子座を、試料中で試験することができる。いくつかの場合において、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、または１００００の遺伝子座を、試料中で試験することができる。いくつかの場合において、最大で、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、または１００００の遺伝子座を、試料中で試験することができる。
いくつかの場合において、遺伝子座は、あるプローブの相対的な結合親和性に基づいて、または本明細書において更に述べるように、ある疾患との関連に基づいて、選択的に選ぶことができる。例えば、自閉症などの疾患と関連することが知られている多数の遺伝子座を選択し、試験することができる。いくつかの場合において、遺伝子座の試験は同時にまたは逐次的に行うことができる。いくつかの場合において、多数の疾患に関する多数の遺伝子座を選択し得る。１または複数の遺伝子座の試験を同時にまたは逐次的に行うことができる。例えば、自閉症に関連する遺伝子座及びトリソミー２１に関連する遺伝子座を同時に試験し得る。別な例において、コピー数多型を含む可能性のある２１番、１８番及び１３番などの特定の染色体に関して、１または複数の遺伝子座を選択してもよい。他の場合において、ゲノム全体にわたる配列を代表するように遺伝子座を選択してもよく、遺伝子座は１または複数の既知の疾患と関連しないものであってもよい。
更に、いくつかの場合において、遺伝子座内で、多型性配列を標的とするようにプローブを選択してもよい。いくつかの場合において、多型性配列はＳＮＰを含有してもよい。他の場合において、多型性配列はＳＮＰを含有しなくてもよい。いくつかの場合において、遺伝子座内で、非多型性配列を標的とするようにプローブを選択してもよい。
本開示のシステム及び方法は様々な種類の遺伝子変異の検知を提供し、該変異は遺伝子座または着目する遺伝子座中に存在してもしなくてもよい。本明細書において、「遺伝子変異」、「遺伝子異常」及び「染色体異常」は互換的に用いられる。いくつかの場合において、遺伝子変異はＣＮＶであってもよい。他の場合において、遺伝子変異はヘテロ接合性消失（ｌｏｓｓ ｏｆ ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙ）（ＬＯＨ）であってもよい。一般的に、遺伝子変異としては、再配列、サブテロメア再配列、異数性、部分的異数性、倍数性、染色体不安定性、変異、希な変異、コピー数多型、塩基転換、転座、反転、インデル、欠失、染色体構造変異、遺伝子融合、染色体融合、遺伝子トランケーション、遺伝子増幅、遺伝子重複、染色体損傷、ＤＮＡ損傷、核酸化学修飾における異常変化、後成的パターンの異常変化、核酸メチル化における異常変化、ウィルス挿入、寄生性ＤＮＡ挿入、縦列反復における変異、感染及びガンを挙げることができるが、これらに限定されない。
ＶＩＩ．バーコード及び追加の配列
いくつかの例において、プローブセットにプローブすなわちハイブリダイゼーション配列との組み合わせで追加の配列が存在する。一般的に、バーコード配列、アダプター配列、ユニバーサルプライマー配列及び他のリンカー配列が、第１及び／または第２のプローブに結合してもよい。
ＭＩＰまたは錠型プローブによって供給されるなどの、第１及び第２のプローブが結合される場合、バーコード配列、アダプター配列、ユニバーサルプライマー配列及び他のリンカー配列は、２のプローブを結合する連続したループ化領域中に存在し得る。プローブが直鎖のままである他の場合において、追加の配列はいずれかのプローブの５’領域の非相補的領域中に存在し得る。
Ａ．分子状バーコード化プローブセット
本開示のシステム及び方法はまた、プローブ配列に識別子を割り振ることも可能にする。識別子の割り振りは、ポリヌクレオチド試料連鎖に結合する特定のプローブ配列のその後の識別を可能にするためのタグ付け、追跡、またはバーコード化を可能にすることができる。識別子の割り振りはまた、識別子の定量または計数手段及びその後の試料中の遺伝子座の計数手段も提供し得る。
いくつかの場合において、識別子はオリゴヌクレオチドバーコード配列であってよい。いくつかの例において、プローブセットに結合したバーコード配列のアイデンティティーは、ハイブリダイゼーション及び下流の分析への当該プローブセットの使用の前に知ることができる。いくつかの場合において、下流のステップにおけるバーコード配列のコピー数の計数が、試料中の結合したプローブのコピー数を表わし得るように、バーコード配列がプローブ配列を表してもよい。更に、結合したプローブのコピー数は、遺伝子座または着目する遺伝子座中に存在する配列のコピー数を表わすことができる。いくつかの場合において、バーコードのコピー数は、プローブのコピー数及びそれに続いて着目する遺伝子座中の配列のコピー数に直接比例し得る。いくつかの場合において、バーコードのコピー数は、プローブのコピー数または着目する遺伝子座中の配列のコピー数に等しくなり得る。従って、バーコード、プローブ、またはそれらの組み合わせの計数が、遺伝子座中の特定の配列のコピー数を特定するために用いられてもよい。
バーコード配列の識別及び計数が、本明細書に更に述べられるような種々の技法を用いて行われてもよい。例えば、本明細書に更に述べられるように、配列決定を用いてバーコードを計数してもよい。
更に、いくつかの場合において、完全に固有のバーコード配列が個々のプローブセットに割り振られてもよい。この場合、プローブセット中の１または複数のプローブに固有のバーコード配列を接続してもよい。いくつかの場合において、１のプローブセットが１の遺伝子座を試験するために設計されてもよい。固有のバーコード配列の検知及び計数は、対応する遺伝子座のアイデンティティー及び存在量を提供する。
いくつかの場合において、固有のバーコードは様々な配列の組み合わせから形成することができる。いくつかの場合において、非固有のバーコードに、プローブ配列、プローブ配列の一部またはプローブに結合した追加の配列などの追加の配列を結合して、固有のバーコード配列を形成してもよい。例えば、プローブ配列が単独または非固有のバーコード配列との組み合わせで用いられる場合、プローブ配列の開始（始まり）部分及び終点（終わり）部分に固有の配列を形成することができる。配列を組み合わせることにより（すなわち、プローブ配列及び非固有のバーコード配列）、固有の識別配列を提供することができる。例えば、いくつかの場合において、バーコードは一般構造５’ＸＸＸＸＹＹＹＹ、但しＸは、それらに限定されないが、第１及び／または第２のプローブ／ハイブリダイゼーション配列、アダプター配列、ユニバーサルプライミング配列、またはリンカー配列を始めとする配列より選択される１の配列に対して相補的な、可変長さの領域である、によって設計することができる。Ｙは可変の長さの非固有のバーコード配列より選択することができる。いくつかの場合において、Ｙ配列は試料中の全てのプローブセットに対して共通であってもよい。他の場合において、Ｙ配列は、染色体全体、または特定の疾患若しく遺伝子型に関連した遺伝子座などの、固有の１の遺伝子座または複数の遺伝子座であってもよい。いくつかの場合において、ＸまたはＹのいずれかとして規定されるヌクレオチドの長さすなわち数は、約１〜２０、２０〜５０、５０〜７５、７５〜１００、１００〜１５０、１５０〜２００、２００〜３００、３００〜４００、または４００〜５００のヌクレオチドであってよい。いくつかの場合において、ＸまたはＹのいずれかとして規定されるヌクレオチドの長さすなわち数は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、３００、４００、または５００のヌクレオチドであってよい。いくつかの場合において、ＸまたはＹのいずれかとして規定されるヌクレオチドの長さすなわち数は、最大で約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、３００、４００、または５００のヌクレオチドであってよい。
別な構成において、バーコードは少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の配列の組み合わせによって形成されてもよい。バーコードは最大で約１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の非固有の配列の組み合わせによって形成されてもよい。
本開示のシステム及び方法の別な構成において、非固有のバーコード配列が、１または複数のプローブセットに割り振られてもよい。例えば、同一のバーコードが、同じ遺伝子座に対して相補的であるプローブに割り振られてもよい。いくつかの場合において、上記遺伝子座は染色体領域であってもよい。他の場合において、遺伝子座は全体の染色体であってよく、ここで、同じ染色体の多数の領域に対してハイブリダイズするように設計されたプローブセットには、同一のバーコード配列が割り振られてもよい。この例において、バーコード配列は、特定の染色体に関しては固有であるが、同じ染色体上の遺伝子座に対しては同一であってよい。例えば、一つの特定のバーコード（「Ａ」）が、例えば２１番染色体などの着目する遺伝子座に対して設計されたプローブまたはプローブセットに割り振られる一方で、異なる配列（「Ｂ」）の別なバーコードが、別な着目する遺伝子座、１８番染色体に対して設計されたプローブに割り振られてもよい。更に、基準を提供するために、第３のバーコード（「Ｃ」）が、２１番染色体または２番染色体のいずれかの外の遺伝子座に割り振られてもよい。バーコードＡ、Ｂ及びＣの計数、及び計数されたＡ〜Ｃ及びＢ〜Ｃのリードの比較を、２１番染色体または１８番染色体のいずれかの全体としてのコピー数多型などの遺伝子変異を検知するために用いることができる。
加えて、共通のバーコード配列が、疾患または病態に関連する１または複数の遺伝子座に割り振られもよい。例えば、一つのバーコード配列（「Ｘ」）が、嚢胞性線維症に関連する１または複数の遺伝子座に対して相補性の１または複数のプローブに割り振られる一方で、別なバーコード（「Ｙ」）が、ダウン症候群に関連する遺伝子座に対して設計されたプローブに割り振られてもよい。第３のバーコード（「Ｚ」）が、いずれの疾患とも関連しない遺伝子座を検知するために設計されたプローブに割り振られてもよい。バーコードＸ、Ｙ及びＺの計数、及び計数されたＸ〜Ｚ及びＹ〜Ｚのリードの比較を、単一のアッセイにおいて、いずれかの疾患の遺伝子変異を検知するために用いることができる。いくつかの場合において、特定の疾患に関連する遺伝子座は、多数の染色体にわたって存在し得る。この様式において、１または複数の疾患に関連する１または複数の遺伝子座を同時に試験することができる。あるいは、１または複数の疾患に関連する１または複数の遺伝子座を逐次的に試験することができる。
いくつかの場合において、上記バーコード配列は、約１〜１０、１０〜２０、２０〜５０、５０〜１００、１００〜５００、または５００〜１０００の塩基対であってよい。いくつかの場合において、上記バーコード配列は、各バーコードが少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、５０、１００、５００、または１０００の塩基対となるような、様々な長さであってよい。他の場合において、上記バーコード配列は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、５０、１００、５００、または１０００未満の塩基対を含んでもよい。
Ｂ．プローブセットへのバーコードの割り振り
多くの場合、本明細書記載のように、プローブセットに割り振られる識別子は、プローブセット中の第１または第２のプローブと連続したオリゴヌクレオチドバーコード配列である。但し、いくつかの場合において、異なる識別子を用いることができる。バーコード配列を有するものとしての識別子は、固有又は非固有であってよい。例えば、いくつかの場合において、上記固有の識別子はハイブリダイゼーションプローブであってもよい。一例において、ハイブリダイゼーションプローブはオリゴヌクレオチド配列及び蛍光エレメント（すなわち、ナノ粒子、ナノプローブ、量子ドット等）などの追加の成分を含んでもよい。いくつかの場合において、１または複数の蛍光エレメントが同様にバーコードとして記載され得る。例えば、異なる波長すなわち色の蛍光エレメントが固有または非固有のパターンまたは配列において配置されてもよい。他の場合において、識別子は色素であり、この場合、接続は色素の分析物分子へのインターカレーション（ＤＮＡ若しくはＲＮＡへのインターカレーションなど）または当該色素で標識されたプローブへの結合を含むことができる。更に別な場合において、識別子は核酸オリゴヌクレオチドであってもよく、この場合、ポリヌクレオチド配列への接続はオリゴヌクレオチドと当該配列との間のライゲーション反応またはＰＣＲによる組込みを含んでもよい。他の場合において、上記反応は、金属同位体の付加を含んでもよく、ここで、第１または第２のプローブのいずれかが該同位体で標識される。
識別子がバーコード配列を含む場合、本開示のシステム及び方法は、バーコードのプローブへの割り振りに必要な任意且つ適宜の薬剤を提供する。いくつかの場合において、ライゲーション反応を利用してもよく、ライゲーション反応においては、それらに限定されないが、リガーゼ酵素、プローブ、緩衝液、アダプターオリゴヌクレオチド、及び複数の識別子ＤＮＡバーコードを始めとする薬剤を、プローブセットを生起させるために用いてもよい。濃縮法の場合には、それらに限定されないが、複数のＰＣＲプライマー、プローブ、オリゴヌクレオチド含有バーコード配列、ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＴＰ、及び緩衝液等を始めとする薬剤をプローブセットの調製に用いてもよい。
ＶＩＩＩ．ハイブリダイゼーション及びライゲーション
一般的に、プローブセットを試料ポリヌクレオチドに対してハイブリダイズさせるために、任意且つ適宜の条件を用いることができる。いくつかの例において、第１及び第２のプローブは逐次的にアニールする。他の例において、第１及び第２のプローブは同時にアニールする。いくつかの場合において、プローブはハイブリダイゼーション反応混合物に逐次的に添加されてもよい。いくつかの場合において、プローブは、複数のプローブが連結されたＭＩＰプローブまたは錠型プローブを用いるなど、ハイブリダイゼーション反応混合物に同時に添加されてもよい。第１及び第２のプローブを結合すると、特にＭＩＰ構成または錠型構成で用いられる場合に、一般的に結合の選択性が高まる。一般的に、本開示においてこの構成を用いると、プローブの非特異的結合が低減される。塩濃度、温度、ポリヌクレオチド濃度、ｐＨ等々などのハイブリダイゼーション条件を変更することもまた、試料ＤＮＡに対するプローブの非特異的な結合を低減するために用いることができる。
一般的に、ハイブリダイゼーションの後に、第１及び第２のプローブが連結されてライゲーション生成物を形成する。一般的に、ライゲーション生成物は人工的な配列、または試料ポリヌクレオチドには元々存在しないヌクレオチド種を含む配列を含む。
いくつかの例において、プローブが試料ポリヌクレオチドに対してハイブリダイズする際に、プローブの間にギャップが存在しないように、プローブを、互いに直接隣接する部位にハイブリダイズするように設計してもよい。この場合、リガーゼの添加は、第１及び第２のプローブ間の連続したライゲーション生成物を十分に形成させる。２の非連続なプローブを伴う場合には、ライゲーション生成物は連続する直鎖ポリヌクレオチドである。ＭＩＰプローブまたは錠型プローブを伴う場合には、本技術分野において公知であるように、第１及び第２のプローブのライゲーションにより、完全に環状の連続する配列が創出される。
他の例において、第１及び第２のプローブは直接隣接しなくてもよく、その場合は本明細書記載のように、プローブ間にギャップが存在する。いくつかの場合において、ライゲーションは、本明細書記載の、ポリメラーゼ及び／または架橋オリゴヌクレオチドを用いるプライマー伸長ステップなどの、更なるステップによって進行させても、または該ステップを伴ってもよい。
Ａ．ポリメラーゼによる伸長ステップ
いくつかの構成において、第１及び第２のプローブは、更なるステップを必要とするように位置してもよい。第１及び第２のプローブが互いに直接隣接していないいくつかの例においては、伸長ステップが必要となる場合がある。いくつかの場合において、ポリメラーゼ及びｄＮＴＰを、相補的な配列を重合して２のプローブ間のギャップを埋めるために用いてもよく、その場合には、第１のプローブの３’末端からの配列は上記ギャップを横断して伸長する。いくつかの例において、この構成が有用となる場合があり、そこでは、第１及び第２のプローブに対する最適なアニーリング部位は互いに直接隣接しなくてもよい。いくつかの場合において、伸長ステップもまた有用となる場合があり、そこでは、結合パートナーが、重合した相補的な配列中のポリヌクレオチド生成物中に組み込まれ得る。例えば、ビオチンなどの結合パートナーと接合したｄＮＴＰを用い、ビオチン化ｄＮＴＰがライゲーション生成物中に組み込まれるようにしてもよい。これは、後続のステップにおける、ストレプトアビジンなどの更なる結合パートナーを用いる生成物のアフィニティー精製に対して有用となる場合がある。アフィニティー精製は、本明細書記載の、連続するライゲーション生成物の試料ＤＮＡ若しくはｇＤＮＡからの分離またはあるライゲーション生成物の濃縮などの種々のステップにおいて有用となり得る。
Ｂ．架橋オリゴ
いくつかの構成において、架橋オリゴは、第１及び第２のプローブとの組み合わせで用いることができる。一般的に、架橋オリゴは、遺伝子座または着目する遺伝子座中の第１または第２のプローブのいずれかにアニールする領域の間に存在する配列に結合することができるポリヌクレオチド配列を含み得る。いくつかの場合において、１０の架橋オリゴが用いられ得る。いくつかの場合において、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の架橋オリゴが用いられる。いくつかの場合において、最大で約１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の架橋オリゴが用いられる。１または複数の架橋オリゴは、互いに及び／または第１若しくは第２のプローブのいずれかの添加と逐次的または同時に添加することができる。
架橋オリゴは、着目する遺伝子座中の第１または第２のプローブのいずれかにアニールする領域の間に存在する任意の配列に対して相補的であってもよい。いくつかの場合において、架橋オリゴは、Ａ／ＴまたはＧ／Ｃ ＳＮＰを含有する領域にアニールしてもよい。他の場合において、架橋オリゴは、着目する遺伝子座中の配列に対して１００％相補的であってもよい。いくつかの場合において、架橋オリゴは、第１または第２のプローブのいずれかにアニールする領域の間に存在する配列に対して、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％または９９．９９％相補的であってよい。いくつかの場合において、架橋オリゴは、第１または第２のプローブのいずれかにアニールする領域の間に存在する配列に対して、最大で約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％または９９．９９％相補的であってよい。
いくつかの場合において、架橋オリゴは、長さにおいて、約５〜５０、５０〜１００、１００〜２００、２００〜３００、３００〜４００、または４００〜５００塩基対であってよい。いくつかの場合において、架橋オリゴは、長さにおいて、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、３００、４００または５００塩基対であってよい。いくつかの場合において、架橋オリゴは、長さにおいて、最大で約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、３００、４００または５００塩基対であってよい。
いくつかの場合において、架橋オリゴはまた、更なる配列も含有し得る。いくつかの場合において、架橋オリゴは、縮重プライマーであってもよく、または縮重プライミング配列を含有してもよい。いくつかの場合において、架橋オリゴは、ユニバーサルプライミング配列を含んでもよい。
いくつかの場合において、架橋オリゴヌクレオチドは、着目する遺伝子座内の第１または第２のプローブのいずれかと任意且つ適宜の間隔をおいた領域にアニールすることができる。いくつかの場合において、当該オリゴと第１または第２のプローブのいずれかとの間に空間がないように、架橋オリゴは、第１または第２のプローブのいずれかに直接隣接してもよい。いくつかの場合において、架橋オリゴと第１または第２のプローブのいずれかとの間に存在する空間は、長さにおいて、少なくとも約１ｂｐ、２ｂｐ、３ｂｐ、４ｂｐ、５ｂｐ、１０ｂｐ、１５ｂｐ、２０ｂｐ、２５ｂｐ、３０ｂｐ、３５ｂｐ、４０ｂｐ、４５ｂｐ、５０ｂｐ、７５ｂｐ、１００ｂｐ、１２５ｂｐ、１５０ｂｐ、１７５ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１Ｋｂ、２Ｋｂ、３Ｋｂ、４Ｋｂ、５Ｋｂ、または１０Ｋｂであってよい。いくつかの場合において、架橋オリゴと第１または第２のプローブのいずれかとの間に存在する空間は、長さにおいて、最大で約１ｂｐ、２ｂｐ、３ｂｐ、４ｂｐ、５ｂｐ、１０ｂｐ、１５ｂｐ、２０ｂｐ、２５ｂｐ、３０ｂｐ、３５ｂｐ、４０ｂｐ、４５ｂｐ、５０ｂｐ、７５ｂｐ、１００ｂｐ、１２５ｂｐ、１５０ｂｐ、１７５ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１Ｋｂ、２Ｋｂ、３Ｋｂ、４Ｋｂ、５Ｋｂ、または１０Ｋｂであってよい。
非結合架橋オリゴを除去するための１又は複数のステップを用いてもよい。いくつかの場合において、このステップは洗浄ステップを含んでもよい。他の場合において、このステップはアフィニティー精製ステップまたはそれらの組み合わせを含んでもよい。
連続したライゲーション生成物は任意且つ適宜の方法を用いて形成することができる。架橋オリゴと第１または第２のプローブのいずれかとの間に空間がない一構成において、結合したオリゴヌクレオチドは一つのステップで連結することができる。本開示のシステム及び方法の別な構成において、架橋オリゴは、第１または第２のプローブのいずれにも直接隣接しない相補的な領域にアニールしてもよい。ある場合において、ポリメラーゼ及びｄＮＴＰを用いて架橋オリゴ、第１若しくは第２のプローブまたはそれらの組み合わせから配列を伸長させるように、伸長ステップが行われてもよい。いくつかの場合において、ポリメラーゼ及びｄＮＴＰを、第１のプローブと架橋オリゴとの間、架橋オリゴと第２のプローブとの間またはそれらの組み合わせのギャップを埋めるために用いてもよい。伸長に続いて、結合したオリゴは連結されて、遺伝子座または着目する遺伝子座を架橋する、連続するポリヌクレオチド生成物を形成してもよい。
加えて、プライマーの伸長におけるポリメラーゼの使用及び第１のプローブ、第２のプローブまたは１若しくは複数の架橋オリゴのハイブリダイゼーションを一つの反応混合物にまとめることができる。他の場合において、１又は複数のステップを逐次的に行ってもよい。
ＩＸ．結合したプローブの単離
ライゲーション後に、結合したプローブを非結合のプローブから分離することが一般的に好ましい。一構成において、結合したプローブは、結合パートナーの組み合わせを用いてアフィニティー精製されてもよい。一例において、プローブ、プローブに結合した配列（すなわち架橋オリゴ）、プライマー伸長生成物、または試料ポリヌクレオチド鎖に連結したアダプター配列は、ビオチンなどの結合パートナーを含有してもよい。次に、該結合パートナーは、アフィニティー精製ステップにおいて、ストレプトアビジンなどの更なる結合パートナーのためのベイトとして用いることができる。いくつかの場合において、結合したプローブが非結合プローブからアフィニティー精製されてもよい。他の場合において、結合パートナー及び結合したプローブを含む試料ポリヌクレオチド鎖が、非結合プローブからアフィニティー精製されてもよい。
一般的に、結合したプローブを捕捉するための任意の化学的手段が好適であり得る。いくつかの場合において、捕捉はビオチン及びストレプトアビジンまたはストレプトアビジン誘導体を含む方法によって行うことができる。例えば、本開示の一実施形態は、ビオチン化ヌクレオチドがプライマー伸長ステップまたは後続の増幅ステップの間に組み込まれ得るポリヌクレオチドの捕捉を提供する。いくつかの場合において、ヌクレオチド及びビオチン化ヌクレオチドの混合物であって、少なくとも１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％ビオチン化ヌクレオチドであってよい上記混合物が用いられてもよい。他の場合において、上記混合物は最大で１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％ビオチン化ヌクレオチドであってよい。
本開示のシステム及び方法の別な構成において、非結合プローブがエキソヌクレアーゼによって分解されてもよい。例えば、ライゲーション後に、ＭＩＰプローブまたは錠型プローブが完全に環状になる一方で、非結合プローブは連続したものにならず、直鎖状のまま残る。エキソヌクレアーゼＩ、ＩＩ、またはＩＩＩなどのエキソヌクレアーゼの添加が用いられ、非結合ポリヌクレオチドプローブなどの直鎖状ポリヌクレオチドを選択的に分解することができる一方で、完全に環状化されたプローブは影響を受けないまま残る。エキソヌクレアーゼ処理後に、結合した環状プローブは試料ポリヌクレオチドより溶離することができる。いくつかの場合において、溶離は、塩を用いるなどの任意選択の洗浄ステップによって行うことができる。他の場合において、結合されたプローブは、本技術分野で公知のように、熱的手段（すなわち、反応混合物の温度を高める）によって試料ポリヌクレオチド鎖からメルトオフ（ｍｅｌｔ ｏｆｆ）することができる。
Ｘ．配列の識別及び計数
本開示の方法は、概括的にはライゲーション生成物の単離並びに該ライゲーション生成物中の１又は複数の配列の識別及び計数を提供する。いくつかの場合において、配列の識別及び計数はバーコード配列が関与する。他の場合において、上記配列の識別及び計数は、ユニバーサルアダプター配列、ユニバーサルプライミング配列、リンカー配列、プローブ配列すなわちハイブリダイゼーション配列の一部又は、いくつかの場合、それらの配列の組み合わせなどの他の配列が関与する。
概括的には本開示の方法は、１又は複数の選択的増幅ステップを提供し、ここで配列特異的プライマーを、標的分子（すなわちライゲーション生成物またはプローブ）中の特定の配列を増幅すなわち濃縮するために用いてもよい。いくつかの場合において、増幅は詳細には、バーコード特異的プライマーを用いて、バーコード配列を対象とする。いくつかの場合において、バーコードは、バーコード配列に隣接するように設計されたユニバーサルプライマーを用いて増幅されてもよい。
増幅後に、配列決定、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）及び他の本技術分野で公知の定量的方法などの方法を始めとする様々な方法を、配列を識別及び計数するために用いることができる。本開示の方法は、バーコードなどの、様々な選択的に増幅された配列の大規模並列配列決定に特に好適であり、該大規模並列配列決定においては、配列の識別及び計数の両方が行われる。
概括的には、本開示の方法及びシステムは、ＵＳ７，５３７，８９７のシステム及び方法を、分子をカウントするための分子状バーコードに利用してもよい。
Ａ．ライゲーション生成物の直接計数
本開示のいくつかの例において、ライゲーション生成物を直接計数する及び識別することが好適であり得る。いくつかの場合において、適宜の感度及び選択性を有する技法を用いることができる。いくつかの場合において、ライゲーション生成物の直接的な計数及び識別は、本明細書記載の、本技術分野で公知の方法を用いる直接的な配列決定を伴ってもよい。ライゲーション生成物の配列を、プローブ配列、バーコード、アダプター配列、ユニバーサルプライミング配列、リンカー配列またはそれらの組み合わせを識別するために用いることができる。配列はまた、配列リード数に基づいて計数することもできる。
いくつかの場合において、１又は複数の定量化可能なハイブリダイゼーションプローブが、種々の部位においてライゲーション生成物に結合してもよい。いくつかの場合において、上記プローブは、１又は複数のプローブすなわちハイブリダイゼーション配列、バーコード配列、アダプター配列、リンカー配列、またはそれらの組み合わせにアニールするように設計されてもよい。いくつかの場合において、上記プローブ配列は更に、定量することができ、試験試料中に存在するプローブ配列の数に相関する発蛍光団または蛍光シグナルに接続されてもよい。例えば、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ社ｎＣｏｕｎｔｅｒシステムなどの本技術分野におけるある製品を、ナノ粒子を含む一連の蛍光バーコードに接合されたＤＮＡハイブリダイゼーションプローブを含む系を用いて、プローブ数を計数するために用いてもよい。上記システムは、高い感度でプローブを計数するために、ナノ粒子バーコードを利用する。更に、他の場合において、ライゲーション生成物にハイブリダイズする更なるプローブが、本明細書記載の方法により直接配列決定され、配列決定リード数に基づいて計数されてもよい。
ライゲーション生成物の量が十分な量でないいくつかの場合において、鋳型として一本鎖のライゲーション生成物を用いて、選択的な増幅を行なうこともできる。プライマーは、プローブ配列、アダプター配列、バーコード、ユニバーサルプライミング部位またはそれらの組み合わせに対して設計されてもよい。増幅ストラテジー及びプライマーセット設計の方法論は本明細書に更に記載される。いくつかの場合において、一本鎖のライゲーション生成物から増幅されたＰＣＲ生成物は、直接的な配列決定または他の適宜の定量的方法を始めとする種々の技法を用いた識別及び計数に用いられてもよい。
Ｂ．ライゲーション生成物の第２の連鎖合成
二本鎖のライゲーション生成物を得ることが好ましいいくつかの場合において、後続の第２の連鎖の合成ステップは、図４に示すように行われてもよい。いくつかの場合において、単一のプライマー４２８を、一本鎖のライゲーション生成物に相補的な連鎖４２４を合成するために用いてもよい。この場合、単一のプライマーは、上記ライゲーション生成物上の部位にアニールしてもよく、該ライゲーション生成物はプローブ配列、バーコード配列、アダプター配列、ユニバーサルプライマー配列、リンカー配列またはそれらの組み合わせを含んでもよい。いくつかの場合において、相補的な連鎖をプライマーの３’末端から伸長させるためにポリメラーゼを用いてもよい。環状プローブ（すなわち、ＭＩＰプローブまたは錠型プローブ）を伴う例において、相補的な連鎖はプライマーの５’末端に連結して、環状の二本鎖のポリヌクレオチドを創生することができる。
更に、いくつかの例において、１又は複数のプライマーを用いてもよい。いくつかの例において、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のプライマーを第２の連鎖の合成に用いてもよい。いくつかの例において、最大で約１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のプライマーを第２の連鎖の合成に用いてもよい。多数のプライマーを伴う場合において、１又は複数のプライマー伸長生成物を連結して第２の連鎖を形成してもよい。
いくつかの場合において、１又は複数のプライマーはまた、更なる配列を含んでもよく、該配列は上記一本鎖のライゲーション生成物に対して相補的でなくともよい。これらの更なる配列としては、それらに限定されないが、配列決定装置尾部配列４２０、アダプター配列、またはバーコード配列を挙げることができ、後続の下流のステップに用いることができる。例えば、本開示のある方法において、配列決定装置特異的な尾部配列は、第２の連鎖の合成に用いられるプライマー中に組み込まれてもよい。合成後に、上記配列決定装置特異的な尾部配列は、二本鎖の分子中の一本鎖領域として存在し得る。この尾部配列は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ社により提供されるような、種々の配列決定プラットフォームに適合するように設計することができる。この例において、本技術分野で公知のように、上記尾部配列を、上記二本鎖の分子を配列決定用の固体担体上にハイブリダイズするまたは捕捉するために用いることができる。これらの方法は、複数の分子またはプローブセットが同時並行で処理及び配列決定される、複合的な応用に特に有用であり得る。
他の場合において、二本鎖の生成物は、本技術分野で公知であり、本開示の他所に記載の他の方法を用いて直接配列決定することができる。直接的な配列決定は、ライゲーション生成物中の配列を識別する及び本明細書記載の配列を計数するために行われる。
Ｃ．ライゲーション生成物の開裂
いくつかの場合において、第２の連鎖の合成の後に、更に、連続するライゲーション生成物を開裂させることが好ましい場合がある。ＭＩＰプローブを伴う場合、図６Ａに示す一構成は、一組のユニバーサルプライミング部位６１０及び６２０に隣接する第１のプローブ６００及び第２のプローブ６５０、並びにバーコード配列６６０を含むＭＩＰプローブを提供する。制限部位６９９がプローブ中に組み込まれてもよく、この場合該制限部位は２つのユニバーサルプライミング部位６１０及び６２０の間に置かれる。ライゲーション後に、第１のプローブ６００及び第２のプローブ６５０は、部位６９５において連結される。制限部位６９９における開裂の後、ユニバーサルプライミング部位は物理的に分離され、今度はバーコード配列及び連続となったプローブ、すなわちハイブリダイゼーション配列の両方に隣接する。この構成は、本明細書で更に述べられる多重の増幅または配列決定ストラテジーを提供する。
図６Ｂに示す、ＭＩＰプローブを伴うこれに代わる別な構成において、第１のプローブ６００及び第２のプローブ６５０は一組のユニバーサルプライミング部位６１０及び６２０に隣接し、該ユニバーサルプライミング部位はバーコード配列６６０に隣接する。制限開裂部位６９９はプローブ中に組み込まれてもよく、該制限開裂部位は、一方のユニバーサル増幅部位６２０と第２のプローブ配列６５０との間に置かれる。ライゲーション後に、第１のプローブ６００及び第２のプローブ６５０は部位６９５において連結される。制限部位６９９における開裂の後、バーコード配列に隣接するユニバーサルプライミング部位は残存し、制限開裂の後に、今度は連続するプローブすなわちハイブリダイゼーション配列に隣接して位置する。この構成は、本明細書で更に述べられる多重の増幅または配列決定ストラテジーを提供する。
Ｄ．ライゲーション生成物の選択的及びユニバーサルな増幅
ｉ．選択的プライマーセットの設計
概括的には、本開示の方法は増幅に関する様々なストラテジーを提供する。選択的増幅の場合、プライマーセットが様々な異なる様式で設計され得る。いくつかの場合において、図６Ａ、６Ｂ及び図７に示すように、プライマーはプローブ配列、アダプター配列、ユニバーサルプライミング部位、リンカー配列または任意のそれらの組み合わせにアニールするように設計することができる。異なる選択的増幅ストラテジーの例が例示目的で提供され、限定されない。例えば、ＭＩＰプローブが開裂して図６Ａに示すような構成を形成するいくつかの場合において、順方向プライマーは、プローブすなわちハイブリダイゼーション配列６８０に対して相補的であってよい。上記プライマーは連結された配列の一部、または第１若しくは第２のプローブのハイブリダイゼーション配列に対して相補的であってよい。このプライマーは、バーコード配列６９２またはユニバーサルプライミング部位６９５に対して相補的な逆方向プライマーとの組み合わせで用いられてもよい。図６Ｂに示すように、一方のハイブリダイゼーション配列または両方の配列の組み合わせに対して相補的なプローブ特異的なプライマーが、逆方向プライマー６８０として用いられてもよい。
図７に示すような、開裂していない環状のライゲーション生成物を伴う別な例において、選択的プライマーとしては、プローブ配列７９０及び７７０に対して相補的なプライマー７８０、または７２０若しくは７１０などのプローブ中の更なるリンカー配列に対して相補的なプライマー７００を挙げることができる。
いくつかの場合において、個々のプライマーは本明細書記載の種々の配列の１又は複数の部分にアニールするように設計することができる。例えばいくつかの場合において、プライマーは一般構造５’ＭＭＭＭＭＮＮＮＮＮ、但し、Ｍは、それらに限定されないが、第１及び／または第２のプローブ配列、アダプター配列、ユニバーサルプライミング配列、またはリンカー配列を始めとする配列に対して相補的な、可変の長さの領域であり、Ｎは同様の群由来の異なる配列より選択される、によって設計することができる。例えば図７において、ハイブリダイゼーション配列及びユニバーサル増幅配列に対して相補的な配列を含むプライマーが用いられてもよい、７６０。いくつかの例において、Ｍはプローブ配列に対して相補的な配列を含んでもよく、Ｎはバーコード配列に対して相補的な配列を含む。いくつかの例において、Ｍは第１のプローブ配列に対して相補的な配列を含んでもよく、Ｎは第２のプローブ配列に対して相補的な配列を含む。いくつかの例において、長さ、すなわちＭまたはＮのいずれかで規定されるヌクレオチドの数は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、３００、４００、または５００ヌクレオチドであってよい。いくつかの場合において、長さ、すなわちＭまたはＮのいずれかで規定されるヌクレオチドの数は、最大で約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、３００、４００、または５００ヌクレオチドであってよい。
ｉｉ．ユニバーサルプライマーの設計
本開示の方法のいくつかの構成において、ライゲーション生成物、または選択的増幅生成物は、着目する遺伝子座由来のハイブリダイゼーション配列を含んでもよくまたは含まなくてもよいが、ユニバーサルに増幅することができる。ユニバーサル増幅は一般的に、１又は複数の領域を増幅するためのユニバーサルプライマーの使用として記載することができる。ユニバーサルプライマーは１又は複数のプローブに共通のプライミング部位である。ユニバーサル増幅生成物は、１又は複数の選択的増幅ステップの前または後に実施することができる。いくつかの場合において、ユニバーサル増幅は、ライゲーション生成物中のユニバーサルプライミング配列部位に対して相補的なユニバーサルプライマーを用いて実施することができる。いくつかの場合において、ユニバーサル増幅はバーコード配列に対して相補的なプライマーを含んでもよい。他の場合において、ユニバーサルプライミング配列は、第２の連鎖の合成、または１若しくは複数の選択的増幅ステップの間に、ポリヌクレオチドに付加されてもよく（すなわち、選択的増幅配列のためのプライマーが、選択的増幅過程の間に、ポリヌクレオチド領域に付加されてもよく）、あるいは、ユニバーサルプライミング部位を含むユニバーサルアダプター配列が、アダプター・ライゲーションなどの方法により、増幅されるべき配列（すなわち、プローブ配列、バーコード配列等々）に隣接する領域に付加されてもよい。
いくつかの構成において、選択的な一巡の増幅が行われる。いくつかの場合において、選択的増幅は、プローブ配列、アダプター配列、バーコード配列、リンカー配列またはそれらの任意の組み合わせの増幅を伴うことができる。選択的増幅の後に、本明細書記載のプライマーセット設計ストラテジーを用いて、選択的増幅生成物上でユニバーサル増幅を行うことができる。いくつかの場合において、ユニバーサル増幅を、ユニバーサルプライマーを用いてライゲーション生成物上で行ない、続いてユニバーサル増幅生成物の選択的増幅を行うことができる。
本開示のシステム及び方法の一構成において、ユニバーサル増幅は、１又は複数のプローブセットに共通のユニバーサル増幅部位から行うことができる。一般的に、全てのプローブセットはユニバーサルプライミング部位を含み得る。ユニバーサル増幅ステップは、この技法が増幅生成物の変動の低減を可能にすることから、一般的に本開示のシステム及び方法に対して好ましい。ユニバーサルプライマーセットを用いると、プローブセット特異的なプライマーを用いた個々のプローブセットの選択的な増幅と比較して、プローブセット全体にわたる増幅がより均一になり得る。多数のプローブ特異的なプライマーセットを伴ういくつかの場合においては、増幅の非効率性が増幅生成物の量を歪める、すなわち変化させ、後のステップにおいて計数すると、それが、特定の遺伝子座におけるコピー数に関する計算に影響し得る。更に、相対的に少ないプライマーを使用することが、高処理能力の、簡素化された一回のアッセイ作業をもたらすことの助けにもなり得る。
本開示のシステム及び方法の一構成において、図６Ａ及び６Ｂに示すように、ユニバーサル増幅はユニバーサル増幅プライマー６７０及び６９５を用いて行ってもよい。この構成においては、増幅生成物はバーコード配列６６０及びハイブリダイゼーション配列（または着目する遺伝子座に関係する配列）を含んでもよい。これは、増幅生成物を配列決定することができ、また遺伝子座が配列決定データから特定される下流での適用に有用であり得る。一般的に、プローブすなわちハイブリダイゼーションに用いられる配列の一部が増幅され得る。いくつかの場合において、約１％〜１０％、２０％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜８０％、８０％〜９０％、９０％〜９９％、または９９％〜９９．９９％のハイブリダイゼーション配列が増幅され得る。いくつかの場合において、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、９９．９％、９９．９９％のハイブリダイゼーション配列が増幅され得る。いくつかの場合において、最大で約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、９９．９％、９９．９９％のハイブリダイゼーション配列が増幅され得る。
この構成の他の変化形において、上記バーコード配列はまた、バーコード特異的なプライマー６９０及び６９２を用いて増幅されてもよい。バーコードが、（本明細書に記載の）関係する遺伝子座に向けて設計されたプローブセットに共通に割り振られてもよい、本開示のシステム及び方法のいくつかの場合において、既知の遺伝子座へのバーコードの割り振りは、予め決定されることとなる。バーコード配列の増幅もまた、ハイブリダイゼーション配列特異的なプライマーまたは他のユニバーサル増幅プライマーを有する組み合わせなどの、異なるプライマーの組み合わせにより行われ得る。
図６Ｂに示す一つの特定の場合において、バーコード配列の増幅は、ユニバーサルプライマーを用い、ハイブリダイゼーション配列の増幅及びそれに続く検知（すなわち配列決定）を行うことなくなし得る。上記ユニバーサルプライマー部位は上記バーコード配列に隣接するように設計され、開裂後に未変化のまま残ることから、これらの部位を、上記バーコード配列及びハイブリダイゼーション配列以外の配列のみを含有する増幅生成物を生起させるために用いてもよい。
図７に示す、本開示のシステム及び方法の別な構成において、ユニバーサル増幅は、環状ライゲーション生成物由来のユニバーサル増幅プライマー７９５を用いて行われてもよい。この構成において、増幅生成物は、バーコード配列７４０及びユニバーサルプライミング配列７９７を増幅生成物中に含んでもよい。バーコード特異的配列もまた用いることができ、７３０及び７５０、またはそれらの組み合わせである。ハイブリダイゼーション配列（または着目する遺伝子座に関係する配列）。これは、増幅生成物を配列決定することができ、また遺伝子座が配列決定データから特定される下流への適用に有用であり得る。この構成の他の変化形において、上記バーコード配列はまた、バーコード特異的なプライマー６９０及び６９２を用いて増幅することもできる。
Ｅ．増幅技法
本技術分野において、多数の増幅方法及び技法が公知である。本開示の方法において、当初の試料またはライゲーション生成物の配列情報の初期の内容を維持しつつ、ポリヌクレオチドの数量すなわち量を増加させるように、任意且つ適宜の方法を用いることができる。１又は複数の増幅方法を、１または複数の組み合わせで用いることができる。
増幅方法の例としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（米国特許第４，６８３，１９５号及び第４，６８３，２０２号；ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｈ．Ａ．Ｅｒｌｉｃｈ編、Ｆｒｅｅｍａｎ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州、ニューヨーク、１９９２）、リガーゼ連鎖反応（ｌｉｇａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）（ＬＣＲ）（Ｗｕ及びＷａｌｌａｃｅ、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４：５６０、１９８９；Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：１０７７、１９８８）、連鎖置換増幅（ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＳＤＡ）（米国特許第５，２７０，１８４号及び第５，４２２，２５２号）、転写媒介性増幅（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＴＭＡ）（米国特許第５，３９９，４９１号）、結合線形増幅（ｌｉｎｋｅｄ ｌｉｎｅａｒ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＬＬＡ）（米国特許第６，０２７，９２３号）など、自律配列複製（ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）（Ｇｕａｔｅｌｌｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７、１８７４（１９９０）及びＷ０９０／０６９９５）、標的ポリヌクレオチド配列の選択的増幅（米国特許第６，４１０，２７６号）、コンセンサス配列プライムポリメラーゼ連鎖反応（ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｐｒｉｍｅｄ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）（ＣＰ−ＰＣＲ）（米国特許第４，４３７，９７５号）、任意プライムポリメラーゼ連鎖反応（ａｒｂｉｔｒａｒｉｌｙ ｐｒｉｍｅｄ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）（ＡＰ−ＰＣＲ）（米国特許第５，４１３，９０９号、第５，８６１，２４５号）、及び核酸配列ベース増幅（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｂａｓｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＮＡＳＢＡ）を挙げることができるが、それらに限定されない。（米国特許第５，４０９，８１８号、第５，５５４，５１７号、及び第６，０６３，６０３号を参照されたく、これらのそれぞれは参照により本明細書に組み込まれる）。用いることができる他の増幅方法としては、ＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ８７／００８８０に記載のＱβレプリカーゼ、Ｗａｌｋｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２０（７）：１６９１〜６（１９９２）に記載のＳＤＡなどの等温増幅方法、及び米国特許第５，６４８，２４５号記載のローリングサークル増幅があげられる。用いることができる他の増幅方法としては、米国特許第５，２４２，７９４号、第５，４９４，８１０号、第４，９８８，６１７号及び米国特許出願第０９／８５４，３１７号及び米国公開第２００３０１４３５９９号に記載され、それらのそれぞれは参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの態様において、ＤＮＡは多様な遺伝子座特異的ＰＣＲによって増幅される。好ましい態様において、ＤＮＡはアダプター−ライゲーション及び単一プライマーＰＣＲを用いて増幅される。均衡ＰＣＲ（ｂａｌａｎｃｅｄ ＰＣＲ）（Ｍａｋｒｉｇｉｏｒｇｏｓら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ、２０：９３６−９（２００２））並びに核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）及び自律配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８７：１８７４（１９９０））などの等温増幅法などの他の利用可能な増幅方法。かかる方法論に基づいて、当業者は、増幅すべき任意且つ適宜の領域のプライマーを、容易に設計することができる。
Ｆ．増幅生成物及び条件
一般的に、本開示の方法においては、任意且つ適宜の増幅生成物及び生成物を生成させるための条件を用いることができる。種々の増幅技法及び配列に対して適切な、様々な増幅長さ、サイクル時間、ハイブリダイゼーション条件、アニーリング条件及び伸長条件を用いることができる。
ｉ．増幅長さ
一般的に、増幅生成物の長さは任意の長さであってよく、配列の計数において有用な任意の配列を含有することができる。一般的に、増幅されたポリヌクレオチドは、少なくとも約５ｂｐ、１０ｂｐ、２０ｂｐ、３０ｂｐ、４０ｂｐ、５０ｂｐ、６０ｂｐ、７０ｂｐ、８０ｂｐ、９０ｂｐ、１００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、１０ｋｂ、２０ｋｂ、３０ｋｂ、４０ｋｂ、５０ｋｂ、７５ｋｂ、または１００ｋｂであってよい。一般的に、増幅されたポリヌクレオチドは、最大で約５ｂｐ、１０ｂｐ、２０ｂｐ、３０ｂｐ、４０ｂｐ、５０ｂｐ、６０ｂｐ、７０ｂｐ、８０ｂｐ、９０ｂｐ、１００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、１０ｋｂ、２０ｋｂ、３０ｋｂ、４０ｋｂ、５０ｋｂ、７５ｋｂ、または１００ｋｂであってよい。
ｉｉ．増幅条件
一般的に、選択的増幅またはユニバーサル増幅のいずれに対しても、任意且つ適宜の増幅条件を用いることができる。いくつの場合において、増幅は線形であってよい。いくつの場合において、増幅は対数的であってよい。本開示の方法は、増幅され得る１または複数の配列の計数を提供することから、様々なステップにおいて増幅を制御して、試料間の変動性を制御することが好適であり得る。
例えば、いくつかの場合において、選択的増幅ステップまたはユニバーサル増幅ステップのいずれにおいても、制限した増幅サイクルの回数を用いることができる。これは、複数の遺伝子座またはバーコードが用いられる多様な条件下で、異なる遺伝子座またはバーコードに対する異なるプライマーセットが異なる挙動を示す選択的増幅に対して、特に好適であり得る。異なるプライマーセット中のプライマーは、それらの鋳型にハイブリダイズする能力が異なる場合があり、従ってプライマーセット間で増幅効率の違いを生じる場合がある。所与の遺伝子座に対するプライマーの各セットは、プライマー及び試料ＤＮＡの配列構成、緩衝液条件、及び他の条件に基づいて異なる挙動を示し得る。多重アッセイシステム用のユニバーサルＤＮＡ増幅は、一般的に偏り及び変動性の持ち込みがより少ない。
１又は複数の遺伝子座またはバーコード間の増幅の変動を低減するために、例えば、増幅は、線形増幅法を用い、それに続いて対数的ユニバーサル増幅を用いてもよい。いくつかの場合において、増幅が線形または略線形となるように、サイクル数は１〜５０サイクルの間に制限される。いくつかの場合において、線形増幅に関する増幅サイクルは、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、または５０サイクルとすることができる。いくつかの場合において、線形増幅に関する増幅サイクルは、最大で約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、または５０サイクルとすることができる。いくつかの場合において、本明細書記載のように、ライゲーション生成物由来の配列の線形な選択的増幅の後に、対数的なユニバーサル増幅ステップが行われてもよい。一般的なプライマーセットが、複数の遺伝子座またはバーコード増幅生成物に対して用いられるユニバーサル増幅は、ますます多くの量の試料を生成しつつ、増幅の変動性を更に低減することができる。
他の場合において、線形増幅の前に対数的増幅が用いられてもよい。いくつかの場合において、対数的増幅に関する増幅サイクルは、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、または５０サイクルとすることができる。いくつかの場合において、対数的増幅に関する増幅サイクルは、最大で約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、または５０サイクルとすることができる。
一般的に、任意且つ適宜のプライマーセットの数が増幅に用いられてもよい。いくつかの場合において、増幅プライマーセットは、試験される遺伝子座の数に概略等しくすることができる。いくつかの場合において、プライマーセットは、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１０００プライマーセットであってよい。いくつかの場合において、プライマーセットは、最大で約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１０００プライマーセットであってよい。
Ｇ．配列の識別及び計数方法
一般的に、バーコード配列の識別及びバーコードの計数の任意の方法または技法が、本開示のシステム及び方法に用いられてもよい。いくつかの場合において、識別は本明細書記載のＰＣＲを用いて行われてもよく、それによって、増幅生成物の有無から直接配列を特定することができ、更に定量することができる。いくつかの場合において、配列の識別は配列決定によって行われてもよい。一般的に、配列の計数は、それらに限定されないが、ｑＰＣＲ、ハイブリダイゼーション法及び配列決定またはそれらの組み合わせを始めとする、任意且つ適宜の定量的方法を用いて実施され得る。
ｉ．ＰＣＲ法
いくつかの場合において、ＰＣＲを伴う方法を、配列を識別する及び計数するために用いてもよい。識別の場合には、いくつかの場合において、プローブ配列を含有するプライマーを有する増幅生成物がうまく生成することが、特定の遺伝子座の存在を示し得る。いくつかの場合において、プローブ配列の生成物の増幅がうまくいかないことが、特定の遺伝子座が存在しないことを示し得る。他の場合において、プローブには個々の固有の識別子配列またはバーコードが結合し得る。ＰＣＲ増幅はバーコード単独上で、またはプローブ配列とバーコードとの組み合わせ上で行うことができる。いくつかの場合において、試料を試験する前に、既知のアイデンティティーの特定のバーコードが、既知の遺伝子座の領域に対して相補的な１または複数のプローブセットに割り振られる。いくつかの場合において、バーコード配列の増幅生成物がうまく生成することが、特定の遺伝子座の存在を示し得る。いくつかの場合において、バーコード配列の生成物の増幅がうまくいかないことが、特定の遺伝子座が存在しないことを示し得る。
いくつかの場合において、ＰＣＲ増幅生成物が、任意且つ適宜の方法を用いて定量され得る。いくつかの場合において、方法は定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）またはその変化形であってよい。いくつかの場合において、これは蛍光に基づく手法であってよく、そこでは蛍光シグナルを定量することができる。定量化されたシグナルを、元々の鋳型（すなわちライゲーション生成物）の相対的な存在量を算出するために用いることができ、従って特定の遺伝子座の相対的な存在量の関係する情報を提供することができる。いくつかの場合において、相対的な存在量の測定を、ＣＮＶなどの遺伝子変異の有無の特定に用いることができる。
ｉｉ．ハイブリダイゼーション方法
あるいは、本発明の別な構成において、上記増幅生成物の全長または一部が、ハイブリダイゼーション技法を用いて分析されてもよい。検知のためのポリヌクレオチド・ハイブリダイゼーション・アッセイの実施方法は本技術分野で公知である。ハイブリダイゼーション・アッセイの手順及び条件は用途によって変わることとなり、Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク、１９８９）、Ｂｅｒｇｅｒ及びＫｉｍｍｅｌ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１５２巻、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州サンディエゴ、１９８７）、Ｙｏｕｎｇ及びＤａｖｉｓ、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ, ８０：１１９４（１９８３）で言及する方法を始めとする公知の一般的な結合方法に従って選択される。繰り返され、制御されたハイブリダイゼーション反応を行うための方法及び装置が、米国特許第５，８７１，９２８号、第５，８７４，２１９号、第６，０４５，９９６号、及び第６，３８６，７４９号、第６，３９１，６２３号に記載されており、それらのそれぞれが参照により本明細書に組み込まれる。
識別の場合において、元々のライゲーション生成物のプローブ配列を含有する配列に対する更なるプローブのハイブリダイゼーションがうまくいくことが、特定の遺伝子座の存在を示し得る。いくつかの場合において、元々のライゲーション生成物のプローブ配列に対する更なるプローブのハイブリダイゼーションがうまくいかないことが、特定の遺伝子座が存在しないことを示し得る。他の場合において、元々のライゲーション生成物のプローブは、個々の固有の識別子配列またはバーコードに結合し得る。
ハイブリダイゼーションは、バーコード単独上で、または元々のプローブとバーコードとの組み合わせ上で行うことができる。いくつかの場合において、試料を試験する前に、どのプローブ配列に、従ってどの遺伝子座に特定のバーコードが結合され得るかが判る。いくつかの場合において、バーコード配列に対するプローブのハイブリダイゼーションがうまくいくことが、特定の遺伝子座の存在を示し得る。いくつかの場合において、バーコード配列に対するプローブのハイブリダイゼーションがうまくいかないことが、特定の遺伝子座が存在しないことを示し得る。
本開示はまた、ある好ましい態様のリガンド間のハイブリダイゼーションのシグナル検知も提供する。米国特許第５，１４３，８５４号、第５，５７８，８３２号、第５，６３１，７３４号、第５，８３４，７５８号、第５，９３６，３２４号、第５，９８１，９５６号、第６，０２５，６０１号、第６，１４１，０９６号、第６，１８５，０３０号、第６，２０１，６３９号、第６，２１８，８０３号、及び第６，２２５，６２５号、米国特許出願第６０／３６４，７３１号及びＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ９９／０６０９７号（Ｗ０９９／４７９６４として公開）を参照されたく、これらのそれぞれは、全ての目的のために、それによって参照によりその全体が組み込まれる。
いくつかの場合において、ハイブリダイゼーションプローブが定量化され、配列を計数することができる。いくつかの場合において、プローブは化学的薬剤、蛍光団または定量化できるリガンドに接合される。一つの特定の例において、本開示の方法は、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ社ｎＣｏｕｎｔｅｒシステムによって提供されるなどの計数システムに好適であり得る。
シグナル検知及び強度データの処理のための方法及び装置が、例えば、米国特許第５，１４３，８５４号、第５，５４７，８３９号、第５，５７８，８３２号、第５，６３１，７３４号、第５，８００，９９２号、第５，８３４，７５８号、第５，８５６，０９２号、第５，９０２，７２３号、第５，９３６，３２４号、第５，９８１，９５６号、第６，０２５，６０１号、第６，０９０，５５５号、第６，１４１，０９６号、第６，１８５，０３０号、第６，２０１，６３９号、第６，２１８，８０３号、及び第６，２２５，６２５号に、米国特許出願第６０／３６４，７３１号及びＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ９９／０６０９７（Ｗ０９９／４７９６４として公開）に開示され、これらのそれぞれもまた、全ての目的のために、それによって参照によりその全体が組み込まれる。
ｉｉｉ．配列決定方法
多数の配列決定方法が本開示のシステム及び方法に適合する。代表的な配列決定方法としては、参照により組み込まれる、Ｄｒｍａｎａｃ、米国特許第６，８６４，０５２号、第６，３０９，８２４号、及び第６，４０１，２６７号、並びにＤｒｍａｎａｃら、米国特許公開第２００５／０１９１６５６号に開示されるようなハイブリダイゼーションに基づく方法；合成方法による配列決定、例えば、Ｎｙｒｅｎら、米国特許第７，６４８，８２４号、第７，４５９，３１１号及び第６，２１０，８９１号；Ｂａｌａｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ、米国特許第７，２３２，６５６号及び第６，８３３，２４６号；Ｑｕａｋｅ、米国特許第６，９１１，３４５号；Ｌｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、１００：４１４〜４１９（２００３）；Ｒｏｎａｇｈｉら、米国特許第７，６４８，８２４号、第７，４５９，３１１号、第６，８２８，１００号、及び第６，２１０，８９１号に開示されるピロリン酸配列決定；並びに、ライゲーションに基づく配列決定方法、例えば、Ｄｒｍａｎａｃら、米国特許出願第２０１００１０５０５２号、及びＣｈｕｒｃｈら、米国特許出願第２００７０２０７４８２号及び第２００９００１８０２４号が挙げられるが、これらに限定されない。
多数（一般的に数千から数十億）の核酸配列を本質的に並列する様式で決定する方法であって、高処理能力の連続的プロセスを用い、多数の配列が好ましくは並列して読み出される上記方法を用いて、配列情報が決定され得る。かかる方法としては、ピロシーケンシング（例えば、４５４ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．、コネチカット州ブランフォードにより商業化されたもの）、ライゲーションによる配列決定（例えば、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州カルスバッドのＳＯＬｉＤ（商標）技術で商業化されたもの）、修飾ヌクレオチドを用いた合成による配列決定（Ｉｌｌｉｍｉｎａ、Ｉｎｃ．、カリフォルニア州サンディエゴによるＴｒｕＳｅｑ（商標）及びＨｉＳｅｑ（商標）技術、Ｈｅｌｉｃｏｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、マサチューセッツ州ケンブリッジによるＨｅｌｉＳｃｏｐｅ（商標）、並びにＰａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州メンローパークによるＰａｃＢｉｏ ＲＳにより商業化されたものなど）、イオン検知技術による配列決定（Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ ，Ｉｎｃ，，カリフォルニア州サウスサンフランシスコ）、ＤＮＡナノボールの配列決定（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州マウンテンビュー）、ナノポアに基づく配列決定技術（例えば、Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＬＴＤ、英国オックスフォードにより開発されたもの）、及び類似の高度に並列化された配列決定方法が挙げられるが、これらに限定されない。
更に、配列のリードは遺伝子座またはバーコード当たりのリードの数を定量することによって計数されてもよい。
ＸＩ．リードのカウント及びフィルタリング
ある場合において、遺伝子変異の特定の前に、リードのカウントデータをフィルターにかける、すなわち選別することが好適であり得る。一般的に、各着目する遺伝子座または着目する遺伝子座の部分集合に関する存在量の測定を、遺伝子変異の有無を特定するために用いてもよい。
多数の標準的な、着目する遺伝子座の部分集合の選択方法がある。該方法としては、ある百分位数未満及び／またはそれを超えるレベルで検知された着目する遺伝子座を分析から除外する、異常値除外が挙げられる。いくつかの場合において、上記百分位数は、存在量により測定して、少なくとも、最低及び最大で約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、または２５％とすることができる。いくつかの場合において、上記百分位数は、存在量により測定して、最大で、最低及び最大で約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、または２５％とすることができる。
選択された遺伝子座の部分集合の別な選択方法としては、ある統計的な制限の外に位置する領域の除外が挙げられる。例えば、１または複数の平均存在量の標準偏差外に位置する着目する遺伝子座は分析から除外され得る。
いくつかの場合において、着目する遺伝子座の部分集合を用いて、選択された遺伝子座の相対的な存在量を、健常な、すなわち正常な試料中の同一の選択された遺伝子座の予期される存在量と比較し、該予想試験で不合格な着目する遺伝子座は全て廃棄してもよい。
本開示のシステム及び方法における変動を更に低減するために、各着目する遺伝子座を測定する回数を増加してもよい。本明細書記載のように、ゲノムが平均で１回未満しか測定されない遺伝子変異検知のランダム法に対して、本開示のシステム及び方法は各着目する遺伝子座を複数回試験し得る。一般に事象をカウントする際に、カウントにおける変動はポアソン統計によって特定することができ、カウントの変動は一般的に、１をカウントの回数の平方根で除した値に等しいとし得る。
いくつかの場合において、着目する遺伝子座は、それぞれ平均で少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００または５０００回測定される。いくつかの場合において、着目する遺伝子座は、それぞれ平均で最大で約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００または５０００回測定される。
別な構成において、着目する遺伝子座の部分集合は、ランダムにではあっても、染色体異常が存在するか否かの特定において統計的に意味のある結果を与えるために十分な数の遺伝子座で選択することができる。母親の試料内において、着目する遺伝子座の異なる部分集合の多重分析を行い、より高い統計的検出力を与えることができる。この例において、ランダム分析の前に如何なる遺伝座も取り除くすなわち除去することが必要である場合と必要ない場合とがある。例えば、２１番染色体に関する１００の選択した遺伝子座及び１８番染色体に関する１００の選択した遺伝子座がある場合、当該染色体のそれぞれに対して、１００よりも少ない遺伝子座を評価する一連の分析を行うこともできる。
他の場合において、増幅の偏りが検知された場合には、カウントにおいて、選択した遺伝子座に関するリードのカウントをフィルターにかける、すなわち制限してもよい。増幅の偏りに起因するなどの変動性に関して疑われる遺伝子座を識別するために、内部基準、標準管理及び他の品質管理技法を独立に用いることができる。いくつかの場合において、疑いのある遺伝子座に関してリードのカウントを制限し、データの歪みを防止することが好ましい場合がある。
ＸＩＩ．試料における遺伝子変異の特定
配列のリードの計数及び任意選択のフィルタリングの後に、本開示は、母親及び胎児のポリヌクレオチドの混合物を含む試料中の１または複数の遺伝子座における遺伝子変異（すなわちＣＮＶ）の有無の特定方法を提供する。いくつかの場合において、アルゴリズムを、遺伝子変異の有無を検知するために用いてもよい。いくつかの場合において、アルゴリズムを、潜在的な遺伝子変異のプロファイルを作成するために用いてもよい。いくつかの場合において、プロファイルは本明細書記載のＣＮＶの有無を示す場合があるのであって、確証的にＣＮＶが存在するまたは存在しないことを示し得ない。ＣＮＶの存在または非存在をそれぞれ示すプロファイルは、ＣＮＶがそれぞれ存在するまたは存在しないことのより高い確率を示すことができる。いくつかの場合において、１または複数の遺伝子変異（すなわちＣＮＶ）に関して、確率値すなわち確度を提供することができる。
あるいは、ＣＮＶの有無はまた、本明細書記載の特定の方法に基づくまたは基づかない他のシステム及び方法によっても、特定または確認することができる。いくつかの場合において、ＰＣＲ、ｑＰＣＲまたは比較ゲノムハイブリダイゼーションなどの技法を、単独でまたはプローブに基づく手法との組み合わせで、遺伝子変異の検知に用いることができる。
試料中の遺伝子変異の特定は、種々の適宜の方法を用いて行うことができる。一例において、例えば、比較のために内部基準が用いられる。いくつかの場合において、内部基準とは、同一の試料中で、異常と想定される存在量（すなわち、重複、異数性等々）で存在する遺伝子座と比較するために、「正常な」存在量（例えば、常染色体に関するダイソミー）で存在する遺伝子座を用いることである。基準染色体として、かかる「正常な」染色体の１を用いることが十分であり得る一方、定量の検出力を高めるために、内部基準染色体として２以上の正常な染色体を用いることも可能である。他の場合において、既知の遺伝子の状態（すなわち、１または複数の遺伝子座に関する既知のコピー数、正倍数性、トリソミー等々）の１または複数の試料を含む外部基準が用いられてもよい。
Ａ．染色体分布の検知
いくつかの場合において、内部基準を用いて、染色体比と呼ばれる、試料中の１または複数の正常な染色体の存在量に対する、異常と想定される染色体の存在量の比を算出する。個々の染色体に関する比もまた算出されてもよく、そこでは、各染色体に対する各遺伝子座の存在量、すなわちカウントが加算され、各染色体に対する合計のカウントを算出する。染色体比に関しては、次に、１の染色体に関する合計のカウントを異なる染色体に対する合計のカウントで除して、それら２の染色体に対する染色体比を導き出す。
あるいは、各染色体に対する染色体比は、まず各染色体に関する各遺伝子座のカウントを加算し、次に上記１の染色体に関する和を２以上の染色体に関する総和で除すことによって算出することができる。算出後に、上記染色体比が正規母集団からの平均染色体比と比較される。
上記平均とは、規格化及び異常値データの除外を伴うまたは伴わない、単純、メジアン、モードまたは他の平均であってよい。いくつかの場合において、単純平均が用いられる。正規母集団由来の染色体比は測定した染色体の正常変動を用いて算出される。この変動は種々の様式で表すことができる。いくつかの場合において、該変動は変動係数、すなわちＣＶとして表される。試料由来の染色体比が正規母集団由来の平均染色体比と比較され、試料に関する染色体比が、統計的に正規母集団に関する平均染色体比の外側に位置する場合には、当該試料は異数性を含み得る。異数性を特定するための統計的閾値は、染色体比の測定における変動及び所望のアッセイに関する許容される偽陽性と偽陰性との比に応じて設定することができる。一般的に、この閾値は、染色体比において観測される変動の倍数とすることができる。例えば、いくつかの場合において、この閾値は、染色体比の変動の少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍である。いくつかの場合において、この閾値は、染色体比の変動の最大で約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍である。
一般的に、染色体比は、染色体に沿って遺伝子座のカウントを加算することにより特定することができる。一般的には、各染色体に対して同一の数の選択された遺伝子座が用いられる。染色体比を導き出す別な方法が用いられ、各染色体に関する遺伝子座に対する平均カウントを算出してもよい。上記平均は単純、メジアンまたはモードの任意の概算値であってよいが、一般的には平均が用いられる。上記平均は全カウントの単純平均または調整された平均若しくは加重平均などの、何がしかの変化形であってもよい。各染色体に関する平均カウントが算出された後、該各染色体に関する平均カウントはその他の平均カウントで除され、２の染色体間の染色体比を得ることができ、各染色体に関する平均カウントは全ての測定した染色体に関する平均の和で除され、本明細書記載の各染色体に関する染色体比を得ることができる。
上記で強調したように、想定されるＤＮＡが低い相対的な存在量で存在する母親の試料中の異数性を検知する能力は、アッセイでの異なる選択された遺伝子座の測定における変動に大きく依存する。この変動を低減するために多数の分析方法を用いることができ、従って異数性を検知するためのこの方法の感度を向上することができる。一つのアッセイの変動の低減方法は、染色体の存在量を算出するために用いる選択された遺伝子座の数を増加させることである。一般的に、染色体の、単一の選択された遺伝子座の測定される変動がＸ％であり、Ｙ％の選択された遺伝子座が同一の染色体上で測定されると仮定した場合、当該染色体上の各選択された遺伝子座の存在量を加算または平均することによって算出される染色体存在量の測定の変動は、概略Ｘ％をＹ％で除した値となり得る。染色体存在量の測定の変動は、概略、各選択された遺伝子座の存在量の測定の平均の変動を遺伝子座の数の平方根で除した値となり得る。
本開示のいくつかの場合において、遺伝子座カウントは結合したバーコードの計数によって特定されてもよい。いくつかの場合において、バーコード配列は、同様の染色体上の異なる遺伝子座に関して同一であってもよい。次に、バーコードは増幅され、カウントされてもよい。この場合、１の染色体の遺伝子座全体にわたる増幅における変動、ひいてはカウントにおける変動を低減することができる。別な例において、異なる染色体の遺伝子座が、１又は複数のバーコードの同様な分布と関連していてもよい。異なるバーコードの増幅のための特定のプライマーセットに関して、増幅効率における変動が存在し得るが、染色体全体で類似のプライマーセットの分布を用いることが、試料全体での増幅の偏り及び変動性の低減を可能にし得る。これが、特に一つの染色体の別な染色体に対するカウントの比較（すなわち染色体比）を改善し得る。
Ｂ．遺伝子座に基づくＣＮＶの識別
いくつかの場合において、ＣＮＶが１または複数の個々の遺伝子座において検知され得る。かかる場合において、ＣＮＶは、特定の遺伝子座が、閾値すなわち基準レベルを超えて増加するか（すなわち、コピー数の獲得）または閾値すなわち基準レベル未満に減少するか（すなわち、コピー数の喪失）を検知することにより、ＣＮＶを識別することができる。いくつかの場合において、特定の遺伝子座が特定の疾患、病態または感染と関連することが知られている場合がある。種々の遺伝子座の比較は、遺伝子座当たりのリードのカウントの数によって特定され、しばしばカバーの程度（ｄｅｐｔｈ ｏｆ ｃｏｖｅｒａｇｅ）と呼ばれる。本技術分野で公知の、ＣＮＶをカバーの程度によって識別するために用いることができる様々なプログラムすなわちアルゴリズムがある。いくつかの場合において、アルゴリズムは、規格化されたカバーの程度の比率を用いて、遺伝子座当たりの相対的なリードのカウントを、基準との比較として評価する。この場合、上記基準は、試験試料と同様の方法で作成された、「正常な」（すなわち二染色体性の）試料の広範なデータセットより得られた複数の遺伝子座に関するメジアンリードカウントからなる。他の場合において、基準は、１または複数の既知の正倍数体ゲノム由来のデータを含んでもよい。他の場合において、基準は、三染色体性または一染色体性遺伝子座などの、他の規定された遺伝子型を有する、１または複数の既知の試料由来のデータを含んでもよい。１または複数の遺伝子座におけるＣＮＶは、コピー数の標準的な分布からの偏差によって識別することができる。
カバーの程度の情報を用いてＣＮＶを識別する任意且つ適宜のアルゴリズムを、本開示の組成物及び方法に用いることができる。別なアルゴリズムとしては、ＣＯＮＴＲＡ、ＸＨＭＭ、ＰｅｎｎＣＮＶ、ＣｏＮＩＦＥＲ、ＶａｒＳｃａｎ、ＣＮＶＳｅｑ、ｃｎ．ＦＡＲＭＳ、ＢＩＣ−ｓｅｑ及びＣｏｎｓｏｌｅなどのプログラムを挙げることができるが、これらに限定されない。遺伝子座に基づくＣＮＶ検知に関係するワークフローの例を、図１及び図２に見ることができる。
Ｃ．対立遺伝子に基づくＣＶＮの識別
いくつかの場合において、ＣＮＶは、遺伝子座由来の対立遺伝子の頻度を評価することによって識別することができる。欠失が存在する場合には、配列のこの領域はヘテロ接合性対立遺伝子を有することがなく、ヘテロ接合性消失（ＬＯＨ）と呼ばれる。ＬＯＨはまた、両方の染色体の複製物または染色体のセグメントが同一の親に由来する状況である片親性ダイソミー（ｕｎｉｐａｒｅｎｔａｌ ｄｉｓｏｍｙ）（ＵＰＤ）がある場合に起こり得る。トリソミーの場合には、ヘテロ接合性ＳＮＰに関して、対立遺伝子の１が２倍に増加し、対立遺伝子発現の比率が正常なパターンと比較して変位を起こす。コピー数の獲得の対立遺伝子の比に対する影響は、喪失に関するよりも獲得に関する方がより小さくなり得る。かかる場合を検知するために、任意且つ適宜のアルゴリズムを用いることができる。
いくつかの場合において、プローブは、あるＳＮＰを検知するように設計されてもよい。いくつかの場合において、ＭＩＰＳプローブまたは錠型プローブが、ＳＮＰが第１及び第２のプローブの間に存在する場合に特に好適である。ＳＮＰの検知のためのＭＩＰプローブの使用は本技術分野で公知であり、ＳＮＰは本明細書記載の方法を用いて検知することができる。いくつかの場合において、第１及び第２のプローブの間のＳＮＰを含有する領域または領域の一部の増幅を、配列決定及び分析してもよい。次に、個々のＳＮＰ対立遺伝子に関するリードのカウントを特定してもよい。
いくつかの場合において、アルゴリズムが、試料中のヘテロ接合性ＳＮＰの対立遺伝子の頻度を評価し、予想される頻度からの偏差があるか否かを特定することができる。この分析に関して、Ｘ対立遺伝子のリードの数値をリードの合計の数値またはカバーの程度で除した値によって計算することにより、基準ではない対立遺伝子「Ｘ」の頻度を、各多型ＳＮＰに対して特定することができる。Ｘ対立遺伝子の頻度に関する予想される頻度は、常染色体及び女性におけるＸ染色体に関しては０．５であり、男性の試料中のＸ及びＹ染色体に関しては０または１である（胎児の性はＹに連動した遺伝子の有無によって決定し得る）。多型の位置に関する違いを評価するために、他の対立遺伝子ＳＮＰ頻度に対して予想される頻度が試験される。そこで、ｃｉｒｃｕｌａｒ ｂｉｎａｒｙ ｓｅｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ（ＣＢＳ）などの種々の統計的ステップを用いて、個々のＳＮＰデータのセグメント化が行われてもよい。一般的に、試験は、試料の頻度の分散と基準の頻度の分散との間の統計的意味を測定するために、分散の等しさに関してＦ試験を用いて行われる。いくつかの場合において、この基準は、任意の本明細書記載の基準のタイプ由来である、試験試料中に存在するヘテロ接合性ＳＮＰに関するメジアンのＸ対立遺伝子の頻度の値から構成される。このセグメント化過程は、試料中に基準との比較において歪んだ対立遺伝子発現があるゲノムにおける、連続する領域を識別し、それによって、１を超える遺伝子座にわたり得るＣＮＶを識別することができる。
いくつかの場合において、ＣＮＶは対立遺伝子の比によって検知することができる。比較対照試料において特定された既知の値と比較した場合により高いかまたはより低いかのいずれかであるＳＮＰ比は、異数性などのＣＮＶの存在を示し得る。
いくつかの場合において、ＳＮＰ比の増加は、比較対照試料における平均値と比較して、少なくとも約１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８０％、または１００％高い場合があり、ＣＮＶの存在を示すことができる。いくつかの場合において、ＳＮＰ比の増加は、比較対照試料における平均値と比較して、最大で約１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８０％、または１００％高い場合があり、ＣＮＶの存在を示すことができる。
いくつかの場合において、ＳＮＰ比の増加は、比較対照試料における平均値と比較して、少なくとも約１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８０％、または１００％低い場合があり、ＣＮＶの存在を示すことができる。いくつかの場合において、ＳＮＰ比の増加は、比較対照試料における平均値と比較して、最大で約１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８０％、または１００％低い場合があり、ＣＮＶの存在を示すことができる。
いくつかの場合において、ＳＮＰ比は、比較対照試料における平均値よりも高いまたは低い標準偏差で測定されることがあり、ＣＮＶが存在する危険性が高いことを示す。いくつかの場合において、ＳＮＰ比は、少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５または５の比較対照試料における平均値よりも高い標準偏差の場合があり、ＣＮＶの存在を示し得る。いくつかの場合において、ＳＮＰ比は、最大で約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５または５の比較対照試料における平均値よりも高い標準偏差であってよく、ＣＮＶの存在を示し得る。
いくつかの場合において、ＳＮＰ比は、少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５または５の比較対照試料における平均値よりも低い標準偏差の場合があり、ＣＮＶの存在を示し得る。いくつかの場合において、ＳＮＰ比は、最大で約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５または５の比較対照試料における平均値よりも低い標準偏差の場合があり、ＣＮＶの存在を示し得る。
いくつかの場合において、ＣＮＶは、対立遺伝子発現に対して適用されるカバーの程度の手法を用いて評価されてもよい。かかる場合には、対立遺伝子は、一方はより高発現された対立遺伝子に相当するものであり、一方の群はより低発現された対立遺伝子に相当するものである、２群に分割され得る。次に各群は、本明細書記載の遺伝子座のリードのカウントデータと同様の方法で、比較することができる。いくつかの場合において、コピー数の相対的変化の大きさがより大きく、結果としてより大きなリードのカウントに繋がり得ることから、対立遺伝子レベル分析の方が遺伝子座レベル分析よりも好ましいことがある。対立遺伝子に基づくＣＮＶ検知に関係するワークフローの一例を図３に見ることができる。
Ｄ．選択される遺伝子座数
いくつかの場合において、アッセイの精度及び分解能は、試験される遺伝子座の数の増加と共に向上し得る。遺伝子座の数を増やすことはまた、染色体全体についてのＣＮＶの判定に関する精度及び分解能を向上させるためにも特に好適であり得る。染色体当たりの試料採取される遺伝子座の数は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、または５０００遺伝子座であってよい。染色体当たりの試料採取される遺伝子座の数は、最大で約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、または５０００遺伝子座であってよい。
Ｅ．遺伝子変異の解釈
ＣＮＶなどの遺伝子変異の識別に続いて、病原性でありそうか又は良性でありそうかを特定するために、遺伝子の異常性の妥当性が評価されてもよい。影響を特定するために、ＥＮＳＥＭＢＬ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇ）、ｅｎｓｅｍｂｌ ｒｅｓｏｕｒｃｅｓを用いた、ヒトにおける染色体不均衡及び表現型のデータベース(ＤＥＣＩＰＨＥＲ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ＰｏｓｔＧｅｎｏｍｉｃｓ／ｄｅｃｉｐｈｅｒ／)、及び遺伝子変異のデータベース（ＤＧＶ、ｈｔｔｐ：／／ｐｒｏｊｅｃｔｓ．ｔｃａｇ．ｃａ／ｖａｒｉａｔｉｏｎ）などの変異を分類したデータベースを参照し、遺伝子変異の結果としての表現型のまたは健康上の影響があり得るかを特定することができる。
他の検討としては、ＣＮＶの大きさ及びゲノムの内容、ｏｎｌｉｎｅ ｍｅｎｄｅｌｉａｎ ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ ｍａｎ（ＯＭＩＭ）データベース（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｏｍｉｍ）における投薬に敏感な遺伝子の根拠並びに最新の文献の検出が挙げられる。これらの分析の一部または全てに基づいて、ＣＮＶの病原性の可能性の判断を決定することができる。
ＸＩＩＩ．応用
Ａ．胎児及び母親の健康
一般的に、本開示のシステム及び方法は、母親及び胎児の特質及び健康の評価を対象とし得る。一般的に、本開示のシステム及び方法を、ＣＮＶなどの、遺伝子変異に関連する任意の適当な疾患または病態を評価するために用いることができる。いくつかの場合において、この情報を、母親及び胎児の治療に関する判断を支援するために用いることができる。他の場合において、この情報を、妊娠（すなわち、妊娠の中止または継続）に関する判断を支援するために用いることができる。体外受精（ＩＶＦ）を伴ういくつかの場合において、いずれの胎芽（胚）を女性（雌）に移植するかの選択の判断に、胎芽（胚）における遺伝子変異に関する情報を用いることができる。
他の場合において、本開示のシステム及び方法を、胎児においてまたは胎児が出生した後に起こるかも知れずまた起こらないかも知れない関係する健康問題に関する予測的情報を提供するために用いることができる。いくつかの場合において、必然的変異型を母親または胎児のいずれかにおいて識別することができ、これを、特定の疾患の発症のリスクを特定または評価するために用いることができる。
Ｂ．ガンの早期検知
本明細書において提供されるシステム及び方法を、母親または胎児のいずれかの既知のガンまたは他の疾患を監視するために用いることができる。これにより、母親、胎児または専門家のいずれかが、疾患の進行に合致した治療の選択肢を採用することを可能にし得る。この例において、本明細書に記載されるシステム及び方法を、疾患の経過にある特定の被験者の遺伝子プロファイルを構築するために用いることができる。いくつかの例において、ガンはより侵攻性となる及び遺伝的に不安定となって進行することがある。他の例において、ガンは良性、非活動性また休止状態のままでいることがある。本開示のシステム及び方法は、疾患の進行の特定において有用であり得る。
更に、本明細書記載のシステム及び方法は、特定の治療選択肢の効能の特定に有用であり得る。一例において、治療選択肢はＣＮＶなどの遺伝子変異の性質または量に対して実際に影響を与え得る。いくつかの場合において、遺伝子変異の監視は治療の効能の監視に有用であり得る。いくつかの場合において、この相関性は治療を選択するまたは変更することにおいて有用であり得る。
Ｃ．数的染色体異常に関係する疾患の早期検知
他の応用において、本開示のシステム及び方法を、染色体異常に関係する胎児または胎芽（胚）の遺伝子変異に関連した他の疾患を検知するために用いることができる。
例えば、本開示のシステム及び方法は、正常な（または単相の）数の染色体の余分なセット（複数可）が存在するもの（三倍性及び四倍性）、個々の染色体の欠損を伴うもの（モノソミー）及び余分な個々の染色体をともなうもの（トリソミー及びダブルトリソミー）などの数的異常の検知を可能にする。自然流産の約半数が胎児の核型における異常な数の染色体の存在に関連し、これにより、異数性が流産の主要な原因となっている。本開示のシステム及び方法は、異数性に基づく病態に関する早期の検知及び可能性のある治療の選択肢において支援し得る。トリソミーは最も頻出する種類の異数性であり、臨床上認知される全妊娠の４％において起こる。最も一般的なトリソミーは２１番染色体（ダウン症候群に関連する）、１８番染色体（エドワード症候群）及び１３番染色体（パトー症候群）に関係する。他の異数性は、ターナー症候群（単一のＸ染色体の存在）、クラインフェルター症候群（ＸＸＹ核型により特徴付けられる）及びＸＹＹ病（ＸＹＹ核型により特徴付けられる）に関連する。本開示の組成物及びシステム及び方法は、ダウン症候群、エドワード症候群及びパトー症候群、並びにターナー症候群、クラインフェルター症候群及びＸＹＹ病を始めとする異数性に関係する病の検知に有用であり得るが、これらに限定されるものではない。
Ｄ．Ｘ関連疾患に関係する疾患の早期検知
本開示のシステム及び方法を、Ｘ染色体が関係する染色体異常を検知するために用いることができる。多数のこれらの染色体異常が、集合的にＸ関連障害と名付けられた一群の疾患及び疾病に関連することが知られている。例えば、本開示のシステム及び方法を用いて、Ｘ染色体上のＨＥＭＡ遺伝子（Ｘｑ２８）における変異を検知することができ、該変異は、遺伝性の血液障害であり、主として男性が冒され、異常な出血をもたらす、第ＶＩＩＩ因子として知られる血液凝固タンパク質の欠乏によって特徴付けられる血友病Ａに関連する。
別な例において、本開示のシステム及び方法を、Ｘ染色体上のＦＭＲ１遺伝子（Ｘｑ２７．３）の一方の末端のＣＧＧモチーフの増幅（２００コピー超が存在）を検知するために用いることもでき、該増幅は、現在知られている最も一般的な遺伝性の精神遅滞である脆弱Ｘ症候群に関連する。
Ｄ．テロメア中の着目する遺伝子座に関係する疾患の早期検知
脆弱Ｘ症候群に加えて、多数の他の遅滞障害が、染色体の末端領域（または先端）（すなわちテロメア）に関係する染色体異常に起因することが知られている。テロメアＤＮＡの大部分は一般的に異なる染色体間で分かち合われる。しかしながら、テロメアはまた、各染色体に特異であり遺伝子に富む固有の（大幅に小さい）配列領域も含む。テロマー領域を含む染色体再配列は、重篤な臨床上の結果を招き得る。例えば、超顕微鏡的なサブテロメアの染色体再配列は、先天性異常を伴うまたは伴わない精神遅滞の重要な原因であることが判っている。テロメア領域は最も高い再結合速度を有し、規則に反する対形成及び乗換えに起因する異常を起こしやすくなる。４５０〜５００バンドレベルの一般的な核型分析によれば、ほとんどの染色体の末端部分は略同一に見えることから、標準的な方法論を用いてのこの領域における染色体の再配列の検知は困難である。本開示のシステム及び方法は、従来の核型分類システム及び方法よりも大幅に高い分解能を提供することができ、これを、かかるサブテロメアの再配列を検知するために用いることができる。
Ｅ．他の様々なＣＮＶ疾患の早期検知
他の例において、本開示のシステム及び方法を、他の様々なＣＮＶに関係する胎児の疾患を検知するために用いることができる。これらとしては、それらに限定されないが、１５番染色体上のセグメントｑ１１〜ｑ１３の欠失を挙げることができ、これは、父系で１５番染色体に由来する場合には、プラダー・ウィリー症候群（精神遅滞、筋緊張の低下、低身長及び肥満によって特徴付けられる障害）に関連する。母系で１５番染色体に由来する場合には、この遺伝子変異はアンジェルマン症候群（精神遅滞、言語機能障害、歩行異常、けいれん発作及び場違いな多幸性挙動によって特徴付けられる神経形成障害）と結び付く。
別な例において、本開示のシステム及び方法を、例えば２２ｑ１１．２バンドに生じる、２２番染色体中の微小欠失を検知するために用いることもでき、該微小欠失は、出生前に確認される先天性心臓疾患における概略１０％の症例との関連で見られる、常染色体優性の疾病であるディジョージ症候群と結び付く。
別な例において、２１番染色体上の小領域（２１ｑ２２など）の分節性重複もまた、本開示のシステム及び方法を用いて検知することができ、該重複は２１番染色体又は別な染色体上に存在することがあり（すなわち、転座の後）、ダウン症候群と関連する。
Ｆ．免疫疾患、感染症、及び胎児性別の早期検知
他の様々な疾患及び感染症は、早期検知及び監視に好適であり得る他の種類の症状をもたらすことがある。例えば、ある場合には、遺伝的障害または感染性疾患が、患者においてある遺伝子のモザイク現象を起こすことがある。この遺伝子のモザイク現象は、本開示のシステム及び方法を用いて検知することができるコピー数多型及び希な変異を起こすことがある。別な例において、本開示のシステム及び方法を、母親または胎児のいずれかの体内の免疫細胞のゲノムを監視するために用いることもできる。Ｂ細胞などの免疫細胞は、ある疾患が存在する場合に急激にクローン展開される場合がある。クローン展開はコピー数多型の検知を用いて監視することができ、ある免疫状態を監視し得る。この例においては、コピー数多型分析を経時的に実施して、特定の疾患がどのように進行していき得るかのプロファイルを作成することができる。
更に、本開示のシステム及び方法を、細菌またはウィルスなどの病原体によって引き起こされ得る全身性感染症それ自体を監視するために用いることもできる。コピー数多型の検知または希な変異の検知ですらも、感染の経過の間に病原体の数がどのように変化していくかを特定するために用いることができる。これは特に、ＨＩＶ／ＡＩＤｓまたは肝炎などの慢性感染の間に重要である場合があり、それにより、感染の間にウィルスがライフサイクル状態を変え及び／またはより強毒性の形態に変異する場合がある。
更に、本開示のシステム及び方法は、胎児の性別（すなわち男性（雄）または女性（雌））を特定するために用いることもできる。例えば、Ｙ染色体の有無またはＸ染色体の二染色体コピー数を特定するためにプローブを用いてもよい。
Ｇ．疾患に関する必然的変異型の早期検知
一般的に、本開示のシステム及び方法を、特定の疾患の重篤性のリスクの特定に有用な必然的変異型（すなわちＳＮＰまたはＣＮＶ）の有無を識別するために用いることもできる。例えば、本開示のシステム及び方法は、ハンチントン病の家族歴を有する患者に対して有用であり得る。この神経変性疾患は、ハンチントン遺伝子（ＨＴＴ）中の様々な長さのトリヌクレオチドの繰り返しに起因する。この繰り返しの長さは固体間並びに世代間で変化し得る。該繰り返しの長さはハンチントン病そのものの重篤度に影響すると考えられている。ＣＮＶレベルの特定が、ハンチントン遺伝子中の繰り返し数に関する情報を与えることができる。この情報は、当該疾患を有することが疑われる胎児における、将来の当該疾患の重篤度への見通しを提供することができる。
ＸＩＶ．情報の保存及び伝達
着目する遺伝子座の分析及び遺伝子変異の有無の識別に由来する情報は、両親、保護者または試料若しくは配列データが由来する胎児の所有者、臨床医、研究専門家、医療専門家、サービス提供者、及び医療保険者若しくは保険会社を始めとする、任意の特定の個人・団体に伝えることができる。医療専門家は、例えば、医師、看護師、医療実験室技術者、及び薬剤師とすることができる。研究専門家は、例えば、主研究者、研究技能者、博士課程後の研修者、及び大学院生とすることができる。
いくつかの実施形態において、専門家は、胎児に特定の遺伝子変異が存在するか否かを特定することにより支援を受けることができ、専門家に遺伝子変異についての情報を伝えることができる。特定の遺伝子変異についての情報が報告された後、医療専門家は両親に影響することとなり得る１または複数の行動を取り得る。例えば、医療専門家は、親の医療記録中に、当該胚芽の発達障害を発症するリスクに関する情報を記録することができる。いくつかの実施形態において、医療専門家は、女性に移植することが選択される場合には、当該胚芽のリスク評価に関する情報を記録することができる。
いくつかの実施形態において、医療専門家は、対象者または対象者の家族に、胚芽の発達障害の発症のスクリーニングに関する情報を伝えることができる。いくつかの実施形態において、医療専門家は、家族に、治療の選択肢及び専門家への紹介を始めとする、発達障害及びリスク評価情報に関する情報を提供することができる。いくつかの実施形態において、医療専門家は、専門家へ、対象者の医療記録のコピーを提供することができる。いくつかの実施形態において、研究専門家は、科学上の研究を進めるために、胚芽の発達障害の発症のリスクに関する情報を応用することができる。
情報を別な人に伝えるためには、任意の適切な方法を用いることができる。例えば、情報は専門家に直接または間接的に与えることができ、実験室の技能者は、本明細書記載の胚芽の遺伝子変異をコンピュータに基づく記録中に入力することができる。いくつかの実施形態において、情報は医療または研究記録への物理的な改訂を行うことによって伝えられる。例えば、医療専門家は、当該記録を再検討する他の医療専門家にリスク評価を伝えるために、医療記録に永続的な注釈すなわちフラッグを作成することができる。加えて、リスク評価情報を伝えるために、任意の形式の伝達手段を用いることができる。例えば、郵便、電子メール、電話、及び対面対話を用いることができる。上記情報はまた、当該情報を専門家が電子的に利用可能にすることによって当該専門家に伝えることができる。例えば、上記情報を、図８に示すように、専門家が上記情報にアクセスできるように上記情報をコンピュータデータベース上に格納することによって、上記専門家に伝えることができる。加えて、上記情報を上記専門家のエージェントの役割を果たす病院、医院、または研究施設に伝えることができる。コンピュータに基づく伝達の代表的な図解を に示す。
ＸＶ．実施形態
本開示の趣旨から逸脱することなく実質的に同様の結果を得るために、多数の且つ種々の修正を行うことができることを当業者は理解することとなろう。本明細書で参照される参考文献の全ては、議論される発明の主題に関して、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。以下の例は例証のみを目的として組み入れられ、本開示の範囲を限定することは意図されない。
例１：ＭＩＰプローブライゲーション及び増幅に関する一般的な実験パラメータ
１．プローブ設計
２．１００ａｔｔｏｍｏｌｅ／μｌ／プローブ（６０００万分子／μｌ／プローブ）の貯蔵原液の作製
３．試料の抽出（すなわちｃｆＤＮＡの単離）
Ａ．市販キットを用いてＣｅｌｌ−Ｆｒｅｅ ＤＮＡ ＢＣＴ中へ血液を採取
Ｂ．最適な結果に向けて、カオトロピック塩の存在下、６０℃、無細胞ＤＮＡの抽出の場合は１時間、細胞ゲノムＤＮＡの抽出の場合は２時間、プロテイナーゼＫ処理ステップ（≧３０ｍＡＵ／ｍｌ消化）を含む。
４．アッセイ
１．以下を組み合わせる：
ａ．抽出されたｃｆＤＮＡを
ｂ．１μｌのプローブ原液と
ｃ．１Ｘアンプリガーゼ緩衝液（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）中で
ｄ．７．８μｌの容量に。
２．サーモサイクラー：
ａ．アニーリング反応混合物を９５℃に５分間加熱し
ｂ．次に、温度を一気に１度低下させ、各温度で１分間保持し、６５℃に到達するまでこれを繰り返し
ｃ．６５℃に終夜保持する。
３．以下を添加する：
ａ．１Ｕのアンプリガーゼ酵素（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）
ｂ．１Ｘアンプリガーゼ緩衝液（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）中
ｃ．１４．２μｌの合計容量で。
４．サーモサイクラー：
ａ．５８℃で２分間
５．以下を添加する：
ａ．０．６５ＵのエキソヌクレアーゼＩ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）
ｂ．３．３ＵのエキソヌクレアーゼＩＩＩ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）
ｃ．無視できる反応混合物の容量変化で。
６．サーモサイクラー：
ａ．３７℃で１５分間
ｂ．酵素を失活させるために８０℃で１５分間。
７．本発明者らは高忠実度ポリメラーゼ（例えばＫａｐａ ＨｉＦｉ）を用い、製造者の指示に従った。Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社供給のＨＰＬＣ精製したユニバーサル順方向及び逆方向増幅プライマー：
ａ．ｘｘｘｘｘｘｘｘｘ−ＴＡＣＴＧＡＧＧＴＣＧＧＴＡＣＡＣＴＣＴ
ｂ．ｙｙｙｙｙｙｙｙｙｙ−ＡＧＴＡＧＣＣＧＴＧＡＣＴＡＴＣＧＡＣＴ。
８．サーモサイクラー：
ａ．９５℃で１０分間
ｂ．以下を５サイクル
ｉ．９４℃で３０秒間
ｉｉ．６３℃で３０秒間
ｉｉｉ．７２℃で３０秒間
ｃ．７２℃で５分間。
例２：トリソミー２１の検知
妊娠の第１または第２三半期にある妊婦より末梢血試料を採取する。採取した試料を遠心分離して、無細胞血漿を得る。ＱｉＡｍｐ ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用い、製造者の指示に従って、無細胞ＤＮＡを上記血漿画分より抽出する。１５ｍｌの血液より概略５ｎｇのＤＮＡを得る。
想定されるトリソミー２１の検知用の試料を試験するために、２１番染色体中の着目する遺伝子座に対して設計したＭＩＰプローブを用いる。着目する遺伝子座は、アーム及び動原体領域の両方の領域において、該染色体全体から選択する。ＲＯＳＯなどの、ハイブリダイゼーションのための最適なプローブ及びプローブセットを選択するための最適化アルゴリズムを用いて、特定のプローブ配列を選択する。選択基準としては、部位選択性、２１番染色体の外の遺伝子座との交差反応性の低減、プローブ長さ、ハイブリダシゼーション反応における塩耐性、プローブにおける２次構造の低減及びプローブ−プローブ二量化の低減が挙げられる。個々のプローブセットのみならず、用いるプローブの全てにわたっても、選択基準及び最適化が適用される。２１番染色体に対してハイブリダイズさせるために１００のプローブセットを用い、各プローブは２のプローブを含む。
各プローブセット内で、相補的配列に結合した場合にプローブ間にギャップが存在しないように、第１のプローブ及び第２のプローブを選択する。２１番染色体ＭＩＰプローブに全て共通にオリゴヌクレオチドバーコード配列（「Ｘ」）が割り振られる。図６Ｂに示すように、ＭＩＰプローブ中のバーコード「Ｘ」には、同様な構成である２のユニバーサルプライマー部位（「Ａ」）が隣接する。
２１番染色体にハイブリダイズするように設計されたプローブに加えて、２１番染色体（着目する遺伝子座）外の基準遺伝子座を対象として設計されたＭＩＰプローブを用いる。２番染色体全体にわたってハイブリダイズさせるように設計された１００のＭＩＰプローブを用いる。各プローブセット内で、２１番染色体に対するプローブと同様に、相補的配列に結合した場合にプローブ間にギャップが存在しないように、第１のプローブ及び第２のプローブを選択する。２番染色体基準プローブに対しても、本明細書記載の２１番染色体に対するプローブと同様のやり方で、選択基準及び最適化が適用される。２番染色体ＭＩＰプローブに全て共通にオリゴヌクレオチドバーコード配列（「Ｙ」）が割り振られる。ＭＩＰプローブ中のバーコード「Ｙ」には、図６Ｂに示すものと同様の構成で、２のユニバーサルプライマー部位（「Ａ」）が隣接する。
２１番染色体プローブセット及び２番染色体プローブセットの両方を同時に、単一のハイブリダイゼーション反応において試料に適用する。２番染色体及び２１番染色体の両方に対するプローブの濃度を、無細胞ＤＮＡ試料中の試験される遺伝子座の濃度の５倍過剰で添加する。まず、９５℃で５分間、試料ポリヌクレオチドを変性して一本鎖無細胞ＤＮＡ分子を生成させ、６５℃で終夜、プローブのハイブリダイゼーションを進行させる。次に、ＮＥＢリガーゼ及び緩衝液を添加し、結合したＭＩＰプローブのライゲーションを実施する。上記反応混合物を２５℃とし、ライゲーションを２時間継続させる。
次に、ＥｘｏＩ／ＩＩＩ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社）の組み合わせを添加し、３７℃で５時間エキソヌクレアーゼの反応を実施し、試料中の非結合のプローブを分解する。次に、上記反応混合物を、精製ステップとしてシリカゲルマトリクスに通して、分解した非結合プローブ及び残存無細胞ＤＮＡ試料ポリヌクレオチドを除去する。連結した生成物を上記シリカゲルマトリクスから流出させ、ＫＡＰＡ／ＨＩＦＩポリメラーゼを用いて第２の連鎖合成を実施する。第２の連鎖合成に用いるプローブ中のリンカー配列の一部に対して相補的なプライマー。
第２の連鎖合成の後、プライマー部位「Ａ」に対して相補的なプライマーを用いて、ユニバーサル増幅ステップを実施する。線形増幅を数回繰り返し、それに続いて対数的増幅サイクルを多数回繰り返す。
次に、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ａｄａｐｔｏｒ Ｏｌｉｇｏ Ｍｉｘ及びＩｌｌｕｍｉｎａ ａｄａｐｔｏｒ（非インデックスＹアダプター）を用いて、増幅生成物をユニバーサルアダプターに連結させる。Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ ＰＣＲ精製システム中に供給される磁気ビームを用いて、アダプターが連結したバーコード配列を、非連結アダプター、アダプター二量体、及び他の薬剤から精製する。次に、上記精製した増幅生成物が４０μｌのＱｉａｇｅｎ ＥＢ緩衝液中に流出する。増幅されたＤＮＡを、ＩｌｌｕｍｉｎａのＧｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ ＩＩを用いて配列決定し、片末端リードを得る。バーコードＸ及びＹの両方に関するリードを、Ｉｌｌｕｍｉｎａソフトウェアを用いて計数する。リードのカウントの合計の設定された閾値は１００００に設定され、該閾値後はカンウントを停止する。カウントＸ／Ｙの比を算出し、加えて同様な実験より得たＸ／Ｙ比の集成値を含む基準閾値と比較する。変動係数及びカイ二乗分析を行って、算出された比の統計的意味を付与する。算出された比及び基準値との比較を評価することによりＣＮＶの特定を行う。
例３：１３番、１８番、２１番、Ｘ、及びＹ染色体に関する多重ＣＮＶ試験
例２に記載のものと同様の実験プロトコルストラテジーを用いて、ＣＮＶに関する多重染色体試験を行ってもよい。加えて、ＣＮＶを含む染色体サブ領域を検知してもよい。例２に記載のものと同様の特性を有するＭＩＰプローブを、１３番、１８番、２１番、Ｘ及びＹ染色体にわたる種々の遺伝子座をハイブリダイズするように設計する。基準プローブを、残余の染色体、１〜２０番及び２２番染色体に向けて設計する。個々のプローブセットに固有のバーコード配列を割り振り、染色体の領域中の個々の遺伝子座に関する配列カウントを解明する。加えて、ユニバーサル増幅部位が、更にＩｌｌｕｍｉｎａ相当のアダプター配列が隣接する固有のバーコード配列に隣接するように、ＭＩＰプローブを設計する。この設計により、例２に記載したような、配列決定のためにアダプター配列を組み込むための更なる増幅ステップは不要となる。
例２に記載したものと同様の生化学的及び分子生物学的ステップを用いて、１３番、１８番、２１番、Ｘ、及びＹ染色体にわたる遺伝子座に対してハイブリダイズするＭＩＰプローブに関するライゲーション生成物を単離する。Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォーム配列決定を用い、例２に記載したものと同様な様式で、バーコード−アダプター配列を増幅し、識別し及び、計数する。各染色体に対するバーコードの合計数（バーコード密度）を測定する。あるいは、バーコード配列の数を染色体の長さに規格化して、バーコード密度比を作成してもよい。染色体の長さへの規格化は必須のステップではなく、単に計数ステップを簡略化するために実施することができる。
得られた各染色体に関するバーコード密度をその他の染色体のそれぞれのバーコード密度と比較して、限定された染色体「量」を導き出し、該染色体「量」は、着目する染色体、例えば２１番染色体、に関するバーコード密度と残余の染色体（すなわち１〜２０番、２２番及びＸ染色体）のそれぞれのバーコード密度との比として算出される。試料中の全ての染色体について上記染色体量を特定する。各着目する染色体に関する上記染色体量は、各着目する染色体についてのバーコードの合計数の、残余の染色体のそれぞれのバーコードの合計数に対する相対比における変動の尺度を与える。上記染色体量は、染色体または染色体群、すなわち、試料間で、着目する染色体の変動に最も近接する変動を有する、規格化する染色体を識別することができる。ＣＮＶ遺伝子変異を、着目する染色体の染色体量の比の、１又は複数の残余の染色体についての規格化された染色体量の比に対する対比に基づいて特定する。
例４：自閉症に関する必然的変異体のＳＮＰ及びＣＮＶの検知
胎児対象者における自閉症などの神経発生上の疾患の発症のリスクを評価するために試験を行う。自閉症のいくつかの場合には、あるＳＮＰ及び／またはＣＮＶ遺伝子変異の存在が、対象者の当該疾患発症のより高いリスクの素因となり得る。この試験において、例２及び３に記載したものと同様の実験プロトコルを用いる。但し、この試験においては、ＭＩＰプローブセットを、自閉症の発症に関連すると思われる着目する遺伝子座にハイブリダイズするように設計する。１又は複数の遺伝子座における希なＳＮＰ及び／またはＣＮＶなどの遺伝子変異は、当該疾患に対して、より高いまたはより低いリスクを示す。各遺伝子座について、個々のプローブに固有のバーコードを割り振る。遺伝子座を多数の染色体にわたって分布させる。加えて、各ＭＩＰプローブセット中の２のプローブを、試料ポリヌクレオチドに結合させた際に、該プローブ間にギャップが存在するように設計する。上記ギャップは、自閉症の発症に関係するＳＮＰを含有し得る特定の遺伝子座の中の試料ポリヌクレオチド中の配列に相当する。更に、ＭＩＰプローブを、図６Ａに示すように、ユニバーサル増幅プライミング部位が上記バーコード配列及びハイブリダイゼーション配列に隣接するように設計する。着目する遺伝子座外の遺伝子座に対する基準プローブを、種々のハウスキーピング遺伝子にハイブリダイズするように、且つまたプローブ間にギャップを含み、自閉症に関連しない遺伝子座のＳＮＰを捕えるように設計してもよい。
例２及び３に記載の実験設計に加えるステップにおいて、試料ポリヌクレオチドに結合したライゲーション前のプローブを、クレノウ断片などのＤＮＡポリメラーゼを用いて処理し、２のハイブリダイズしたプローブ間のギャップに配列を重合する。この重合した配列は、当該配列のその領域に存在するＳＮＰのアイデンティティーを捕えることができる。
ライゲーション及び生成物の単離の後、増幅を実施する。複数の異なる増幅ステップを実施してもよい。一方法において、個々のバーコード、または１若しくは複数のバーコードに共通の配列に対して設計したプライマーを用いて増幅を行う。次に、これらの生成物を配列決定し計数する。個々のバーコードの比を比較して、１または複数の遺伝子座におけるＣＮＶを特定することができる。別なステップにおいて、ユニバーサルプライマー部位及び想定されるＳＮＰの位置に隣接して設計された部位の組み合わせを用いて、別な増幅反応を行ってもよい。増幅生成物はバーコード配列及びハイブリダイゼーション配列の一部の両方並びに当該ＳＮＰを含有する配列を含有する。
これらの増幅生成物の配列は、ハイブリダイゼーション配列の一部及び識別されるべきＳＮＰを用いて、基準配列にアラインしてもよい。他の場合においては、バーコードの識別が着目する遺伝子座を示すこととなるため、アラインメントは用いなくてもよい。上記バーコード配列及びＳＮＰの両方を計数する。着目する遺伝子座及び着目する遺伝子座外の遺伝子座の両方に対する対立遺伝子の頻度を算出するために、ＳＮＰとバーコードとの比較を用いる。自閉症に関する特定の必然的変異体（ＳＰＮまたはＣＮＶ）を特定するために、比の比較を用いてもよく、胎児対象者における当該疾患の発症に対するリスクまたはリスクの要因の評価に用いてもよい。
例５：高感度での遺伝子変異の検知
増幅ステップ及び配列決定ステップを用いなくてもよい遺伝子変異に関する試験を行ってもよい。この試験において、本明細書記載のように、但し実験プロトコル中の下流へのステップへと変更して、結合したＭＩＰのライゲーション生成物を生起させる。当該ライゲーション生成物を単離後、これらの生成物それ自体を用いて、当該生成物中に含まれる配列を直接計数することができる。いくつかの場合に、試料ポリヌクレオチド材料は、十分な数のプローブが結合し連結することができるために十分な量であってよく、バーコード及び他の配列が、増幅ステップなしで計数することができる。他の方法において、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ ｎＣｏｕｎｔｅｒシステムなどの高感度検知アッセイシステムを用いて、試料ポリヌクレオチドに結合したプローブの数が比較的低い場合であっても、ライゲーション生成物から直接バーコードを計数することができる。
上記ｎＣｏｕｎｔｅｒは、ハイブリダイゼーション配列及び対応する蛍光ナノ粒子に基づくバーコード配列を含む分子を用いるハイブリダイゼーションに基づく方法を採用する。これらのエレメントが共同で、ハイブリダイゼーション配列のアイデンティティー並びに、試料中に存在するライゲーション生成物に結合したハイブリダイゼーション配列を計数するために用いることができる定量可能なシグナルを提供する。この試験において、ライゲーション生成物を単離した後、ライゲーション生成物中に含まれるバーコード配列のために設計したハイブリダイゼーション配列を含有するｎＣｏｕｎｔｅｒ分子を用いて、バーコード配列を計数することができる。ｎＣｏｕｎｔｅｒ分子中のナノ粒子バーコードを、特定のハイブリダイゼーション配列（ポリヌクレオチドバーコード）に割り振ることができ、従ってＭＩＰプローブに割り振られた特定のバーコードの識別及び計数の両方を提供できる。この試験を、本開示のシステム及び方法に関係する任意の応用に用いることができる。ｎＣｏｕｎｔｅｒシステムの使用、または任意の関係する単一分子アッセイシステムを、ライゲーション生成物中の配列の計数に用いることができる。本方法を、種々のライゲーション生成物の増幅または濃縮ステップと合わせて用いることもできる。
例６：錠型プローブの例
図９は本開示に従ったプローブの例及び該プローブの領域を増幅するためのＰＣＲ増幅プライマーの例を図解する。プローブ例中の「ｎ」は骨格配列を表わし、該骨格配列は環状概略図中に詳細に図解され、該環状概略図は、プローブであって、末端が連結して環状ポリヌクレオチドを形成した、その標的に結合した上記プローブを表わす。上記環状概略図中において、「Ｎ」は分子タグのための縮重塩基を表わし、「Ｂ」はプローブを識別するためのバーコード配列を表わす。ＰＣＲ増幅プライマー中で、「Ｘ」は特定の試料に連結したバーコードの配列を表わす。この例において、プローブの５’末端と３’末端とは、更に伸長することなく連結している。これに続いて、順方向及び逆方向プライマー、Ｒ ＰＣＲプライマー及びＦ ＰＣＲプライマーを用いたＰＣＲが行われ、図１０に該ＰＣＲを図解する。Ｒ ＰＣＲプライマーは連結したプローブに対してハイブリダイズし、ポリメラーゼによって伸長されて第１の伸長生成物を生起する。Ｆ ＰＣＲプライマーは上記第１の伸長生成物に対してハイブリダイズし、ポリメラーゼによって伸長されて第２の伸長生成物を生起する。該第２の伸長生成物及びその後の生成物を、示されたプローブ配列を増幅するための鋳型として用いて、更なるＲ ＰＣＲプライマー及びＦ ＰＣＲプライマーのハイブリダイゼーション及び伸長を繰り返してもよい。次に、Ｉｌｌｕｍｉｎａフローセルを用いて、ＰＣＲ生成物を配列決定する。

Claims (44)

  1. 母親及び胎児のＤＮＡポリヌクレオチドの混合物を含む試料中の１または複数の遺伝子座における遺伝子変異の試験方法であって、
    ａ．試験試料中の母親及び胎児のポリヌクレオチドを得るステップと、
    ｂ．母親及び胎児のポリヌクレオチドを含む前記試料中の、少なくとも１の着目する遺伝子座及び少なくとも１の前記着目する遺伝子座外の遺伝子座に対して複数のプローブをハイブリダイズさせるステップであり、少なくとも１または複数のプローブが識別子と結合している前記ステップと、
    ｃ．任意選択で、ポリメラーゼを用いてプローブを伸長させるステップと、
    ｄ．プローブを連結して連続したライゲーション生成物を生成させるステップと、
    ｅ．結合したライゲーション生成物を非結合プローブより単離するステップと、
    ｆ．前記ライゲーション生成物内に含まれる１または複数の領域を計数するステップであり、前記１または複数の領域が完全に未変化のプローブ以外のエレメントを含む前記ステップと、
    ｇ．１または複数の遺伝子座における遺伝子変異の有無を特定するステップと
    を含む、前記試験方法。
  2. 母親及び胎児のポリヌクレオチドの混合物を含む試料中の１または複数の遺伝子座における遺伝子変異の試験方法であって、
    ａ．試験試料中の母親及び胎児のポリヌクレオチドを得るステップと、
    ｂ．母親及び胎児のポリヌクレオチドを含む前記試料中の、少なくとも１の着目する遺伝子座及び少なくとも１の前記着目する遺伝子座外の遺伝子座に対して相補的なハイブリダイゼーション配列を含む複数のプローブを、ポリヌクレオチドに対してハイブリダイズさせるステップであり、少なくとも１または複数のプローブが識別子配列と結合している前記ステップと、
    ｃ．任意選択で、ポリメラーゼ及びｄＮＴＰを用いてプローブを伸長させるステップと、
    ｄ．プローブを連結して連続したライゲーション生成物を生成させるステップと、
    ｅ．連続したライゲーション生成物を非結合プローブより単離するステップと、
    ｆ．前記ライゲーション生成物由来の領域を増幅して複数の増幅された配列を生成させるステップであり、前記増幅された配列が前記識別子配列を含む前記ステップと、
    ｇ．ステップｆの配列の全てまたは一部を計数するステップであり、計数することが完全に未変化のハイブリダイゼーション配列以外の配列の計数を含む前記ステップと、
    ｈ．１または複数の遺伝子座における遺伝子変異の有無を特定するステップと
    を含む、前記試験方法。
  3. 母親及び胎児のポリヌクレオチドの混合物を含む試料中の１または複数の遺伝子座における遺伝子変異の試験方法であって、
    ａ．試験試料中の母親及び胎児のポリヌクレオチドを得るステップと、
    ｂ．母親及び胎児のポリヌクレオチドを含む前記試料中の、少なくとも１の着目する遺伝子座及び少なくとも１の前記着目する遺伝子座外の遺伝子座に対して相補的なハイブリダイゼーション配列を含む複数のプローブを、ポリヌクレオチドに対してハイブリダイズさせるステップであり、少なくとも１または複数のプローブが識別子配列と結合している前記ステップと、
    ｃ．任意選択で、ポリメラーゼ及びｄＮＴＰを用いてプローブを伸長させるステップと、
    ｄ．プローブを連結して連続したライゲーション生成物を生成させるステップと、
    ｅ．連続したライゲーション生成物を非結合プローブより単離するステップと、
    ｆ．前記識別子配列を含有する前記ライゲーション生成物由来の領域を計数するステップであり、計数することが完全に未変化のハイブリダイゼーション配列以外の配列の計数を含み、配列の計数が増幅ステップを伴わない前記ステップと、
    ｇ．１または複数の遺伝子座における遺伝子変異の有無を特定するステップと
    を含む、前記試験方法。
  4. 母親及び胎児のＤＮＡポリヌクレオチドの混合物を含む試料中の１または複数の遺伝子座における遺伝子変異の試験方法であって、
    ａ．試験試料中の母親及び胎児のポリヌクレオチドを得るステップと、
    ｂ．母親及び胎児のポリヌクレオチドを含む前記試料中の、少なくとも１の着目する遺伝子座及び少なくとも１の前記着目する遺伝子座外の遺伝子座に対して相補的なハイブリダイゼーション配列を含む複数のプローブを、ポリヌクレオチドに対してハイブリダイズさせるステップであり、少なくとも１または複数のプローブが識別子配列と結合している前記ステップと、
    ｃ．同一の遺伝子座中の２のハイブリダイゼーション配列間の領域に１または複数の架橋オリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせるステップと、
    ｄ．任意選択で、ポリメラーゼ及びｄＮＴＰを用いて前記プローブ及び／または架橋オリゴヌクレオチドを伸長させるステップと、
    ｅ．前記プローブ及び架橋オリゴヌクレオチドを連結して連続したライゲーション生成物を生成させるステップと、
    ｆ．連続したライゲーション生成物を非結合プローブより単離するステップと、
    ｇ．前記識別子配列及び完全に未変化のハイブリダイゼーション配列以外の配列を含有する前記ライゲーション生成物由来の領域を増幅するステップと、
    ｈ．ステップ（ｇ）において増幅された前記領域を計数するステップであり、計数することが前記識別子配列及び完全に未変化のハイブリダイゼーション配列以外の配列の計数を含む前記ステップと、
    ｉ．１または複数の遺伝子座における遺伝子変異の有無を特定するステップと
    を含む、前記試験方法。
  5. 母親及び胎児のＤＮＡポリヌクレオチドの混合物を含む試料中の１または複数の遺伝子座における遺伝子変異の試験方法であって、
    ａ．試験試料中の母親及び胎児のポリヌクレオチドを得るステップと、
    ｂ．母親及び胎児のポリヌクレオチドを含む前記試料中の、少なくとも１の着目する遺伝子座及び少なくとも１の前記着目する遺伝子座外の遺伝子座に対して相補的なハイブリダイゼーション配列を含む複数のプローブを、ポリヌクレオチドに対してハイブリダイズさせるステップであり、少なくとも１または複数のプローブが識別子配列と結合している前記ステップと、
    ｃ．同一の遺伝子座中の２のハイブリダイゼーション配列間の領域に１または複数の架橋オリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせるステップと、
    ｄ．任意選択で、ポリメラーゼ及びｄＮＴＰを用いて前記プローブ及び／または架橋オリゴヌクレオチドを伸長させるステップと、
    ｅ．前記プローブ及び架橋オリゴヌクレオチドを連結して連続したライゲーション生成物を生成させるステップと、
    ｆ．連続したライゲーション生成物を非結合プローブより単離するステップと、
    ｇ．前記ライゲーション生成物由来の領域を増幅するステップであり、前記領域が前記識別子及び完全に未変化のハイブリダイゼーション配列以外の配列を含む前記ステップと、
    ｈ．前記識別子配列を計数するステップと、
    ｉ．１または複数の遺伝子座における遺伝子変異の有無を特定するステップと
    を含む、前記試験方法。
  6. 胎児及び母親のポリヌクレオチドの混合物を含む試料中の遺伝子座の遺伝子変異の有無の特定方法またはそのためのアッセイシステムであって、前記アッセイシステムが、前記試料中の遺伝子座に接触するプローブと結合した識別子配列の計数を備える、前記特定方法またはアッセイシステム。
  7. 請求項１、２、３、４、５または６に記載の方法に従って試験される組成物。
  8. 前記遺伝子変異がＣＮＶである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
  9. 前記遺伝子変異が偶発的変異型である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
  10. 前記識別子または識別子配列がバーコード配列である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
  11. プローブが、１または複数の遺伝子座中の領域に対して相補的な、別個の固定された配列である、請求項１に記載の方法。
  12. ハイブリダイゼーション配列が、１または複数の遺伝子座中の領域に対して相補的な、別個の固定された配列である、請求項２〜５のいずれか１項に記載の方法。
  13. プローブが、１または複数の遺伝子座中の領域に対して相補的な配列を有するプレサークルプローブを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
  14. 前記ライゲーション生成物由来の領域を増幅することが１または複数の増幅ステップを含む、請求項２、４または５に記載の方法。
  15. 計数することが配列決定ステップを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
  16. 未変化のハイブリダイゼーション配列がハイブリダイゼーション配列を含まない、請求項２、４または５に記載の方法。
  17. 未変化のハイブリダイゼーション配列が、１００％未満の、遺伝子座に対して相補的なハイブリダイゼーション配列を含む、請求項２〜５のいずれか１項に記載の方法。
  18. 計数することが、ハイブリダイゼーション配列を含有しない配列を計数することを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
  19. 増幅することがユニバーサル増幅ステップによって行われる、請求項２、４または５に記載の方法。
  20. 増幅することが選択的増幅ステップによって行われる、請求項２、４または５に記載の方法。
  21. 増幅することが、ハイブリダイゼーション配列を含有しない配列上で行われる、請求項２、４または５に記載の方法。
  22. 少なくとも１の遺伝子座が遺伝子変異に関して試験される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
  23. 少なくとも１００の遺伝子座が遺伝子変異に関して試験される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
  24. 少なくとも５００の遺伝子座が遺伝子変異に関して試験される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
  25. 少なくとも１０００の遺伝子座が遺伝子変異に関して試験される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
  26. 少なくとも１の遺伝子座が多型性を含むまたは多型性を含むことが想定される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
  27. 少なくとも１の遺伝子座がコピー数に関して試験され、該少なくとも１の遺伝子座が多型性を含む別な遺伝子座とは異なる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
  28. 前記遺伝子座が染色体である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
  29. 前記遺伝子座が染色体サブ領域である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
  30. 前記遺伝子座が単一座である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
  31. 少なくとも１の架橋オリゴヌクレオチドが２のプローブ間の領域に対してハイブリダイズする、請求項４及び５に記載の方法。
  32. 連続したライゲーション生成物を単離することが、非結合プローブの分解を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
  33. 分解がエキソヌクレアーゼを用いて行われる、請求項３１に記載の方法。
  34. 連続したライゲーション生成物を単離することが、結合パートナーを用いたアフィニティーキャプチャーを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
  35. ｄＮＴＰがアフィニティーキャプチャーのための残基と接合されている、請求項２、４または５に記載の方法。
  36. ｄＮＴＰがビオチンと接合されている、請求項３５に記載の方法。
  37. 前記プローブ及びライゲーション生成物が人工的な配列である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
  38. １または複数の領域を計数することまたは前記識別子配列の計数が人工的な配列上で行われる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
  39. 前記遺伝子変異が胎児の異数性である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
  40. 遺伝子変異の有無を特定することに基づいて、医療上の意思決定を行うことを更に含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
  41. 遺伝子変異の有無を特定することに基づいて、治療の推奨を行うことを更に含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
  42. 計数することが統計的分析を用いて行われる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
  43. 統計的分析がコンピュータアルゴリズムを用いて行われる、請求項４２に記載の方法。
  44. 計数することがプロセッサー実行可能な指示を有するコンピュータ可読媒体によって行われる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
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