JP7220200B2 - ライブラリー構築および配列解析のための組成物および方法 - Google Patents

ライブラリー構築および配列解析のための組成物および方法 Download PDF

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Description

関連出願への相互参照
この出願は、2017年4月19日に出願された米国仮出願第62/487,423号、および2018年4月13日に出願された米国仮出願第62/657,544号(両出願の内容は、全ての目的のためにそれらの全体が参考として本明細書に援用される)に対する優先権の利益を主張する。一部の態様では、本開示は、2017年4月19日に出願された米国仮出願第62/487,422号(この内容は、全ての目的のためにその全体が参考として本明細書に援用される)に関する。
本開示は、例えば、ポリヌクレオチドシークエンシングによって、遺伝子解析およびゲノム解析を行うための組成物、キット、デバイスおよび方法に関する。特定の態様においては、シークエンシング中のライゲーション効率および変換率が改善したライブラリーを構築するための組成物、キットおよび方法が、本明細書で提供される。ある特定の実施形態においては、本明細書中の組成物、キットおよび方法は、ポリヌクレオチド断片、例として、循環腫瘍DNAを含む、被験体の体内の循環ポリヌクレオチド断片を解析するのに有用である。
以下の説明において、ある特定の物品および方法が、背景および導入の目的のために説明されている。本明細書中に含有されるいずれのものも、先行技術の「承認」として解釈されるべきではない。出願人は、該当する場合、適用される法律規定の下に本明細書で参照される物品および方法が先行技術を構成しないことを示す権利を明確に保持している。
ここ数年にわたるライブラリー構築におけるいくつかの改善にもかかわらず、次世代シークエンシングのためのライブラリー構築プロセスは、非効率的なままであり、そのため多くの元の分子が様々なステップ中に失われる。二本鎖ライゲーション効率は低いままであり、適切にライゲーションされるのは分子の約20~30%である。加えて、多くの分子は、精製およびハイブリダイゼーション捕捉ステップ中に失われ、そのため、最終的な変換率は、およそ10~20%である。低対立遺伝子率バリアント、例えば、循環腫瘍DNA(ctDNA)において見られるバリアントを調べる場合、感度は低いままである。低対立遺伝子率を含むライブラリーを検査する場合、低効率が感度の喪失をもたらすので、このことは、低対立遺伝子率変異体をコールする場合、精度を制限することとなる。
当技術分野の上記の問題を克服するための解析技術の改善が要求されている。本開示は、この、および他の関連する要求に取り組む。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
(項目1)
1組のアダプターを一本鎖ポリヌクレオチドのライブラリーにライゲーションすることを含む方法であって、
前記ライゲーションが、一本鎖DNA(ssDNA)リガーゼによって触媒され;
各一本鎖ポリヌクレオチドが、5’末端でのライゲーションを防止するために前記5’末端でブロックされており;
各アダプターが、前記アダプターがライゲーションされる前記一本鎖ポリヌクレオチドに目印を付けるユニーク分子識別子(UMI)配列を含み、3’末端でのライゲーションを防止するために前記3’末端でブロックされており;かつ
前記アダプターの5’末端が、前記ssDNAリガーゼによって前記一本鎖ポリヌクレオチドの3’末端にライゲーションされて直鎖状ライゲーション生成物を形成し、
それによって、直鎖状一本鎖ライゲーション生成物のライブラリーを得る、
方法。
(項目2)
前記ライゲーションステップ前に、試料から一本鎖ポリヌクレオチドの前記ライブラリーを得るステップをさらに含む、項目1に記載の方法。
(項目3)
前記得るステップが、前記試料からの二本鎖ポリヌクレオチドを変性させることを含む、項目2に記載の方法。
(項目4)
前記試料が、生物学的試料であり、必要に応じて、(1)前記生物学的試料が、いかなる処理も行わずに被験体から直接得られるか;(2)前記生物学的試料中のポリヌクレオチドが、亜硫酸水素塩変換に供されていないか;または(3)前記生物学的試料中のポリヌクレオチドが、部分的なもしくは完全な亜硫酸水素塩変換に供されている、項目2または3に記載の方法。
(項目5)
前記生物学的試料が、疾患または状態、例として、がんまたは新生物を有するか、またはそれを有する疑いのある被験体からのものである、項目4に記載の方法。
(項目6)
前記生物学的試料が、循環腫瘍DNA(ctDNA)を含む試料、例として、血液、血清、血漿もしくは体液試料またはそれらの任意の組み合わせである、項目5に記載の方法。
(項目7)
前記一本鎖ポリヌクレオチドが、約20~約400核酸残基の長さである、項目1から6のいずれか一項に記載の方法。
(項目8)
前記ssDNAリガーゼが、ThermusバクテリオファージRNAリガーゼ、例として、バクテリオファージTS2126 RNAリガーゼ(例えば、CircLigase(商標)およびCircLigase II(商標))、古細菌RNAリガーゼ、例として、Methanobacterium thermoautotrophicum RNAリガーゼ1、T4 RNAリガーゼI、熱安定性5’App DNA/RNAリガーゼ、T4 RNAリガーゼ2、切断型T4 RNAリガーゼ2、例えば、T4 RNAリガーゼ2切断型、T4 RNAリガーゼ2切断型K227Q、T4 RNAリガーゼ2切断型KQまたはT4 DNAリガーゼである、項目1から7のいずれか一項に記載の方法。
(項目9)
各一本鎖ポリヌクレオチドの前記ブロックが、その5’末端でのライゲーションを防止するための脱リン酸化を含む、項目1から8のいずれか一項に記載の方法。
(項目10)
各アダプターの前記ブロックが、その3’末端でのライゲーションを防止するための、炭素スペーサー、ddCTP、ddATP、ddTTP、ddGTP、ヘキサンジオール、トリエチレングリコールおよび/またはヘキサエチレングリコールを含む、項目1から9のいずれか一項に記載の方法。
(項目11)
各アダプターが、前記5’末端において、前記UMI配列に対して5’側であるジヌクレオチド配列、例として、GA(5’~3’)、GG(5’~3’)、AA(5’~3’)またはAG(5’~3’)を含む、項目1から10のいずれか一項に記載の方法。
(項目12)
各アダプター中の前記UMI配列が、約6~約15核酸残基の長さであり、例えば、前記UMI配列が、12merである、項目1から11のいずれか一項に記載の方法。
(項目13)
前記ライゲーション反応が、密集剤の存在下で行われる、項目1から12のいずれかに記載の方法。
(項目14)
前記密集剤が、ポリエチレングリコール(PEG)、例として、PEG4000もしくはPEG6000、デキストランおよび/またはフィコールを含む、項目13に記載の方法。
(項目15)
直鎖状一本鎖ライゲーション生成物の前記ライブラリーを直鎖状二本鎖ライゲーション生成物のライブラリーに変換することをさらに含む、項目1から14のいずれかに記載の方法。
(項目16)
前記変換が、各々が、前記アダプターに逆相補的であり、かつ/または前記アダプターにハイブリダイズ可能な配列を含む、プライマーまたは1組のプライマーを使用する、項目15に記載の方法。
(項目17)
直鎖状二本鎖ライゲーション生成物の前記ライブラリーを増幅および/または精製することをさらに含む、項目15または16に記載の方法。
(項目18)
前記精製が、約50ヌクレオチド~約1000ヌクレオチドの長さのポリヌクレオチドを選択的に精製し、前記精製が、必要に応じて、ビーズベースまたはカラムベースであり、前記精製が、一方が前記直鎖状二本鎖ライゲーション生成物に結合し、もう一方が固体支持体(例として、ビーズ)に結合する特定の結合対(例として、ビオチン/ストレプトアビジン)を使用することを含まない、項目17に記載の方法。
(項目19)
各々が、前記アダプターに逆相補的であり、かつ/または前記アダプターにハイブリダイズ可能な配列を含む、1組のプライマー;および
標的配列(例えば、EGFR遺伝子配列)にハイブリダイズ可能なプライマーであって、必要に応じて、配列番号4~1529からなる群より選択される配列もしくはその相補的もしくは実質的に相補的な配列またはその数値範囲もしくは部分範囲を含むプライマーを使用して、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって、直鎖状二本鎖ライゲーション生成物の前記ライブラリーを増幅し、
それによって、前記標的配列の配列情報を含む直鎖状二本鎖ライゲーション生成物の増幅したライブラリーを得ること
をさらに含む、項目15から18のいずれかに記載の方法。
(項目20)
各々が前記標的配列に特異的な配列を含む、複数のプライマーが、使用され、前記プライマーが、同じまたは異なる標的配列を有し、必要に応じて、前記複数のプライマーが、配列番号4~1529のうちの任意の1つもしくは複数もしくはその相補的もしくは実質的に相補的な配列またはその数値範囲もしくは部分範囲を含む、項目19に記載の方法。
(項目21)
前記標的配列の前記配列情報が、変異、一塩基多型(SNP)、コピー数多型(CNV)またはエピジェネティック変化を含む、項目19または20に記載の方法。
(項目22)
前記変異が、点変異、挿入、欠失、インデル、逆位、トランケーション、融合、転座、増幅またはそれらの任意の組み合わせを含む、項目21に記載の方法。
(項目23)
直鎖状二本鎖ライゲーション生成物の前記増幅したライブラリーが、全ゲノムライブラリーではない、項目19から22のいずれかに記載の方法。
(項目24)
直鎖状二本鎖ライゲーション生成物の前記増幅したライブラリーを精製することをさらに含む、項目19から23のいずれかに記載の方法。
(項目25)
前記精製が、ビーズベースであり、約150ヌクレオチドを超える長さのポリヌクレオチドを選択的に精製し、前記精製が、一方が前記直鎖状二本鎖ライゲーション生成物に結合し、もう一方が固体支持体(例として、ビーズ)に結合する特定の結合対(例として、ビオチン/ストレプトアビジン)を使用することを含まない、項目24に記載の方法。
(項目26)
直鎖状二本鎖ライゲーション生成物の増幅し、精製したライブラリーをシークエンシングすることをさらに含む、項目24または25に記載の方法。
(項目27)
前記シークエンシングステップが、シークエンシングアダプターおよび/または試料特異的バーコードを各直鎖状二本鎖ライゲーション生成物に結合することを含む、項目26に記載の方法。
(項目28)
前記結合ステップが、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を使用して行われる、項目27に記載の方法。
(項目29)
前記シークエンシングの変換率(シークエンシングリードを生ずる、前記ライブラリーにおける一本鎖ポリヌクレオチドの割合)が、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%または少なくとも約90%である、項目26に記載の方法。
(項目30)
被験体における疾患もしくは状態の診断および/または予後、被験体の処置に対する応答性を予測すること、前記疾患/状態もしくは処置についての薬理遺伝学マーカーを同定すること、ならびに/または遺伝情報について集団をスクリーニングすることのために使用される、項目26から29のいずれか一項に記載の方法。
(項目31)
前記疾患または状態が、がんまたは新生物であり、前記処置が、がんまたは新生物処置である、項目30に記載の方法。
(項目32)
項目1から14のいずれかに記載の方法によって生成された直鎖状一本鎖ライゲーション生成物のライブラリー。
(項目33)
項目15から18のいずれかに記載の方法によって生成された直鎖状二本鎖ライゲーション生成物のライブラリー。
(項目34)
項目19から25のいずれかに記載の方法によって生成された直鎖状二本鎖ライゲーション生成物の増幅したライブラリー。
(項目35)
項目26から31のいずれかに記載の方法によって生成されたシークエンシングライブラリー。
(項目36)
一本鎖DNA(ssDNA)リガーゼ;
複数のアダプターであって、各アダプターが、3’末端でのライゲーションを防止するためにブロックされており、一方で、前記アダプターの5’末端が、直鎖状一本鎖ライゲーション生成物を形成するために一本鎖ポリヌクレオチドへのライゲーションに利用可能であり、各アダプターが、前記一本鎖ポリヌクレオチドに目印を付けるユニーク分子識別子(UMI)配列を含む、複数のアダプター
を含む、ライゲーション生成物のライブラリーを構築するためのキット。
(項目37)
試料からの二本鎖ポリヌクレオチドを変性させて前記一本鎖ポリヌクレオチドを得るための変性試薬をさらに含む、項目36に記載のキット。
(項目38)
前記ssDNAリガーゼが、ThermusバクテリオファージRNAリガーゼ、例として、バクテリオファージTS2126 RNAリガーゼ(例えば、CircLigase(商標)およびCircLigase II(商標))、古細菌RNAリガーゼ、例として、Methanobacterium thermoautotrophicum RNAリガーゼ1、T4 RNAリガーゼI、熱安定性5’App DNA/RNAリガーゼ、T4 RNAリガーゼ2、切断型T4 RNAリガーゼ2、例えば、T4 RNAリガーゼ2切断型、T4 RNAリガーゼ2切断型K227Q、T4 RNAリガーゼ2切断型KQまたはT4 DNAリガーゼである、項目36または37に記載のキット。
(項目39)
前記一本鎖ポリヌクレオチドの5’ホスフェート基を除去するための脱リン酸化試薬をさらに含む、項目36から38のいずれか一項に記載のキット。
(項目40)
各アダプターが、その3’末端でのライゲーションを防止するための、炭素スペーサー、ddCTP、ddATP、ddTTP、ddGTP、ヘキサンジオール、トリエチレングリコールおよび/またはヘキサエチレングリコールを含む、項目36から39のいずれか一項に記載のキット。
(項目41)
各アダプターが、その5’末端において、ジヌクレオチド配列、例として、GA(5’~3’)、GG(5’~3’)、AA(5’~3’)またはAG(5’~3’)を含む、項目36から40のいずれか一項に記載のキット。
(項目42)
各アダプター中の前記UMI配列が、約6~約15核酸残基の長さであり、例えば、前記UMI配列が、12merである、項目36から41のいずれか一項に記載のキット。
(項目43)
ライゲーション反応のための密集剤をさらに含む、項目36から42のいずれか一項に記載のキット。
(項目44)
前記密集剤が、ポリエチレングリコール(PEG)、例として、PEG4000もしくはPEG6000、デキストランおよび/またはフィコールを含む、項目13に記載のキット。
(項目45)
前記一本鎖ポリヌクレオチドを二本鎖ポリヌクレオチドに変換するための、各々が、前記アダプターに逆相補的であり、かつ/または前記アダプターにハイブリダイズ可能な配列を含む、プライマーまたは1組のプライマーをさらに含む、項目36から44のいずれかに記載のキット。
(項目46)
プライマーダイマーを除去するための試薬をさらに含む、項目45に記載のキット。
(項目47)
標的配列の配列情報を含む増幅した直鎖状二本鎖ライゲーション生成物を得るための、前記標的配列(例えば、EGFR遺伝子配列)に特異的な配列を含むプライマーであって、必要に応じて、配列番号4~1529からなる群より選択される配列もしくはその相補的もしくは実質的に相補的な配列またはその数値範囲もしくは部分範囲を含むプライマーをさらに含む、項目45または46に記載のキット。
(項目48)
複数のプライマーを含み、各々が前記標的配列に特異的な配列を含み、前記プライマーが、同じまたは異なる標的配列を有し、必要に応じて、前記複数のプライマーが、配列番号4~1529のうちの任意の1つもしくは複数もしくはその相補的もしくは実質的に相補的な配列またはその数値範囲もしくは部分範囲を含む、項目47に記載のキット。
(項目49)
前記増幅した直鎖状二本鎖ライゲーション生成物をシークエンシングするための、シークエンシングアダプターおよび/または試料特異的バーコードをさらに含む、項目47または48に記載のキット。
(項目50)
各構成成分のための別々のバイアルおよび/または前記構成成分を使用するための指示をさらに含む、項目36から49のいずれか一項に記載のキット。
(項目51)
被験体から循環腫瘍DNA(ctDNA)を含む試料を得るための指示および/または前記試料、例として、血液、血清、血漿もしくは体液試料もしくはそれらの任意の組み合わせから一本鎖ポリヌクレオチドを得るための指示をさらに含む、項目50に記載のキット。
(項目52)
AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTG(配列番号1)またはその一部、例えば、約18~22個のヌクレオチド残基を含む一部を含むポリヌクレオチド。
(項目53)
~N が、任意の核酸残基、例えば、A、T、CまたはGであり、iが、約4~約25の整数である、N ...N AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGまたはその一部を含む、項目52に記載のポリヌクレオチド。
(項目54)
Nが、任意の核酸残基、例えば、A、T、CまたはGである、GANNNNNNNNNNNNAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTG(配列番号2)またはその一部、例えば、約32~36個のヌクレオチド残基を含む一部を含む、項目52または53に記載のポリヌクレオチド。
(項目55)
CACTCTTTCCCTACACGACGC(配列番号3)またはその一部、例えば、約12~20個のヌクレオチド残基を含む一部を含むポリヌクレオチド。
(項目56)
配列番号4~1529からなる群より選択される任意の1つもしくは複数の配列またはその数値範囲もしくは部分範囲を含むプライマー。
(項目57)
配列番号4~1529のうちの任意の1つもしくは複数、例えば、配列番号4~1529のうちの約10、20、50、100、150、200、250もしくは300、400、500、600、700、800、900、1,000、1,100、1,200、1,300、1,400、1,500もしくは1529個すべてもしくはその相補的もしくは実質的に相補的な配列またはその数値範囲もしくは部分範囲を含むプライマー組。
(項目58)
配列番号4~1529のうちの任意の1つもしくは複数、例えば、配列番号4~1529のうちの約10、20、50、100、150、200、250もしくは300、400、500、600、700、800、900、1,000、1,100、1,200、1,300、1,400、1,500もしくは1529個すべてもしくはその相補的もしくは実質的に相補的な配列またはその数値範囲もしくは部分範囲、および
CACTCTTTCCCTACACGACGC(配列番号3)またはその一部を含むプライマー
を含むプライマー組。
(項目59)
配列番号4~1529のうちの任意の1つもしくは複数、例えば、配列番号4~1529のうちの約10、20、50、100、150、200、250もしくは300、400、500、600、700、800、900、1,000、1,100、1,200、1,300、1,400、1,500もしくは1529個すべてもしくはその相補的もしくは実質的に相補的な配列もしくはその数値範囲もしくは部分範囲、
CACTCTTTCCCTACACGACGC(配列番号3)もしくはその一部を含むプライマー、および/または
AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTG(配列番号1)もしくはその一部を含むポリヌクレオチド
を含むキット。
本概要は、特許請求の範囲の主題の範囲を限定するために使用されるとは意図されない。特許請求の範囲の主題の他の特色、詳細、利用性および利点は、付属の図面において、および付属の特許請求の範囲において開示される態様を含む、詳細な説明から明らかである。
一実施形態においては、1組のアダプターを一本鎖ポリヌクレオチドのライブラリーにライゲーションすることを含む方法が本明細書に提供される。一態様においては、ライゲーションは、一本鎖DNA(ssDNA)リガーゼによって触媒される。別の態様においては、各一本鎖ポリヌクレオチドは、5’末端でのライゲーションを防止するために5’末端でブロックされている。なお別の態様においては、各アダプターは、アダプターがライゲーションされる一本鎖ポリヌクレオチドに目印を付けるユニーク分子識別子(UMI)配列を含む。一つの別の態様においては、各アダプターは、3’末端でのライゲーションを防止するために3’末端でブロックされている。一態様においては、アダプターの5’末端は、ssDNAリガーゼによって前記一本鎖ポリヌクレオチドの3’末端にライゲーションされて直鎖状ライゲーション生成物を形成している。前述の実施形態のいずれかにおいて、直鎖状一本鎖ライゲーション生成物のライブラリーが得られ得る。
別の実施形態においては、1組のアダプターを一本鎖ポリヌクレオチドのライブラリーにライゲーションすることを含む方法が提供され、この方法においては、ライゲーションが、一本鎖DNA(ssDNA)リガーゼによって触媒され、各一本鎖ポリヌクレオチドが、5’末端でのライゲーションを防止するために5’末端でブロックされており、各アダプターが、そのアダプターがライゲーションされる一本鎖ポリヌクレオチドに目印を付けるユニーク分子識別子(UMI)配列を含み、各アダプターが、3’末端でのライゲーションを防止するために3’末端でブロックされており、アダプターの5’末端が、ssDNAリガーゼによって一本鎖ポリヌクレオチドの3’末端にライゲーションされて直鎖状ライゲーション生成物を形成し、それによって、直鎖状一本鎖ライゲーション生成物のライブラリーを得る。
前述の実施形態のいずれかにおいては、方法は、ライゲーションステップ前に、試料から一本鎖ポリヌクレオチドのライブラリーを得るステップをさらに含み得る。一態様においては、得るステップは、試料からの二本鎖ポリヌクレオチドを変性させることを含む。
前述の実施形態のいずれかにおいては、試料は、生物学的試料であり得る。いくつかの実施形態においては、生物学的試料は、いかなる処理も行わずに被験体から直接得られる。いくつかの実施形態においては、生物学的試料中のポリヌクレオチドは、亜硫酸水素塩変換に供されていない。いくつかの実施形態においては、生物学的試料中のポリヌクレオチドは、部分的なもしくは完全な亜硫酸水素塩変換に供されている。ある特定の態様においては、生物学的試料は、疾患または状態、例として、がんまたは新生物を有するか、またはそれを有する疑いのある被験体からのものである。
前述の実施形態のいずれかにおいては、一本鎖ポリヌクレオチドは、循環腫瘍DNA(ctDNA)を含む試料、例として、血液、血清、血漿もしくは体液試料またはそれらの任意の組み合わせからのものであり得る。
前述の実施形態のいずれかにおいては、一本鎖ポリヌクレオチドは、約20~約400核酸残基の長さ、例えば、約80、約100、約120、約140、約160、約180、約200、約220または約240核酸残基の長さであり得る。
前述の実施形態のいずれかにおいては、ssDNAリガーゼは、ThermusバクテリオファージRNAリガーゼ、例として、バクテリオファージTS2126 RNAリガーゼ(例えば、CircLigase(商標)およびCircLigase II(商標))または古細菌RNAリガーゼ、例として、Methanobacterium thermoautotrophicum RNAリガーゼ1であり得る。他の態様においては、ssDNAリガーゼは、RNAリガーゼ、例として、T4 RNAリガーゼ、例えば、T4 RNAリガーゼI、例えば、New England Biosciences、M0204S、T4 RNAリガーゼ2、例えば、New England Biosciences、M0239S、T4 RNAリガーゼ2切断型、例えば、New England Biosciences、M0242S、T4 RNAリガーゼ2切断型KQ、例えば、M0373SまたはT4 RNAリガーゼ2切断型K227Q、例えば、New England Biosciences、M0351Sである。前述の実施形態のいずれかにおいては、また、キットは、熱安定性5’App DNA/RNAリガーゼ、例えば、New England Biosciences、M0319SまたはT4 DNAリガーゼ、例えば、New England Biosciences、M0202Sを含み得る。
前述の実施形態のいずれかにおいては、各一本鎖ポリヌクレオチドのブロックは、その5’末端でのライゲーションを防止するための脱リン酸化を含み得る。
前述の実施形態のいずれかにおいては、各アダプターのブロックは、その3’末端でのライゲーションを防止するための、炭素スペーサー、ddCTP、ddATP、ddTTP、ddGTP、ヘキサンジオール、トリエチレングリコールおよび/またはヘキサエチレングリコールを含み得る。
前述の実施形態のいずれかにおいては、各アダプターは、5’末端において、UMI配列に対して5’側であるジヌクレオチド配列、例として、GA(5’~3’)、GG(5’~3’)、AA(5’~3’)またはAG(5’~3’)を含み得る。
前述の実施形態のいずれかにおいては、各アダプター中のUMI配列は、約6~約15核酸残基の長さであり、例えば、前記UMI配列が、12merであり得る。
前述の実施形態のいずれかにおいては、ライゲーション反応は、密集剤の存在下で行われ得る。一態様においては、密集剤は、ポリエチレングリコール(PEG)、例として、PEG4000もしくはPEG6000、デキストランおよび/またはフィコールを含む。
前述の実施形態のいずれかにおいては、方法は、直鎖状一本鎖ライゲーション生成物のライブラリーを直鎖状二本鎖ライゲーション生成物のライブラリーに変換することをさらに含み得る。一態様においては、変換は、各々が、アダプターに逆相補的であり、かつ/またはアダプターにハイブリダイズ可能な配列を含む、プライマーまたは1組のプライマーを使用する。
前述の実施形態のいずれかにおいては、方法は、直鎖状二本鎖ライゲーション生成物のライブラリーを増幅および/または精製することをさらに含み得る。一態様においては、精製は、ビーズベースである。別の態様においては、精製は、サイズ選択に基づき、例えば、精製ステップは、約50ヌクレオチド~約1000ヌクレオチドの長さのポリヌクレオチドを選択的に精製し、例えば、約40ヌクレオチドの長さのアダプター(ならびに約40bpのプライマーダイマーおよび/またはプライマー-アダプター二本鎖)は除去される。別の態様においては、精製は、一方が直鎖状二本鎖ライゲーション生成物に結合し、もう一方が固体支持体(例として、ビーズ)に結合する特定の結合対(例として、ビオチン/ストレプトアビジン)を使用することを含まない。一態様においては、精製は、例えば、dsDNAまたはssDNA精製カラム、例として、ZymoまたはQiagenからのカラムを使用することによる、カラムベースである。
前述の実施形態のいずれかにおいては、本明細書の方法は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって、直鎖状二本鎖ライゲーション生成物のライブラリーを増幅して、標的配列の配列情報を含む直鎖状二本鎖ライゲーション生成物の増幅したライブラリーを得ることをさらに含み得る。一態様においては、方法は、各々が、アダプターに逆相補的であり、かつ/またはアダプターにハイブリダイズ可能な配列を含む、プライマーまたは1組のプライマーを使用することを含む。別の態様においては、方法は、標的配列(例えば、EGFR遺伝子配列)にハイブリダイズ可能なプライマーを使用することをさらに含む。
前述の実施形態のいずれかにおいては、本明細書の方法は、各々が、アダプターに逆相補的であり、かつ/またはアダプターにハイブリダイズ可能な配列を含む、プライマーまたは1組のプライマー、標的配列(例えば、EGFR遺伝子配列)にハイブリダイズ可能なプライマーを使用して、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって、直鎖状二本鎖ライゲーション生成物のライブラリーを増幅し、それによって、標的配列の配列情報を含む直鎖状二本鎖ライゲーション生成物の増幅したライブラリーを得ることを含み得る。
前述の実施形態のいずれかにおいては、標的特異的プライマーは、配列番号4~1529からなる群より選択される任意の1つもしくは複数の配列またはその相補的もしくは実質的に相補的な配列を含み得る。
前述の実施形態のいずれかにおいては、各々が標的配列に特異的な配列を含む、複数のプライマーを使用してもよく、プライマーは、同じまたは異なる標的配列を有する。一態様においては、複数のプライマーは、配列番号4~1529のうちの任意の1つもしくは複数、例えば、約10、20、50、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1,000、1,100、1,200、1,300、1,400、1,500もしくは1529個すべてもしくはその相補的もしくは実質的に相補的な配列またはその数値範囲もしくは部分範囲を含む。
前述の実施形態のいずれかにおいては、標的配列の配列情報は、変異、一塩基多型(SNP)、コピー数多型(CNV)またはエピジェネティック変化を含み得る。一態様においては、変異は、点変異、挿入、欠失、逆位、トランケーション、融合、増幅またはそれらの任意の組み合わせを含む。
前述の実施形態のいずれかにおいては、直鎖状二本鎖ライゲーション生成物の増幅したライブラリーは、全ゲノムライブラリー以外のライブラリー、例えば、半標的化(semi-targeted)ゲノムライブラリーであり得る。
前述の実施形態のいずれかにおいては、方法は、直鎖状二本鎖ライゲーション生成物の増幅したライブラリーを精製することをさらに含み得る。一態様においては、精製は、ビーズベースである。別の態様においては、精製は、サイズ選択に基づき、例えば、精製ステップは、約150ヌクレオチドを超える長さのポリヌクレオチドを選択的に精製する。別の態様においては、精製は、一方が直鎖状二本鎖ライゲーション生成物に結合し、もう一方が固体支持体(例として、ビーズ)に結合する特定の結合対(例として、ビオチン/ストレプトアビジン)を使用することを含まない。一態様においては、精製は、例えば、dsDNAまたはssDNA精製カラム、例として、ZymoまたはQiagenからのカラムを使用することによる、カラムベースである。
前述の実施形態のいずれかにおいては、方法は、直鎖状二本鎖ライゲーション生成物の増幅し、精製したライブラリーをシークエンシングすることをさらに含み得る。一態様においては、シークエンシングステップは、シークエンシングアダプターおよび/または試料特異的バーコードを各直鎖状二本鎖ライゲーション生成物に結合することを含む。特定の一態様においては、結合ステップは、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を使用して行われる。
前述の実施形態のいずれかにおいては、シークエンシングの変換率(シークエンシングリードを生ずる、ライブラリーにおける一本鎖ポリヌクレオチドの割合)は、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%または少なくとも約90%であり得る。
前述の実施形態のいずれかにおいては、方法は、被験体における疾患もしくは状態の診断および/または予後、被験体の処置に対する応答性を予測すること、疾患/状態もしくは処置についての薬理遺伝学マーカーを同定すること、ならびに/または遺伝情報について集団をスクリーニングすることのために使用され得る。一態様においては、疾患または状態は、がんまたは新生物であり、処置は、がんまたは新生物処置である。
別の態様においては、前述の実施形態のいずれかによる方法によって生成された直鎖状一本鎖ライゲーション生成物のライブラリーが本明細書に開示される。
なお別の態様においては、前述の実施形態のいずれかによる方法によって生成された直鎖状二本鎖ライゲーション生成物のライブラリーが本明細書に開示される。
さらに別の態様においては、前述の実施形態のいずれかによる方法によって生成された直鎖状二本鎖ライゲーション生成物の増幅したライブラリーが本明細書に開示される。
別の一態様においては、前述の実施形態のいずれかによる方法によって生成されたシークエンシングライブラリーが本明細書に開示される。
別の態様において本明細書に開示されるのは、ライゲーション生成物のライブラリーを構築するためのキットである。別の態様においては、キットは、一本鎖DNA(ssDNA)リガーゼを含む。別の態様においては、キットは、複数のアダプターを含む。特定の態様においては、各アダプターは、3’末端でのライゲーションを防止するためにブロックされており、一方で、アダプターの5’末端は、直鎖状一本鎖ライゲーション生成物を形成するために一本鎖ポリヌクレオチドへのライゲーションに利用可能である。さらに特定の態様においては、各アダプターは、一本鎖ポリヌクレオチドに目印を付けるユニーク分子識別子(UMI)配列を含む。
前述の実施形態のいずれかにおいては、ライゲーション生成物のライブラリーを構築するためのキットは、ssDNAリガーゼおよび複数のアダプターを含んでもよく、各アダプターは、3’末端でのライゲーションを防止するためにブロックされており、一方で、アダプターの5’末端は、直鎖状一本鎖ライゲーション生成物を形成するために一本鎖ポリヌクレオチドへのライゲーションに利用可能であり、各アダプターは、一本鎖ポリヌクレオチドに目印を付けるUMI配列を含む。
前述の実施形態のいずれかにおいては、キットは、試料からの二本鎖ポリヌクレオチドを変性させて一本鎖ポリヌクレオチドを得るための変性試薬をさらに含み得る。
前述の実施形態のいずれかにおいては、キットは、ThermusバクテリオファージRNAリガーゼ、例として、バクテリオファージTS2126 RNAリガーゼ(例えば、CircLigase(商標)およびCircLigase II(商標))または古細菌RNAリガーゼ、例として、Methanobacterium thermoautotrophicum RNAリガーゼ1を含み得る。前述の実施形態のいずれかにおいては、キットは、RNAリガーゼ、例として、T4 RNAリガーゼ、例えば、T4 RNAリガーゼI、例えば、New England Biosciences、M0204S、T4 RNAリガーゼ2、例えば、New England Biosciences、M0239S、T4 RNAリガーゼ2切断型、例えば、New England Biosciences、M0242S、T4 RNAリガーゼ2切断型KQ、例えば、M0373SまたはT4 RNAリガーゼ2切断型K227Q、例えば、New England Biosciences、M0351Sを含み得る。前述の実施形態のいずれかにおいては、また、キットは、熱安定性5’App DNA/RNAリガーゼ、例えば、New England Biosciences、M0319SまたはT4 DNAリガーゼ、例えば、New England Biosciences、M0202Sを含み得る。
前述の実施形態のいずれかにおいては、キットは、一本鎖ポリヌクレオチドの5’ホスフェート基を除去するための脱リン酸化試薬をさらに含み得る。前述の実施形態のいずれかにおいては、各アダプターのブロックは、その3’末端でのライゲーションを防止するための、炭素スペーサー、ddCTP、ddATP、ddTTP、ddGTP、ヘキサンジオール、トリエチレングリコールおよび/またはヘキサエチレングリコールを含み得る。キットの実施形態のいずれかにおいては、各アダプターは、その5’末端において、ジヌクレオチド配列、例として、GA(5’~3’)、GG(5’~3’)、AA(5’~3’)またはAG(5’~3’)を含み得る。前述の実施形態のいずれかにおいては、各アダプター中のUMI配列は、約6~約15核酸残基の長さであり、例えば、前記UMI配列が、12merであり得る。
前述の実施形態のいずれかにおいては、キットは、ライゲーション反応のための密集剤をさらに含み得る。一態様においては、密集剤は、ポリエチレングリコール(PEG)、例として、PEG4000もしくはPEG6000、デキストランおよび/またはフィコールを含む。
前述の実施形態のいずれかにおいては、キットは、一本鎖ポリヌクレオチドを二本鎖ポリヌクレオチドに変換するための、各々が、前記アダプターに逆相補的であり、かつ/または前記アダプターにハイブリダイズ可能な配列を含む、プライマーまたは1組のプライマーをさらに含み得る。
前述の実施形態のいずれかにおいては、キットは、プライマーダイマーおよび/またはプライマー-アダプター二本鎖を除去するための試薬をさらに含み得る。
前述の実施形態のいずれかにおいては、キットは、標的配列の配列情報を含む増幅した直鎖状二本鎖ライゲーション生成物を得るための、標的配列(例えば、EGFR遺伝子配列)に特異的な配列を含むプライマーをさらに含み得る。前述の実施形態のいずれかにおいては、標的特異的プライマーは、配列番号4~1529からなる群より選択される任意の1つもしくは複数の配列またはその相補的もしくは実質的に相補的な配列を含み得る。
前述の実施形態のいずれかにおいては、キットは、各々が標的配列に特異的な配列を含む、複数のプライマーを含んでもよく、プライマーは、同じまたは異なる標的配列を有する。一態様においては、複数のプライマーは、配列番号4~1529のうちの任意の1つもしくは複数、例えば、約10、20、50、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1,000、1,100、1,200、1,300、1,400、1,500もしくは1529個すべてもしくはその相補的もしくは実質的に相補的な配列またはその数値範囲もしくは部分範囲を含む。
前述の実施形態のいずれかにおいては、キットは、増幅した直鎖状二本鎖ライゲーション生成物をシークエンシングするための、シークエンシングアダプターおよび/または試料特異的バーコードをさらに含み得る。
前述の実施形態のいずれかにおいては、キットは、各構成成分のための別々のバイアルおよび/または構成成分を使用するための指示をさらに含み得る。一態様においては、指示は、循環腫瘍DNA(ctDNA)を含む試料、例として、血液、血清、血漿もしくは体液試料またはそれらの任意の組み合わせから一本鎖ポリヌクレオチドを得ることを含む。
AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTG(配列番号1)またはその一部、例えば、約18~22個のヌクレオチド残基を含む一部を含むポリヌクレオチドも本明細書に開示される。
一態様においては、N~Nが、任意の核酸残基、例えば、A、T、CまたはGであり、iが、約4~約25の整数である、N...NAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGまたはその一部を含む、ポリヌクレオチドが本明細書に開示される。
別の態様においては、Nが、任意の核酸残基、例えば、A、T、CまたはGである、GANNNNNNNNNNNNAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTG(配列番号2)またはその一部、例えば、約32~36個のヌクレオチド残基を含む一部を含む、ポリヌクレオチドが本明細書に開示される。
一態様においては、CACTCTTTCCCTACACGACGC(配列番号3)またはその一部、例えば、約12~20個のヌクレオチド残基を含む一部を含むポリヌクレオチドが本明細書に開示される。
他の一態様においては、配列番号4~1529からなる群より選択される任意の1つもしくは複数の配列を含むプライマーが本明細書に開示される。一態様においては、配列番号4~1529のうちの任意の1つもしくは複数、例えば、約10、20、50、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1,000、1,100、1,200、1,300、1,400、1,500もしくは1529個すべてもしくはその相補的もしくは実質的に相補的な配列またはその数値範囲もしくは部分範囲を含むプライマー組が本明細書に開示される。一態様においては、配列番号4~1529のうちの任意の1つもしくは複数、例えば、約10、20、50、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1,000、1,100、1,200、1,300、1,400、1,500もしくは1529個すべてもしくはその相補的もしくは実質的に相補的な配列またはその数値範囲もしくは部分範囲、および CACTCTTTCCCTACACGACGC(配列番号3)またはその一部を含むプライマーを含むプライマー組が本明細書に開示される。一態様においては、配列番号4~1529のうちの任意の1つもしくは複数、例えば、約10、20、50、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1,000、1,100、1,200、1,300、1,400、1,500もしくは1529個すべてもしくはその相補的もしくは実質的に相補的な配列もしくはその数値範囲もしくは部分範囲、CACTCTTTCCCTACACGACGC(配列番号3)もしくはその一部を含むプライマー、および/またはAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTG(配列番号1)もしくはその一部を含むポリヌクレオチドを含むキットが本明細書に開示される。
図1は、本開示の一態様による、一本鎖ポリヌクレオチドライブラリーを構築し、ライブラリーを使用してシークエンシング解析を行うためのステップを示す。
図2は、本開示の一態様による、シークエンシングのための標的分子を含む構築物を示す。
図3は、本明細書で開示する方法を使用して予測された対立遺伝子率と観察された対立遺伝子率との線形相関を示し、本方法が優れた再現性を有することを示す。
図4は、本明細書で開示する方法を使用した、エラー補正前後の複数のバリアントについての対立遺伝子率を比較する。
図5は、本明細書で開示する方法とライブラリー構築およびシークエンシングのための従来型ハイブリダイゼーション捕捉法との性能パラメータを比較する。
図6は、本明細書で開示する方法(TitanSeq)と従来型ハイブリダイゼーション捕捉法との変換率を比較する。
図7は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。 図7は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。 図7は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。 図7は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。 図7は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。 図7は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。 図7は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。 図7は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。 図7は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。 図7は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。 図7は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。 図7は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。 図7は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。 図7は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。 図7は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。 図7は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。 図7は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。 図7は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。 図7は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。 図7は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。 図7は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。 図7は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。 図7は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。 図7は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。 図7は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。 図7は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。 図7は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。 図7は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。 図7は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。 図7は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。 図7は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。 図7は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。 図7は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。 図7は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。 図7は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。 図7は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。 図7は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。 図7は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。 図7は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。 図7は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。 図7は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。 図7は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。 図7は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。 図7は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。 図7は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。 図7は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。 図7は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。 図7は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。 図7は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。 図7は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。 図7は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。 図7は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。 図7は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。 図7は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。 図7は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。 図7は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。 図7は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。 図7は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。 図7は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。 図7は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。 図7は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。 図7は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。 図7は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。 図7は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。 図7は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。
本開示の完全な理解を提供するために、以下の説明において多くの特定の詳細が示されている。これらの詳細は、例の目的のために提供され、特許請求の範囲の主題は、これらの特定の詳細の一部またはすべてを伴わず、特許請求の範囲によって実施され得る。特許請求の範囲の主題の範囲から逸脱することなく、他の実施形態を使用してもよく、構造的変化を行ってもよいことが理解されるべきである。個々の実施形態のうちの1つまたは複数において説明されている様々な特色および機能性は、それらが説明されている特定の実施形態へのそれらの適用可能性において限定されないことを理解すべきである。その代わりに、それらは、そのような実施形態が説明されているかどうかにかかわらず、およびそのような特色が説明されている実施形態の一部であると示されているかどうかにかかわらず、単独で、または組み合わせで、本開示の他の実施形態のうちの1つまたは複数に適用することができる。明確にするために、特許請求の範囲の主題が不必要に不明確にならないように、特許請求の範囲の主題に関連する技術分野において公知の技術材料については詳細に説明していない。
この出願において参照される特許文献、科学論文およびデータベースを含むすべての刊行物は、各個々の刊行物が参照により個々に組み込まれているのと同様にすべての目的についてその全体が参照により組み込まれている。刊行物または文献の引用は、それらのいずれかが関係先行技術であるという承認とは意図されず、それが、これらの刊行物または文献の内容または日付についてのいかなる承認を構成することもない。
すべての見出しは、読み手の便利のためであり、指定されない限り、見出しに続く本文の意味を限定するために使用されるべきではない。
提供される実施形態の実施は、別に示されない限り、当技術分野において実施する当業者の技術の範囲内である有機化学、ポリマー技術、分子生物学(組換え技術を含む)、細胞生物学、生化学およびシークエンシング技術の従来技術および説明を用いる。そのような従来技術として、ポリペプチドおよびタンパク質合成および修飾、ポリヌクレオチド合成および修飾、ポリマーアレイ合成、ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションおよびライゲーション、ハイブリダイゼーションの検出ならびにヌクレオチドシークエンシングが挙げられる。好適な技術の特定の例示は、本明細書の実施例を参照して行われ得る。しかしながら、他の同等の従来手順もまた、もちろん、使用することができる。そのような従来技術および説明は、標準の試験室マニュアル、例として、それらのすべてをすべての目的について参照によりそれらを全体として本明細書に組み込む、Greenら編、Genome Analysis: A Laboratory Manual Series(I~IV巻)(1999年);Weiner、Gabriel、Stephens編、Genetic Variation: A Laboratory Manual(2007年);Dieffenbach、Dveksler編、PCR Primer: A Laboratory Manual(2003年);BowtellおよびSambrook、DNA Microarrays: A Molecular Cloning Manual(2003年);Mount、Bioinformatics: Sequence and Genome Analysis(2004年);SambrookおよびRussell、Condensed Protocols from Molecular Cloning: A Laboratory Manual(2006年);ならびにSambrookおよびRussell、Molecular Cloning: A Laboratory Manual(2002年)(すべてCold Spring Harbor Laboratory Pressから);Ausubelら編、Current Protocols in Molecular Biology(1987年);T. Brown編、Essential Molecular Biology(1991年)、IRL Press;Goeddel編、Gene Expression Technology(1991年)、Academic Press;A. Bothwellら編、Methods for Cloning and Analysis of Eukaryotic Genes(1990年)、Bartlett Publ.;M. Kriegler、Gene Transfer and Expression(1990年)、Stockton Press;R. Wuら編、Recombinant DNA Methodology(1989年)、Academic Press;M. McPhersonら、PCR: A Practical Approach(1991年)、IRL Press at Oxford University Press;Stryer、Biochemistry(第4版)(1995年)、W. H. Freeman、New York N.Y.;Gait、Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach(2002年)、IRL Press、London;NelsonおよびCox、Lehninger, Principles of Biochemistry(2000年)第3版、W. H. Freeman Pub.、New York、N.Y.;Bergら、Biochemistry(2002年)第5版、W. H. Freeman Pub.、New York、N.Y.において見ることができる。
A. 定義
別に定めない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。この節において示されている定義が、参照により本明細書に組み込まれている特許、出願、公開出願および他の刊行物において示されている定義に反するか、または別の点で矛盾する場合、この節において示されている定義が、参照により本明細書に組み込まれている定義に優先する。
本明細書で使用されるとき、「a」または「an」は、「少なくとも1つ」または「1つまたは複数」を意味する。本明細書で使用されるとき、単数形「a」、「an」および「the」は、文脈が明確に別のように指定しない限り、複数の参照物を含む。
この開示全体を通して、特許請求の範囲の主題の様々な態様が、範囲形式で示される。範囲形式での説明は、単に便利および簡潔にするためであり、特許請求の範囲の主題の範囲に対する融通の利かない限定として解釈されるべきではないことを理解するべきである。したがって、範囲の説明は、具体的に開示されるすべての可能な部分範囲およびその範囲内の個々の数値を有すると考えられるべきである。例えば、値の範囲が示される場合、その範囲の上限と下限との間の各間の値、および任意の他の示される値またはその示される範囲内の間の値は、特許請求の範囲の主題に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限および下限は独立して、より小さい範囲内に含まれてもよく、これらもまた、示される範囲内の任意の具体的に除外される限界を条件として、特許請求の範囲の主題に包含される。示される範囲が、限界のうちの1つまたは両方を含む場合、それらの含まれる限界のうちのいずれかまたは両方を除外する範囲もまた、特許請求の範囲の主題に含まれる。このことは、範囲の広さにかかわらず、適用される。
「約」について、本明細書中の値またはパラメータは、その値またはパラメータそれ自体を対象とする変形を含む(かつ説明する)。例えば、「約X」について言及する説明は、「X」の説明を含む。加えて、数の任意の連なりに先行する「約」の使用は、その連なりにおいて列挙される数のうちの「約」各数を含む。例えば、「約X、YまたはZ」について言及する説明は、「約X、約Yまたは約Z」を説明すると意図される。
「平均」という用語は、本明細書で使用されるとき、文脈が明確に別のように示さない限り、平均値もしくは中央値、または平均値もしくは中央値に近似するために使用される任意の値のいずれかを指す。
「被験体」とは、本明細書で使用されるとき、提供される組成物、方法、キット、デバイスおよび系が投与または適用され得る生物または生物の一部もしくは構成成分を指す。例えば、被験体は、哺乳動物または哺乳動物の細胞、組織、器官もしくは一部であり得る。本明細書で使用されるとき、「哺乳動物」とは、哺乳動物クラスの種のいずれか、好ましくはヒト(ヒト、ヒト被験体またはヒト患者を含む)を指す。哺乳動物として、家畜、狩猟用動物、ペット、霊長類、ウマ、イヌ、ネコならびにげっ歯類、例として、マウスおよびラットが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用されるとき、「試料」という用語は、生物学的試料を含む、解析が所望される標的分子を含有し得るいかなるものも指す。本明細書で使用されるとき、「生物学的試料」とは、生きている供給源もしくはウイルス(またはプリオン)供給源、または高分子および生体分子の他の供給源から得た任意の試料を指してもよく、核酸、タンパク質および/または他の高分子を得ることができる被験体の任意の細胞型または組織を含む。生物学的試料は、生物学的供給源から直接得た試料または加工された試料であり得る。例えば、単離され、増幅された核酸は、生物学的試料を構成する。生物学的試料として、体液、例として、血液、血漿、血清、脳脊髄液、滑液、尿、汗、精液、便、痰、涙、粘液、羊水その他、滲出液、骨髄試料、腹水、骨盤洗浄液(pelvic wash fluid)、胸水、髄液、リンパ液、眼液(ocular fluid)、鼻抽出物、咽頭もしくは生殖器スワブ、消化した組織からの細胞懸濁物、または糞便物質抽出物、ならびに動物および植物からの組織および器官試料およびそれに由来する加工試料が挙げられるが、これらに限定されない。
「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」および「核酸分子」という用語は、本明細書で互換的に使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指し、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドおよびそのアナログまたは混合物を含む。この用語は、三本鎖、二本鎖および一本鎖デオキシリボ核酸(「DNA」)ならびに三本鎖、二本鎖および一本鎖リボ核酸(「RNA」)を含む。また、それは、ポリヌクレオチドの、例えば、アルキル化によって、および/またはキャッピングによって修飾した形態、ならびに非修飾形態を含む。より特に、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」および「核酸分子」という用語は、ポリデオキシリボヌクレオチド(2-デオキシ-D-リボースを含有する)、スプライシングされているか、スプライシングされていないかにかかわらずtRNA、rRNA、hRNAおよびmRNAを含むポリリボヌクレオチド(D-リボースを含有する)、プリンまたはピリミジン塩基のN-またはC-グリコシドである任意の他の種類のポリヌクレオチド、および非ヌクレオチド骨格を含有する他のポリマー、例えば、ポリアミド(例えば、ペプチド核酸(「PNA」))およびポリモルホリノ(Anti-Virals,Inc.、Corvallis、ORからNeugeneとして市販されている)ポリマー、ならびにポリマーがDNAおよびRNAにおいて見られるような塩基対形成および塩基スタッキングを可能にする構成で核酸塩基を含有するならば他の合成配列特異的核酸ポリマーを含む。したがって、これらの用語は、例えば、3’-デオキシ-2’,5’-DNA、オリゴデオキシリボヌクレオチドN3’~P5’ホスホルアミデート、2’-O-アルキル-置換RNA、DNAとRNAとのハイブリッドまたはPNAとDNAもしくはRNAとのハイブリッドを含み、また、公知の種類の修飾、例えば、標識、アルキル化、「キャップ」、ヌクレオチドのうちの1つまたは複数のアナログによる置換、ヌクレオチド間修飾、例として、例えば、非荷電連結を有するもの(例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カルバメートなど)、負荷電連結を有するもの(例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど)および正荷電連結を有するもの(例えば、アミノアルキルホスホルアミデート、アミノアルキルホスホトリエステル)、ペンダント部分、例として、例えば、タンパク質(酵素(例えば、ヌクレアーゼ)、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ-L-リジンなどを含む)を含有するもの、インターカレーター(例えば、アクリジン、ソラレンなど)を有するもの、(例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属などの)キレートを含有するもの、アルキレーターを含有するもの、修飾連結を有するもの(例えば、アルファ芳香族核酸など)ならびにポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの非修飾形態を含む。核酸は一般的に、ホスホジエステル結合を含有するが、一部の場合、代替の骨格、例として、ホスホルアミダイト、ホスホロジチオエートもしくはメチルホスホルアミダイト(methylphophoroamidite)連結、またはペプチド核酸骨格および連結を有する核酸アナログが含まれ得る。他のアナログ核酸として、ロックド核酸を含む二環式構造、正電骨格(positive backbone)、非イオン性骨格および非リボース骨格を有するアナログ核酸が挙げられる。リボース-ホスフェート骨格の修飾は、分子の安定性を増大させるために行われ得る;例えば、PNA:DNAハイブリッドは、一部の環境においてより高い安定性を示し得る。「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」および「核酸分子」という用語は、任意の好適な長さ、例として、少なくとも5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、1,000またはそれよりも多いヌクレオチドを含み得る。
本明細書で使用されるとき、「ヌクレオシド」および「ヌクレオチド」という用語は、公知のプリンおよびピリミジン塩基のみでなく、また、修飾されている他のヘテロ環式塩基を含有する部分を含むことが理解される。そのような修飾として、メチル化プリンもしくはピリミジン、アシル化プリンもしくはピリミジンまたは他のヘテロ環が挙げられる。また、修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドは、糖部分についての修飾を含んでもよく、例えば、ヒドロキシル基のうちの1つまたは複数は、ハロゲン、脂肪族基で置換されるか、またはエーテル、アミンその他として官能化される。「ヌクレオチド単位」という用語は、ヌクレオシドおよびヌクレオチドを包含すると意図される。
「相補的」および「実質的に相補的」という用語は、ヌクレオチドまたは核酸間、例えば、二本鎖DNA分子の2鎖間またはオリゴヌクレオチドプライマーと一本鎖核酸上のプライマー結合部位との間の、ハイブリダイゼーションまたは塩基対形成または二本鎖形成を含む。相補的ヌクレオチドは一般的に、AおよびT(またはAおよびU)またはCおよびGである。2つの一本鎖RNAまたはDNA分子は、1つの鎖のヌクレオチドが、最適にアラインメントおよび比較され、適切なヌクレオチド挿入または欠失を伴って、他の鎖の少なくとも約80%、通常少なくとも約90%~約95%、さらに約98%~約100%と対形成する場合、実質的に相補的と言われる。一態様においては、2つの相補的ヌクレオチド配列は、相対するヌクレオチド間で好ましくは25%未満の、より好ましくは15%未満の、さらにより好ましくは5%未満のミスマッチ、最も好ましくはミスマッチなしでハイブリダイズすることができる。好ましくは、2つの分子は、高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする。
参照配列について、本明細書で使用されるとき、逆相補配列は、逆の順序の参照配列の相補配列である。例えば、5’-ATCG-3’について、相補配列は、3’-TAGC-5’であり、逆相補配列は、5’-CGAT-3’である。
「ハイブリダイゼーション」は、本明細書で使用されるとき、2つの一本鎖ポリヌクレオチドが非共有結合して、安定な二本鎖ポリヌクレオチドを形成するプロセスを指し得る。一態様においては、得られる二本鎖ポリヌクレオチドは、「ハイブリッド」または「二本鎖」であり得る。「ハイブリダイゼーション条件」は典型的に、およそ1M未満、多くの場合約500mM未満の塩濃度を含み、約200mM未満であってもよい。「ハイブリダイゼーション緩衝液」は、緩衝塩溶液、例として、5%SSPE、または当技術分野で公知の他のそのような緩衝液を含む。ハイブリダイゼーション温度は、5℃程度に低くてもよいが、典型的には22℃を超え、より典型的には約30℃を超え、典型的には37℃を超える。ハイブリダイゼーションは多くの場合、ストリンジェントな条件、すなわち、配列がその標的配列にハイブリダイズするが、他の非相補配列にはハイブリダイズしない条件下で行われる。ストリンジェントな条件は、配列依存的であり、異なる状況においては異なる。例えば、より長い断片は、短い断片より、特異的ハイブリダイゼーションのためにより高いハイブリダイゼーション温度を必要とし得る。相補鎖の塩基組成および長さ、有機溶媒の存在ならびに塩基ミスマッチ形成の程度を含む他の因子は、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を及ぼし得るので、パラメータの組み合わせは、任意の1つのパラメータ単独の絶対的な尺度より重要である。一般的に、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度およびpHにおける特定の配列についてのTより約5℃低く選択される。融解温度Tは、二本鎖核酸分子の集団の半分が解離して一本鎖になる温度であり得る。核酸のTを計算するためのいくつかの式が、当技術分野で周知である。標準の参考文献によって示される通り、核酸が1M NaClの水溶液中に存在する場合、T値の単純な見積もりは、式、T=81.5+0.41(%G+C)によって計算することができる(例えば、AndersonおよびYoung、Quantitative Filter Hybridization、Nucleic Acid Hybridization(1985年)を参照されたい)。他の参考文献(例えば、AllawiおよびSantaLucia, Jr.、Biochemistry、36巻:10581~94頁(1997年))は、構造特徴および環境特徴ならびに配列特徴を考慮してTの計算を行う代替の計算法を含む。
一般的に、ハイブリッドの安定性は、イオン濃度および温度の関数である。典型的に、ハイブリダイゼーション反応は、より低いストリンジェンシーの条件下で行われ、続いて、様々な、しかしより高いストリンジェンシーの洗浄が行われる。例示的な、ストリンジェントな条件として、約7.0~約8.3のpHおよび少なくとも25℃の温度における少なくとも0.01M~1M以下のナトリウムイオン濃度(または他の塩)の塩濃度が挙げられる。例えば、5×SSPE(pH7.4における750mM NaCl、50mMリン酸ナトリウム、5mM EDTA)および約30℃の温度の条件は、対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーションに好適であるが、好適な温度は、ハイブリダイズする領域の長さおよび/またはGC含有量に依存する。一態様においては、ミスマッチの割合の決定における「ハイブリダイゼーションのストリンジェンシー」は、以下の通りであり得る:1)高ストリンジェンシー:0.1×SSPE、0.1%SDS、65℃;2)中程度のストリンジェンシー:0.2×SSPE、0.1%SDS、50℃(適度なストリンジェンシーとも呼ばれる);および3)低ストリンジェンシー:1.0×SSPE、0.1%SDS、50℃。代替の緩衝液、塩および温度を使用して同等のストリンジェンシーが達成され得ることが理解される。例えば、適度にストリンジェントなハイブリダイゼーションは、核酸分子、例として、プローブが相補核酸分子に結合することを可能にする条件を指し得る。ハイブリダイズした核酸分子は一般的に、例えば、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%または95%の同一性のいずれかを含む、少なくとも60%の同一性を有する。適度にストリンジェントな条件は、42℃における50%ホルムアミド、5×デンハルト溶液、5×SSPE、0.2%SDS中でのハイブリダイゼーション、続いて42℃における0.2×SSPE、0.2%SDS中での洗浄に相当する条件であり得る。高ストリンジェンシー条件は、例えば、42℃における50%ホルムアミド、5×デンハルト溶液、5×SSPE、0.2%SDS中でのハイブリダイゼーション、続いて65℃における0.1×SSPEおよび0.1%SDS中での洗浄によって提供され得る。低ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、22℃における10%ホルムアミド、5×デンハルト溶液、6×SSPE、0.2%SDS中でのハイブリダイゼーション、続いて37℃における1×SSPE、0.2%SDS中での洗浄に相当する条件を指し得る。デンハルト溶液は、1%フィコール、1%ポリビニルピロリドンおよび1%ウシ血清アルブミン(BSA)を含有する。20×SSPE(塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム、EDTA)は、3M塩化ナトリウム、0.2Mリン酸ナトリウムおよび0.025M EDTAを含有する。他の好適な、適度なストリンジェンシーおよび高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション緩衝液および条件は、当業者に周知であり、例えば、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor Press、Plainview、N.Y.(1989年);およびAusubelら、Short Protocols in Molecular Biology、第4版、John Wiley & Sons(1999年)において説明されている。
あるいは、RNAまたはDNA鎖が選択的ハイブリダイゼーション条件下でその相補鎖にハイブリダイズするとき、実質的な相補性が存在する。典型的には、少なくとも14~25個のヌクレオチドのストレッチにわたり少なくとも約65%の相補性、好ましくは少なくとも約75%、より好ましくは少なくとも約90%の相補性が存在する場合、選択的ハイブリダイゼーションが起こる。M. Kanehisa、Nucleic Acids Res. 12巻:203頁(1984年)を参照されたい。
本明細書で使用される「プライマー」は、ポリヌクレオチド鋳型と二本鎖を形成する際に、核酸合成の開始点として作用し、その3’末端から鋳型に沿って伸長することができ、そのため伸長した二本鎖が形成される、天然または合成いずれかのオリゴヌクレオチドであり得る。伸長プロセス中に付加されるヌクレオチド配列は、鋳型ポリヌクレオチドの配列によって決定される。プライマーは通常、ポリメラーゼ、例えば、DNAポリメラーゼによって伸長される。
「ライゲーション」は、鋳型で駆動される反応における、2つまたはそれよりも多い核酸、例えば、オリゴヌクレオチドおよび/またはポリヌクレオチドの末端間の共有結合または連結の形成を指し得る。結合または連結の性質は広く変動してもよく、ライゲーションは酵素的に行ってもよい。本明細書で使用されるとき、ライゲーションは通常、酵素的に行い、1つのオリゴヌクレオチドの5’炭素末端ヌクレオチドと別のヌクレオチドの3’炭素との間にホスホジエステル連結を形成する。
「増幅」は、本明細書で使用されるとき、一般的に、所望の配列の多数のコピーを生成するプロセスを指す。「多数のコピー」とは、少なくとも2つのコピーを意味する。「コピー」は、鋳型配列との完全な配列相補性または同一性を必ずしも意味しない。例えば、コピーは、ヌクレオチドアナログ、例として、デオキシイノシン、意図的な配列変化(例として、鋳型にハイブリダイズ可能であるが、相補的でない配列を含むプライマーを通して導入された配列変化)および/または増幅中に起こる配列エラーを含み得る。
「配列決定」などは、核酸のヌクレオチド塩基配列に関連する情報の決定を含む。そのような情報は、核酸の部分的および完全な配列情報の同定または決定を含み得る。配列情報は、様々な程度の統計的信頼性または信頼度で決定することができる。一態様においては、この用語は、核酸における複数の連続ヌクレオチドの同一性および順序の決定を含む。
「シークエンシング」、「ハイスループットシークエンシング」または「次世代シークエンシング」という用語は、本質的に並列様式で、すなわち、DNA鋳型が一度に1つではなくバルクプロセスでシークエンシングのために調製され、かつ多くの配列が好ましくは並列して読み出される、多く(典型的に数千~数十億)の核酸配列を決定する方法を使用する、またはあるいは、それ自体が並列化され得る超ハイスループット逐次プロセスを使用する配列決定を含む。そのような方法として、ピロシークエンシング(例えば、454 Life Sciences,Inc.、Branford、CTによって市販されている);ライゲーションによるシークエンシング(例えば、SOLiD(商標)技術、Life Technologies,Inc.、Carlsbad、CAにおいて市販されている);修飾ヌクレオチドを使用する合成によるシークエンシング(例として、Illumina,Inc.、San Diego、CAによるTruSeq(商標)およびHiSeq(商標)技術;Helicos Biosciences Corporation、Cambridge、MAによるHeliScope(商標);ならびにPacific Biosciences of California,Inc.、Menlo Park、CAによるPacBio RSにおいて市販されている)、イオン検出技術によるシークエンシング(例として、Ion Torrent(商標)技術、Life Technologies、Carlsbad、CA);DNAナノボールのシークエンシング(Complete Genomics,Inc.、Mountain View、CA);ナノポアベースのシークエンシング技術(例えば、Oxford Nanopore Technologies,LTD、Oxford、UKにより開発されている)および同様の高度に並列化したシークエンシング法が挙げられるが、これらに限定されない。
「SNP」または「一塩基多型」は、個体間の遺伝的変異;例えば、生物のDNAにおける可変性の単一の窒素性塩基位置を含み得る。SNPは、ゲノムにわたって見られ、個体間の遺伝的変異の多くは、SNP遺伝子座における変異のためであり、多くの場合この遺伝的変異は、個体間の表現型変異をもたらす。本開示における使用のためのSNPおよびそれらの各々の対立遺伝子は、任意の数の供給源、例として、公のデータベース(U.C.Santa Cruz Human Genome Browser Gateway(genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway)またはNCBI dbSNPウェブサイト(ncbi.nlm.nih gov/SNP/))に由来してもよく、または米国特許第6,969,589号;および「Human Genomic Polymorphisms」という表題の米国公開公報第2006/0188875号で説明されているように実験的に決定してもよい。SNPの使用は、本明細書で示す実施形態の一部において説明されているが、他の二対立遺伝子または多対立遺伝子マーカーもまた使用してもよいことが理解される。二対立遺伝子マーカーは、2つの多型または対立遺伝子を有するマーカーである。上述の通り、形質と関連付けられる二対立遺伝子マーカーについて、対照群と比較して症例群の遺伝組成においてより豊富な対立遺伝子は、「関連対立遺伝子」と呼ばれ、もう一方の対立遺伝子は、「非関連対立遺伝子」と呼ばれ得る。したがって、所与の形質(例えば、疾患または薬物応答)と関連付けられる各二対立遺伝子多型について、対応する関連付けられる対立遺伝子が存在する。本明細書で示す方法で使用され得る他の二対立遺伝子多型として、多ヌクレオチド変化、挿入、欠失および転座が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書におけるDNAについての言及は、ゲノムDNA、ミトコンドリアDNA、エピソームDNAおよび/またはDNA誘導体、例として、アンプリコン、RNA転写産物、cDNA、DNAアナログなどを含み得ることがさらに理解される。関連研究においてスクリーニングされる多型遺伝子座は、二倍体または一倍体状態で存在してもよく、理想的には、ゲノムにわたる部位に由来する。シークエンシング技術は、SNPシークエンシングについて利用可能であり、例として、ビーズアレイプラットホーム(GOLDENGATE(商標)アッセイ)(Illumina,Inc.、San Diego、CA)(Fanら、Cold Spring Symp. Quant. Biol.、68巻:69~78頁(2003年)を参照されたい)を用いてもよい。
一部の実施形態においては、「メチル化状態(methylation state)」または「メチル化状態(methylation status)」という用語は、DNA配列内のCpGジヌクレオチドのうちの1つまたは複数における5-メチルシトシン(「5-mC」または「5-mCyt」)の存在または非存在を指す。DNA配列内の1つまたは複数の特定のCpGメチル化部位(各々、2つのCpGジヌクレオチド配列を有する)におけるメチル化状態として、「非メチル化」、「完全メチル化」および「ヘミメチル化」がある。「ヘミメチル化(hemi-methylation)」または「ヘミメチル化(hemimethylation)」という用語は、1つの鎖のみがメチル化されている二本鎖DNAのメチル化状態を指す。「高メチル化」という用語は、正常対照DNA試料内の対応するCpGジヌクレオチドにおいて見られる5-mCytの量と比較した、試験DNA試料のDNA配列内のCpGジヌクレオチドのうちの1つまたは複数における5-mCytの存在の増大に対応する平均メチル化状態を指す。「低メチル化」という用語は、正常対照DNA試料内の対応するCpGジヌクレオチドにおいて見られる5-mCytの量と比較した、試験DNA試料のDNA配列内のCpGジヌクレオチドのうちの1つまたは複数における5-mCytの存在の減少に対応する平均メチル化状態を指す。
本明細書中の「多重化」または「多重アッセイ」とは、2つ以上のマーカーを使用することによって多数の標的、例えば、多数の核酸配列の存在および/または量を同時にアッセイすることができるアッセイまたは他の解析法を指してもよく、マーカーの各々は、少なくとも1つの異なる検出特徴、例えば、蛍光特徴(例えば、励起波長、発光波長、発光強度、FWHM(半値幅のピーク高さ(full width at half maximum peak height))または蛍光寿命)またはユニークな核酸もしくはタンパク質配列特徴を有する。
本明細書で使用されるとき、「疾患または障害」とは、例えば、感染または遺伝的欠陥から生じ、同定可能な症状によって特徴付けられる生物における病理学的状態を指す。
B. ライブラリー構築およびポリヌクレオチドシークエンシングによるポリヌクレオチド断片解析の概略
一態様においては、本方法の標的(または鋳型)ポリヌクレオチドは、例えば、約100残基~約1000残基の範囲、一部の実施形態においては、約150残基~約400残基の範囲の、断片化ポリヌクレオチドである。
標的または鋳型DNAとして、標準のゲノムDNA、染色体DNA、染色体外DNA(例として、ミトコンドリアDNA)またはそれらの断片が挙げられ得る。他の実施形態においては、標的または鋳型DNAは、加工されたDNA、例えば、酵素消化、架橋結合、化学的もしくは物理的剪断、亜硫酸水素塩変換および/または分解を受けたDNAである。
亜硫酸水素塩変換は、亜硫酸水素塩を使用して、DNAのメチル化パターンを決定する方法である。DNAメチル化は、メチル基の、シトシンまたはアデニンDNAヌクレオチドへの付加に関する生化学プロセスである。細胞が分裂して、胚性幹細胞から特定の組織に分化する際に、DNAメチル化により、細胞における遺伝子発現が安定に変更される。亜硫酸水素塩変換においては、最初に、非メチル化シトシンをウラシルに特異的に変換するが、メチル化シトシンには影響を有しない亜硫酸水素塩試薬で、標的核酸を処理する。亜硫酸水素塩変換の1つの結果は、配列相補性の喪失のために、元の標的の二本鎖コンフォメーションが破壊されることである。標的配列は、試料調製および解析または診断試験中に2つの別々の一本鎖DNAとして存在する。また、標的核酸配列は多くの場合、非常に低い濃度で存在する。このことは、循環腫瘍DNA(「無細胞腫瘍DNA」または「ctDNA」とも呼ばれる)については、多くの場合、循環中のその低い濃度および非常に低い対立遺伝子率のためにとりわけ重要な考慮事項である。
一部の実施形態においては、本明細書で開示する目的の核酸分子は、無細胞DNA、例として、無細胞胎児DNA(「cfDNA」とも呼ばれる)またはctDNAである。cfDNAは、妊娠中の女性の体内で、例として、血中で循環し、胎児ゲノムを表し、一方、ctDNAは、がん患者の体内で、例として、血中で循環し、一般的に事前に断片化されている。他の実施形態においては、本明細書で開示する目的の核酸分子は、例えば、有害な条件下での保存のための、古いかつ/もしくは損傷を受けたDNA、例として、ホルマリン固定試料、または部分的に消化された試料中のDNAである。
がん細胞が死滅すると、それらはDNAを血流へと放出する。このDNAは、循環腫瘍DNA(ctDNA)として公知であり、非常に断片化されており、平均の長さは約150塩基対である。白血球を除去すると、ctDNAは一般的に、残りの血漿DNAのわずかな割合を構成し、例えば、ctDNAは、血漿DNAの約10%未満を構成し得る。一般的に、この割合は、約1%未満、例えば、約0.5%未満または約0.01%未満である。加えて、血漿DNAの全量は一般的に非常に低く、例えば、血漿1mL当たり約10ngである。
ctDNA中のバリアントは、次世代シークエンシングを含む、様々な方法を使用して調べることができる。ctDNAの血漿DNAに対する低い比率のために、PCRおよびシークエンシングエラーのため高信頼度でバリアントをコールすることは困難である。ユニーク分子識別子(UMI)は一般的に、確認された任意のバリアントをコンセンサス配列と比較することができるように、元の分子にタグ付けするために使用される。これは、偽陽性から真の陽性を分けるのに有効な方法である。バリアントがコンセンサスとマッチする場合、それは真の陽性である。そうでなければ、それは解析から除去される。さらに、感度を高く維持するために、高い割合の元の分子がシークエンシングライブラリーに変えられること、すなわち、バリアントが脱落のために失われないことが重要である。したがって、ライブラリー構築中のライゲーション効率は、非常に重要である。
一態様においては、ライゲーション効率を大いに改善し、依然として選択されたゲノム領域を標的化する技術が、本明細書で提供される。一実施形態においては、シークエンシングによって検出されるポリヌクレオチド、例として、ctDNAは最初に、ctDNAのそれ自体へのライゲーションを防止するために、脱リン酸化して5’ホスフェートを除去する。その後、すべてのDNAが一本鎖になるように、ctDNAを変性させる。一本鎖DNAリガーゼであるCircligase(商標)を使用して、アダプターをctDNAの3’末端にライゲーションする。一態様においては、アダプターは、ライゲーション効率を最適化するための5’末端上の2つの特異的塩基、およびそれに続くUMIを含有する。一態様においては、アダプターの3’末端は、アダプターの自己ライゲーションを防止するために炭素スペーサーを含有する。別の態様においては、ライゲーション反応は、密集剤(crowding agent)、例として、PEG4000を使用してさらに最適化される。一態様においては、ライゲーション後、アダプターに逆相補的なプライマーを使用して分子を二本鎖にする。このことにより、標準の精製による、使用可能なDNAの除去を伴わない、過剰のライゲーションしていないアダプターの効率的な除去が可能になる。
一態様においては、その後、DNAは、半標的化PCRを使用して増幅される。一方のプライマーは、アダプターに逆相補的であり、一方で、もう一方(例えば、プライマープール中の1つのプライマーとして)は、特異的な標的化ゲノム領域にアニールする。特異的プライマーは、プライマー-ダイマー相互作用およびオフターゲットアニーリングを最小限にするように設計された。一態様においては、標的特異的プライマーは、小さいDNAサイズのために特定のバリアントに近接して配置するようにさらに最適化される。別のクリーンアップ後、PCRにより、全長シークエンシングアダプターおよびバーコードを付加する。その後、最終的なライブラリーを、例えば、Illumina機でシークエンシングする。
一態様においては、半標的化PCRは、約30,000bpの比較的小さい標的領域を有するにもかかわらず、元の分子組の約40,000倍を超える濃縮をもたらす。一態様においては、標準のライブラリー構築およびハイブリダイゼーション捕捉と比較すると、本方法の全変換率は、少なくとも60%であり、元の分子の少なくとも約3倍多い分子がシークエンシング可能な材料に変換されることを示唆する。他の実施形態においては、全変換率は、約60%~約70%、約70%~約80%、約80%~約90%または90%を超える。一態様においては、本方法はしたがって、例えば、0.01%もの低さの、極めて低い変異対立遺伝子率での遺伝子バリアントまたはゲノムバリアント、例として、SNV、インデル、CNVおよび融合を正確にコールすることができる。他の態様においては、遺伝子バリアントまたはゲノムバリアントの対立遺伝子率は、約0.05%、約0.1%、約0.5%、約1%または約2%である。
以下の節は、本方法のある特定のステップをより詳細に説明する。
C. 一本鎖ポリヌクレオチドライブラリーおよびそれを構築する方法
例えば、ctDNAについての、次世代シークエンシングのためのライブラリー構築は一般的に、末端修復、A-テーリングおよびアダプター分子の二本鎖ライゲーションを含む、いくつかのステップからなる。その後、これらのライゲーションされた分子を、ハイブリダイゼーション捕捉を使用してある特定のゲノム領域について1000~2000倍に濃縮し得る。ここ数年にわたるライブラリー構築におけるいくつかの改善にもかかわらず、プロセスは非効率的なままであり、そのため多くの元の分子が様々なステップ中に失われる。二本鎖ライゲーション効率は低いままであり、適切にライゲーションされるのは分子の約20~30%である。加えて、多くの分子は、精製およびハイブリダイゼーション捕捉ステップ中に失われ、そのため、最終的な変換率は、およそ10~20%である。ctDNAにおいて見られる低対立遺伝子率バリアントを調べる場合、感度は低いままである。低対立遺伝子率のライブラリーを検査する場合、低効率が感度の喪失をもたらすので、このことは、低対立遺伝子率変異体をコールする場合、精度を制限することとなる。
加えて、ある特定のポリヌクレオチド、例として、ctDNAは、小さいサイズのために、タグ付断片化法(tagmentation)ベースのライブラリー構築の使用が妨げられる。例えば、最初に、ポリヌクレオチドに(例えば、ビオチンで)タグ付けして標的化ライブラリーを産生し、その後、(例えば、ストレプトアビジンによって)タグを捕捉することによって濃縮する。このようにして、目的の領域についてのライブラリーを、約1000~2000倍に濃縮することができる。最後に、PCRを行って、シークエンシングのために分子を増幅およびインデックス付けする。しかしながら、PCRベースの方法は、元の分子にUMIを付加することが困難であることが明らかになっており、高エラー率をもたらす。
一態様においては、本明細書で説明する組成物、キットおよび方法は、上記の問題に取り組んだ。一部の実施形態においては、組成物、キットおよび方法は、様々なライブラリーの構築、様々な増幅反応(例として、PCRおよび/またはプライマー伸長による)、構築したライブラリーの精製およびシークエンシングリードの解析を含むが、これらに限定されない、核酸分子のシークエンシングにおいて有用である。
ある特定の態様においては、シークエンシングライブラリーは、例えば、断片化ポリヌクレオチド、例として、断片DNAを含有する試料から調製することができる。一態様においては、試料、例えば、直接、患者からの、天然に存在する試料、例として、血液、血漿、血清、脳脊髄液、滑液、尿、汗、精液、痰、涙、粘液または羊水を含むが、これらに限定されない組織液または体液を得る。他の態様においては、シークエンシングライブラリーは、(例えば、DNAを剪断することによって)DNAの断片を形成し、DNA断片に本明細書中のアダプターを結合することによって調製することができる。特定の実施形態においては、断片化ポリヌクレオチドおよびアダプターは、一本鎖である。
断片(例えば、ctDNA、またはより長いDNA鎖を断片化することによって形成される断片)は、アダプター、例として、本明細書で開示する一本鎖アダプターに隣接して「挿入」またはライゲーションされ得るので、「インサート」と呼ばれることがある。また、例えば、RNA分子を逆転写してDNA分子を形成し、それをアダプターに結合することによって、RNA分子をシークエンシングすることができる。
一態様においては、1組のアダプターを一本鎖ポリヌクレオチドのライブラリーにライゲーションすることを含む方法が提供され、この方法においては、ライゲーションが、一本鎖DNA(ssDNA)リガーゼによって触媒される。本明細書で使用されるとき、ssDNAリガーゼは、相補配列の非存在下でssDNAの末端をライゲーションすることができる。例えば、CircLigase(商標)ssDNAリガーゼおよびCircLigase(商標)II ssDNAリガーゼは両方とも、典型的に5’-ホスフェートおよび3’-ヒドロキシル基を有するssDNA鋳型の分子内ライゲーション(すなわち、環状化)を触媒するために使用される熱安定性リガーゼである。相補DNA配列上で互いに隣接してアニールするDNA末端をライゲーションするT4 DNAリガーゼおよびAmpligase(登録商標)DNAリガーゼとは対照的に、ssDNAリガーゼは、相補配列の非存在下でssDNAの末端をライゲーションする。それゆえ、この酵素は、直鎖状ssDNAから環状ssDNA分子を作製するのに有用である。環状ssDNA分子は、ローリングサークル型複製またはローリングサークル型転写のための基質として使用することができる。ssDNAに対するその活性に加えて、CircLigase酵素は、3’-ヒドロキシルリボヌクレオチドおよび5’-リン酸化リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドを有する一本鎖核酸をライゲーションすることにおいても活性を有する。
CircLigase(商標)ssDNAリガーゼまたはCircLigase(商標)II ssDNAリガーゼのいずれかを、本開示において使用することができる。2つの酵素は、CircLigase IがCircLigase IIよりはるかにアデニル化されておらず、最大活性のためにはATPを必要とする点で異なる。CircLigase Iは、ATPの存在下でssDNAを再環状化する。CircLigase IIは、ほぼ100%アデニル化されており、それゆえ、反応緩衝液にATPを添加する必要はない。CircLigase IIは、化学量論反応として働き、酵素は、オリゴの5’末端に結合し、オリゴを酵素活性部位においてアデニル化し、その後、オリゴをライゲーションし、停止する。反応はATPを含有しないので、CircLigase IIは、1:1の酵素:オリゴ構成で働く。環状化が完了すると、環状ssDNAは、活性部位から放出され、反応は停止する。また、他の好適なssDNAリガーゼを使用してもよい。例えば、熱安定性5’App DNA/RNAリガーゼ、例えば、New England Biosciences、M0319SまたはT4 DNAリガーゼ、例えば、New England Biosciences、M0202SまたはT4 RNAリガーゼ、例えば、T4 RNAリガーゼI、例えば、New England Biosciences、M0204S、T4 RNAリガーゼ2、例えば、New England Biosciences、M0239S、T4 RNAリガーゼ2切断型、例えば、New England Biosciences、M0242S、T4 RNAリガーゼ2切断型KQ、例えば、M0373SまたはT4 RNAリガーゼ2切断型K227Q、例えば、New England Biosciences、M0351Sを使用することができる。
一態様においては、各一本鎖ポリヌクレオチドは、5’末端でのライゲーションを防止するために5’末端でブロックされており、各アダプターは、そのアダプターがライゲーションされる一本鎖ポリヌクレオチドに目印を付けるユニーク分子識別子(UMI)配列を含み、各アダプターは、3’末端でのライゲーションを防止するために3’末端でブロックされており、アダプターの5’末端は、ssDNAリガーゼによって一本鎖ポリヌクレオチドの3’末端にライゲーションされて直鎖状ライゲーション生成物を形成し、それによって、直鎖状一本鎖ライゲーション生成物のライブラリーを得る。一本鎖DNAの鋳型非依存的環状化は、その開示を、それらを全体として本明細書に組み込む、WO2010/094040 A1において説明されている。しかしながら、WO2010/094040 A1は、一本鎖ポリヌクレオチドの分子内ライゲーション(例えば、環状化)のみを開示している。
したがって、本方法は、ssDNAリガーゼ、例として、CircLigaseまたはCircLigase IIを、非従来型様式で使用する。環状化の代わりに、本ライゲーション法は、一本鎖標的ポリヌクレオチドとアダプター分子との直鎖状ライゲーション生成物を産生することを目的とする。一態様においては、本開示は、例えば、アダプターを一本鎖ポリヌクレオチドにライゲーションするために、分子内ライゲーションを行うためのssDNAリガーゼを使用する。一態様においては、それを行うために、一本鎖ポリヌクレオチドは、環状化を防止するために5’末端でブロックされている。このようにして、ssDNAの3’末端の、それ自体の5’末端への分子内ライゲーション、および1つのssDNAの3’末端の、同じライブラリー内の別のssDNAの5’末端への分子間ライゲーションを防止する。したがって、一態様においては、ライゲーション反応中の一本鎖ポリヌクレオチドの環状化および(一本鎖ポリヌクレオチドおよび/またはアダプターを含有する)直鎖状コンカテマーの形成の両方が防止される。図1で示す通り、各一本鎖ポリヌクレオチドのブロックは、5’末端でのライゲーションを防止するために、その5’末端での脱リン酸化を含み得る。
別の態様においては、各アダプターは、3’末端でのライゲーションを防止するために3’末端でブロックされている。このようにして、アダプターの3’末端の、それ自体の5’末端への分子内ライゲーション、および1つのアダプター分子の3’末端の、別のアダプター分子の5’末端への分子間ライゲーションを防止する。各アダプターのブロックは、その3’末端でのライゲーションを防止するために、炭素スペーサー、ddCTP、ddATP、ddTTP、ddGTP、ヘキサンジオール、トリエチレングリコール(TEG)および/またはヘキサエチレングリコールを含み得る。したがって、一態様においては、ライゲーション反応中の一本鎖アダプターの環状化および(一本鎖ポリヌクレオチドおよび/またはアダプターを含有する)直鎖状コンカテマーの形成の両方が防止される。
アダプターは、任意の好適な組み合わせの、1つまたは複数のスペーサーの1つまたは複数のコピーを含み得る。例えば、GansaugeおよびMeyerは、C3スペーサーおよびビオチニル化TEGスペーサーの10個のコピーを含むアダプターを開示した。その全体を参照により本明細書に援用する、GansaugeおよびMeyer(2013年)、「Single-stranded DNA library preparation for the sequencing of ancient or damaged DNA」、Nature Protocols、8巻(4号):737~48頁。しかしながら、この参考文献は、ライゲーション直後に、ビオチン-ストレプトアビジン相互作用を介して、ライゲーションしたssDNAを捕捉することを必要とする。このステップは、ライブラリーにおけるssDNA分子の顕著な喪失をもたらし得る。その後、この参考文献は、捕捉したssDNAをdsDNAに変換し、一方で、ssDNAは、ビーズ上に捕捉されたまま残る。
図1で示す通り、本開示は、ライゲーション直後に、ライゲーションしたssDNAを捕捉することを必要としない。代わりに、ライゲーションしたssDNAは、dsDNAに変換されるとき、ライゲーション反応体積中に残る。
一態様においては、ライブラリー中のssDNAのライゲーション効率は高く、例えば、試料中の一本鎖ポリヌクレオチドの少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%または少なくとも約99%が、アダプターにライゲーションする。特定の実施形態においては、ライゲーション効率は、約80%である。この大いに改善されたライゲーション効率でも、特許請求される方法は、以下に説明する通り、選択されたゲノム領域を依然として標的化することができる。
一態様においては、アダプターは、以下の構造:/5’ホス/N...N-UMI-M...M-ブロッカーを有し、「5’ホス」は5’ホスフェート基を表し、「N...N」はUMI配列に対する5’側の配列を表し、「M...M」はUMI配列に対する3’側の配列を表し、「ブロッカー」は、アダプターの3’末端がアダプターへのライゲーションを防止するためにブロックされていることを示す。iおよびjは両方とも整数であり、iは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30または30を超えてもよく;jは、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50または50を超えてもよい。特定の実施形態においては、iは2であり得る。一部の実施形態においては、N...Nの5’末端におけるジヌクレオチド配列Nは、ライゲーション効率を向上させるために、GA(5’~3’)、GG(5’~3’)、AA(5’~3’)またはAG(5’~3’)であり得る。
一態様においては、M...M配列の一部またはすべては、ライゲーションした一本鎖ポリヌクレオチドを二本鎖ポリヌクレオチドに変換するためのプライマーとして使用される逆相補配列を設計するために、かつ/または選択された標的配列を増幅するための半標的化PCRのために(プライマー対のもう一方のプライマーは、標的特異的プライマーである)、後のステップにおいて使用される。一態様においては、M...M配列は、AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTG(配列番号1)または約18~22個のヌクレオチド残基を含むその一部を含む。
別の態様においては、「ブロッカー」は、5’~3’方向で任意の好適な組み合わせおよび順序にて、1つまたは複数のブロッカー基の1つまたは複数のコピーにおいて、炭素スペーサー、ddCTP、ddATP、ddTTP、ddGTP、ヘキサンジオール、トリエチレングリコール(TEG)および/またはヘキサエチレングリコールを含む。
一態様においては、UMIの使用は、標的配列のエラーのないシークエンシングリードの決定、選択および/または単離を促進し、シークエンシングリードは、高精度および高スループットで選択することができる。そのような確証された、エラーのないシークエンシングリードは、より大きな公知配列の分子の構築、多型および/または変異スクリーニング、大規模並列シークエンシングならびに方法における偏りを排除するための定量化法を含む、配列忠実度を必要とする任意の技術において有用である。
一態様においては、ユニーク分子識別子は、一本鎖標的ポリヌクレオチドおよびアダプターを含むライゲーションした構築物と関連付けられ、ライゲーションした構築物をユニークに識別する。換言すれば、同じ配列を有する2つの一本鎖標的ポリヌクレオチドを、それらのUMI配列において互いに異なる2つの異なるアダプターにライゲーションしてもよく;得られるライゲーション生成物は異なり、(同じ配列を有する標的ポリヌクレオチドではなく)各ライゲーション生成物は、UMIによってユニークに識別される。別の態様においては、一本鎖ライゲーション生成物を二本鎖ポリヌクレオチドに変換し、増幅した場合、非常に高い忠実度のポリメラーゼが利用可能であるとしても、反復複製中に増幅エラーが導入され得る。その結果、低いエラー率でさえも、特に、大きなライブラリーの構築においては、顕著な影響を有し得る。大規模並列シークエンシングは、コストおよびスループットにおいて利点を有するが、リードの精度は、増幅および/または検出技術の限界によって構成され得る。
UMIを使用することによって、本方法は、エラーのない増幅生成物および/またはシークエンシングリードを識別し、技術的エラーを有するものを解析から除外することができる。同じUMIを有する増幅生成物および/またはシークエンシングリードは、関連する(同祖的な(identical by descent))ものとして確認することができ、したがって、同じUMIを有する分子間の配列の相違は、配列中の実際の相違(例えば、野生型配列とがん関連変異配列との間の配列の相違)ではなく技術的エラーとして識別することができる。換言すれば、各一本鎖ライゲーション生成物は、そのUMIによってユニークに識別可能であるので、技術的エラーが導入されていない場合、(増幅および/またはシークエンシングによる)その子孫のすべては、同じ標的配列を有するはずである。しかしながら、エラー、例として、単一ヌクレオチド挿入が増幅および/またはシークエンシング中に標的配列に導入された場合、同祖的な(例えば、同じUMIを共有する)一部の増幅生成物および/またはシークエンシングリードは、挿入を有し、一方で、その他は有しない。挿入を有する生成物と挿入を有しない生成物との正確な比は、エラーが増幅および/またはシークエンシングプロセス中のいつ起こったかに依存して変動する。一般的に、非常に高い忠実度のポリメラーゼを使用した場合、エラーを伴わない生成物が大多数で存在する。別の態様においては、同祖的な増幅生成物および/またはシークエンシングリードを識別することができるので、多数の分子からのデータを使用してコンセンサス配列を決定し、それによって、高精度のハイスループットシークエンシングを達成することができる。
一態様においては、UMIは縮重核酸配列であり、UMI中のヌクレオチドの数は、UMI配列によって表される潜在的配列および実際の配列の数が、最初のライブラリー中の標的一本鎖標的ポリヌクレオチドの総数より多くなるように設計される。一態様においては、UMI配列多様性(または各単一のUMI配列についての「特有性」)は、各位置においてすべての4つの塩基の混合物により合成することによってランダムに産生された配列の縮重した集合物を使用することによって提供することができる。あるいは、多様な、しかし事前に規定された組の配列を合成し、最初の一本鎖ポリヌクレオチドライブラリーにライゲーションしてもよい。UMIの組の多様性は、同祖的でない分子が同祖的として間違えられない程度に十分である必要がある。一態様においては、「ユニーク」分子識別子は、絶対的にユニークである必要はなく、それらが異なり、同祖的な分子について間違えられないことが明らかであるという条件で、異なる標的一本鎖ポリヌクレオチドについて使用され得る。ヌクレオチドのランダムアセンブリから産生され得る多数のUMI配列は、各個々のライゲーション生成物がユニークに識別され得る高い確率を提供する。例えば、UMIが、各位置においてA、C、GおよびTの混合物により合成される12merを含む場合、412個の可能性のある配列が存在する。UMIが、各位置においてA、C、GおよびTの混合物により合成される20merを含む場合、420個(約1012個)の可能性のある配列が存在する。そのようなランダムな識別子の使用は、互いに個々に区別され得る一本鎖標的ポリヌクレオチドの大きなライブラリーを可能にする。
特定の態様においては、UMIは、5mer、6mer、7mer、8mer、9mer、10mer、11mer、12mer、13mer、14mer、15mer、16mer、17mer、18mer、19mer、20mer、21mer、22mer、23mer、24mer、25mer、またはさらにそれよりも長い縮重配列である。一態様においては、アダプターは、以下の構造:/5’ホス/GANNNNNNNNNNNNAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTG/3SpC3/を有し、「NNNNNNNNNNNN」は12mer UMI配列を表し、「3SpC3」は3’炭素スペーサーを表す。GANNNNNNNNNNNNAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGの配列は、配列番号2である。
DNAの濃度は、縮合剤、例として、コバルトヘキサミンおよび生体ポリアミン、例として、スペルミジンを添加することによって、または同様に酵素の有効濃度を増大させる密集剤、例として、ポリエチレングリコール(PEG)を使用することによって、人為的に増大することができる。一態様においては、添加剤、例として、コバルトヘキサミンは、分子間反応を排他的に生成し、環状生成物ではなく直鎖状ライゲーション生成物をもたらし得る。したがって、一本鎖標的ポリヌクレオチドの5’末端および一本鎖アダプターの3’末端がライゲーションを防止するために完全にブロックされていない場合、添加剤、例として、コバルトヘキサミンは、分子間反応を向上させ、一本鎖標的ポリヌクレオチドおよび/またはアダプターの環状化をさらに防ぐために使用され得る。
一部の実施形態においては、同じライゲーション反応においてアダプターの2つ以上の構成を使用することができる。例えば、アダプターの2つの構成を使用してもよい:
構成番号1:/5’ホス/N...N-UMI-M...M-ブロッカー、および
構成番号2:/5’ホス/P...P-UMI-Q...Q-ブロッカー
...NおよびP...Pは同じでも、異なってもよく、UMIおよびUMIは同じでも、異なってもよく、M...MおよびQ...Qは同じでも、異なってもよく、ブロッカーおよびブロッカーは同じでも、異なってもよい。一実施形態においては、UMIは、UMIとは異なる(例えば、UMIは12mer縮重配列であり、一方で、UMIは13mer縮重配列である)が、アダプターの他の特徴は同じである。別の実施形態においては、N...Nは、P...Pとは異なる(例えば、一方はAGであり、一方で、もう一方はGAである)が、アダプターの他の特徴は同じである。また別の実施形態においては、M...Mは、Q...Qとは異なるが、アダプターの他の特徴は同じである。さらに別の実施形態においては、ブロッカーとブロッカーとは異なるが、アダプターの他の特徴は同じである。
ライゲーション反応後、一本鎖ライゲーション生成物は、精製(例えば、過剰のライゲーションしていないアダプター分子からのライゲーション生成物の分離)を一切必要とせず、二本鎖ライゲーション生成物への変換に即座に供することができる。加えて、一本鎖標的ポリヌクレオチドも、アダプターも、後続のライゲーション生成物の二本鎖ポリヌクレオチドへの変換および/または増幅ステップのために(例えば、ビーズへのビオチン-ストレプトアビジン媒介結合によって)固体支持体上に捕捉する必要がない。したがって、本方法は、一本鎖ライゲーション生成物の精製または単離のための、DNA試料、例としてctDNA中の既に対立遺伝子率が小さい変異体の喪失を回避および/または低減する。代わりに、一態様においては、一本鎖ライゲーション生成物は、溶液中に残り、それはプライマー伸長に直接供される。
D. 一本鎖ポリヌクレオチドライブラリーの二本鎖ポリヌクレオチドライブラリーへの変換
一態様においては、図1で示す通り、一本鎖ライゲーション生成物を含有するライブラリーの構築後、本方法は、直鎖状一本鎖ライゲーション生成物のライブラリーを直鎖状二本鎖ライゲーション生成物のライブラリーに変換することをさらに含み得る。一態様においては、変換は、各々が、アダプターに逆相補的であり、かつ/またはアダプターにハイブリダイズ可能な配列を含む、プライマーまたは1組のプライマーを使用する。
以下の構造:/5’ホス/N...N-UMI-M...M-ブロッカーを有するアダプターについて、プライマーは、M...Mに逆相補的であり、かつ/またはこれにハイブリダイズ可能な配列を含み得る。この例においては、プライマーが、構造ssDNA-N...N-UMI-M...M-ブロッカーを有するライゲーションされた生成物にハイブリダイズする場合、プライマー伸長反応は、ssDNA-N...N-UMI配列(および必要に応じて、M...M配列のすべてまたは一部)を二本鎖ポリヌクレオチドに変換し得る。特定の一例においては、逆相補的プライマーは、配列番号3で示される配列:CACTCTTTCCCTACACGACGC(5’~3’)を含む。
一部の実施形態においては、プライマーは、M...Mまたはその一部の完全な逆相補体でなくてもよく;それにもかかわらず、プライマーは、ストリンジェントな条件下でM...Mにハイブリダイズ可能である(およびしたがって、ssDNAはアダプターにライゲーションされる)。
前述の実施形態のいずれかにおいては、方法は、直鎖状二本鎖ライゲーション生成物のライブラリーを増幅および/または精製することをさらに含み得る。一態様においては、二本鎖ライゲーション生成物を精製およびサイズ選択して、非結合アダプター分子および/または非結合プライマーおよび/またはアダプターとその逆相補的プライマーとの間で形成された複合体を除去する。一般的に所望の二本鎖ライゲーション生成物より短いこれらの断片を除去するために、任意の好適な方法を使用することができる。例えば、QiagenからのPCR精製カラムを使用すると、試料からより小さい断片を削除することを補助することができ、カラム精製した試料を2%保証の低域ウルトラアガロースゲルで泳動すると、所望の断片サイズを選択することを補助することができる。AMPure法を含むビーズベースのDNA精製も、より小さい断片を除去するのに役立つ。一部の実施形態においては、所望の二本鎖ライゲーション生成物サイズは、約100bp~約600bp、例として、約100bp~約400bp、約150bp~約200bp、約200bp~約250bpおよび約250bp~約300bpである。一実施形態においては、dsDNA(150bpより長く400bpより短い)を、例えば、Tri-EDTA緩衝液中に懸濁したビーズを溶出することによって、精製および収集する。
一態様においては、精製は、ビーズベースである。別の態様においては、精製は、サイズ選択に基づき、例えば、精製ステップは、約50ヌクレオチド~約1000ヌクレオチドの長さのポリヌクレオチドを選択的に精製し、例えば、約40ヌクレオチドの長さのアダプター(ならびに約40bpのプライマーダイマーおよび/またはプライマー-アダプター二本鎖)が除去される。一態様においては、精製は、例えば、dsDNAまたはssDNA精製カラム、例として、ZymoまたはQiagenからのカラムを使用することによる、カラムベースである。
別の態様においては、精製は、一方が直鎖状二本鎖ライゲーション生成物に結合し、もう一方が固体支持体(例として、ビーズ)に結合する特定の結合対(例として、ビオチン/ストレプトアビジン)を使用することを含まない。
前述の実施形態のいずれかにおいては、本明細書の方法は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって、直鎖状二本鎖ライゲーション生成物のライブラリーを増幅して、標的配列の配列情報を含む直鎖状二本鎖ライゲーション生成物の増幅したライブラリーを得ることをさらに含み得る。この増幅は、例えば、ユニバーサルアダプター対を二本鎖ライゲーション生成物の末端にライゲーションし、ユニバーサルプライマー対ですべてのタグ付けした二本鎖ライゲーション生成物を増幅することによる、偏りのない増幅であり得る。他の実施形態においては、偏りのない増幅の代わりに、またはこれに加えて、半標的化増幅を行う。半標的化増幅は、偏りのない増幅の前に行っても、後に行ってもよい。
E. 二本鎖ポリヌクレオチドライブラリーの半標的化増幅
一態様においては、図1で示す通り、二本鎖ライゲーション生成物ライブラリーの半標的化増幅は、アダプターに逆相補的であり、かつ/またはこれにハイブリダイズ可能な配列を含むプライマー、および標的配列(例えば、EGFR遺伝子配列)にハイブリダイズ可能な1つのプライマーまたは同じ標的配列もしくは多数の標的配列にハイブリダイズ可能な複数のプライマーを使用することを含む。
以下の構造:/5’ホス/N...N-UMI-M...M-ブロッカーを有するアダプターについて、プライマーは、M...Mに逆相補的であり、かつ/またはこれにハイブリダイズ可能な配列を含み得る。このように、プライマーがdsDNAの1つの鎖にハイブリダイズし、標的特異的プライマーがdsDNAの他の鎖にハイブリダイズする場合、PCR産物は、標的配列およびN...N-UMI配列(および必要に応じて、M...M配列のすべてまたは一部)を含有する。特定の一例においては、逆相補的プライマーは、配列番号3で示される配列:CACTCTTTCCCTACACGACGC(5’~3’)を含む。
一態様においては、各々が、同じまたは異なる標的配列について特異的な配列を含む、複数の標的特異的プライマーを使用してもよい。換言すれば、プライマーは、同じまたは異なる標的配列を有してもよい。一部の実施形態においては、標的特異的プライマーのプールは、約5、約10、約25、約50、約100、約150、約200、約250、約300、約400、約500、約600、約700、約800、約900、約1000個または約1000個よりも多い様々なプライマー、例として、約10、約10、約10個またはそれよりも多いプライマーを含む。他の実施形態においては、プールは、約20~約60、約60~約100、約100~約140、約140~約180、約180~約220、約220~約260、約260~約300、約300~約350または約350~約400個の様々なプライマーを含む。一態様においては、標的特異的プライマーのプールは、1つの共通の逆相補的プライマーと共に使用され、共通の逆相補的プライマーは、プール中の各個々の標的特異的プライマーとプライマー対を形成して、半標的化様式でこれらのプライマー間の標的配列を増幅する。したがって、この態様においては、半標的化増幅は、全ゲノム増幅ではない。
ctDNAはランダムに断片化するので、一態様においては、標的特異的プライマーのプライマー位置は重要であり得る。例えば、プライマーの配置が切断点にまたがる場合、それはより低い変換率をもたらし得る。より大きな標的特異的プライマープールおよび/または同じ標的配列についての多数の部分重複プライマーの使用は、この問題を解決し得る。
一態様においては、標的配列の配列情報は、変異、一塩基多型(SNP)、コピー数多型(CNV)またはエピジェネティック変化を含み得る。一態様においては、変異は、点変異、挿入、欠失、逆位、トランケーション、融合、増幅またはそれらの任意の組み合わせを含む。
一部の実施形態においては、直鎖状二本鎖ライゲーション生成物の増幅したライブラリーは、全ゲノムライブラリー以外のライブラリー、例えば、半標的化ゲノムライブラリーであり得る。
一部の実施形態においては、方法は、直鎖状二本鎖ライゲーション生成物の増幅したライブラリーを精製することをさらに含み得る。プライマーダイマーを含むより小さい断片を除去するために、任意の好適な方法を使用することができる。例えば、QiagenからのPCR精製カラムを使用すると、試料からより小さい断片を削除することを補助することができ、カラム精製した試料を2%保証の低域ウルトラアガロースゲルで泳動すると、所望の断片サイズを選択することを補助することができる。AMPure法を含むビーズベースのDNA精製も、より小さい断片を除去するのに役立つ。一部の実施形態においては、増幅生成物サイズは、約100bp~約600bp、例として、約100bp~約400bp、約150bp~約200bp、約200bp~約250bpおよび約250bp~約300bpである。一実施形態においては、dsDNA(150bpより長く400bpより短い)を、例えば、Tri-EDTA緩衝液中に懸濁したビーズを溶出することによって、精製および収集する。
一態様においては、精製は、ビーズベースである。別の態様においては、精製は、サイズ選択に基づき、例えば、精製ステップは、約150ヌクレオチドを超える長さのポリヌクレオチドを選択的に精製する。別の態様においては、精製は、一方が直鎖状二本鎖ライゲーション生成物に結合し、もう一方が固体支持体(例として、ビーズ)に結合する特定の結合対(例として、ビオチン/ストレプトアビジン)を使用することを含まない。一態様においては、精製は、例えば、dsDNAまたはssDNA精製カラム、例として、ZymoまたはQiagenからのカラムを使用することによる、カラムベースである。
F. 配列ライブラリーの構築およびシークエンシングリードの解析
一態様においては、方法は、直鎖状二本鎖ライゲーション生成物の増幅し、精製したライブラリーをシークエンシングすることをさらに含む。一態様においては、シークエンシングステップは、シークエンシングアダプターおよび/または試料特異的バーコードを各直鎖状二本鎖ライゲーション生成物に結合することを含む。特定の一態様においては、結合ステップは、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を使用して行われる。
図2は、シークエンシングのための標的分子を含む構築物の例示的な構成を示す。Illuminaシークエンシングのために、これらの構築物は、各末端上に、ライブラリー断片がフローセル表面に結合することを可能にするフローセル結合部位、P5およびP7を有する。一本鎖ライブラリー断片のP5およびP7領域は、フローセル表面上のそれらの相補的オリゴにアニールする。フローセルオリゴは、プライマーとして作用し、ライブラリー断片に相補的な鎖が合成される。その後、元の鎖を洗い流すと、混合した配向で、フローセル表面に共有結合している断片コピーが残る。その後、各断片のコピーを架橋増幅によって産生し、クラスターを作製する。その後、P5領域を切断し、P7領域によって結合している断片のみを含有するクラスターを得る。このことにより、すべてのコピーが同じ向きでシークエンシングされることが確実になる。シークエンシングプライマーを、断片のP5末端にアニールし、合成プロセスによってシークエンシングを開始する。試料がバーコード化されている場合、インデックスリードが行われる。リード1を終了すると、リード1からのすべてを除去し、インデックスプライマーを添加し、これは断片のP7末端にアニールし、バーコードをシークエンシングする。その後、鋳型からすべてを取り除き、これは、リード1と同様に架橋増幅によってクラスターを形成する。これにより、混合した配向で、フローセル表面に共有結合している断片コピーが残る。今度は、P5の代わりにP7を切断し、P5領域によって結合している断片のみを含有するクラスターを得る。このことにより、すべてのコピーが(リード1と反対の)同じ向きでシークエンシングされることが確実になる。シークエンシングプライマーを、P7領域にアニールし、鋳型の他の末端をシークエンシングする。
次世代シークエンシングプラットホーム、例として、MiSeq(Illumina Inc.、San Diego、CA)は、高多重化アッセイリードアウトのために使用することができる。様々な統計的ツール、例として、比例検定(proportion test)、偽陽性率に基づく多重比較補正(BenjaminiおよびHochberg、1995年、Journal of the Royal Statistical Society Series B (Methodological) 57巻、289~300頁を参照のこと)および多重検定のボンフェローニ補正は、アッセイ結果を解析するために使用することができる。加えて、RNA-Seqデータからの差次的発現の解析のために開発されたアプローチを使用して、各標的配列についての分散を低減し、解析における全体的な検出力を増大させることができる。Smyth、2004年、Stat. Appl. Genet. Mol. Biol. 3巻、論文3を参照されたい。
全体として、一部の実施形態においては、本方法の変換率は、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%または少なくとも約95%である。一態様においては、変換率は、シークエンシングリードを生ずる、最初のライブラリーにおける標的化された一本鎖ポリヌクレオチドの割合である。
前述の実施形態のいずれかにおいては、方法は、被験体における疾患または状態の診断および/もしくは予後、被験体の処置に対する応答性を予測すること、疾患/状態もしくは処置についての薬理遺伝学マーカーを同定すること、ならびに/または遺伝情報について集団をスクリーニングすることのために使用することができる。一態様においては、疾患または状態は、がんまたは新生物であり、処置は、がんまたは新生物処置である。
変異体DNA分子は、非常に特異的であるため、がん関連バイオマーカーに優るユニークな利点を提供する。変異は、個々の正常細胞において低率(約10-9~10-10個の変異/bp/世代)で起こるが、そのような変異は、全正常DNAのうちのわずかな割合であるので、ある特定の技術法の検出限界未満の桁である。いくつかの研究により、変異体DNAは、CRC患者の便、尿および血液中で検出され得ることが示されている(OsbornおよびAhlquist、Stool screening for colorectal cancer: molecular approaches、Gastroenterology 2005年;128巻:192~206頁)。
本明細書のシークエンシング結果に基づいて、患者における循環腫瘍DNAの検出を行うことができ、がんの診断および腫瘍再発についての予測を行うことができる。この予測に基づいて、処置およびサーベイランスの決定を行うことができる。例えば、将来の再発を示す循環腫瘍DNAにより、追加のまたはより積極的な療法、ならびに追加のまたはより精巧な画像化およびモニタリングを行い得る。循環DNAは、腫瘍に対して異所性のDNAを指す。
ctDNAについてモニタリングすることができる試料として、血液および便が挙げられる。血液試料は、例えば、血液の画分、例として、血清または血漿であってもよい。同様に、便は、DNAを他の構成成分から精製するために分画してもよい。腫瘍試料を使用して、腫瘍の体細胞変異遺伝子を同定し、これは、体内の他の場所において腫瘍マーカーとして使用することができる。したがって、例として、腫瘍における特定の体細胞変異は、当技術分野で公知の任意の標準の手段によって同定することができる。典型的な手段として、対立遺伝子特異的プローブ、対立遺伝子特異的増幅、プライマー伸長などを使用する、腫瘍DNAの直接的なシークエンシングが挙げられる。体細胞変異が特定されると、それを身体の他の区画において使用して、腫瘍由来DNAを身体の他の細胞由来のDNAと区別することができる。体細胞変異は、それらが同じ患者の身体の正常組織において存在しないことを決定することによって確認される。この様式で診断および/またはモニタリングすることができる腫瘍のタイプは、事実上無制限である。細胞および/またはDNAを血液もしくは便または他の体液に放出する任意の腫瘍を使用することができる。そのような腫瘍として、結腸直腸腫瘍に加えて、乳房、肺、腎臓、肝臓、膵臓、胃、脳、頭頸部、リンパ管、卵巣、子宮、骨、血液などの腫瘍が挙げられる。
一態様においては、本明細書で開示する方法は、シークエンシングにおける、および/または標的配列の1つもしくは複数の領域のエピジェネティック状態(status/state)の決定における使用のためのライブラリーを構築するために使用することができる。DNAメチル化は、最初は、発見されたエピジェネティックな目印であった。エピジェネティックスは、根底にあるDNA配列における変化以外の機構によって引き起こされた遺伝子発現または細胞表現型における変化の研究である。メチル化は主に、ジヌクレオチドCpGのシトシン残基の炭素5位へのメチル基の付加に関し、転写活性の抑制または阻害と関連付けられる。
亜硫酸水素塩変換は、DNAのメチル化パターンを決定するための、DNAを処理する亜硫酸水素塩試薬の使用である。DNAの亜硫酸水素塩での処理は、シトシン残基をウラシルに変換するが、5-メチルシトシン残基は影響を受けずに残る。したがって、亜硫酸水素塩処理は、DNA配列において、個々のシトシン残基のメチル化状態に依存する特定の変化を導入する。この情報を検索するために、例えば、亜硫酸水素塩変換から生ずる一塩基多型(SNP)を区別するために、変化した配列について様々な解析を行うことができる。すべて参照により本明細書に組み込む、米国特許第7,620,386号、同第9,365,902号および米国特許出願公開第2006/0134643号は、亜硫酸水素塩変換により変更された配列の検出についての当業者に公知の方法を例示している。亜硫酸水素塩変換は、任意の好適な技術、手順または試薬を使用して行うことができる。一部の実施形態においては、亜硫酸水素塩変換は、以下のキットおよびキットで提供される手順:EpiMark Bisulfite Conversion Kit、New England Biosciences、E3318S;EZ DNA Methylation Kit、Zymo Research、D5001;MethylCode Bisulfite Conversion Kit、Thermo Fisher Scientific、MECOV50;EZ DNA Methylation Gold Kit、Zymo Research、D5005;EZ DNA Methylation Direct Kit、Zymo Research、D5020;EZ DNA Methylation Lightning Kit、Zymo Research、D5030T;EpiJET Bisulfite Conversion Kit、Thermo Fisher Scientific、K1461;またはEpiTect Bisulfite Kit、Qiagen、59104のいずれかを使用して行うことができる。
上記に説明する通り、亜硫酸水素塩変換の1つの結果は、配列相補性の喪失のために、元の標的の二本鎖コンフォメーションが破壊されることである。このことは、二本鎖ライブラリーを構築するための伝統的方法については問題を引き起こし得るが、本方法は、一態様においては、ユニークに、シークエンシング解析のための亜硫酸水素塩変換試料から一本鎖ライブラリーを構築するのに適している。
別の態様においては、本方法は、例えば、すべての目的についてその全体を参照により本明細書に組み込む、2017年4月19日出願の「Compositions and Methods for Detection of Genomic Variance and DNA Methylation Status」という表題の米国仮出願第62/487,422号(代理人整理番号737993000100)において説明されている通り、メチル化状態(state/status)を決定するための方法と組み合わせて使用することができる。一実施形態においては、試料を、脱リン酸化および/または変性ステップの前にメチル化感受性制限酵素(MSRE)と接触させ、その後、メチル化プロファイルを、本明細書で開示するライゲーションにより一本鎖ライブラリーを構築することによって解析する。
G. ライブラリー構築および/またはシークエンシングのためのキット
ライゲーション生成物のライブラリーを構築するためのキットが、本明細書で別の態様において開示される。一実施形態においては、キットは、一本鎖DNA(ssDNA)リガーゼを含む。別の態様においては、キットは、複数のアダプターを含む。特定の態様においては、各アダプターは、3’末端でのライゲーションを防止するためにブロックされており、一方で、アダプターの5’末端は、直鎖状一本鎖ライゲーション生成物を形成するために一本鎖ポリヌクレオチドへのライゲーションに利用可能である。さらに特定の態様においては、各アダプターは、一本鎖ポリヌクレオチドに目印を付けるユニーク分子識別子(UMI)配列を含む。
一態様においては、ライゲーション生成物のライブラリーを構築するためのキットは、ssDNAリガーゼおよび複数のアダプターを含んでもよく、各アダプターは、3’末端でのライゲーションを防止するためにブロックされており、一方で、アダプターの5’末端は、直鎖状一本鎖ライゲーション生成物を形成するために一本鎖ポリヌクレオチドへのライゲーションに利用可能であり、各アダプターは、一本鎖ポリヌクレオチドに目印を付けるUMI配列を含む。
別の態様においては、キットは、試料からの二本鎖ポリヌクレオチドを変性させて一本鎖ポリヌクレオチドを得るための変性試薬をさらに含み得る。
また別の態様においては、キットは、ThermusバクテリオファージRNAリガーゼ、例として、バクテリオファージTS2126 RNAリガーゼ(例えば、CircLigase(商標)およびCircLigase II(商標))または古細菌RNAリガーゼ、例として、Methanobacterium thermoautotrophicum RNAリガーゼ1を含み得る。前述の実施形態のいずれかにおいては、キットは、RNAリガーゼ、例として、T4 RNAリガーゼ、例えば、T4 RNAリガーゼ2、T4 RNAリガーゼ2切断型、T4 RNAリガーゼ2切断型KQまたはT4 RNAリガーゼ2切断型K227Qを含み得る。また、本キットは、他の好適なssDNAリガーゼ、例えば、T4 RNAリガーゼI、熱安定性5’App DNA/RNAリガーゼ、T4 RNAリガーゼ2、切断型T4 RNAリガーゼ2、例えば、T4 RNAリガーゼ2切断型、T4 RNAリガーゼ2切断型K227Q、T4 RNAリガーゼ2切断型KQまたはT4 DNAリガーゼを含み得る。
一態様においては、キットは、ライゲーション反応のための密集剤をさらに含み得る。一態様においては、密集剤は、ポリエチレングリコール(PEG)、例として、PEG4000もしくはPEG6000、デキストランおよび/またはフィコールを含む。
別の態様においては、キットは、一本鎖ポリヌクレオチドを二本鎖ポリヌクレオチドに変換するための、各々が、アダプターに逆相補的であり、かつ/またはアダプターにハイブリダイズ可能な配列を含む、1組のプライマーをさらに含み得る。
一態様においては、キットは、プライマーダイマーおよび/またはプライマー-アダプター二本鎖を除去するための試薬をさらに含み得る。
別の態様においては、キットは、標的配列の配列情報を含む増幅した直鎖状二本鎖ライゲーション生成物を得るための、標的配列(例えば、EGFR遺伝子配列)に特異的な配列を含むプライマーをさらに含み得る。さらなる態様においては、キットは、増幅した直鎖状二本鎖ライゲーション生成物をシークエンシングするための、シークエンシングアダプターおよび/または試料特異的バーコードをさらに含み得る。
また、上記のキット構成成分に基づく診断キットが提供され、それらは、被験体において疾患または状態、例えば、がんを診断するために使用することができる。別の態様においては、キットは、薬物、療法、処置またはそれらの組み合わせへの個体の応答を予測するために使用することができる。そのような試験キットは、被験体が医療提供者の助けなく、例えば、ctDNAの、試料を得るために使用することができるデバイスおよび指示を含み得る。
上記に説明または示唆される適用における使用のために、また、キットまたは製造物品が提供される。そのようなキットは、疾患または状態についてのマーカーを遺伝子型決定するために特異的な少なくとも1つの試薬を含んでもよく、本明細書で説明する方法を実行するための指示をさらに含み得る。
一部の実施形態においては、ポリヌクレオチドのまたはその任意の特定の部分の特異的増幅を可能にするプライマーおよびプライマー対、ならびに定性的にまたは定量的に、検出の目的のために核酸分子にまたはその任意の部分に選択的または特異的にハイブリダイズするプローブを含む、組成物およびキットが本明細書で提供される。プローブは、検出可能なマーカー、例として、例えば、放射性同位体、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発光化合物、金属キレーターまたは酵素で標識してもよい。そのようなプローブおよびプライマーは、試料中のポリヌクレオチドの存在を検出するために、およびポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質を発現する細胞を検出するための手段として、使用することができる。当業者によって理解されるように、非常に多くの様々なプライマーおよびプローブが、本明細書で提供される配列に基づいて調製され、ポリヌクレオチド、例として、ゲノムDNA、mtDNAおよびその断片を増幅する、クローニングするおよび/またはそれらの存在および/またはレベルを決定するために有効に使用され得る。
一部の実施形態においては、キットは、ポリペプチドの存在を検出するための試薬をさらに含み得る。そのような試薬は、ポリペプチドに特異的に結合する抗体または他の結合分子であってもよい。一部の実施形態においては、そのような抗体または結合分子は、多型の結果としてのポリペプチドについての構造的変種を区別することができてもよく、したがって、遺伝子型決定するために使用してもよい。抗体または結合分子は、検出可能なマーカー、例として、例えば、放射性同位体、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発光化合物、金属キレーターまたは酵素で標識してもよい。結合アッセイ、例として、ELISAを行うための他の試薬をキットに含めてもよい。
一部の実施形態においては、キットは、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも5、少なくとも10個またはそれよりも多いマーカーを遺伝子型決定するための試薬を含む。マーカーは、ポリヌクレオチドマーカー(例として、がん関連変異またはSNP)であっても、ポリペプチドマーカー(例として、過剰発現、またはタンパク質の高リン酸化もしくは低リン酸化を含む翻訳後修飾)であっても、それらの任意の組み合わせであってもよい。一部の実施形態においては、キットは、増幅した核酸の検出のための捕捉プローブのための表面または基材(例として、マイクロアレイ)をさらに含み得る。
キットは、1つまたは複数の容器手段、例として、バイアル、管などを近接して拘束して受容するために区画化されている担体手段をさらに含んでもよく、容器手段の各々は、方法において使用される別々の要素のうちの1つを含む。例えば、容器手段の1つは、検出可能に標識された、または検出可能に標識され得るプローブを含んでもよい。そのようなプローブは、バイオマーカーに特異的なポリヌクレオチドであってもよい。また、キットは、標的核酸配列の増幅のためのヌクレオチドを含有する容器、および/またはレポーター分子、例として、酵素標識、蛍光標識もしくは放射性同位体標識に結合したレポーター手段を含む容器を有してもよい。
キットは典型的に、上記の容器(複数可)、ならびに緩衝液、希釈剤、フィルター、針、シリンジおよび使用のための指示を有する添付文書を含む商業的観点およびユーザーの立場から望ましい材料を含む1つまたは複数の他の容器を含む。組成物が特定の療法または非療法的適用に使用されることを示すために、容器上に標識があってもよく、また、上記の使用のようなin vivoまたはin vitro使用いずれかについての手引きを示してもよい。
キットは、組織または細胞または体液試料を調製し、試料から核酸(例として、ctDNA)を調製するための1組の指示および材料をさらに含んでもよい。
H. さらなる例示的な実施形態
前述の実施形態のいずれかにおいては、ssDNAリガーゼは、ThermusバクテリオファージRNAリガーゼ、例として、バクテリオファージTS2126 RNAリガーゼ(例えば、CircLigase(商標)およびCircLigase II(商標))または古細菌RNAリガーゼ、例として、Methanobacterium thermoautotrophicum RNAリガーゼ1であり得る。他の態様においては、ssDNAリガーゼは、RNAリガーゼ、例として、T4 RNAリガーゼ、例えば、T4 RNAリガーゼI、例えば、New England Biosciences、M0204S、T4 RNAリガーゼ2、例えば、New England Biosciences、M0239S、T4 RNAリガーゼ2切断型、例えば、New England Biosciences、M0242S、T4 RNAリガーゼ2切断型KQ、例えば、M0373SまたはT4 RNAリガーゼ2切断型K227Q、例えば、New England Biosciences、M0351Sである。前述の実施形態のいずれかにおいては、また、ssDNAリガーゼは、熱安定性5’App DNA/RNAリガーゼ、例えば、New England Biosciences、M0319SまたはT4 DNAリガーゼ、例えば、New England Biosciences、M0202Sであり得る。
一部の実施形態においては、本方法は、一本鎖DNA(ssDNA)リガーゼを使用して1組のアダプターを一本鎖ポリヌクレオチドのライブラリーにライゲーションすることを含む。本明細書で開示するssDNAリガーゼを含む任意の好適なssDNAリガーゼを使用することができる。アダプターは、任意の好適なレベルまたは濃度、例えば、約1μM~約100μM、例として、約1μM、10μM、20μM、30μM、40μM、50μM、60μM、70μM、80μM、90μMもしくは100μMまたはそれらの任意の部分範囲で使用することができる。アダプターは、任意の好適な配列もしくは塩基を含むか、または任意の好適な配列もしくは塩基で始まってもよい。例えば、アダプター配列は、塩基のすべての2bpの組み合わせで始まることができる。
一部の実施形態においては、ライゲーション反応は、密集剤の存在下で行ってもよい。一態様においては、密集剤は、ポリエチレングリコール(PEG)、例として、PEG4000、PEG6000もしくはPEG8000、デキストランおよび/またはフィコールを含む。密集剤、例えば、PEGは、任意の好適なレベルまたは濃度で使用することができる。例えば、密集剤、例えば、PEGは、約0%(w/v)~約25%(w/v)のレベルまたは濃度で、例えば、約0%(w/v)、1%(w/v)、2%(w/v)、3%(w/v)、4%(w/v)、5%(w/v)、6%(w/v)、7%(w/v)、8%(w/v)、9%(w/v)、10%(w/v)、11%(w/v)、12%(w/v)、13%(w/v)、14%(w/v)、15%(w/v)、16%(w/v)、17%(w/v)、18%(w/v)、19%(w/v)、20%(w/v)、21%(w/v)、22%(w/v)、23%(w/v)、24%(w/v)もしくは25%(w/v)またはそれらの任意の部分範囲で使用することができる。
一部の実施形態においては、ライゲーション反応は、任意の好適な期間の間、行ってもよい。例えば、ライゲーション反応は、約2~約16時間の期間の間、%、例えば、約2時間、3時間、4時間、5時間、6時間、7時間、8時間、9時間、10時間、11時間、12時間、13時間、14時間、15時間もしくは16時間またはその任意の部分範囲の間、行うことができる。
一部の実施形態においては、ライゲーション反応中のssDNAリガーゼは、任意の好適な体積で使用してもよい。例えば、ライゲーション反応中のssDNAリガーゼは、約0.5μl~約2μlの体積で、%、例えば、約0.5μl、0.6μl、0.7μl、0.8μl、0.9μl、1μl、1.1μl、1.2μl、1.3μl、1.4μl、1.5μl、1.6μl、1.7μl、1.8μl、1.9μlもしくは2μlまたはその任意の部分範囲で使用することができる。
一部の実施形態においては、ライゲーション反応は、ライゲーションエンハンサー、例えば、ベタインの存在下で行ってもよい。ライゲーションエンハンサー、例えば、ベタインは、任意の好適な体積、例えば、約0μl~約1μlで、例えば、約0μl、0.1μl、0.2μl、0.3μl、0.4μl、0.5μl、0.6μl、0.7μl、0.8μl、0.9μl、1μlまたはその任意の部分範囲で使用することができる。
一部の実施形態においては、ライゲーション反応は、以下の例示的な反応混合物(20μl):1×反応緩衝液(50mM Tris-HCl、pH7.5、10mM MgCl2、1mM DTT)、25%(wt/vol)PEG8000、1mMヘキサミン塩化コバルト(必要に応じて)、1μl(10ユニット)T4 RNAリガーゼおよび1mM ATP中で、T4 RNAリガーゼI、例えば、New England BiosciencesからのT4 RNAリガーゼI、M0204Sを使用して行うことができる。反応を、25℃で16時間インキュベートしてもよい。反応は、40μlの10mM Tris-HCl pH8.0、2.5mM EDTAを添加することによって停止してもよい。
一部の実施形態においては、ライゲーション反応は、以下の例示的な反応混合物(20μl):ssDNA/RNA基質20pmol(1pmol/μl)、5’App DNAオリゴヌクレオチド40pmol(2pmol/μl)、10×NE緩衝液1(2μl)、50mM MnCl(ssDNAライゲーションのみのため)(2μl)、熱安定性5’App DNA/RNAリガーゼ(2μl(40pmol))およびヌクレアーゼ非含有水(全部で20μlになるように)中で、熱安定性5’App DNA/RNAリガーゼ、例えば、New England Biosciencesからの熱安定性5’App DNA/RNAリガーゼ、M0319Sを使用して行うことができる。反応を、65℃で1時間インキュベートしてもよい。反応は、90℃で3分間加熱することによって停止してもよい。
一部の実施形態においては、ライゲーション反応は、以下の例示的な反応混合物(20μl):T4 RNAリガーゼ緩衝液(2μl)、酵素(1μl)、PEG(10μl)、DNA(1μl)、アダプター(2μl)および水(4μl)中で、T4 RNAリガーゼ2、例えば、New England BiosciencesからのT4 RNAリガーゼ2、M0239Sを使用して行うことができる。反応を、25℃で16時間インキュベートしてもよい。反応は、65℃で20分間加熱することによって停止してもよい。
一部の実施形態においては、ライゲーション反応は、以下の例示的な反応混合物(20μl):T4 RNAリガーゼ緩衝液(2μl)、酵素(1μl)、PEG(10μl)、DNA(1μl)、アダプター(2μl)および水(4μl)中で、T4 RNAリガーゼ2切断型、例えば、New England BiosciencesからのT4 RNAリガーゼ2切断型、M0242Sを使用して行うことができる。反応を、25℃で16時間インキュベートしてもよい。反応は、65℃で20分間加熱することによって停止してもよい。
一部の実施形態においては、ライゲーション反応は、以下の例示的な反応混合物(20μl):T4 RNAリガーゼ緩衝液(2μl)、酵素(1μl)、PEG(10μl)、DNA(1μl)、アデニル化アダプター(0.72μl)および水(5.28μl)中で、T4 RNAリガーゼ2切断型K227Q、例えば、New England BiosciencesからのT4 RNAリガーゼ2切断型K227Q、M0351Sを使用して行うことができる。反応を、25℃で16時間インキュベートしてもよい。反応は、65℃で20分間加熱することによって停止してもよい。
一部の実施形態においては、ライゲーション反応は、以下の例示的な反応混合物(20μl):T4 RNAリガーゼ緩衝液(2μl)、酵素(1μl)、PEG(10μl)、DNA(1μl)、アデニル化アダプター(0.72μl)および水(5.28μl)中で、T4 RNAリガーゼ2切断型KQ、例えば、New England BiosciencesからのT4 RNAリガーゼ2切断型KQ、M0373Sを使用して行うことができる。反応を、25℃で16時間インキュベートしてもよい。反応は、65℃で20分間加熱することによって停止してもよい。
一部の実施形態においては、ライゲーション反応は、以下の例示的な反応混合物(20μl):T4 RNAリガーゼ緩衝液(2μl)、酵素(1μl)、PEG(10μl)、DNA(1μl)、アデニル化アダプター(0.72μl)および水(5.28μl)中で、T4 DNAリガーゼ、例えば、New England BiosciencesからのT4 DNAリガーゼ、M0202Sを使用して行うことができる。反応を、16℃で16時間インキュベートしてもよい。反応は、65℃で10分間加熱することによって停止してもよい。
第2鎖合成ステップは、任意の好適な酵素を使用して行うことができる。例えば、第2鎖合成ステップは、Bstポリメラーゼ、例えば、New England Biosciences、M0275SまたはKlenow断片(3’->5’エキソ-)、例えば、New England Biosciences、M0212Sを使用して行うことができる。
一部の実施形態においては、第2鎖合成ステップは、以下の例示的な反応混合物(10μl):水(1.5μl)、プライマー(0.5μl)、dNTP(1μl)、ThermoPol反応緩衝液(5μl)およびBst(2μl)中で、Bstポリメラーゼ、例えば、New England Biosciences、M0275Sを使用して行うことができる。反応は、62℃で2分間および65℃で30分間インキュベートしてもよい。反応後、二本鎖DNA分子を、さらに精製してもよい。
一部の実施形態においては、第2鎖合成ステップは、以下の例示的な反応混合物(10μl):水(0.5μl)、プライマー(0.5μl)、dNTP(1μl)、NEB緩衝液(2μl)およびエキソ-(3μl)中で、Klenow断片(3’->5’エキソ-)、例えば、New England Biosciences、M0212Sを使用して行うことができる。反応は、37℃で5分間および75℃で20分間インキュベートしてもよい。反応後、二本鎖DNA分子を、さらに精製してもよい。
第2鎖合成後であるが、最初のまたは半標的化PCRの前に、二本鎖DNAを精製してもよい。二本鎖DNAは、任意の好適な技術または手順を使用して精製することができる。例えば、二本鎖DNAは、以下のキット:Zymo clean and concentrator、Zymo research、D4103;Qiaquick、Qiagen、28104;Zymo ssDNA精製キット、Zymo Research、D7010;Zymoオリゴ精製キット、Zymo Research、D4060;およびAmpureXPビーズ、Beckman Coulter、A63882:1.2×~4×ビーズ比のいずれかを使用して精製することができる。
最初のまたは半標的化PCRは、任意の好適な酵素または反応条件を使用して行うことができる。例えば、ポリヌクレオチドまたはDNA鎖は、約52℃~約72℃の範囲の温度で、例えば、約52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃もしくは72℃またはその任意の部分範囲でアニールすることができる。最初のまたは半標的化PCRは、任意の好適な回数のサイクルにわたって行うことができる。例えば、最初のまたは半標的化PCRは、10~40サイクルにわたって、例えば、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39または40サイクルにわたって行うことができる。プライマープールは、任意の好適な濃度で使用することができる。例えば、プライマープールは、約5nM~約200nMの範囲の濃度で、例えば、約5nM、6nM、7nM、8nM、9nM、10nM、20nM、30nM、40nM、50nM、60nM、70nM、80nM、90nM、100nM、110nM、120nM、130nM、140nM、150nM、160nM、170nM、180nM、190nMもしくは200nMまたはその任意の部分範囲で使用することができる。
最初のまたは半標的化PCRは、任意の好適な温度サイクル条件を使用して行うことができる。例えば、最初のまたは半標的化PCRは、以下のサイクル条件:95℃ 3分間、(95℃ 15秒間、62℃ 30秒間、72℃ 90秒間)×3もしくは×5、または(95℃ 15秒間、72℃ 90秒間)×23もしくは×21、72℃ 1分間、その後永久に4℃のいずれかを使用して行うことができる。
一部の実施形態においては、最初のまたは半標的化PCRは、以下の例示的な反応混合物(50μl):DNA(2μl)、KAPASYBR(25μl)、プライマープール(各々26nM)(10μl)、Aプライマー(100μM)(0.4μl)および水(12.6μl)中で、KAPA SYBR FAST、例えば、KAPA biosciences、KK4600を使用して行うことができる。最初のまたは半標的化PCRは、以下のサイクル条件:95℃ 30秒間、(95℃ 10秒間、50~56℃ 45秒間、72℃ 35秒間)×40のいずれかを使用して行うことができる。
一部の実施形態においては、最初のまたは半標的化PCRは、以下の例示的な反応混合物(50μl):DNA(15μl)、KAPAHiFi(25μl)、プライマープール(各々26nM)(10μl)およびAプライマー(100μM)(0.4μl)中で、KAPA HiFi、例えば、KAPA Biosciences、KK2601を使用して行うことができる。最初のまたは半標的化PCRは、以下のサイクル条件:95℃ 3分間、(98℃ 20秒間、53~54℃ 15秒間、72℃ 35秒間)×15、72℃ 2分間、その後永久に4℃のいずれかを使用して行うことができる。
亜硫酸水素塩変換は、任意の好適な技術、手順または試薬を使用して行うことができる。一部の実施形態においては、亜硫酸水素塩変換は、以下のキットおよびキットで提供される手順:EpiMark Bisulfite Conversion Kit、New England Biosciences、E3318S;EZ DNA METHYLATION KIT、Zymo Research、D5001;MethylCode Bisulfite Conversion Kit、Thermo Fisher Scientific、MECOV50;EZ DNA Methylation Gold Kit、Zymo Research、D5005;EZ DNA Methylation Direct Kit、Zymo Research、D5020;EZ DNA Methylation Lightning Kit、Zymo Research、D5030T;EpiJET Bisulfite Conversion Kit、Thermo Fisher Scientific、K1461;またはEpiTect Bisulfite Kit、Qiagen、59104のいずれかを使用して行うことができる。
一部の実施形態においては、DNA分子は、一本鎖ポリヌクレオチドを構築するためのステップ、一本鎖ポリヌクレオチドライブラリーの二本鎖ポリヌクレオチドライブラリーへの変換のためのステップ、二本鎖ポリヌクレオチドライブラリーの半標的化増幅のためのステップおよび配列ライブラリーの構築のためのステップを含む、実施例4で例示する手順を使用して調製することができる。そのようなDNA分子は、任意の好適な方法または手順を使用してメチル化状態についてさらに解析してもよい。
I. 実施例
(実施例1)
この実施例においては、鋳型(例えば、シークエンシングされるポリヌクレオチド)は、約200bp長未満の短いDNA断片である。これらのDNA断片は、血漿から抽出したDNA、(例えば、断片化酵素(fragmentase)によって)酵素処理したゲノムDNAまたは物理的に剪断したDNAを含み得る。物理的に剪断したDNAは、末端修復してもよい。特定の態様においては、鋳型は、ライゲーションのための3’ヒドロキシル基を有する。
典型的に、10~30ngの適切に調製した鋳型DNAを、例えば、100mM MOPS(pH7.5)、20mM KCl、10mM MgCl、2mM DTTおよび5mM MnCl中で37℃にて10分間、1UのFastAP熱感受性アルカリホスファターゼ(Thermo Scientific)を使用して脱リン酸化した。その後、DNAを、例えば、95℃で2分間変性させ、氷上に1分間置いた。
一本鎖アダプターを、5’ホスフェート基および3’炭素スペーサーを伴って、IDTで合成した。5’末端は、GA、およびそれに続く12merのユニーク分子識別子(UMI)配列を含有する。典型的な一本鎖アダプターは、以下の配列:/5ホス/GANNNNNNNNNNNNAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTG/3SpC3/(「5ホス」は5’ホスフェート基を表し、「NNNNNNNNNNNN」は12mer UMI配列を表し、「3SpC3」は3’炭素スペーサーを表す)を有する。
その後、脱リン酸化した一本鎖DNAを鋳型として使用して、ライゲーション反応を行った。ライゲーション反応において以下の最終濃度:50mM MOPS(pH7.5)、10mM KCl、5mM MgCl、1mM DTTおよび2.5mM MnCl、50% PEG4000、0.5μMアダプター、125μM ATPならびに200U Epicentre Circligase(商標)を使用した。反応を、60℃で2時間、80℃で10分間、85℃で2分間インキュベートし、4℃で維持した。
その後、以前の反応体積を以下のもの:10mM Tris-HCl(pH8.3)、50mM KCl、1.5mM MgCl、1.25U Taq DNAポリメラーゼ(NEB)、1μM逆相補的プライマー(アダプターに逆相補的なプライマー)および200μM dNTPミックスに添加することによって、DNAを二本鎖にした。反応を、95℃で30秒間、62℃で2分間、68℃で10分間インキュベートし、4℃で維持した。典型的な逆相補的プライマーは、配列番号3:CACTCTTTCCCTACACGACGC(5’~3’)で示される配列を含む。以下のものは、アダプターと逆相補的プライマーとのアラインメントである:
Figure 0007220200000001
その後、1.6(ビーズ比)×AmPure(登録商標)XPビーズを使用して、反応を精製した。ビーズを添加し、10分間インキュベートした。その後、混合物を磁石に移して、5分間置いた。その後、上清を除去した。ビーズを、150μLの80%エタノールで2回、各30秒間洗浄した。その後、すべての残留エタノールを除去し、ビーズを磁石から外して室温で3分間乾燥させた。15μlの低TE緩衝液(Thermo Fisher)をビーズに添加し、2分間インキュベートした。その後、ビーズを磁石に戻して1分間置いた。上清を除去し、次の反応のために保存した。一態様においては、ビーズ比は、精製プロセスにおいてサイズ選択性をもたらし、約100bpより短い分子を除去するビーズ比(例として、1.6倍)が選択され得る。
1組のPCRプライマーを、プライマー-プライマー相互作用およびオフターゲットアニーリングを最小限にするように設計した。プライマーを、特定のバリアントに近接して配置するようにさらに最適化した。設計後、IDTによってプライマーを合成した。プライマーを等しい体積比で混合してプライマープールにした。半標的化PCR反応を、以下の試薬:以前の反応からのすべての精製DNA、1×KAPA 2G multiplexマスターミックス、プールからの66nMの各プライマーおよび800nM逆相補的プライマーで行った。反応を、以下の熱サイクリングプログラム:95℃ 3分間、(95℃ 15秒間、72℃ 90秒間)×20、72℃ 1分間に供し、4℃で維持した。
その後、1.6(ビーズ比)×AmPure(登録商標)XPビーズを使用して、反応を精製した。ビーズを添加し、10分間インキュベートした。その後、混合物を磁石に移して、5分間置いた。その後、上清を除去した。ビーズを、150μLの80%エタノールで2回、各30秒間洗浄した。その後、すべての残留エタノールを除去し、ビーズを磁石から外して室温で3分間乾燥させた。20μlの低TE緩衝液(Thermo Fisher)をビーズに添加し、2分間インキュベートした。その後、ビーズを磁石に戻して1分間置いた。上清を除去し、次の反応のために保存する。遊離アダプター分子、遊離プライマー分子および/またはアダプター/プライマーダイマーを含む、約100bpより短い分子を除去するビーズ比(例として、1.6倍)が選択され得る。
その後、全長シークエンシングアダプターおよび試料特異的バーコードを付加するための別のPCR反応を完了した。PCR反応は、以下のもの:以前の反応からの2μLの精製DNA、1×NEB ultra Q5 IIマスターミックス、400nMユニバーサルプライマーおよび400nMバーコード特異的プライマーを含有した。反応を、以下の熱サイクリングプログラム:95℃ 3分間、(98℃ 10秒間、65℃ 75秒間)×10、65℃ 2分間に供し、4℃で維持した。
その後、0.8(ビーズ比)×AmPure(登録商標)XPビーズを使用して、反応を精製した。ビーズを添加し、10分間インキュベートした。その後、混合物を磁石に移して、5分間置いた。その後、上清を除去した。ビーズを、150μLの80%エタノールで2回、各30秒間洗浄した。その後、すべての残留エタノールを除去し、ビーズを磁石から外して室温で3分間乾燥させた。25μlの低TE緩衝液(Thermo Fisher)をビーズに添加し、2分間インキュベートする。その後、ビーズを磁石に戻して1分間置いた。上清を除去し、シークエンシングのために準備する。約200bpより短い分子の大部分を除去するビーズ比(例として、0.8倍)が選択され得る。
(実施例2)
この実施例においては、公知のバリアントを含むゲノムDNA(gDNA)試料および血漿試料の両方を、10ngおよび20ngインプットを使用して試験した。gDNA試料は、一塩基多様性(SNV:「一塩基変化」、SNCと互換的に使用される)、インデル、CNVおよび融合を含有した。各バリアントを、様々な対立遺伝子率:5%、1%、0.5%および0.1%でコールした。各変異型についての各対立遺伝子率における感度および特異性を測定した。ここで使用したプライマープールを、表1に示す。各標的特異的プライマーは、プール全体について同じ体積比で、または異なる体積比で使用することができる。例えば、体積比2のプライマーについては、そのプライマーは、比1のプライマーの2倍の体積で添加される。
Figure 0007220200000002
Figure 0007220200000003
Figure 0007220200000004
Figure 0007220200000005
Figure 0007220200000006
Figure 0007220200000007
Figure 0007220200000008
Figure 0007220200000009
Figure 0007220200000010
Figure 0007220200000011
Figure 0007220200000012
Figure 0007220200000013
Figure 0007220200000014
Figure 0007220200000015
一態様においては、本方法は、ある特定の遺伝子座における感度の増大を達成し得る。以下の表2において、本方法を、従来型ハイブリッド捕捉法と比較する。本方法は、ハイブリッド捕捉が捉え損ねたいくつかの遺伝子座をコールしており、このことは、本方法の変換率の増大に直接関連している。
Figure 0007220200000016
約80%の非常に高いライゲーション効率が達成され、標準ライブラリー(複数)の、それぞれ、約25%および10%と比較して、約60%の変換率をもたらした。本方法の例示的な変換率を、表3に示す。
Figure 0007220200000017
Figure 0007220200000018
Figure 0007220200000019
図6で示す通り、分布は、ハイブリッド捕捉よりも、本方法で、変換率が顕著に高くなっていることを示す。この実施例においては、従来型ハイブリダイゼーション捕捉法が、約47%の変換率を達成し得る一方で、本方法は、約88%の非常に高い変換率を達成する。この顕著により高い変換率、および単一の反応で数百の遺伝子座にわたり多重化する能力によって、本方法は、とりわけ、非常に低い対立遺伝子率を有する試料、例として、がん関連SNPおよび/または変異を有するctDNAについては、ポリヌクレオチドの高スループットおよび高精度シークエンシングおよび解析のために理想的なものとなっている。
加えて、非常に小さい標的領域(約30,000塩基)についてのオンターゲット率は、最大で70%であり、標準ライブラリーについての約2000倍の濃縮係数と比較して、40,000倍を超える濃縮係数をもたらす。効率の改善は、より大きな感度をもたらし、多くのバリアントにおいて0.1%に至る正確なコールを可能にした。SNV、インデル、CNVおよび融合は、正確にコールされた。さらに、手順は非常に堅固であり、0%の失敗率を有する。
(実施例3)
この実施例においては、例えば、循環腫瘍DNAから、一塩基変化(SNC)、インデル、コピー数多型(CNV)および融合を調べるために、抽出した血漿DNAからライブラリーを構築するための方法を説明する。この実施例の原理として、(例えば、ヒトから)抽出した血漿DNAを、脱リン酸化および変性させる。一本鎖DNAライゲーションにより、ユニバーサルアダプターを各分子の3’末端に付加する。その後、部位特異的プライマーおよびアダプターに対する逆相補的プライマーを使用して、DNAを半標的化PCRに供する。全長アダプターおよびバーコードを各分子に付加する二次的PCRによりライブラリーを作製する。
この実施例で使用される設備、材料および供給品として:Veriti Thermocycler、96ウェル磁石、96ウェル氷ブロック、Vortexer、プレートミニ遠心分離器、Semi-skirted 96ウェルPCRプレート、プレートシール、ピペットおよびピペットチップがある。
この実施例で使用される試薬および媒体として、ヌクレアーゼ非含有水(Ambion/Thermo:AM9939)、低TE緩衝液(Thermo fisher:12090015)、Circligase Kit(Epicenter:CL4115K)、FastAP(Thermo Fisher:EF0651)、50%PEG4000(Sigma:95904-250g-F、ヌクレアーゼ非含有水Ambion/Thermo:AM9939中で10mL中5gを希釈する)、10μM N12アダプター(IDT)、Taqポリメラーゼ(NEB:M0273S)、dNTPミックス(NEB:N0447L)、標準Taq緩衝液(NEB:M0273S)、Ampure XPビーズ(Agincourt/Beckman Coulter:A63881)、100μM逆相補的プライマー(IDT)、プライマーミックス(IDT)、KAPA 2G multiplex(KAPA:KK5802)、NEBNext Ultra Q5 II(NEB:M0544L)および10μM NEBNext Multiplex Oligos(IDT)がある。
手順
脱リン酸化:
1.以下のマスターミックスを作製する:
Figure 0007220200000020
2.マスターミックスおよびDNAを96ウェルプレートに添加する。
3.プレートを密閉して、軽くボルテックスし、スピンダウンする。
4.以下のプログラム:37℃ 10分間、95℃ 2分間を行う。
5.直後に、プレートを96ウェル氷ブロック上に1分間置き、その後、プレートを除去して、以下のライゲーションを即座に続ける。
ライゲーション:
1.以下のマスターミックスを作製する:
Figure 0007220200000021
2.18μlのマスターミックスを脱リン酸化からの生成物に直接添加する。
3.プレートを密閉して、軽くボルテックスし、スピンダウンする。
4.以下のプログラム:60℃ 2時間、80℃ 10分間、85℃ 2分間、4℃で維持を行う。
5.以下の第2鎖合成に即座に進める。
第2鎖合成:
1.以下のマスターミックスを作製する:
Figure 0007220200000022
2.10μlのマスターミックスをライゲーション生成物に直接添加する。
3.プレートを密閉して、軽くボルテックスし、スピンダウンする。
4.以下のプログラム:95℃ 30秒間、62℃ 2分間、68℃ 10分間、4℃で維持を行う。
5.以下のAmPure(登録商標)XPビーズクリーンアップに即座に進める。
AmPure(登録商標)XPビーズクリーンアップ:
1.AmPure(登録商標)ビーズを、溶液が均一になるまでボルテックスする。
2.80μlのビーズを第2鎖合成からの生成物に添加し、ピペットで吸引・排出してビーズをホモジナイズする。
3.室温で10分間インキュベートする。
4.プレートを磁石に移し、磁石上で5分間またはすべてのビーズが磁石に向かって移動するまでインキュベートする。
5.すべての上清を除去する。
6.150μLの80% EtOHを添加し、30秒間インキュベートする。
7.上清を除去する。
8.ステップ6~7を繰り返す。
9.すべての残留エタノールが除去されたことを確実にし、プレートを磁石から除去し、室温で3分間インキュベートする。
10.16μlの低TE緩衝液を添加し、ピペットで吸引・排出してビーズをホモジナイズする。
11.室温で2分間インキュベートする。
12.プレートを磁石に移し、磁石上で1分間またはすべてのビーズが磁石に移動するまでインキュベートする。
13.15μlの上清を取り出し、それをきれいなプレートに入れる。
14.以下の第1PCRに進めるか、または-20℃で保存する。
第1PCR:
1.以下のマスターミックスを作製する:
Figure 0007220200000023
2.35μlのマスターミックスを15μlの精製DNAに添加する。
3.プレートを密閉して、軽くボルテックスし、スピンダウンする。
4.以下のプログラム:95℃ 3分間、(95℃ 15秒間、72℃ 90秒間)×20、72℃ 1分間、4℃で維持を行う。
5.以下のAmPure(登録商標)XPビーズクリーンアップに即座に進める。
AmPure(登録商標)XPビーズクリーンアップ
1.AmPure(登録商標)XPビーズを、溶液が均一になるまでボルテックスする。
2.80μlのビーズを第2鎖合成からの生成物に添加し、ピペットで吸引・排出してビーズをホモジナイズする。
3.室温で10分間インキュベートする。
4.プレートを磁石に移し、磁石上で5分間またはすべてのビーズが磁石に向かって移動するまでインキュベートする。
5.すべての上清を除去する。
6.150μLの80% EtOHを添加し、30秒間インキュベートする。
7.上清を除去する。
8.ステップ6~7を繰り返す。
9.すべての残留EtOHが除去されたことを確実にし、プレートを磁石から除去し、室温で3分間インキュベートする。
10.20μlの低TE緩衝液を添加し、ピペットで吸引・排出してビーズをホモジナイズする。
11.室温で2分間インキュベートする。
12.プレートを磁石に移し、磁石上で1分間またはすべてのビーズが磁石に移動するまでインキュベートする。
13.19μlの上清を取り出し、それをきれいなプレートに入れる。
14.以下の第2PCRに進めるか、または-20℃で保存する。
第2PCR
1.以下のマスターミックスを作製し、インデックスプライマーおよびDNAを別々に添加することに留意し、残りのDNAは-20℃で保存する:
Figure 0007220200000024
2.新しいプレートに、46μLのマスターミックス、2μLのインデックスプライマーおよび2μLのDNAを添加する。
3.プレートを密閉して、軽くボルテックスし、スピンダウンする。
4.以下のプログラム:95℃ 3分間、(98℃ 10秒間、65℃ 75秒間)×10、65℃ 2分間、4℃で維持を行う。
5.以下のビーズクリーンアップに即座に進める。
AmPure(登録商標)XPビーズクリーンアップ
1.AmPure(登録商標)ビーズを、溶液が均一になるまでボルテックスする。
2.40μlのビーズを第2鎖合成からの生成物に添加し、ピペットで吸引・排出してビーズをホモジナイズする。
3.室温で10分間インキュベートする。
4.プレートを磁石に移し、磁石上で5分間またはすべてのビーズが磁石に向かって移動するまでインキュベートする。
5.すべての上清を除去する。
6.150μLの80% EtOHを添加し、30秒間インキュベートする。
7.上清を除去する。
8.ステップ6~7を繰り返す。
9.すべての残留EtOHが除去されたことを確実にし、プレートを磁石から除去し、室温で3分間インキュベートする。
10.25μlの低TE緩衝液を添加し、ピペットで吸引・排出してビーズをホモジナイズする。
11.室温で2分間インキュベートする。
12.プレートを磁石に移し、磁石上で1分間またはすべてのビーズが磁石に移動するまでインキュベートする。
13.24μlの上清を取り出し、きれいなプレートに入れて-20℃で保存する。
LabChip QC
LabChip HSキットについて
1.LabChipおよび試薬を4℃から取り出し、RTまで平衡化する(10分間)。
2.必要な場合、新しいゲル-色素溶液を調製する。
3.活性チップウェルの各々を、吸引し、分子グレードのHOで2回すすぐ。
4.ラダー管中で12μLのラダー溶液を108μLのHOと混合することによってLabChipラダーを調製する。
5.緩衝液管中に750μlのHOを調製する。
6.逆ピペッティング技術を使用して、LabChipを調製する。
7.BioRad HardshellまたはThermo Fisher Armadillo96ウェルプレート中で、1μLのライブラリーを19μLの水中に希釈する。
8.LabChipを行う。
qPCR Quant
1.必要な場合、30μlのIlluminaフォワードおよびリバースプライマーをKapa SYBR Fast qPCR MM-5mL(KK4601)の新しい瓶に添加することによってqPCRマスターミックスを調製する。
2.すべてのライブラリーの1:10,000希釈物を調製する。
3.BioRad Hard-ShellプレートまたはThermo Fisher Armadilloプレート中で、以下の反応を調製し、少なくとも12個のウェルは空のままにする。
Figure 0007220200000025
4.同じ96ウェルプレート中で、6個のqPCR標準を二連で調製する。
Figure 0007220200000026
5.プレートファイルをプレートレイアウトおよび標準濃度を反映するように編集する。
6.BioRad C1000サーマルサイクラー上で以下のプログラム:95℃ 5分間>(95℃ 30秒間>60℃ 45秒間>画像ステップ)×35を行う。
7.qPCRデータをエクセル(登録商標)シートとしてエクスポートする。
8.開始濃度を(452/300)倍して、Kapa標準とライブラリーとの間のサイズの差について調節する。
9.ステップ8からの濃度を10倍して、希釈因数について調節し、pMをnMに変換する。
シークエンシング(次世代シークエンシング)
1.300サイクルの次世代シークエンシング試薬カートリッジを冷水に入れることによって解凍し、フローセルを4℃から取り出して室温まで平衡化する。
2.シークエンシングするライブラリーを1:1のモル比でプールする。
3.変性および希釈プロトコールを使用して、ライブラリープールを2.2pMの最終濃度および1300μLを超える最終体積まで希釈する。
4.1300μLを次世代シークエンシング試薬カートリッジのウェル10にロードする。
5.次世代シークエンシング廃液容器を空にし、新しいフローセルおよび緩衝液カートリッジをロードする。
6.ウェル10にライブラリーを含有する次世代シークエンシング試薬カートリッジをロードする。次世代シークエンシングリード長についての設定を以下に示す:
Figure 0007220200000027
7.シークエンシングする。

Claims (20)

  1. 1組のアダプターを一本鎖ポリヌクレオチドのライブラリーにライゲーションすることを含む方法であって、
    前記ライゲーションが、一本鎖DNA(ssDNA)リガーゼによって触媒され;
    各一本鎖ポリヌクレオチドが、5’末端でのライゲーションを防止するために前記5’末端でブロックされており;
    各アダプターが、前記アダプターがライゲーションされる前記一本鎖ポリヌクレオチドに目印を付けるユニーク分子識別子(UMI)配列を含み、3’末端でのライゲーションを防止するために前記3’末端でブロックされており;かつ
    前記アダプターの5’末端が、前記ssDNAリガーゼによって前記一本鎖ポリヌクレオチドの3’末端にライゲーションされて直鎖状ライゲーション生成物を形成し、
    それによって、直鎖状一本鎖ライゲーション生成物のライブラリーを得、
    直鎖状一本鎖ライゲーション生成物の前記ライブラリーを直鎖状二本鎖ライゲーション生成物のライブラリーに変換することをさらに含み、
    直鎖状二本鎖ライゲーション生成物の前記ライブラリーを、
    前記アダプターに逆相補的であり、かつ/または前記アダプターにハイブリダイズ可能な配列を各々が含む、1組のプライマー;および
    標的配列にハイブリダイズ可能なプライマー
    を使用して、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって増幅し、
    それによって、前記標的配列の配列情報を含む直鎖状二本鎖ライゲーション生成物の増幅したライブラリーを得ることをさらに含み、
    直鎖状二本鎖ライゲーション生成物の前記増幅したライブラリーをシークエンシングすることであって、前記シークエンシングの変換率が少なくとも60%であること、をさらに含む、
    方法。
  2. 前記ライゲーションステップ前に、試料から一本鎖ポリヌクレオチドの前記ライブラリーを得るステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
  3. 前記試料が、生物学的試料である、請求項2に記載の方法。
  4. 前記生物学的試料が、疾患を有するか、またはそれを有する疑いのある被験体からのものである、請求項3に記載の方法。
  5. 前記生物学的試料が、循環腫瘍DNA(ctDNA)を含む試料である、請求項4に記載の方法。
  6. 前記ssDNAリガーゼが、ThermusバクテリオファージRNAリガーゼ、古細菌RNAリガーゼ、T4 RNAリガーゼI、熱安定性5’App DNA/RNAリガーゼ、T4 RNAリガーゼ2、切断型T4 RNAリガーゼ2、またはT4 DNAリガーゼである、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
  7. 各一本鎖ポリヌクレオチドの前記ブロックが、その5’末端でのライゲーションを防止するための脱リン酸化を含む、または
    各アダプターの前記ブロックが、その3’末端でのライゲーションを防止するための、炭素スペーサー、ddCTP、ddATP、ddTTP、ddGTP、ヘキサンジオール、トリエチレングリコールおよび/またはヘキサエチレングリコールを含む、
    請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
  8. 各アダプターが、前記5’末端において、前記UMI配列に対して5’側であるジヌクレオチド配列を含む、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
  9. 各アダプター中の前記UMI配列が、6~15核酸残基の長さである、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記ライゲーション反応が、密集剤の存在下で行われる、請求項1から9のいずれかに記載の方法。
  11. (1)前記生物学的試料が、いかなる処理も行わずに被験体から直接得られているか;(2)前記生物学的試料中のポリヌクレオチドが、亜硫酸水素塩変換に供されていないか;または(3)前記生物学的試料中のポリヌクレオチドが、部分的なもしくは完全な亜硫酸水素塩変換に供されている、請求項3に記載の方法。
  12. 前記疾患ががんまたは新生物である、請求項4に記載の方法。
  13. 各々が前記標的配列に特異的な配列を含む、複数のプライマーが、使用され、前記プライマーが、同じまたは異なる標的配列を有する、請求項1から12のいずれかに記載の方法。
  14. 前記標的配列の前記配列情報が、変異、一塩基多型(SNP)、コピー数多型(CNV)またはエピジェネティック変化を含む、請求項12または13に記載の方法。
  15. 前記試料が、血液、血清、血漿もしくは体液試料またはそれらの任意の組み合わせである、請求項5に記載の方法。
  16. 被験体における疾患の診断および/または予後、被験体の処置に対する応答性を予測すること、前記疾患もしくは処置についての薬理遺伝学マーカーを同定すること、ならびに/または遺伝情報について集団をスクリーニングすることのために使用される、請求項15に記載の方法。
  17. 前記ジヌクレオチド配列が、GA(5’~3’)、GG(5’~3’)、AA(5’~3’)、またはAG(5’~3’)である、請求項8に記載の方法。
  18. 前記密集剤が、ポリエチレングリコール(PEG)、デキストランおよび/またはフィコールである、請求項10に記載の方法。
  19. 前記疾患が、がんまたは新生物であり、および/または、前記処置が、がんまたは新生物処置である、請求項16に記載の方法。
  20. 標的配列にハイブリダイズ可能な前記プライマーが、配列番号4~1529からなる群より選択される配列またはその相補的な列を含む、請求項1に記載の方法。
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