CN114395618A - 一种测定酶连接效率的方法及试剂盒 - Google Patents

一种测定酶连接效率的方法及试剂盒 Download PDF

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姜锋
张介中
李志民
孙雪光
王娟
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Abstract

本发明提供一种测定酶连接效率的方法，其步骤包括配制第一样品、第二样品和接头，其中所述第一样品可由待测酶与所述接头进行连接，并可以进行PCR扩增，所述第二样品不能由所述待测酶进行连接，并可以进行PCR扩增；将所述第一样品和所述第二样品，加入含有所述待测酶与接头的同一工作体系中进行连接反应，得到连接产物，所述连接产物包括第一样品连接产物和第二样品连接产物；根据反应前所述第一样品与所述第二样品的浓度与反应后所述第一样品连接产产物与所述第二样品连接产物的浓度计算所述待测酶的连接效率。该方法能够稳定而有效的测得酶的连接效率。

Description

一种测定酶连接效率的方法及试剂盒
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种测定酶连接效率的方法及试剂盒。
背景技术
DNA连接酶，可以催化粘性末端或平末端双链DNA或RNA的5'磷酸基和3'羟基之间形成3'5'-磷酸二酯键，连接两个独立的片段。在分子生物学实验领域有着广泛的应用范围，在众多实验中是保障实验结果的关键步骤。例如：在二代测序建库过程中，连接就是关键步骤(将DNA片段与含有测序结合位点的DNA接头连接，得到能进行测序的文库)，因此连接步骤是建库及测序成功的重要因素之一。
目前主流对连接酶中T4连接酶的连接酶活进行定量和质检的方法来自国标《GB/T34776-2017T4DNA连接酶酶活及杂质检测方法》。国标主要利用内切酶Hind III将一定量的λDNA进行酶切，得到粘性末端后，使用T4连接酶对其进行连接。然后将连接产物进行电泳，与已知酶活的T4连接酶进行比较对得到待测连接酶酶的酶活。大致流程为：质控品制备(酶切+纯化)→测试(对照+待检，需要多梯度稀释)→质检(跑胶)。
国标展示的方法虽然能一定程度上测定出待测T4连接酶的活性，但是目前连接酶的使用场景中，很大一部分应用于文库的构建，所以国标的方法不适用于文库构建过程，或者说使用存在偏差以及该方法结果无法定量：
1.连接产物复杂，在实际应用中产生部分无效片段干扰质检；
2.投入量级大，需要微克级别，产物片段较长，达到kbp级别，不适用于目前的二代建库体系；
3.酶切产物连接难以定量计算连接，难以对实际连接体系的优化进行指导；
4.建库质检过程需要对添加对照组和待测组多梯度测试条件，对大批量检测连接酶效率存在通量的限制；
5.结果只能依据经验和肉眼判断，存在一定偏差。
CN 201810214423.1也公开了一种T4DNA连接酶的活性检测方法。该方法：提供一端与磁珠固定的第一DNA片段；提供第二DNA片段，所述第一DNA片段和第二DNA片段端部具有互补碱基序列；使用待测T4连接酶连接第二DNA片段和第一DNA片段；将连接有第一DNA片段和第二DNA片段的磁珠固定至玻片；使用第一探针对玻片上第一DNA片段进行标示并计数；使用第二探针对玻片上第二DNA片段进行标示并计数；定义第二DNA片段的数量和第一DNA片段的数量的比值作为待测T4连接酶活性参考值。
该技术能定量检测连接酶活力，但是过程复杂，需要合成一端连接磁珠的DNA片段、2种荧光探针，检测过程中需要2次进行探针扩增和拍照，需要花费较长时间和成本。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本发明提供一种测定DNA连接酶连接效率的方法及试剂盒。
具体来说，本发明涉及如下方面：
1、一种测定酶连接效率的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
配制第一样品、第二样品和接头，其中所述第一样品可由待测酶与所述接头进行连接，可以进行PCR扩增，所述第二样品不能由所述待测酶进行连接，可以进行PCR扩增；
将所述第一样品和所述第二样品，加入含有所述待测酶与接头的同一工作体系中进行连接反应，得到连接产物，所述连接产物包括第一样品连接产物和第二样品连接产物；
根据反应前所述第一样品与所述第二样品的浓度与反应后所述第一样品连接产物与所述第二样品连接产物的浓度计算所述待测酶的连接效率。
2、根据项1所述的方法，其特征在于，所述第一样品为一端或两端带有磷酸基团和/或正常羟基的粘性末端或平末端双链DNA片段，所述接头为末端可与所述第一样品末端发生连接的互补粘性末端或平末端。
3、根据项1所述的方法，其特征在于，所述第一样品为双链3'端突出一个以上碱基，5'端磷酸化的粘性末端双链DNA片段，优选为所述第一样品为双链3'端突出一个A，5'端磷酸化的粘性末端双链DNA片段，接头为任一链3'端突出与所述第一样品突出链互补的碱基，互补链5'端磷酸化的粘性末端双链DNA片段，优选为所述接头为任一链3'端突出一个T，互补链5'端磷酸化的粘性末端双链DNA片段。
4、根据项1所述的方法，其特征在于，所述第二样品是不能被待测酶连接的双链DNA片段，优选为两端无磷酸基团的双链DNA片段。
5、根据项1所述的方法，其特征在于，所述步骤还包括在连接反应后，对所述第一样品连接产物和所述第二样品连接产物进行PCR扩增，得到第一样品扩增产物和第二样品扩增产物，所述第一样品连接产物与所述第二样品连接产物可使用同一对引物扩增。
6、根据项1所述的方法，其特征在于，所述的待测酶为DNA连接酶，优选为T4 DNA连接酶。
7、根据项1所述的方法，其特征在于，所述待测酶的连接效率为：
Figure BDA0003444247950000031
其中C10为所述第一样品在所述工作体系中的起始浓度，C11为所述第一样品连接产物在所述工作体系中的浓度，C20为所述第二样品在所述工作体系中的起始浓度，C21为所述第二样品连接产物在所述工作体系中的浓度。
8、根据项5所述的方法，其特征在于，所述待测酶的连接效率为：
Figure BDA0003444247950000032
其中C10为所述第一样品在所述工作体系中的起始浓度，C11为所述第一样品扩增产物在所述工作体系中的浓度，C20为所述第二样品在所述工作体系中的起始浓度，C21为所述第二样品扩增产物在所述工作体系中的浓度。
9、根据项1所述的方法，其特征在于，所述的测定酶连接效率的方法还可以应用于测定连接反应步骤中其他连接条件的连接效率，所述的其他连接条件包括：连接缓冲液(buffer)、接头、反应温度、反应时间、底物与接头使用比例、酶用量。
10、一种用于测定酶连接效率的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-9中任一项所述的第一样品、第二样品、以及接头。
本发明测定酶连接效率的方法具有以下有益效果：
1、能定量测定酶连接效率，检测过程有效而稳定，模仿不同的应用场景的体系条件，适合于不同实际应用场景过程中质控的应用。特别是可模仿不同文库构建步骤中的连接场景，适合于高通量测序过程中质控的应用。
2、本方法不仅限于对连接酶的活力进行测定，且在一定的测试方案下，对影响连接步骤的所有因素均可进行测定；能为连接反应步骤的优化提供实际数据支持。
3、本方法简单易操作且支持高通量检测。检测过程2步骤，能同时完成多多种酶，多种条件的测试。
4、本方法建立了检测酶连接效率的模型。
5、本方法检测投入反应底物的量级比较小，纳克级别即可完成检测，节省体系用量和成本。
附图说明
图1是本发明测定酶连接效率的方法的原理图；
图2是本发明测定酶连接效率的方法的计算原理图；
图3不同酶量(模拟酶活性)连接效率与实际建库浓度结果对比图；
图4不同连接酶连接效率检测结果与连接产物浓度对比图；
图5不同连接酶和buffer的连接效率对比图。
具体实施方式
下面结合实施例进一步说明本发明，应当理解，实施例仅用于进一步说明和阐释本发明，并非用于限制本发明。
除非另外定义，本说明书中有关技术的和科学的术语与本领域内的技术人员所通常理解的意思相同。虽然在实验或实际应用中可以应用与此间所述相似或相同的方法和材料，本文还是在下文中对材料和方法做了描述。在相冲突的情况下，以本说明书包括其中定义为准，另外，材料、方法和例子仅供说明，而不具限制性。以下结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但不用来限制本发明的范围。
本发明提供一种测定酶连接效率的方法，所述方法包括以下步骤：
配制第一样品、第二样品和接头，其中所述第一样品可以由待测酶与所述接头进行连接，可以进行PCR扩增，所述第二样品不能由所述待测酶进行连接，可以进行PCR扩增；
将所述第一样品和所述第二样品，加入含有所述待测酶与接头的同一工作体系进行连接反应，得到反应产物，所述的反应产物中包括第一样品连接产物和第二样品连接产物；
根据反应前所述第一样品与所述第二样品的浓度与反应后所述第一样品连接产物与所述第二样品连接产物的浓度计算所述待测酶的连接效率。
其中，第一样品、第二样品和接头均为双链DNA片段，来源可以为来自人、动植物、微生物以及人造片段等；可以通过酶切、PCR、人工合成等方式获得。一般情况下，接头片段小于第一样品片段长度。
在本发明中，所述的第一样品也可称为待测酶的反应底物，其能被待测酶催化与接头进行连接，即能在含有所述待测酶与接头的工作体系进行连接反应，连接之后还可以进行PCR扩增。第一样品和接头选自以下任意一种：
第一种：第一样品为任一链3'端突出一个以上碱基，互补链5'端磷酸化的粘性末端dsDNA片段或双链3'端突出一个以上碱基，5'端磷酸化的粘性末端双链DNA片段；接头为任一链3'端突出与所述第一样品突出链互补的碱基，互补链5'端磷酸化的粘性末端双链DNA片段；
第二种：第一样品为任一链5'端突出一个以上碱基，互补链3'端正常羟基的粘性末端双链DNA片段或两条链5'端突出一个以上碱基，3'端正常羟基的粘性末端双链DNA片段；接头为任一链5'端突出与所述第一样品突出链互补的碱基，互补链3'端为正常羟基的粘性末端双链DNA片段；
第三种：第一样品为任一链5'端磷酸化的平末端双链DNA片段或双链5'端磷酸化的平末端双链DNA片段；接头为任一链5'端磷酸化，互补链3'端为正常羟基的双链DNA。
在一具体实施例中，所述第一样品为双链3'端突出一个A(腺嘌呤)，5'端磷酸化的粘性末端双链DNA片段；接头为任一链3'端突出一个T(胸腺嘧啶)，互补链5'端磷酸化的粘性末端双链DNA片段。
在本发明中，所述第二样品的结构不能被待测酶连接，但是可以同第一样品连接产物在同一体系中被同一对引物扩增，从而在需要扩增检测的体系中可以作为第一样品扩增的一个参照物。因此，在本发明的一些具体实施方式中，第二样品称为内参。在一具体的实施方式中，第二样品是两端无磷酸基团的双链DNA片段。
在本发明中，所述第一样品、第二样品与接头连接的反应条件应选自连接酶的最适反应温度与时长范围。进一步限定16～30℃，10分钟-12小时。具体地，可以是该温度和时间条件下的任意组合，连接接头的反应温度为16℃～30℃，时间可以是10分钟、15分钟、30分钟、1小时2小时3小时4小时、10小时和12小时。在一具体实施方式中，反应条件为20℃，15分钟。
所述的连接产物包括第一样品连接产物与第二样品连接产物。第一样品连接产物与第二样品连接产物(或第一样品扩增产物与第二样品扩增产物)的片段大小和/或序列不同。其差异取决于后期浓度测量时采用的方法。具体地，采用光密度测定、生物分析仪、荧光定量仪、凝胶电泳、实时定量PCR等依赖片段大小测定样本浓度的方法时，第一样品连接产物片段与第二样品连接产物片段(或第一样品扩增产物片段与第二样品扩增产物片段)至少存在片段大小的不同；采用测序法测定样本浓度，则第一样品连接产物片段与第二样品连接产物片段(或第一样品扩增产物片段与第二样品扩增产物片段)至少存在片段序列的不同。本发明中所述的第一样品连接产物与第二样品连接产物的长度不同，所述不同相差在20bp以上。
在本发明中，第一样品、第二样品和接头片段大小可以根据实际应用场景进行设计。其中第一样品、第二样品片段大小可选自80～1000bp；优选地第一样品片段大小为80-300bp，第二样品片段大小为100～500bp。在一具体实施例中，第一样品片段大小为110bp，第二样品片段大小为210bp。
其中，同一工作体系是指同一个反应体系，即第一样品和第二样品在同一个反应体系中进行连接反应。在本发明中，测定酶连接效率的方法更优选还包括在连接反应之后的PCR步骤，即对第一样品连接产物和第二样品连接产物进行PCR扩增，得到扩增反应产物，所述的扩增反应产物包括第一样品扩增产物和第二样品扩增产物。在PCR反应过程中，第一样品连接产物与第二样品连接产物可采用同一对引物扩增。为实现该步骤，这里所述的第一样品连接产物的两端与第二样品连接产物的两端应有一段相同的序列，可对应同一对引物进行PCR扩增反应。
上述的本发明的测定酶连接效率的方法的原理如图1和图2所示，其中测定酶连接效率的方法更优选还包括在连接反应之后的PCR步骤。长度为110bp的第一样品在待测酶的作用下两端分别与接头进行连接，并进一步通过进行PCR扩增，得到长度为230bp的底物的扩增产物，扩增产物的两端连接接头和标签引物。而第二样品则不能发生连接发生，即连接反应结束后，长度为210bp的内参长度依然保持为210bp，进一步进行PCR扩增后得到长度为270bp的扩增产物，其两端连接标签引物。
进一步的，根据所述第一样品扩增前后的浓度与所述第二样品扩增前后的浓度计算所述待测酶的连接效率。具体地，所述待测酶的连接效率的公式为：
Figure BDA0003444247950000071
其中C10为所述第一样品在所述工作体系中的起始浓度，C11为所述第一样品扩增产物在所述工作体系中的浓度，C20为所述第二样品在所述工作体系中的起始浓度，C21为所述第二样品扩增产物在所述工作体系中的浓度。
进一步，所述的浓度可为摩尔浓度，待测酶的连接效率
Figure BDA0003444247950000072
其中M为反应后所述第一样品连接(或扩增)产物在所述工作体系中的质量浓度，K为所述第一样品连接(或扩增)产物的片段长度，m为反应前所述第一样品在所述工作体系中的质量浓度，k为所述第一样品的片段长度，N为反应后所述第二样品连接(或扩增)产物在所述工作体系中的质量浓度，S为所述第二样品连接(或扩增)产物的片段长度，n为反应前所述第二样品在所述工作体系中的质量浓度，s为所述第二样品的片段长度。具体到图2中，M/230为底物扩增产物即第一样品扩增产物的摩尔浓度，m/110为底物在工作体系中的起始摩尔浓度。N/270为内参扩增产物即第二样品扩增产物在工作体系中的摩尔浓度，n/210为内参在工作体系中的起始摩尔浓度。
所述的浓度的测量方法可以使用本领域技术人员已知的任何可以实现的方法，如，测定峰图，可以使用通过所述LabChip GX Touch或2100等。再例如：Qubit、实时定量PCR、测序、生物分析仪等。
在本发明中，上述第一样品扩增产物、第二样品扩增产物都可以通过Caliper GX检测得到质量浓度。需要说明的是，虽然第一样品和第二样品的长度、接头和标签引物都可以根据具体的应用场景进行设计，但是为了能够在Caliper GX检测时对第一样品扩增产物和第二样品扩增产物进行区分，需要第一样品扩增产物和第二样品扩增产物的长度差别在20bp以上。
所述第一样品和第二样品在工作体系中的起始摩尔浓度可根据实际应用场景进行调整。所述第一样品和所述第二样品可以提前配制在一起，然后直接或稀释后加入到工作体系，也可以分别加入到工作体系中。在一个具体实施例中，将第一样品于第二样品定量检测后，按照比例混合成连接酶质控品。
本发明测定酶连接效率的方法的待测酶可以是任何能够起连接作用的酶。在一个具体的实施方式中，所述待测酶为DNA连接酶，优选为T4连接酶。
其中，T4连接酶即T4-DNA连接酶，可以催化粘端或平端双链DNA或RNA的5'-P末端和3'-OH末端之间以磷酸二酯键结合，该催化反应需ATP作为辅助因子。同时T4 DNA连接酶可以修补双链DNA、双链RNA或DNA/RNA杂合物上的单链缺口(single-strand nicks)。T4DNA连接酶在分子生物学中有广泛的应用。T4 DNA连接酶是经原核表达，柱层析纯化获得的高纯T4 DNA接酶，SDS-PAGE显示为一条62kD的蛋白条带。本品附带10x Ligation Buffer含有ATP。适用于DNA片断接、克隆等各种反应。
本发明中，所述接头与第一样品(底物)在工作体系中的使用比例可以根据试剂应用场景进行调整。
在一个具体的实施方式中，所述接头在工作体系中的起始摩尔浓度与所述第一样品在工作体系中的摩尔浓度比值为10：1～20：1。例如可以为10：1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1。
本发明测定酶连接效率的方法的步骤还可以包括：
第一样品的富集纯化；
第二样品的富集纯化；
接头的富集纯化；
第一样品与第二样品的按比例混合定量。
另一方面，本发明所提供的测定酶连接效率的方法还可应用于连接反应步骤中其他连接条件的连接效率的测定。所述的其他连接条件包括：连接缓冲液(buffer)、接头、反应温度、反应时间、底物接头比例、酶用量等。在一具体实施例中，测定了不同连接缓冲液(buffer)的连接效率。
另一方面，本发明还提供了一种用于检测酶连接效率的试剂盒，包括上述第一样品、第二样品、以及接头。
实施例
以下实施例中使用的试剂来源如下表1所示：
表1
Figure BDA0003444247950000091
第一样品的序列如下(SEQ ID NO:1)：
5'-GTACGAACGAGTGTGTGAACGCTGCGTGCGCGCTTGCAGACTTAGCGCTGTATGAACCGGCGCGGTAACGCCTCCGACCAGTGTAAGCCTATTATGGTAATAACATGACC-3'
第二样品的序列如下(SEQ ID NO:2)：
5'-TAGTCTGAGCCGTGCTCTTGCCAATGTGGATCGCAGAGTGGATCGACTGGAGCCATCTACAGGCTTAGTGGTAGCTGATGCGCCATTGCGCGTGATCGCTGGTCCTATGGGCGCTAACTGCGTGATAGCTGGGACTTGACGCTAATTGCGCGTGCATGCTGGGACTCAAGGCGCTAACTGCGCGTGAGTTCTGGTGCACGGAGTGCTACG-3'
1.配制第一样品
(1)将110bp第一样品进行稀释，稀释至1ng/27μL。使用引物对PAR-110P-1/-2进行扩增。所述引物序列如下：
PAR-110P-1(SEQ ID NO：3)：
5'-GTACGAACGAGTGTGTGAACGCTGC-3'
PAR-110P-2(SEQ ID NO：4)：
5'-GGTCATGTTATTACCATAATAGGCT-3'
在冰盒上按照表2所示的用量配制PCR反应体系。
表2
Figure BDA0003444247950000101
按以下表3方法进行PCR扩增
表3
Figure BDA0003444247950000102
(2)PCR结束后，使用(1.8X)90μL纯化磁珠悬浮液进行纯化，用50μL纯化洗脱液溶解。
(3)将洗脱好的产物转移至新的1.5mL离心管中备用，得到的上清液即为110bp底物。
2.配制第二样品
(1)将210bp第二样品进行稀释，稀释至1ng/17μL。使用引物对PAR-210P-1/-2进行扩增。所述引物序列如下：
PAR-210-1(SEQ ID NO:5)：5'-TAGTCTGAGC CGTGCTCTTG CC-3'
PAR-210-2(SEQ ID NO:6)：5'-CGTAGCACTCCGTGCACCAGAA-3'
在冰盒上按照下表4所示的用量配制PCR反应体系。
表4
Figure BDA0003444247950000111
按以下表5方法进行PCR扩增。
表5
Figure BDA0003444247950000112
(2)PCR结束后，使用(1.8X)90μL纯化磁珠悬浮液进行纯化，用50μL纯化洗脱液溶解。
(3)将洗脱好的产物转移至新的1.5mL离心管中备用，得到的上清液即为210bp内参。
3.连接酶质控品配制
(1)将上述步骤中纯化后得到的110bp第一样品和210bp第二样品，使用
Figure BDA0003444247950000113
dsDNA HS Assay Kit检测其浓度。
(2)计算各取100ng所需的体积，然后按照质量浓度1:1进行配制，即获得连接酶质控品。使用
Figure BDA0003444247950000114
dsDNA HS Assay Kit检测混合产物浓度。
4.连接反应
(1)连接酶质控品稀释：将步骤3中得到的连接酶质控品稀释至2.6ng/16μL。
(2)将准备好的2×Rapid Ligation Buffer、退火后的合格的公共接头(按接头：质控品＝1：10)(0.4pmol/μL)及T4 DNA连接酶工作液(待检测酶稀释10倍)置于冰盒上，按照表6所示的试剂用量进行配制，取3个重复。
所述接头序列如下：
接头1.1(SEQ ID NO 7):
5'-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC-3'
接头1.2(SEQ ID NO 8):
5'-TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3'
表6
Figure BDA0003444247950000121
(3)20℃反应15min，获得连接产物。
5.PCR扩增
将KAPA HiFi HotStart Ready Mix、接头引物-1/2室温条件下溶解，振荡混匀，2000rpm离心10s。按照下表7所示的用量进行配制。所述引物序列如下：接头引物-1(SEQ IDNO 9):
5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGAC-3'
接头引物-2(SEQ ID NO 10):
5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAAGCAATGGTGACTGGAGTTC-3'
表7
Figure BDA0003444247950000122
按以下表8方法进行PCR扩增。
表8
Figure BDA0003444247950000131
反应结束后，获得PCR扩增产物。
6.对扩增产物进行检测
使用
Figure BDA0003444247950000132
dsDNA HS Assay Kit对PCR产物进行浓度检测，得到第一样品扩增(连接)产物浓度与第二样品扩增(连接)产物浓度。
7.对结果进行计算分析
DNA连接酶连接效率
Figure BDA0003444247950000133
M—反应后体系中第一样品扩增产物质量浓度；
m—反应前体系中第一样品质量浓度；
N—反应后体系中第二样品扩增产物质量浓度；
m—反应前体系中第二样品质量浓度；
8.用计算所得的待测酶连接效率与其在高通量测序过程中，实际构建文库的平均文库浓度相互对比印证。其中建库中采用LabChip GX Touch检测文库浓度。
实施例1
选择两支实际在高通量测序建库中多次应用过的T4连接酶及相应的buffer，其中一支已过效期，已知在测序建库过程中效果较差(命名M1)，另外一支为效期内正常活性，已知建库表现良好的商品连接酶(命名M2)。其中酶的使用量均为1μl。采用上述1-7步骤建立3个平行组测定平均酶连接效率，同时与两支酶在实际建库过程中的平均文库浓度相对比，其结果如表9所示：
表9
连接酶 平均文库浓度(ng/ul) STDEV CV 平均连接效率 STDEV CV
M1 16.91 1.7788 0.1052 0.0934 0.0031 0.0342
M2 39.71 1.8359 0.0462 0.2042 0.0101 0.0497
区别2种不同连接效率的DNA连接酶是保证连接效率检测方法有效性的前提之一，本方法能稳定的检出不同连接效率的T4 DNA连接酶的连接效率，且CV＜10％。
实施例2
选实施例1中的两支连接酶。在不同的时间、仪器(PCR仪-1/2/3)、不同的实验操作人员的操作下，采用上述1-7测定步骤，对每支酶的连接效率进行2次实验，每次2组平行，共计6个平行检测。其中酶的使用量为1μl。检测结果如下表10：
表10
Figure BDA0003444247950000141
编号为M2的酶连接效率均高于编号为M1的酶，与预期连接酶效期活性一致。编号为M2酶的平均连接效率为0.2左右，编号为M1的酶的平均连接效率为0.09左右。说明本发明的检测方法稳定，在不同的时间、仪器以及不同操作人员测试时能稳定有效的检测酶连接活性，所得数据有良好的平行性。可稳定区分不同活性T4 DNA连接酶的连接效率，为本方法应用于质检环节提供保证。
实施例3
选活性稳定有效的商品T4 DNA连接酶。对其进行梯度稀释，分别取实际酶量为：0.2ul、0.4ul、0.6ul、0.8ul及1ul。采用上述1-7步骤测定酶连接效率，并与其在实际建库过程中相应用量下平均文库浓度相作图对比，其结果如表11和图3所示：
表11
Figure BDA0003444247950000151
T4 DNA连接酶梯度稀释，使用酶量(模拟不同酶活性)与高通量测序建库过程中检测得到的平均文库浓度进行作图比对分析，剔除检测CV值为31.14％的0.2μl酶量的数据(低酶量酶反应不稳定且低酶量取用准确度较差，导致CV偏高)。在酶量为0.4～1μl的水平下，连接效率与酶量(模拟不同酶活性)正向呈线性相关，且R2＝0.9989；同时，酶量(模拟不同酶活性)与实际测序中构建的文库的平均文库浓度有成正相关。
实施例4
选择3支实际在高通量测序建库中多次应用过的不同酶活的酶，分别标号E1、E2、E3(已知酶活性E3>E2>E1)，根据步骤1-7进行检测，其中酶的使用量均为1μl。检测结果如表12和图4所示：
表12
Figure BDA0003444247950000152
Figure BDA0003444247950000161
E1酶的连接效率为0.22、E2酶的连接效率为0.24、E3酶的连接效率为0.46，本发明的检测方法，能够检测10％的酶活差异。
实施例5
为检测质检方法的有效性，针对现实实验中已知建库效率(一支建库不合格、三支建库合格)的T4 DNA连接酶进行连接效率的测定。验证连接效率的方法采用带入实际构建文库的结果，建库不合格的则认为连接效率不足。结果如下表13：
表13
平均连接效率 STDEV CV
不合格T4 DNA Ligase 0.0934 0.0048 0.0506
T4 DNA Ligase 0.207 0.0066 0.0321
本方法检测的连接效率与实际建库过程中得到的文库的平均文库浓度相互印证。说明本方法的有效性与在高通量测序过程的相适性。
实施例6
为检测本方法对连接酶过程中其他条件测试的适用性与有效性，选取上述2支不同活性的连接酶(M1与M2)，对5种不同批次的Buffer进行测试，其中Buffer4在实际建库过程中普遍观察到效率较低，其余均为M1、M2对应不同批次商品buffer，结果如下表14图5所示：
表14
Figure BDA0003444247950000162
汇总以上结果分析，本发明方法建立了个模型定量测定酶的连接效率，能有效区分不同活性得连接酶，如实施例2中在不同时间、不同仪器和操作人员操作条件下，均可得有稳定有效得到测量结果。同时在合理的酶活使用范围内，测量所得的连接效率与实际反应结果有良好得一致性。可根据实际需求得不同，模仿不同的应用场景的体系条件，适用于不同得实验过程与生产质控场景。特别是实施例中所应用得高通量测序中，建库过程的质量控制。本方法不仅限对连接酶的活力进行测定，且在一定的测试方案下，对影响连接步骤的所有因素均可进行测定，如实施例6中，可测定不同批次buffer的连接效率，为实验优化提供实际数据支持。本方法的在实际操作中，浓度的测量可采用高通量方式，检测过程2步骤，能同时完成多种酶和条件的检测，便于实际应用。
序列表
<110> 安诺优达基因科技（北京）有限公司
<120> 一种测定酶连接效率的方法及试剂盒
<130> PE02027
<150> CN202011627190.1
<151> 2020-12-30
<160> 10
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 110
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 1
gtacgaacga gtgtgtgaac gctgcgtgcg cgcttgcaga cttagcgctg tatgaaccgg 60
cgcggtaacg cctccgacca gtgtaagcct attatggtaa taacatgacc 110
<210> 2
<211> 210
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 2
tagtctgagc cgtgctcttg ccaatgtgga tcgcagagtg gatcgactgg agccatctac 60
aggcttagtg gtagctgatg cgccattgcg cgtgatcgct ggtcctatgg gcgctaactg 120
cgtgatagct gggacttgac gctaattgcg cgtgcatgct gggactcaag gcgctaactg 180
cgcgtgagtt ctggtgcacg gagtgctacg 210
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 3
gtacgaacga gtgtgtgaac gctgc 25
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工
<400> 4
ggtcatgtta ttaccataat aggct 25
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 5
tagtctgagc cgtgctcttg cc 22
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 6
cgtagcactc cgtgcaccag aa 22
<210> 7
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 7
gatcggaaga gcacacgtct gaactccagt cac 33
<210> 8
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 8
tacactcttt ccctacacga cgctcttccg atct 34
<210> 9
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 9
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgac 45
<210> 10
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 10
caagcagaag acggcatacg agataagcaa tggtgactgg agttc 45

Claims (10)

1.一种测定酶连接效率的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
配制第一样品、第二样品和接头，其中所述第一样品可由待测酶与所述接头进行连接，可以进行PCR扩增，所述第二样品不能由所述待测酶进行连接，可以进行PCR扩增；
将所述第一样品和所述第二样品，加入含有所述待测酶与接头的同一工作体系中进行连接反应，得到连接产物，所述连接产物包括第一样品连接产物和第二样品连接产物；
根据反应前所述第一样品与所述第二样品的浓度与反应后所述第一样品连接产物与所述第二样品连接产物的浓度计算所述待测酶的连接效率。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一样品为一端或两端带有磷酸基团和/或正常羟基的粘性末端或平末端双链DNA片段，所述接头为末端可与所述第一样品末端发生连接的互补粘性末端或平末端。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一样品为双链3'端突出一个以上碱基，5'端磷酸化的粘性末端双链DNA片段，优选为所述第一样品为双链3'端突出一个A，5'端磷酸化的粘性末端双链DNA片段，接头为任一链3'端突出与所述第一样品突出链互补的碱基，互补链5'端磷酸化的粘性末端双链DNA片段，优选为所述接头为任一链3'端突出一个T，互补链5'端磷酸化的粘性末端双链DNA片段。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二样品是不能被待测酶连接的双链DNA片段，优选为两端无磷酸基团的双链DNA片段。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤还包括在连接反应后，对所述第一样品连接产物和所述第二样品连接产物进行PCR扩增，得到第一样品扩增产物和第二样品扩增产物，所述第一样品连接产物与所述第二样品连接产物可使用同一对引物扩增。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的待测酶为DNA连接酶，优选为T4 DNA连接酶。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待测酶的连接效率为：
Figure FDA0003444247940000011
其中C10为所述第一样品在所述工作体系中的起始浓度，C11为所述第一样品连接产物在所述工作体系中的浓度，C20为所述第二样品在所述工作体系中的起始浓度，C21为所述第二样品连接产物在所述工作体系中的浓度。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述待测酶的连接效率为：
Figure FDA0003444247940000021
其中C10为所述第一样品在所述工作体系中的起始浓度，C11为所述第一样品扩增产物在所述工作体系中的浓度，C20为所述第二样品在所述工作体系中的起始浓度，C21为所述第二样品扩增产物在所述工作体系中的浓度。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的测定酶连接效率的方法还可以应用于测定连接反应步骤中其他连接条件的连接效率，所述的其他连接条件包括：连接缓冲液(buffer)、接头、反应温度、反应时间、底物与接头使用比例、酶用量。
10.一种用于测定酶连接效率的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-9中任一项所述的第一样品、第二样品、以及接头。
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