JP7220200B2 - ライブラリー構築および配列解析のための組成物および方法 - Google Patents
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Description
この出願は、2017年4月19日に出願された米国仮出願第62/487,423号、および2018年4月13日に出願された米国仮出願第62/657,544号(両出願の内容は、全ての目的のためにそれらの全体が参考として本明細書に援用される)に対する優先権の利益を主張する。一部の態様では、本開示は、2017年4月19日に出願された米国仮出願第62/487,422号(この内容は、全ての目的のためにその全体が参考として本明細書に援用される)に関する。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
(項目1)
1組のアダプターを一本鎖ポリヌクレオチドのライブラリーにライゲーションすることを含む方法であって、
前記ライゲーションが、一本鎖DNA(ssDNA)リガーゼによって触媒され;
各一本鎖ポリヌクレオチドが、5’末端でのライゲーションを防止するために前記5’末端でブロックされており;
各アダプターが、前記アダプターがライゲーションされる前記一本鎖ポリヌクレオチドに目印を付けるユニーク分子識別子(UMI)配列を含み、3’末端でのライゲーションを防止するために前記3’末端でブロックされており;かつ
前記アダプターの5’末端が、前記ssDNAリガーゼによって前記一本鎖ポリヌクレオチドの3’末端にライゲーションされて直鎖状ライゲーション生成物を形成し、
それによって、直鎖状一本鎖ライゲーション生成物のライブラリーを得る、
方法。
(項目2)
前記ライゲーションステップ前に、試料から一本鎖ポリヌクレオチドの前記ライブラリーを得るステップをさらに含む、項目1に記載の方法。
(項目3)
前記得るステップが、前記試料からの二本鎖ポリヌクレオチドを変性させることを含む、項目2に記載の方法。
(項目4)
前記試料が、生物学的試料であり、必要に応じて、(1)前記生物学的試料が、いかなる処理も行わずに被験体から直接得られるか;(2)前記生物学的試料中のポリヌクレオチドが、亜硫酸水素塩変換に供されていないか;または(3)前記生物学的試料中のポリヌクレオチドが、部分的なもしくは完全な亜硫酸水素塩変換に供されている、項目2または3に記載の方法。
(項目5)
前記生物学的試料が、疾患または状態、例として、がんまたは新生物を有するか、またはそれを有する疑いのある被験体からのものである、項目4に記載の方法。
(項目6)
前記生物学的試料が、循環腫瘍DNA(ctDNA)を含む試料、例として、血液、血清、血漿もしくは体液試料またはそれらの任意の組み合わせである、項目5に記載の方法。
(項目7)
前記一本鎖ポリヌクレオチドが、約20~約400核酸残基の長さである、項目1から6のいずれか一項に記載の方法。
(項目8)
前記ssDNAリガーゼが、ThermusバクテリオファージRNAリガーゼ、例として、バクテリオファージTS2126 RNAリガーゼ(例えば、CircLigase(商標)およびCircLigase II(商標))、古細菌RNAリガーゼ、例として、Methanobacterium thermoautotrophicum RNAリガーゼ1、T4 RNAリガーゼI、熱安定性5’App DNA/RNAリガーゼ、T4 RNAリガーゼ2、切断型T4 RNAリガーゼ2、例えば、T4 RNAリガーゼ2切断型、T4 RNAリガーゼ2切断型K227Q、T4 RNAリガーゼ2切断型KQまたはT4 DNAリガーゼである、項目1から7のいずれか一項に記載の方法。
(項目9)
各一本鎖ポリヌクレオチドの前記ブロックが、その5’末端でのライゲーションを防止するための脱リン酸化を含む、項目1から8のいずれか一項に記載の方法。
(項目10)
各アダプターの前記ブロックが、その3’末端でのライゲーションを防止するための、炭素スペーサー、ddCTP、ddATP、ddTTP、ddGTP、ヘキサンジオール、トリエチレングリコールおよび/またはヘキサエチレングリコールを含む、項目1から9のいずれか一項に記載の方法。
(項目11)
各アダプターが、前記5’末端において、前記UMI配列に対して5’側であるジヌクレオチド配列、例として、GA(5’~3’)、GG(5’~3’)、AA(5’~3’)またはAG(5’~3’)を含む、項目1から10のいずれか一項に記載の方法。
(項目12)
各アダプター中の前記UMI配列が、約6~約15核酸残基の長さであり、例えば、前記UMI配列が、12merである、項目1から11のいずれか一項に記載の方法。
(項目13)
前記ライゲーション反応が、密集剤の存在下で行われる、項目1から12のいずれかに記載の方法。
(項目14)
前記密集剤が、ポリエチレングリコール(PEG)、例として、PEG4000もしくはPEG6000、デキストランおよび/またはフィコールを含む、項目13に記載の方法。
(項目15)
直鎖状一本鎖ライゲーション生成物の前記ライブラリーを直鎖状二本鎖ライゲーション生成物のライブラリーに変換することをさらに含む、項目1から14のいずれかに記載の方法。
(項目16)
前記変換が、各々が、前記アダプターに逆相補的であり、かつ/または前記アダプターにハイブリダイズ可能な配列を含む、プライマーまたは1組のプライマーを使用する、項目15に記載の方法。
(項目17)
直鎖状二本鎖ライゲーション生成物の前記ライブラリーを増幅および/または精製することをさらに含む、項目15または16に記載の方法。
(項目18)
前記精製が、約50ヌクレオチド~約1000ヌクレオチドの長さのポリヌクレオチドを選択的に精製し、前記精製が、必要に応じて、ビーズベースまたはカラムベースであり、前記精製が、一方が前記直鎖状二本鎖ライゲーション生成物に結合し、もう一方が固体支持体(例として、ビーズ)に結合する特定の結合対(例として、ビオチン/ストレプトアビジン)を使用することを含まない、項目17に記載の方法。
(項目19)
各々が、前記アダプターに逆相補的であり、かつ/または前記アダプターにハイブリダイズ可能な配列を含む、1組のプライマー;および
標的配列(例えば、EGFR遺伝子配列)にハイブリダイズ可能なプライマーであって、必要に応じて、配列番号4~1529からなる群より選択される配列もしくはその相補的もしくは実質的に相補的な配列またはその数値範囲もしくは部分範囲を含むプライマーを使用して、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって、直鎖状二本鎖ライゲーション生成物の前記ライブラリーを増幅し、
それによって、前記標的配列の配列情報を含む直鎖状二本鎖ライゲーション生成物の増幅したライブラリーを得ること
をさらに含む、項目15から18のいずれかに記載の方法。
(項目20)
各々が前記標的配列に特異的な配列を含む、複数のプライマーが、使用され、前記プライマーが、同じまたは異なる標的配列を有し、必要に応じて、前記複数のプライマーが、配列番号4~1529のうちの任意の1つもしくは複数もしくはその相補的もしくは実質的に相補的な配列またはその数値範囲もしくは部分範囲を含む、項目19に記載の方法。
(項目21)
前記標的配列の前記配列情報が、変異、一塩基多型(SNP)、コピー数多型(CNV)またはエピジェネティック変化を含む、項目19または20に記載の方法。
(項目22)
前記変異が、点変異、挿入、欠失、インデル、逆位、トランケーション、融合、転座、増幅またはそれらの任意の組み合わせを含む、項目21に記載の方法。
(項目23)
直鎖状二本鎖ライゲーション生成物の前記増幅したライブラリーが、全ゲノムライブラリーではない、項目19から22のいずれかに記載の方法。
(項目24)
直鎖状二本鎖ライゲーション生成物の前記増幅したライブラリーを精製することをさらに含む、項目19から23のいずれかに記載の方法。
(項目25)
前記精製が、ビーズベースであり、約150ヌクレオチドを超える長さのポリヌクレオチドを選択的に精製し、前記精製が、一方が前記直鎖状二本鎖ライゲーション生成物に結合し、もう一方が固体支持体(例として、ビーズ)に結合する特定の結合対(例として、ビオチン/ストレプトアビジン)を使用することを含まない、項目24に記載の方法。
(項目26)
直鎖状二本鎖ライゲーション生成物の増幅し、精製したライブラリーをシークエンシングすることをさらに含む、項目24または25に記載の方法。
(項目27)
前記シークエンシングステップが、シークエンシングアダプターおよび/または試料特異的バーコードを各直鎖状二本鎖ライゲーション生成物に結合することを含む、項目26に記載の方法。
(項目28)
前記結合ステップが、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を使用して行われる、項目27に記載の方法。
(項目29)
前記シークエンシングの変換率(シークエンシングリードを生ずる、前記ライブラリーにおける一本鎖ポリヌクレオチドの割合)が、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%または少なくとも約90%である、項目26に記載の方法。
(項目30)
被験体における疾患もしくは状態の診断および/または予後、被験体の処置に対する応答性を予測すること、前記疾患/状態もしくは処置についての薬理遺伝学マーカーを同定すること、ならびに/または遺伝情報について集団をスクリーニングすることのために使用される、項目26から29のいずれか一項に記載の方法。
(項目31)
前記疾患または状態が、がんまたは新生物であり、前記処置が、がんまたは新生物処置である、項目30に記載の方法。
(項目32)
項目1から14のいずれかに記載の方法によって生成された直鎖状一本鎖ライゲーション生成物のライブラリー。
(項目33)
項目15から18のいずれかに記載の方法によって生成された直鎖状二本鎖ライゲーション生成物のライブラリー。
(項目34)
項目19から25のいずれかに記載の方法によって生成された直鎖状二本鎖ライゲーション生成物の増幅したライブラリー。
(項目35)
項目26から31のいずれかに記載の方法によって生成されたシークエンシングライブラリー。
(項目36)
一本鎖DNA(ssDNA)リガーゼ;
複数のアダプターであって、各アダプターが、3’末端でのライゲーションを防止するためにブロックされており、一方で、前記アダプターの5’末端が、直鎖状一本鎖ライゲーション生成物を形成するために一本鎖ポリヌクレオチドへのライゲーションに利用可能であり、各アダプターが、前記一本鎖ポリヌクレオチドに目印を付けるユニーク分子識別子(UMI)配列を含む、複数のアダプター
を含む、ライゲーション生成物のライブラリーを構築するためのキット。
(項目37)
試料からの二本鎖ポリヌクレオチドを変性させて前記一本鎖ポリヌクレオチドを得るための変性試薬をさらに含む、項目36に記載のキット。
(項目38)
前記ssDNAリガーゼが、ThermusバクテリオファージRNAリガーゼ、例として、バクテリオファージTS2126 RNAリガーゼ(例えば、CircLigase(商標)およびCircLigase II(商標))、古細菌RNAリガーゼ、例として、Methanobacterium thermoautotrophicum RNAリガーゼ1、T4 RNAリガーゼI、熱安定性5’App DNA/RNAリガーゼ、T4 RNAリガーゼ2、切断型T4 RNAリガーゼ2、例えば、T4 RNAリガーゼ2切断型、T4 RNAリガーゼ2切断型K227Q、T4 RNAリガーゼ2切断型KQまたはT4 DNAリガーゼである、項目36または37に記載のキット。
(項目39)
前記一本鎖ポリヌクレオチドの5’ホスフェート基を除去するための脱リン酸化試薬をさらに含む、項目36から38のいずれか一項に記載のキット。
(項目40)
各アダプターが、その3’末端でのライゲーションを防止するための、炭素スペーサー、ddCTP、ddATP、ddTTP、ddGTP、ヘキサンジオール、トリエチレングリコールおよび/またはヘキサエチレングリコールを含む、項目36から39のいずれか一項に記載のキット。
(項目41)
各アダプターが、その5’末端において、ジヌクレオチド配列、例として、GA(5’~3’)、GG(5’~3’)、AA(5’~3’)またはAG(5’~3’)を含む、項目36から40のいずれか一項に記載のキット。
(項目42)
各アダプター中の前記UMI配列が、約6~約15核酸残基の長さであり、例えば、前記UMI配列が、12merである、項目36から41のいずれか一項に記載のキット。
(項目43)
ライゲーション反応のための密集剤をさらに含む、項目36から42のいずれか一項に記載のキット。
(項目44)
前記密集剤が、ポリエチレングリコール(PEG)、例として、PEG4000もしくはPEG6000、デキストランおよび/またはフィコールを含む、項目13に記載のキット。
(項目45)
前記一本鎖ポリヌクレオチドを二本鎖ポリヌクレオチドに変換するための、各々が、前記アダプターに逆相補的であり、かつ/または前記アダプターにハイブリダイズ可能な配列を含む、プライマーまたは1組のプライマーをさらに含む、項目36から44のいずれかに記載のキット。
(項目46)
プライマーダイマーを除去するための試薬をさらに含む、項目45に記載のキット。
(項目47)
標的配列の配列情報を含む増幅した直鎖状二本鎖ライゲーション生成物を得るための、前記標的配列(例えば、EGFR遺伝子配列)に特異的な配列を含むプライマーであって、必要に応じて、配列番号4~1529からなる群より選択される配列もしくはその相補的もしくは実質的に相補的な配列またはその数値範囲もしくは部分範囲を含むプライマーをさらに含む、項目45または46に記載のキット。
(項目48)
複数のプライマーを含み、各々が前記標的配列に特異的な配列を含み、前記プライマーが、同じまたは異なる標的配列を有し、必要に応じて、前記複数のプライマーが、配列番号4~1529のうちの任意の1つもしくは複数もしくはその相補的もしくは実質的に相補的な配列またはその数値範囲もしくは部分範囲を含む、項目47に記載のキット。
(項目49)
前記増幅した直鎖状二本鎖ライゲーション生成物をシークエンシングするための、シークエンシングアダプターおよび/または試料特異的バーコードをさらに含む、項目47または48に記載のキット。
(項目50)
各構成成分のための別々のバイアルおよび/または前記構成成分を使用するための指示をさらに含む、項目36から49のいずれか一項に記載のキット。
(項目51)
被験体から循環腫瘍DNA(ctDNA)を含む試料を得るための指示および/または前記試料、例として、血液、血清、血漿もしくは体液試料もしくはそれらの任意の組み合わせから一本鎖ポリヌクレオチドを得るための指示をさらに含む、項目50に記載のキット。
(項目52)
AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTG(配列番号1)またはその一部、例えば、約18~22個のヌクレオチド残基を含む一部を含むポリヌクレオチド。
(項目53)
N 1 ~N i が、任意の核酸残基、例えば、A、T、CまたはGであり、iが、約4~約25の整数である、N 1 ...N i AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGまたはその一部を含む、項目52に記載のポリヌクレオチド。
(項目54)
Nが、任意の核酸残基、例えば、A、T、CまたはGである、GANNNNNNNNNNNNAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTG(配列番号2)またはその一部、例えば、約32~36個のヌクレオチド残基を含む一部を含む、項目52または53に記載のポリヌクレオチド。
(項目55)
CACTCTTTCCCTACACGACGC(配列番号3)またはその一部、例えば、約12~20個のヌクレオチド残基を含む一部を含むポリヌクレオチド。
(項目56)
配列番号4~1529からなる群より選択される任意の1つもしくは複数の配列またはその数値範囲もしくは部分範囲を含むプライマー。
(項目57)
配列番号4~1529のうちの任意の1つもしくは複数、例えば、配列番号4~1529のうちの約10、20、50、100、150、200、250もしくは300、400、500、600、700、800、900、1,000、1,100、1,200、1,300、1,400、1,500もしくは1529個すべてもしくはその相補的もしくは実質的に相補的な配列またはその数値範囲もしくは部分範囲を含むプライマー組。
(項目58)
配列番号4~1529のうちの任意の1つもしくは複数、例えば、配列番号4~1529のうちの約10、20、50、100、150、200、250もしくは300、400、500、600、700、800、900、1,000、1,100、1,200、1,300、1,400、1,500もしくは1529個すべてもしくはその相補的もしくは実質的に相補的な配列またはその数値範囲もしくは部分範囲、および
CACTCTTTCCCTACACGACGC(配列番号3)またはその一部を含むプライマー
を含むプライマー組。
(項目59)
配列番号4~1529のうちの任意の1つもしくは複数、例えば、配列番号4~1529のうちの約10、20、50、100、150、200、250もしくは300、400、500、600、700、800、900、1,000、1,100、1,200、1,300、1,400、1,500もしくは1529個すべてもしくはその相補的もしくは実質的に相補的な配列もしくはその数値範囲もしくは部分範囲、
CACTCTTTCCCTACACGACGC(配列番号3)もしくはその一部を含むプライマー、および/または
AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTG(配列番号1)もしくはその一部を含むポリヌクレオチド
を含むキット。
別に定めない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。この節において示されている定義が、参照により本明細書に組み込まれている特許、出願、公開出願および他の刊行物において示されている定義に反するか、または別の点で矛盾する場合、この節において示されている定義が、参照により本明細書に組み込まれている定義に優先する。
一態様においては、本方法の標的(または鋳型)ポリヌクレオチドは、例えば、約100残基~約1000残基の範囲、一部の実施形態においては、約150残基~約400残基の範囲の、断片化ポリヌクレオチドである。
例えば、ctDNAについての、次世代シークエンシングのためのライブラリー構築は一般的に、末端修復、A-テーリングおよびアダプター分子の二本鎖ライゲーションを含む、いくつかのステップからなる。その後、これらのライゲーションされた分子を、ハイブリダイゼーション捕捉を使用してある特定のゲノム領域について1000~2000倍に濃縮し得る。ここ数年にわたるライブラリー構築におけるいくつかの改善にもかかわらず、プロセスは非効率的なままであり、そのため多くの元の分子が様々なステップ中に失われる。二本鎖ライゲーション効率は低いままであり、適切にライゲーションされるのは分子の約20~30%である。加えて、多くの分子は、精製およびハイブリダイゼーション捕捉ステップ中に失われ、そのため、最終的な変換率は、およそ10~20%である。ctDNAにおいて見られる低対立遺伝子率バリアントを調べる場合、感度は低いままである。低対立遺伝子率のライブラリーを検査する場合、低効率が感度の喪失をもたらすので、このことは、低対立遺伝子率変異体をコールする場合、精度を制限することとなる。
構成番号1:/5’ホス/N1N2...Ni-UMI1-M1M2...Mj-ブロッカー1、および
構成番号2:/5’ホス/P1P2...Pk-UMI2-Q1Q2...Ql-ブロッカー2。
一態様においては、図1で示す通り、一本鎖ライゲーション生成物を含有するライブラリーの構築後、本方法は、直鎖状一本鎖ライゲーション生成物のライブラリーを直鎖状二本鎖ライゲーション生成物のライブラリーに変換することをさらに含み得る。一態様においては、変換は、各々が、アダプターに逆相補的であり、かつ/またはアダプターにハイブリダイズ可能な配列を含む、プライマーまたは1組のプライマーを使用する。
一態様においては、図1で示す通り、二本鎖ライゲーション生成物ライブラリーの半標的化増幅は、アダプターに逆相補的であり、かつ/またはこれにハイブリダイズ可能な配列を含むプライマー、および標的配列(例えば、EGFR遺伝子配列)にハイブリダイズ可能な1つのプライマーまたは同じ標的配列もしくは多数の標的配列にハイブリダイズ可能な複数のプライマーを使用することを含む。
一態様においては、方法は、直鎖状二本鎖ライゲーション生成物の増幅し、精製したライブラリーをシークエンシングすることをさらに含む。一態様においては、シークエンシングステップは、シークエンシングアダプターおよび/または試料特異的バーコードを各直鎖状二本鎖ライゲーション生成物に結合することを含む。特定の一態様においては、結合ステップは、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を使用して行われる。
ライゲーション生成物のライブラリーを構築するためのキットが、本明細書で別の態様において開示される。一実施形態においては、キットは、一本鎖DNA(ssDNA)リガーゼを含む。別の態様においては、キットは、複数のアダプターを含む。特定の態様においては、各アダプターは、3’末端でのライゲーションを防止するためにブロックされており、一方で、アダプターの5’末端は、直鎖状一本鎖ライゲーション生成物を形成するために一本鎖ポリヌクレオチドへのライゲーションに利用可能である。さらに特定の態様においては、各アダプターは、一本鎖ポリヌクレオチドに目印を付けるユニーク分子識別子(UMI)配列を含む。
前述の実施形態のいずれかにおいては、ssDNAリガーゼは、ThermusバクテリオファージRNAリガーゼ、例として、バクテリオファージTS2126 RNAリガーゼ(例えば、CircLigase(商標)およびCircLigase II(商標))または古細菌RNAリガーゼ、例として、Methanobacterium thermoautotrophicum RNAリガーゼ1であり得る。他の態様においては、ssDNAリガーゼは、RNAリガーゼ、例として、T4 RNAリガーゼ、例えば、T4 RNAリガーゼI、例えば、New England Biosciences、M0204S、T4 RNAリガーゼ2、例えば、New England Biosciences、M0239S、T4 RNAリガーゼ2切断型、例えば、New England Biosciences、M0242S、T4 RNAリガーゼ2切断型KQ、例えば、M0373SまたはT4 RNAリガーゼ2切断型K227Q、例えば、New England Biosciences、M0351Sである。前述の実施形態のいずれかにおいては、また、ssDNAリガーゼは、熱安定性5’App DNA/RNAリガーゼ、例えば、New England Biosciences、M0319SまたはT4 DNAリガーゼ、例えば、New England Biosciences、M0202Sであり得る。
(実施例1)
この実施例においては、鋳型(例えば、シークエンシングされるポリヌクレオチド)は、約200bp長未満の短いDNA断片である。これらのDNA断片は、血漿から抽出したDNA、(例えば、断片化酵素(fragmentase)によって)酵素処理したゲノムDNAまたは物理的に剪断したDNAを含み得る。物理的に剪断したDNAは、末端修復してもよい。特定の態様においては、鋳型は、ライゲーションのための3’ヒドロキシル基を有する。
この実施例においては、公知のバリアントを含むゲノムDNA(gDNA)試料および血漿試料の両方を、10ngおよび20ngインプットを使用して試験した。gDNA試料は、一塩基多様性(SNV:「一塩基変化」、SNCと互換的に使用される)、インデル、CNVおよび融合を含有した。各バリアントを、様々な対立遺伝子率:5%、1%、0.5%および0.1%でコールした。各変異型についての各対立遺伝子率における感度および特異性を測定した。ここで使用したプライマープールを、表1に示す。各標的特異的プライマーは、プール全体について同じ体積比で、または異なる体積比で使用することができる。例えば、体積比2のプライマーについては、そのプライマーは、比1のプライマーの2倍の体積で添加される。
この実施例においては、例えば、循環腫瘍DNAから、一塩基変化(SNC)、インデル、コピー数多型(CNV)および融合を調べるために、抽出した血漿DNAからライブラリーを構築するための方法を説明する。この実施例の原理として、(例えば、ヒトから)抽出した血漿DNAを、脱リン酸化および変性させる。一本鎖DNAライゲーションにより、ユニバーサルアダプターを各分子の3’末端に付加する。その後、部位特異的プライマーおよびアダプターに対する逆相補的プライマーを使用して、DNAを半標的化PCRに供する。全長アダプターおよびバーコードを各分子に付加する二次的PCRによりライブラリーを作製する。
脱リン酸化:
1.以下のマスターミックスを作製する:
3.プレートを密閉して、軽くボルテックスし、スピンダウンする。
4.以下のプログラム:37℃ 10分間、95℃ 2分間を行う。
5.直後に、プレートを96ウェル氷ブロック上に1分間置き、その後、プレートを除去して、以下のライゲーションを即座に続ける。
1.以下のマスターミックスを作製する:
3.プレートを密閉して、軽くボルテックスし、スピンダウンする。
4.以下のプログラム:60℃ 2時間、80℃ 10分間、85℃ 2分間、4℃で維持を行う。
5.以下の第2鎖合成に即座に進める。
1.以下のマスターミックスを作製する:
3.プレートを密閉して、軽くボルテックスし、スピンダウンする。
4.以下のプログラム:95℃ 30秒間、62℃ 2分間、68℃ 10分間、4℃で維持を行う。
5.以下のAmPure(登録商標)XPビーズクリーンアップに即座に進める。
1.AmPure(登録商標)ビーズを、溶液が均一になるまでボルテックスする。
2.80μlのビーズを第2鎖合成からの生成物に添加し、ピペットで吸引・排出してビーズをホモジナイズする。
3.室温で10分間インキュベートする。
4.プレートを磁石に移し、磁石上で5分間またはすべてのビーズが磁石に向かって移動するまでインキュベートする。
5.すべての上清を除去する。
6.150μLの80% EtOHを添加し、30秒間インキュベートする。
7.上清を除去する。
8.ステップ6~7を繰り返す。
9.すべての残留エタノールが除去されたことを確実にし、プレートを磁石から除去し、室温で3分間インキュベートする。
10.16μlの低TE緩衝液を添加し、ピペットで吸引・排出してビーズをホモジナイズする。
11.室温で2分間インキュベートする。
12.プレートを磁石に移し、磁石上で1分間またはすべてのビーズが磁石に移動するまでインキュベートする。
13.15μlの上清を取り出し、それをきれいなプレートに入れる。
14.以下の第1PCRに進めるか、または-20℃で保存する。
1.以下のマスターミックスを作製する:
3.プレートを密閉して、軽くボルテックスし、スピンダウンする。
4.以下のプログラム:95℃ 3分間、(95℃ 15秒間、72℃ 90秒間)×20、72℃ 1分間、4℃で維持を行う。
5.以下のAmPure(登録商標)XPビーズクリーンアップに即座に進める。
1.AmPure(登録商標)XPビーズを、溶液が均一になるまでボルテックスする。
2.80μlのビーズを第2鎖合成からの生成物に添加し、ピペットで吸引・排出してビーズをホモジナイズする。
3.室温で10分間インキュベートする。
4.プレートを磁石に移し、磁石上で5分間またはすべてのビーズが磁石に向かって移動するまでインキュベートする。
5.すべての上清を除去する。
6.150μLの80% EtOHを添加し、30秒間インキュベートする。
7.上清を除去する。
8.ステップ6~7を繰り返す。
9.すべての残留EtOHが除去されたことを確実にし、プレートを磁石から除去し、室温で3分間インキュベートする。
10.20μlの低TE緩衝液を添加し、ピペットで吸引・排出してビーズをホモジナイズする。
11.室温で2分間インキュベートする。
12.プレートを磁石に移し、磁石上で1分間またはすべてのビーズが磁石に移動するまでインキュベートする。
13.19μlの上清を取り出し、それをきれいなプレートに入れる。
14.以下の第2PCRに進めるか、または-20℃で保存する。
1.以下のマスターミックスを作製し、インデックスプライマーおよびDNAを別々に添加することに留意し、残りのDNAは-20℃で保存する:
3.プレートを密閉して、軽くボルテックスし、スピンダウンする。
4.以下のプログラム:95℃ 3分間、(98℃ 10秒間、65℃ 75秒間)×10、65℃ 2分間、4℃で維持を行う。
5.以下のビーズクリーンアップに即座に進める。
1.AmPure(登録商標)ビーズを、溶液が均一になるまでボルテックスする。
2.40μlのビーズを第2鎖合成からの生成物に添加し、ピペットで吸引・排出してビーズをホモジナイズする。
3.室温で10分間インキュベートする。
4.プレートを磁石に移し、磁石上で5分間またはすべてのビーズが磁石に向かって移動するまでインキュベートする。
5.すべての上清を除去する。
6.150μLの80% EtOHを添加し、30秒間インキュベートする。
7.上清を除去する。
8.ステップ6~7を繰り返す。
9.すべての残留EtOHが除去されたことを確実にし、プレートを磁石から除去し、室温で3分間インキュベートする。
10.25μlの低TE緩衝液を添加し、ピペットで吸引・排出してビーズをホモジナイズする。
11.室温で2分間インキュベートする。
12.プレートを磁石に移し、磁石上で1分間またはすべてのビーズが磁石に移動するまでインキュベートする。
13.24μlの上清を取り出し、きれいなプレートに入れて-20℃で保存する。
LabChip HSキットについて
1.LabChipおよび試薬を4℃から取り出し、RTまで平衡化する(10分間)。
2.必要な場合、新しいゲル-色素溶液を調製する。
3.活性チップウェルの各々を、吸引し、分子グレードのH2Oで2回すすぐ。
4.ラダー管中で12μLのラダー溶液を108μLのH2Oと混合することによってLabChipラダーを調製する。
5.緩衝液管中に750μlのH2Oを調製する。
6.逆ピペッティング技術を使用して、LabChipを調製する。
7.BioRad HardshellまたはThermo Fisher Armadillo96ウェルプレート中で、1μLのライブラリーを19μLの水中に希釈する。
8.LabChipを行う。
1.必要な場合、30μlのIlluminaフォワードおよびリバースプライマーをKapa SYBR Fast qPCR MM-5mL(KK4601)の新しい瓶に添加することによってqPCRマスターミックスを調製する。
2.すべてのライブラリーの1:10,000希釈物を調製する。
3.BioRad Hard-ShellプレートまたはThermo Fisher Armadilloプレート中で、以下の反応を調製し、少なくとも12個のウェルは空のままにする。
6.BioRad C1000サーマルサイクラー上で以下のプログラム:95℃ 5分間>(95℃ 30秒間>60℃ 45秒間>画像ステップ)×35を行う。
7.qPCRデータをエクセル(登録商標)シートとしてエクスポートする。
8.開始濃度を(452/300)倍して、Kapa標準とライブラリーとの間のサイズの差について調節する。
9.ステップ8からの濃度を10倍して、希釈因数について調節し、pMをnMに変換する。
1.300サイクルの次世代シークエンシング試薬カートリッジを冷水に入れることによって解凍し、フローセルを4℃から取り出して室温まで平衡化する。
2.シークエンシングするライブラリーを1:1のモル比でプールする。
3.変性および希釈プロトコールを使用して、ライブラリープールを2.2pMの最終濃度および1300μLを超える最終体積まで希釈する。
4.1300μLを次世代シークエンシング試薬カートリッジのウェル10にロードする。
5.次世代シークエンシング廃液容器を空にし、新しいフローセルおよび緩衝液カートリッジをロードする。
6.ウェル10にライブラリーを含有する次世代シークエンシング試薬カートリッジをロードする。次世代シークエンシングリード長についての設定を以下に示す:
Claims (20)
- 1組のアダプターを一本鎖ポリヌクレオチドのライブラリーにライゲーションすることを含む方法であって、
前記ライゲーションが、一本鎖DNA(ssDNA)リガーゼによって触媒され;
各一本鎖ポリヌクレオチドが、5’末端でのライゲーションを防止するために前記5’末端でブロックされており;
各アダプターが、前記アダプターがライゲーションされる前記一本鎖ポリヌクレオチドに目印を付けるユニーク分子識別子(UMI)配列を含み、3’末端でのライゲーションを防止するために前記3’末端でブロックされており;かつ
前記アダプターの5’末端が、前記ssDNAリガーゼによって前記一本鎖ポリヌクレオチドの3’末端にライゲーションされて直鎖状ライゲーション生成物を形成し、
それによって、直鎖状一本鎖ライゲーション生成物のライブラリーを得、
直鎖状一本鎖ライゲーション生成物の前記ライブラリーを直鎖状二本鎖ライゲーション生成物のライブラリーに変換することをさらに含み、
直鎖状二本鎖ライゲーション生成物の前記ライブラリーを、
前記アダプターに逆相補的であり、かつ/または前記アダプターにハイブリダイズ可能な配列を各々が含む、1組のプライマー;および
標的配列にハイブリダイズ可能なプライマー
を使用して、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって増幅し、
それによって、前記標的配列の配列情報を含む直鎖状二本鎖ライゲーション生成物の増幅したライブラリーを得ることをさらに含み、
直鎖状二本鎖ライゲーション生成物の前記増幅したライブラリーをシークエンシングすることであって、前記シークエンシングの変換率が少なくとも60%であること、をさらに含む、
方法。 - 前記ライゲーションステップ前に、試料から一本鎖ポリヌクレオチドの前記ライブラリーを得るステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記試料が、生物学的試料である、請求項2に記載の方法。
- 前記生物学的試料が、疾患を有するか、またはそれを有する疑いのある被験体からのものである、請求項3に記載の方法。
- 前記生物学的試料が、循環腫瘍DNA(ctDNA)を含む試料である、請求項4に記載の方法。
- 前記ssDNAリガーゼが、ThermusバクテリオファージRNAリガーゼ、古細菌RNAリガーゼ、T4 RNAリガーゼI、熱安定性5’App DNA/RNAリガーゼ、T4 RNAリガーゼ2、切断型T4 RNAリガーゼ2、またはT4 DNAリガーゼである、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
- 各一本鎖ポリヌクレオチドの前記ブロックが、その5’末端でのライゲーションを防止するための脱リン酸化を含む、または
各アダプターの前記ブロックが、その3’末端でのライゲーションを防止するための、炭素スペーサー、ddCTP、ddATP、ddTTP、ddGTP、ヘキサンジオール、トリエチレングリコールおよび/またはヘキサエチレングリコールを含む、
請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。 - 各アダプターが、前記5’末端において、前記UMI配列に対して5’側であるジヌクレオチド配列を含む、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
- 各アダプター中の前記UMI配列が、6~15核酸残基の長さである、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ライゲーション反応が、密集剤の存在下で行われる、請求項1から9のいずれかに記載の方法。
- (1)前記生物学的試料が、いかなる処理も行わずに被験体から直接得られているか;(2)前記生物学的試料中のポリヌクレオチドが、亜硫酸水素塩変換に供されていないか;または(3)前記生物学的試料中のポリヌクレオチドが、部分的なもしくは完全な亜硫酸水素塩変換に供されている、請求項3に記載の方法。
- 前記疾患ががんまたは新生物である、請求項4に記載の方法。
- 各々が前記標的配列に特異的な配列を含む、複数のプライマーが、使用され、前記プライマーが、同じまたは異なる標的配列を有する、請求項1から12のいずれかに記載の方法。
- 前記標的配列の前記配列情報が、変異、一塩基多型(SNP)、コピー数多型(CNV)またはエピジェネティック変化を含む、請求項12または13に記載の方法。
- 前記試料が、血液、血清、血漿もしくは体液試料またはそれらの任意の組み合わせである、請求項5に記載の方法。
- 被験体における疾患の診断および/または予後、被験体の処置に対する応答性を予測すること、前記疾患もしくは処置についての薬理遺伝学マーカーを同定すること、ならびに/または遺伝情報について集団をスクリーニングすることのために使用される、請求項15に記載の方法。
- 前記ジヌクレオチド配列が、GA(5’~3’)、GG(5’~3’)、AA(5’~3’)、またはAG(5’~3’)である、請求項8に記載の方法。
- 前記密集剤が、ポリエチレングリコール(PEG)、デキストランおよび/またはフィコールである、請求項10に記載の方法。
- 前記疾患が、がんまたは新生物であり、および/または、前記処置が、がんまたは新生物処置である、請求項16に記載の方法。
- 標的配列にハイブリダイズ可能な前記プライマーが、配列番号4~1529からなる群より選択される配列またはその相補的な配列を含む、請求項1に記載の方法。
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