CN110964782A - 单链核酸连接效率检测方法 - Google Patents

单链核酸连接效率检测方法 Download PDF

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CN110964782A CN201911250298.0A CN201911250298A CN110964782A CN 110964782 A CN110964782 A CN 110964782A CN 201911250298 A CN201911250298 A CN 201911250298A CN 110964782 A CN110964782 A CN 110964782A
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Abstract

本发明提供核酸连接效率的检测方法，包括：提供第一单链核酸和第二单链核酸；将第一单链核酸的任一端或第二单链核酸的任一端修饰后，使第一单链核酸与第二单链核酸连接，然后通过合成互补链使连接产物成为双链核酸，任选进行核酸纯化；检测所述双链核酸的浓度；计算所述核酸连接效率。本发明利用单链核酸和接头进行连接，以带有单链核酸和接头的质粒作为标准品，建立标曲，通过具体数值进行明确对比，实现高灵敏度、高精度连接效率检测。

Description

单链核酸连接效率检测方法
技术领域
本发明涉及单链核酸连接效率检测方法。
背景技术
连接酶用于两段DNA或者RNA的5’磷酸末端和3’-OH末端形成磷酸二酯键变成一个分子。随着分子生物学的发展，特别是近年来基因测序技术的广泛应用。现有的分子检测方法中，连接酶被大量使用。其中单链连接对于特殊形式或特殊处理的DNA(如甲基化亚硫酸盐转化处理)具有较大优势。因此连接酶的活性是保证DNA分子检测能够准确进行的重要因素。现有单链连接酶活性检测更多依赖于琼脂糖胶检测，该方法检测灵敏度低，不易于量化。因此需要有更为准确且易于量化的单链连接酶活性检测方法。本发明利用单链核酸和接头进行连接，以带有单链核酸和接头的质粒作为标准品，建立标曲，通过具体数值进行明确对比，实现高灵敏度、高精度连接效率检测。
发明内容
本发明第一方面提供一种核酸，所述核酸
(1)包含SEQ ID NO:1或2所示序列或与其具有至少70％序列相同性的突变体；或由SEQ ID NO:1或2所示序列组成，
(2)是(1)的互补序列。
在一个或多个实施方案中，核酸包含10-1000个碱基，优选20～500个碱基，更优选100～200个碱基。
在一个或多个实施方案中，核酸是单链核酸。
在一个或多个实施方案中，所述核酸还包含(1)SEQ ID NO:3-8中任一所示序列或与其具有至少70％序列相同性的突变体；(2)(1)的互补序列。
本发明第二方面提供一种检测单链核酸连接效率的方法，包括：
1)提供第一单链核酸和第二单链核酸，所述第一单链核酸的任一端或第二单链核酸的任一端经修饰，
2)使第一单链核酸与第二单链核酸连接，得到连接产物，
3)通过合成互补链使连接产物成为双链核酸，任选进行核酸纯化，
4)检测所述双链核酸的浓度，和
5)计算所述单链核酸连接效率。
在一个或多个实施方案中，第一单链核酸包含10-1000个碱基，优选20～500个碱基，更优选100～200个碱基。
在一个或多个实施方案中，第二单链核酸包含5-200个碱基，优选10～100个碱基，更优选20～50个碱基。
在一个或多个实施方案中，第一单链核酸和第二单链核酸的长度比为200:1～1:2，优选100:1-1:1，更优选50:1-2:1。
在一个或多个实施方案中，步骤2)的连接通过酶促法或非酶促法进行。
在一个或多个实施方案中，步骤2)中的连接包括将第一单链核酸、第二单链核酸与连接酶接触的步骤。
在一个或多个实施方案中，所述修饰阻止被修饰端的连接反应。
在一个或多个实施方案中，所述修饰是修饰5'端。优选地，修饰5'端包括化学交联和去磷酸化。
在一个或多个实施方案中，所述修饰是修饰3'端。优选地，修饰3'端包括磷酸化、C3 Spacer修饰、Amino Linker修饰、LNA修饰、双脱氧核苷酸修饰。
在一个或多个实施方案中，所述修饰选自：5'端化学交联、5'端去磷酸化、3'端磷酸化、3'端C3 Spacer修饰、3'端Amino Linker修饰、3'端LNA修饰和3'端双脱氧核苷酸修饰。
在一个或多个实施方案中，所述修饰通过酶促或非酶促进行。在一个或多个实施方案中，所述修饰包括用去磷酸化酶进行去磷酸化。
在一个或多个实施方案中，步骤3)中合成互补链通过酶促法或化学合成法进行。
在一个或多个实施方案中，步骤5)的计算包括利用所述双链核酸的浓度与100％连接时的理论浓度进行比对，计算核酸连接效率。
在一个或多个实施方案中，步骤4)的检测包括通过qPCR检测。优选地，步骤4)的检测包括：
4a)利用正向引物和反向引物对步骤3)的双链核酸进行qPCR，得到所述双链核酸的浓度，所述正向引物和反向引物分别识别位于第一单链核酸与第二单链核酸的连接点两侧的核酸序列。
在一个或多个实施方案中，正向引物和反向引物设置为在利用所述引物进行PCR时，形成的核酸产物跨越第一单链核酸和第二单链核酸的连接点。
在一个或多个实施方案中，所述正向引物和反向引物分别包含SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11或由其组成。
任选地，步骤4)的检测还包括：
4b)提供不同浓度的包含已连接的第一单链核酸和第二单链核酸的多核苷酸作为参照，
4c)利用正向引物和反向引物对步骤4c)的多核苷酸进行qPCR，得到所述多核苷酸的浓度，
4d)通过比对所述双链核酸与所述不同浓度的多核苷酸的qPCR结果，得到所述双链核酸的浓度。
在一个或多个实施方案中，步骤4b)的多核苷酸是质粒。在一个或多个实施方案中，所述质粒包括pUC57、pUC18和/或pCR2.1。
本发明第三方面提供一种评估单链核酸连接酶的方法，包括：
1)提供第一单链核酸和第二单链核酸，所述第一单链核酸的任一端或第二单链核酸的任一端经修饰，
2)使第一单链核酸、第二单链核酸与所述连接酶接触，得到连接产物，
3)通过合成互补链使连接产物成为双链核酸，任选进行核酸纯化，
4)检测所述双链核酸的浓度，和
5)计算所述核酸连接效率。
在一个或多个实施方案中，第一单链核酸包含10-1000个碱基，优选20～500个碱基，更优选100～200个碱基。
在一个或多个实施方案中，第二单链核酸包含5-200个碱基，优选10～100个碱基，更优选20～50个碱基。
在一个或多个实施方案中，第一单链核酸和第二单链核酸的长度比为200:1～1:2，优选100:1-1:1，更优选50:1-2:1。
在一个或多个实施方案中，第一单链核酸包含SEQ ID NO:1或2所示序列或与其具有至少70％序列相同性的突变体，或是该序列或突变体的互补序列。
在一个或多个实施方案中，第二单链核酸包含SEQ ID NO:3-8中任一所示序列或与其具有至少70％序列相同性的突变体，或是该序列或突变体的互补序列。
在一个或多个实施方案中，所述修饰阻止被修饰端的连接反应。
在一个或多个实施方案中，所述修饰是修饰5'端。优选地，修饰5'端包括化学交联和去磷酸化。
在一个或多个实施方案中，所述修饰是修饰3'端。优选地，修饰3'端包括磷酸化、C3 Spacer修饰、Amino Linker修饰、LNA修饰、双脱氧核苷酸修饰。
在一个或多个实施方案中，所述修饰通过酶促或非酶促进行。在一个或多个实施方案中，所述修饰包括用去磷酸化酶进行去磷酸化。
在一个或多个实施方案中，步骤3)中合成互补链通过酶促法或化学合成法进行。
在一个或多个实施方案中，步骤5)的计算包括利用所述双链核酸的浓度与100％连接时的理论浓度进行比对，计算核酸连接效率。
在一个或多个实施方案中，步骤4)的检测包括通过qPCR检测。优选地，步骤4)的检测包括步骤：
4a)利用正向引物和反向引物对步骤3)的双链核酸进行qPCR，得到所述双链核酸的浓度，所述正向引物和反向引物分别识别位于第一单链核酸与第二单链核酸的连接点两侧的核酸序列。
在一个或多个实施方案中，正向引物和反向引物设置为在利用所述引物进行PCR时，形成的核酸产物跨越第一单链核酸和第二单链核酸的连接点。
任选地，步骤4)的检测还包括：
4b)提供不同浓度的包含已连接的第一单链核酸和第二单链核酸的多核苷酸作为参照，
4c)利用正向引物和反向引物对步骤4c)的多核苷酸进行qPCR，得到所述多核苷酸的浓度，
4d)通过比对所述双链核酸与所述不同浓度的多核苷酸的qPCR结果，得到所述双链核酸的浓度。
在一个或多个实施方案中，步骤4b)的多核苷酸是质粒。在一个或多个实施方案中，所述质粒包括pUC57、pUC18和/或pCR2.1。
本发明第四方面提供本文所述的核酸和/或核酸接头在检测单链核酸连接效率或评估单链核酸连接酶中的应用。
本发明第五方面提供一种检测单链核酸连接效率的试剂盒，所述试剂盒包含第一单链核酸、第二单链核酸、正向引物、反向引物和任选的核酸分子，所述核酸分子包含连接的第一单链核酸与第二单链核酸或其互补序列，其中所述第一单链核酸的任一端或第二单链核酸的任一端经修饰，所述正向引物和反向引物分别识别位于第一单链核酸与第二单链核酸的连接点两侧的核酸序列，从而在利用所述引物进行PCR时，形成的核酸产物跨越第一单链核酸和第二单链核酸的连接点。
在一个或多个实施方案中，试剂盒还包括(1)使第一单链核酸与第二单链核酸连接所需的试剂，(2)合成第一单链与第二单链的连接产物的互补链所需的试剂，和/或(3)进行qPCR所需的试剂。
在试剂盒的一个或多个实施方案中，所述第一单链核酸包含SEQ ID NO:1或2所示序列或与其具有至少70％序列相同性的突变体，或是该序列或突变体的互补序列；和/或所述第二单链核酸包含SEQ ID NO:3-8中任一所示序列或与其具有至少70％序列相同性的突变体，或是该序列或突变体的互补序列。
在试剂盒的一个或多个实施方案中，所述正向引物和反向引物分别包含SEQ IDNO:10和SEQ ID NO:11或由其组成。
附图说明
图1，示例性实施方案中核酸连接效率检测方法的步骤。
图2，示例性实施方案中核酸连接效率检测方法的示意图。
图3，示例性实施方案中检测的不同连接酶的连接效率。
具体实施方式
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成优选的技术方案。
术语“一个”或“一种”意在表示“一个(种)或多个(种)”。当术语“包含”及其各种变体例如“包括”和“含有”位于叙述步骤或要素之前的时候，是用来表示添加其它的步骤或要素是任选的，并且是非排它性的。本发明的实践中可以使用与本文所述类似或等价的任何方法、装置和材料。本文提供的以下定义是用来帮助理解本文经常用到的某些术语，不对本发明的范围构成限制。
图1显示了本发明的核酸连接效率检测方法的步骤示意图，包括：
101提供第一单链核酸和第二单链核酸，所述第一单链核酸的任一端或第二单链核酸的任一端经修饰，
102使第一单链核酸与第二单链核酸连接，然后通过合成互补链使连接产物成为双链核酸，任选进行核酸纯化，
103检测所述双链核酸的浓度，和
104计算核酸连接效率。
在一个或多个实施方案中，检测所述双链核酸的浓度包括步骤：
103a提供正向引物和反向引物，分别识别位于连接点两侧的核酸序列，
103b提供不同浓度的包含已连接的第一单链核酸和第二单链核酸的多核苷酸作为参照，和
103c利用正向引物和反向引物对步骤102的双链核酸和步骤103b的多核苷酸进行qPCR，获得所述双链核酸的浓度。
在步骤101中，本文的单链核酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA或人工合成的DNA。本领域已知单链核酸的合成方法。本文方法涉及使用第一单链核酸和第二单链核酸。
术语“核酸”、“核酸序列”或“多核苷酸”指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸(DNA)或核糖核苷酸聚合物(RNA)，及其互补物。核酸含有合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。核苷酸可以是核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、或其修饰形式。本文考虑的多核苷酸的示例包括单链和双链DNA，单链和双链RNA，以及具有单链和双链DNA和RNA的混合物的杂合分子。
DNA基本组成单位是脱氧核糖核苷酸，经磷酸二酯键缩合而成长链状分子。每个脱氧核糖核苷酸由磷酸、脱氧核糖和碱基组成。DNA的碱基(bp)主要有腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)。在DNA序列中，N代表任意碱基。
术语“扩增产物”是指在引物定向扩增反应过程中产生的核酸片段。引物定向扩增的一般方法包括聚合酶链反应(PCR)，连接酶链反应(LCR)或链置换扩增(SDA)。如果选择PCR方法，则复制组合物可包含用于核酸复制的组分，例如：核苷酸三磷酸，具有适当序列的两种或更多种引物，聚合酶，缓冲液，溶质和蛋白质。
第一单链核酸可以为任意序列和任意长度。在一个或多个实施方案中，第一单链核酸包含约10-1000个碱基，优选约20～500个碱基，更优选约100～200个碱基。在一个实施方案中，第一单链核酸包含SEQ ID NO:1或2所示序列或与其具有至少70％序列相同性的突变体，或该序列或突变体的互补序列。在一个实施方案中，第一单链核酸由SEQ ID NO:1或2所示序列组成。在示例性实施例中，第一单链核酸称为oligo DNA。
第二单链核酸可以为任意序列和任意长度。在一个实施方案中，第二单链核酸包含约5-200个碱基，优选约10～100个碱基，更优选约20～50个碱基。第二单链核酸是接头。在一个实施方案中，第二单链核酸的序列包含SEQ ID NO:3-8中任一所示序列或与其具有至少70％序列相同性的突变体，或该序列或突变体的互补序列。在一个实施方案中，第二单链核酸的序列由SEQ ID NO:3-8中任一所示序列组成。优选地，第二单链核酸的序列包含SEQ ID NO:3或由其组成。更优选地，第二单链核酸的序列包含SEQ ID NO:4或由其组成。相比SEQ ID NO:5-8，SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4作为第二单链核酸的连接效率检测结果更稳定。在示例性实施例中，第二单链核酸称为Adopter DNA。
在一个或多个实施方案中，第一单链核酸和第二单链核酸的长度比为200:1～1:2，优选100:1-1:1，更优选50:1-2:1，更优选10:1-3:1，或为这些端值中任意组合形成的范围，例如100:1-3:1。
本文术语“变体”或“突变体”是指与参照序列相比，通过一个或多个核苷酸的插入、缺失或取代使核酸序列发生变化同时保留其与其他核酸序列连接能力的多核苷酸。本文任一实施方案所述的突变体包括与参照序列(如本文所述的SEQ ID NO:1-11)具有至少70％，优选至少80％，优选至少85％，优选至少90％，优选至少95％，优选至少97％的序列相同性并保留参照序列的生物学活性的核苷酸序列。可采用例如NCBI的BLASTn计算两条比对的序列之间的序列相同性。突变体还包括在参照序列的和核苷酸序列中具有一个或多个突变(插入、缺失或取代)、同时仍保留参照序列生物学活性的核苷酸序列。所述多个突变通常指1－10个以内，例如1－8个、1－5个或1－3个。取代可以是嘌呤核苷酸与嘧啶核苷酸之间的取代，也可以是嘌呤核苷酸之间或嘧啶核苷酸之间的取代。取代优选是保守性取代。例如，在本领域中，用性能相近或相似的核苷酸进行保守性取代时，通常不会改变多核苷酸的稳定性和功能。保守性取代例如嘌呤核苷酸之间的(A与G)的互换，嘧啶核苷酸之间的(T或U与C)的互换。因此，在本发明多核苷酸中用来自同一残基替换一个或几个位点，将不会在实质上影响其活性。
在步骤102中，本文所述第一单链核酸或第二单链核酸在连接前经修饰。所述修饰使核酸序列的被修饰端无法进行连接反应。修饰5'端的示例包括化学交联和去磷酸化；修饰3'端的示例包括磷酸化、C3 Spacer修饰、Amino Linker修饰、LNA修饰、双脱氧核苷酸修饰等。本领域已知常规核酸序列末端修饰方法。在一个实施方式中，所述修饰是去磷酸化。去磷酸化的核酸序列因5'端无磷酸基团，所以5'端无法参与连接反应。去磷酸化的核酸序列的3’具有羟基的，可以与目的片段的5'端磷酸基团连接。本领域已知核酸去磷酸化方法，例如使用去磷酸化酶，例如碱性磷酸酶，如NEB公司的Alkaline Phosphatase,CalfIntestinal(CIP)、Quick CIP和ThermoFisher Scientific公司的FastAPThermosensitive Alkaline Phosphatase。
本文涉及使用本领域技术人员已知或未知的方法连接核酸序列的方法。“连接”表示在两个或多个核酸末端之间形成共价键或连接。连接可以通过酶促或非酶促方式进行。酶促连接包括使用核酸连接酶进行连接，以在一个寡核苷酸末端核苷酸的5'碳与另一个寡核苷酸的3'碳之间形成磷酸二酯键。核酸连接酶可以获自重组或天然来源。这样的核酸连接酶包括：本领域技术人员已知的DNA连接酶和RNA连接酶。DNA连接酶包括细菌和哺乳动物DNA连接酶。示例性连接酶包括：T3连接酶、T4连接酶、T7连接酶、大肠杆菌DNA连接酶、TaqDNA连接酶、Pfu连接酶、环状连接酶、
Figure BDA0002308827760000091
DNA连接酶、CircligaseTM连接酶、瞬时黏性连接酶、HiFi Taq DNA连接酶等。
本文还涉及单链核酸的互补链合成，包括酶促或化学合成法。合成的互补链与所述单链核酸通过核苷酸配对成为双链核酸产物。互补链的酶促合成包括自身引导合成法、置换合成法、或引导合成法。互补链还可通过本领域已知的单链核酸合成方法合成，并退火至与其互补的单链核酸。
本文还涉及核酸纯化，本领域技术人员已知的常规核酸纯化方法可用于获得本文的核酸。
在步骤103中，本发明包括检测互补链合成形成的双链核酸的浓度。本领域周知检测双链核酸浓度的方法，包括但不限于：分光光度法、基于酶催化的核酸定量法、荧光染料法、PCR电泳法、酶联免疫法、qPCR法、数字PCR法、Southern杂交、Northern杂交、基因芯片、支链信号放大技术等。在示例性实施方案中，使用qPCR法检测所述双链核酸的浓度，包括上述步骤103a、103b和103c。
在步骤103a中，本文所用术语“引物”通常是指合成的寡核苷酸，当其置于聚合酶催化的条件下时，能够起到核酸合成或复制的起始点的作用。引物还可含有可检测标记物，例如5'末端标记物。引物通常成对使用，正向引物与靶区域一端的核酸模板链互补，反向引物与靶区域相对端或另一端的另一条核酸模板链互补。本领域周知正向引物和反向引物仅是相对概念，可互换使用。核酸聚合酶可由引物的3’端开始合成新的核酸链。人工设计的引物被广泛用于聚合酶链反应、测序和探针合成等。本发明方法包括提供引物对，包含正向引物和反向引物，它们分别识别位于第一单链核酸和第二单链核酸的连接点两侧的核酸序列。从而在利用所述引物对进行PCR时，形成的核酸产物跨越所述连接点。在一个示例性实施方式，本文所用引物序列如SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11所示。
在步骤103b中，本发明方法还包括提供不同浓度的包含顺序连接的第一单链核酸和第二单链核酸的多核苷酸。所述多核苷酸用于获得qPCR的标准曲线。所述多核苷酸可为直链核酸、环状核酸或核酸构建物，例如质粒。本领域周知获得所述多核苷酸的方法，例如通过人工合成或PCR。在所述多核苷酸是质粒时，可将第一单链核酸和第二单链核酸以顺序连接的方式插入到质粒中。将核酸序列插入质粒的方法本领域周知，例如通过PCR或粘性末端连接。本发明方法可使用本领域周知的任何重组核酸工程中所涉质粒。适用于本文的质粒包括pUC57、pUC18、pCR2.1等。在示例性实施方式中，本文所用多核苷酸称为Ciroligo。
本文所述多核苷酸可配制为系列浓度的标准品。本领域周知确定所述系列浓度并配制多核苷酸标准品的方法。所述标准品可用本领域周知的缓冲液稀释，例如低TE缓冲液。在示例性实施方式中，本文所用标准品是多核苷酸浓度分别为20pM、2pM、0.2pM、0.02pM、0.002pM、0.0002pM、0pM的系列稀释物。
在步骤103c中，本发明方法还包括对本文所述的双链核酸产物和/或核酸构建体进行定量聚合酶链反应(qPCR)。qPCR又称实时聚合酶链反应(real-time PCR)，在PCR期间实时监测靶核酸分子的扩增。qPCR可以定量地或半定量地确定样品中模板核酸的含量。在qPCR中检测PCR产物的两种常用方法是插入任何双链核酸的非特异性荧光染料和由荧光报告基因标记的寡核苷酸组成的序列特异性核酸探针。qPCR过程通常包括一系列重复25-50次的温度变化。这些循环通常由三个阶段组成：第一阶段约95℃，允许分离核酸的双链；第二阶段约50-70℃，允许引物与核酸模板结合；第三阶段约68-72℃，促进DNA聚合酶进行的聚合。在一些实施方式中，第三阶段可省略。各循环使用的温度和时间取决于多种参数，例如用于合成DNA的酶、反应中二价离子和脱氧核糖核苷酸(dNTP)的浓度以及引物的结合温度。本领域已知确定qPCR各循环温度和时间的方法。在第一单链核酸和第二单链核酸是RNA时，本发明还涉及使用RT-qPCR，即将RNA连接产物反转录为cDNA，再通过qPCR定量。qPCR检测可使用任何商业化(KAPA
Figure BDA0002308827760000101
FAST Universal、NEB Luna Universal)或者自配的反应混合物，该混合物中包括任何形式的DNA聚合酶、4种脱氧核糖核苷酸、任意浓度的Mg离子等。qPCR检测仪器可使用任意厂家qPCR仪，如BioRad CFX connect Real-Time PCRDetection System。
在使用qPCR检测双连核酸浓度的实施方案中，可通过本领域周知的方法利用qPCR的结果计算获得双链核酸浓度。示例性地，利用qPCR的结果计算获得双链核酸浓度包括：根据标准品检测Ct值，构建Ct值与DNA浓度的标准曲线；根据连接产物检测Ct值，计算连接产物的稀释后DNA浓度；然后根据稀释倍数，计算连接产物实际DNA浓度，
在步骤104中，本发明方法还包括计算核酸连接效率的步骤。利用连接后经互补链合成的双链核酸的浓度与100％连接时的理论浓度进行比对，计算得到核酸连接效率。
本发明通过参考以下实验实施例进一步详细地进行描述。这些实施例仅出于说明性的目的提供，并不意欲为限制性的，除非另有规定。因此，本发明决不应被解释为限于以下实施例，而是应被解释为包括由于本文提供的教导变得显而易见的任何和全部的变化。实施例中所用的方法和试剂，除非另有说明，否则为本领域常规的方法和试剂。
实施例
实施例1，制备标准品及标准曲线
1、配制标准品Ciroligo(由上海生工生物有限公司合成，包含如SEQ ID NO:9所示的序列)：用低TE缓冲液(ThermoFisher Sicentific,TE buffer,12090015)梯度稀释标准品使其浓度分别至20pM、2pM、0.2pM、0.02pM、0.002pM、0.0002pM、0pM(即低TE缓冲液)。
2、采用Sigma-Aldrich公司的KAPA
Figure BDA0002308827760000111
FAST Universal试剂盒进行qPCR。按照5μL的Kapa SYBR Fast qPCR MIX加上1μL的正向引物/反向引物(2μM)配制7个稀释的标准品的qPCR反应体系。qPCR的引物序列如SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11所示。
3、涡旋振荡，短暂离心。分装6μL至PCR管中，再分别加入4μL Ciroligo标准品，涡旋振荡，短暂离心。
4、将PCR管放入荧光定量PCR仪(BioRad CFX connect Real-Time PCRDetectionSystem)中，运行如下程序：预变性(95℃，5分钟)；信号收集，40个循环(95℃，30秒；60℃，45秒(荧光信号收集))。
实施例2，核酸连接和双链检测
1、取合成的200mM 130nt oligo DNA 2μL，使用连接酶1、2和3分别进行进行连接反应。按以下比例混合为40μL体系，oligo DNA(SEQ ID NO:2，2μL)，无核酸酶水(24μL)，接头序列(序列如SEQ ID NO:4所示，2μL)，10X反应缓冲液(5μL)，1mM ATP(2.5μL)，50mM氯化锰(2.5μL)，连接酶(2μL)。连接反应条件为60℃、2小时，80℃、10分钟和4℃保温。
2、利用安捷伦公司Pfu Turbo DNA聚合酶进行互补链合成反应，取100μM反向引物0.5μL，10mM各dNTP 1μL，10X Pfu Turbo反应缓冲液5μL，Pfu Turbo DNA聚合酶0.5μL，3μL无核酸酶水。将上述混合物加入步骤1的连接产物中，混匀并离心。运行如下程序：95℃30秒，62℃2分钟，68℃15分钟，4℃保持。
3、用80μL磁珠纯化步骤2所得产物，并用20μL低TE缓冲液洗脱DNA，转移19μL至新的管子中。
4、将纯化产物稀释100,000倍：取2μL纯化产物，加入198μL无核酸酶水，得到稀释100倍的纯化产物。取2μL稀释100倍的纯化产物，加入98μL无核酸酶水，得到稀释5,000倍的纯化产物。取5μL稀释5,000倍的纯化产物，加入95μL无核酸酶水，得到稀释100,000倍的纯化产物。
5、按照实施例1的步骤2-4对稀释100,000倍的纯化产物进行qPCR。
实施例3，连接效率计算
根据实施例1，200nM DNA oligo加入2μL，该DNA经连接、二链合成反应并纯化后最终体积为20μL。根据实施例2的qPCR结果与100％效率下的理论值进行比较。结果如表1和图3所示，三种连接酶的检测灵敏度高，误差小，精度高。
表1
Figure BDA0002308827760000131
在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域研究人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书写限定的范围。
实施例4，核酸连接和单链检测
使用与实施例2相同的方法检测核酸酶1的连接效率，但不进行互补链合成步骤。本实施例中，单链DNA在PCR中，第一次扩增比二链DNA少一倍模板分子，因而100％连接理论DNA量是互补链合成后的一半。结果如下表2所示，不做互补链合成就进行连接检测，整体检测稳定性很差，连接效率也与实际不符。因此，连接后以双链形式进行荧光定量相比以单链形式进行荧光定量的稳定性和准确性都大大提高。
表2
Figure BDA0002308827760000141
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 上海鹍远健康科技有限公司
<120> 单链核酸连接效率检测方法
<130> 194684
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 130
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
gactggaaga gcactgttgt gattccgcgg gtcagcgtat cagttggagg ctcatcgttc 60
ctttttagat gttatcgagg tccgacnnnn nnacagggag gtcaggtgtg gatcggatac 120
gcatgaggct 130
<210> 2
<211> 130
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
gactggaaga gcactgttgt gattccgcgg gtcagcgtat cagttggagg ctcatcgttc 60
ctttttagat gttatcgagg tccgacatcg gcacagggag gtcaggtgtg gatcggatac 120
gcatgaggct 130
<210> 3
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
nnnnnnagat cggaagagcg tcgtgtaggg aaagagtgc 39
<210> 4
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
actagtcaga tcggaagagc gtcgtgtagg gaaagagtgc 40
<210> 5
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
gatcggaaga gcacacgtct gaactccagt cac 33
<210> 6
<211> 58
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatct 58
<210> 7
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
ctgtctctta tacacatcta gatgtgtata agagacag 38
<210> 8
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
aatgatacgg cgaccaccga gatctacacg cctccctcgc gccatcag 48
<210> 9
<211> 170
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
gactggaaga gcactgttgt gattccgcgg gtcagcgtat cagttggagg ctcatcgttc 60
ctttttagat gttatcgagg tccgacatcg gcacagggag gtcaggtgtg gatcggatac 120
gcatgaggct actagtcaga tcggaagagc gtcgtgtagg gaaagagtgc 170
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
gactggaaga gcactgtt 18
<210> 11
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 11
cactctttcc ctacacg 17

Claims (18)

1.一种检测单链核酸连接效率的方法，包括：
1)提供第一单链核酸和第二单链核酸，其中所述第一单链核酸的任一端或第二单链核酸的任一端经修饰，
2)使第一单链核酸与第二单链核酸连接，得到连接产物，
3)通过合成互补链使连接产物成为双链核酸，任选进行核酸纯化，
4)通过qPCR检测所述双链核酸的浓度，和
5)计算所述单链核酸连接效率。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法具有下述特征中的一个或多个：
第一单链核酸包含10-1000个碱基；
第二单链核酸包含5-200个碱基；
第一单链核酸和第二单链核酸的长度比为200:1～1:2；
步骤2)的连接通过酶促或非酶促进行；
所述修饰阻止被修饰端的连接反应；
步骤3)中合成互补链通过酶促法或化学合成法进行；
步骤5)的计算包括利用所述双链核酸的浓度与100％连接时的理论浓度进行比对，计算核酸连接效率。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述修饰选自：5'端化学交联、5'端去磷酸化、3'端磷酸化、3'端C3 Spacer修饰、3'端Amino Linker修饰、3'端LNA修饰和3'端双脱氧核苷酸修饰。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中的连接包括将第一单链核酸、第二单链核酸与连接酶接触的步骤。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，
所述第一单链核酸包含SEQ ID NO:1所示序列或与其具有至少70％序列相同性的突变体，或是该序列或突变体的互补序列；和/或
所述第二单链核酸包含SEQ ID NO:3、5-8中任一所示序列或与其具有至少70％序列相同性的突变体，或是该序列或突变体的互补序列。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，
所述第一单链核酸包含SEQ ID NO:2所示序列或与其具有至少70％序列相同性的突变体，或是该序列或突变体的互补序列；和/或
所述第二单链核酸包含SEQ ID NO:4所示序列或与其具有至少70％序列相同性的突变体，或是该序列或突变体的互补序列。
7.如权利要求1所述的方法，其中步骤4)的检测包括：
利用正向引物和反向引物对步骤3)的双链核酸进行qPCR，得到所述双链核酸的浓度，所述正向引物和反向引物分别识别位于第一单链核酸与第二单链核酸的连接点两侧的核酸序列。
8.如权利要求7所述的方法，其中正向引物和反向引物设置为在利用所述引物进行PCR时，形成的核酸产物跨越第一单链核酸和第二单链核酸的连接点。
9.如权利要求8所述的方法，其中正向引物和反向引物分别包含SEQ ID NO:10和SEQID NO:11或由其组成。
10.一种核酸，所述核酸包含
(1)SEQ ID NO:1所示序列或与其具有至少70％序列相同性的突变体；
(2)(1)的互补序列。
11.如权利要求10所述的核酸，其特征在于，所述核酸包含
(1)SEQ ID NO:2所示序列或与其具有至少70％序列相同性的突变体；
(2)(1)的互补序列。
12.如权利要求10所述的核酸，其特征在于，所述核酸还包含
(1)SEQ ID NO:3、5-8中任一所示序列或与其具有至少70％序列相同性的突变体；
(2)(1)的互补序列。
13.如权利要求10所述的核酸，其特征在于，所述核酸还包含
(1)SEQ ID NO:4所示序列或与其具有至少70％序列相同性的突变体；
(2)(1)的互补序列。
14.权利要求10-13中任一项所述的核酸在检测单链核酸连接效率或评估单链核酸连接酶的连接效率中的应用，或在制备用于检测单链核酸连接效率或评估单链核酸连接酶的连接效率的试剂盒中的应用。
15.一种检测单链核酸连接效率的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含第一单链核酸、第二单链核酸、正向引物和反向引物，
其中所述第一单链核酸的任一端或第二单链核酸的任一端经修饰，所述正向引物和反向引物分别识别位于第一单链核酸与第二单链核酸的连接点两侧的核酸序列，从而在利用所述引物进行PCR时，形成的核酸产物跨越第一单链核酸和第二单链核酸的连接点。
16.如权利要求15所述的试剂盒，其特征在于，
所述第一单链核酸包含SEQ ID NO:1所示序列或与其具有至少70％序列相同性的突变体，或是该序列或突变体的互补序列；和/或
所述第二单链核酸包含SEQ ID NO:3、5-8中任一所示序列或与其具有至少70％序列相同性的突变体，或是该序列或突变体的互补序列。
17.如权利要求16所述的试剂盒，其特征在于，
所述第一单链核酸包含SEQ ID NO:2所示序列或与其具有至少70％序列相同性的突变体，或是该序列或突变体的互补序列；
所述第二单链核酸包含SEQ ID NO:4所示序列或与其具有至少70％序列相同性的突变体，或是该序列或突变体的互补序列；和
所述正向引物和反向引物分别包含SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11或由其组成。
18.如权利要求15所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括
(1)使第一单链核酸与第二单链核酸连接所需的试剂，
(2)合成第一单链与第二单链的连接产物的互补链所需的试剂，和/或
(3)进行qPCR所需的试剂。
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