CN104278090A - 一种dna连接酶活性测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种DNA连接酶活性测定方法，所述方法包括以下步骤：首先根据单链DNA模板合成毗连的两段引物，其中按引物的5’至3’方向来说，5’方向的引物的3’端与3’方向的引物的5’相邻，并且5’方向的引物为正常引物，而3’方向的引物为3’末端被磷酸化的引物；然后将这两段引物与单链DNA模板退火，以形成的单链DNA模板/正常引物-3’末端磷酸化引物复合物为底物，在DNA连接酶存在下进行连接反应；随后以连接反应的产物为底物，在具有链置换活性的聚合酶作用下进行聚合反应，然后检测双链DNA或单链DNA的相对量，并以该相对量为基础推导出DNA连接酶的活性程度。本发明方法无放射性污染；操作简单快速；并且可以对DNA连接酶活性进行定量的检测分析。
Description
技术领域
本发明属于生化技术领域，具体来说涉及一种DNA连接酶活性测定方法。
背景技术
DNA连接酶是1967年发现的，它可以封闭DNA链上的缺口，通过ATP或NAD水解提供的能量催化DNA链的5’-磷酸末端和3’-羟基末端生成磷酸二酯键，使与同一条互补链配对结合并紧邻（之间没有空隙）的两条寡核苷酸链相连。大肠杆菌DNA连接酶，来源于大肠杆菌，是最早发现的DNA连接酶，可以用于连接粘性末端；T4 DNA连接酶，来源于T4噬菌体，它可以连接粘性末端和平末端，但是连接效率较低；热稳定的DNA连接酶，是从嗜热高温放线菌菌株中分离纯化得到的，它是一种能够在高温下催化两条寡核苷酸探针发生连接作用的核酸酶。
DNA连接酶是基因工程技术以及分子生物学研究中一种重要的工具酶，广泛应用于分子克隆中重组DNA构建等领域。（周李华等，中国测试.2014 March；40（2）：64-66）。工具酶的酶活力检测是工具酶产品质量控制的关键，研究和建立工具酶酶活力的测定方法是工具酶产品标准化制定的一个重点，也是一个难点。另外有文献报道,临床研究发现连接酶的活性水平与乳腺癌及恶性胶质瘤等肿瘤的发病机制密切相关，抑制连接酶的活性不仅能降低肿瘤侵袭转移能力，还能显著提高肿瘤细胞的药敏性，因此，定量分析连接酶活性对开展肿瘤的早期诊断和预后评估具有重要意义。（刘斌等，高等学校化学学报.2010 March；31（3）：463-467）。
目前，对于DNA连接酶的测活普遍采用的是一种半定量的检测方法。将T4 DNA连接酶（或大肠杆菌DNA连接酶）做一系列的稀释倍数，将稀释后的酶加入到含有双链DNA片段（经HindⅢ消化的λDNA片段）和1× DNA连接酶反应缓冲液的反应体系中，在一定温度下反应一定时间。反应终止后，用琼脂糖凝胶电泳进行检测，通过分析连接产物即大分子量片段的量，来计算连接酶活性。这种方法实验成本较低，但是其最大的缺陷在于电泳图谱的分析存在相当强的主观性。即使用图像扫描、灰度分析来判定连接产物的比例，仍然是一种半定量的方法，因此不能精确测定DNA连接酶的活性，从而不能很好地保持批次之间的稳定性。
基于荧光技术发展的分子信标法及AP标记法虽然简单快速，但探针设计复杂，成本高，检测过程中容易产生假阳性信号，无法满足人们研究的不同需求。（刘斌等，高等学校化学学报.2010March；31（3）：463-467）。
发明内容
本发明建立了一种简便、快速、非放射性且定量的DNA连接酶测活方法，其原理如图1所示。
具体来说，本发明采用的是如下技术方案：
一种DNA连接酶活性测定方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：首先根据单链DNA模板合成毗连的两段引物，其中按引物的5’至3’方向来说，5’方向的引物的3’端与3’方向的引物的5’相邻，并且5’方向的引物为正常引物，而3’方向的引物为3’末端被磷酸化的引物；然后将这两段引物与单链DNA模板退火，形成单链DNA模板/正常引物-3’末端磷酸化引物复合物；接着以该单链DNA模板/正常引物-3’末端磷酸化引物复合物为底物，在DNA连接酶存在下进行连接反应；随后以连接反应的产物为底物，在具有链置换活性的聚合酶作用下进行聚合反应，聚合反应完成后检测双链DNA或单链DNA的相对量，并以该相对量为基础推导出DNA连接酶的活性程度。
优选地，双链DNA或单链DNA的相对量是利用荧光染料，通过荧光法测得的，并且双链DNA或单链DNA的相对量是以荧光强度表示的。更优选，所采用的荧光染料是双链DNA特异性荧光染料。在一个实施例中，所采用的染料是业内常用的商购染料picogreen染料。
优选地，所采用的单链DNA模板是单链环状DNA模板，聚合反应所形成的双链DNA是在该单链环状DNA模板上形成互补链而形成的双链环状DNA。更优选，所采用的单链DNA模板是M13噬菌体单链DNA，以便于建立可以在业内通用并且更方便的标准的测定方法。
所用的具有链置换活性的聚合酶可以采用多种来源的该类聚合酶，在一个实施方案中，所采用的具有链置换活性的聚合酶是大肠杆菌聚合酶I。
本发明的优点：
1. 操作步骤简单快速，重复性好，稳定性强；
2. 可以对DNA连接酶活性进行定量的检测分析，引物设计容易，便于操作。
附图说明
图1是本发明的测定方法的原理图。
图2是作为一个实例的T4 DNA连接酶活性-荧光强度曲线图。
图3是作为另一个实例的大肠杆菌DNA连接酶活性-荧光强度曲线图。
具体实施方式
本发明的目的在于建立一种简便、快速、非放射性且定量的DNA连接酶测活方法，其原理如图1所示。
如图1所示，我们设计两个M13单链环状DNA的引物：一个为与之匹配的正常引物，另一个为3’末端磷酸化修饰的引物（若引物3’末端发生磷酸化修饰，则它本身虽然能以M13单链环状DNA匹配，但因为3’-OH被封闭，不能发生聚合反应），其中正常引物与3’末端磷酸化引物是M13单链环状DNA上两个顺次的引物，正常引物的3’端与3’末端磷酸化引物的5’端有一个缺刻（没有磷酸二酯键相连）。DNA连接酶可将正常引物的3’-OH末端与3’末端磷酸化引物的5’-P末端连接起来，生成磷酸二酯键，使两条引物连成一条长的3’末端磷酸化修饰的引物。大肠杆菌聚合酶Ⅰ是一种有聚合活性和链置换活性的酶，当正常引物与3’末端磷酸化引物未发生连接时，它可以M13单链环状DNA为模板，以正常引物为引物，将3’末端磷酸化引物置换下来，发生聚合反应，生成M13双链DNA。M13双链DNA可被双链特异性的picogreen染料结合，产生荧光。而当正常引物与3’末端磷酸化引物连接时，大肠杆菌聚合酶Ⅰ不能以3’末端磷酸化修饰的引物为引物，进行聚合反应，由此不能生成M13双链DNA，picogreen染料不能结合单链DNA，从而不能产生荧光。
DNA连接酶的活性在一定范围内同生成的长的3’末端磷酸化修饰的引物的量成正比；而在大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ活性一定的情况下，生成的长的3’末端磷酸化修饰的引物的量同荧光强度成反比。因此，本发明将DNA连接酶的测活体系同大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的聚合反应体系偶联起来。
本发明人进一步证明了上述假设，从而建立了非放射性、简便、快速且可以定量的DNA连接酶测活方法。
下面将结合具体实施例更详细地说明本发明。
实施例1. “转化法”测定T4 DNA连接酶活性的可行性验证
M13模板/正常引物-3’末端磷酸化引物复合物的制备：
M13单链DNA：M13mp18单链DNA (NEB)；
正常M13引物：5’-aagccatccgcaaaaatgacctct-3’；
3’末端磷酸化M13引物：5’-tatcaaaaggagcaattaaagg-3’（3’末端羟基进行了磷酸化修饰）
M13模板/正常引物-3’末端磷酸化引物复合物：将M13mp18单链DNA同正常M13引物、3’末端磷酸化M13引物按摩尔比1:1:1混合，在退火缓冲液（10 mM Tris-HCl pH 8.0, 50 mM NaCl）中，70℃加热5分钟后，缓慢降至室温，使模板引物退火。
M13模板/3’末端磷酸化引物复合物的制备：
M13单链DNA：M13mp18单链DNA (NEB)；
3’末端磷酸化M13引物：5’-tatcaaaaggagcaattaaagg-3’（3’末端羟基进行磷酸化修饰）
M13模板/3’末端磷酸化引物复合物：将M13mp18单链DNA同3’末端磷酸化M13引物按摩尔比1:1混合，在退火缓冲液（10 mM Tris-HCl pH 8.0, 50 mM NaCl）中，70℃加热5分钟后，缓慢降至室温，使模板引物退火。
连接反应：
T4 DNA连接酶为NEB M0202
| 温度 | 时间 |
| 23℃ | 30分钟 |
| 60℃ | 10分钟（T4 DNA连接酶失活） |
| 4℃ | 保持 |
DNA聚合酶反应：
*1-12号管加入对应管号的T4 DNA连接酶反应产物。
| 温度 | 时间 |
| 37℃ | 30分钟 |
| 4℃ | 保持。 |
picogreen荧光检测
向反应产物中加入0.5 μl picogreen染料（invitrogen P11495）；用荧光酶标仪检测，激发波长为480 nm，发射波长为520 nm。检测结果如下表：
| 管号 | 荧光数值 |
| 1 | 1598 |
| 2 | 1588. |
| 3 | 1514. |
| 4 | 1400. |
| 5 | 1185. |
| 6 | 788. |
| 7 | 516. |
| 8 | 374. |
| 9 | 305. |
| 10 | 264. |
| 11 | 236. |
| 12 | 215. |
| 13 | 1574 |
| 14 | 204 |
这一结果表明：
a. 在连接酶的作用下，引物正常M13引物的3’-OH末端和引物3’末端磷酸化M13引物的5’-P末端可以发生连接，生成一个较长的3’末端发生磷酸化修饰的引物，大肠杆菌聚合酶Ⅰ不能以3’末端磷酸化修饰的引物为引物，进行聚合反应，由此不能生成M13双链DNA；
b.无T4 DNA连接酶存在时，引物正常M13引物和3’末端磷酸化M13引物不发生连接，而大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ既具有聚合活性也具有链置换活性，它可以正常M13引物为引物，将3’末端磷酸化M13引物置换下来，发生聚合反应，催化生成M13双链DNA；
c.在一定范围内，T4 DNA连接酶活性与生成的较长的3’末端发生磷酸化修饰的引物的量成正相关，而生成的较长的3’末端发生磷酸化修饰的引物的量又显然与picogreen荧光强度成负相关，因此T4 DNA连接酶的活性与荧光强度成负相关，这点已被上表的结果所证明。
通过本实施例，我们将T4 DNA连接酶的连接反应同大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的聚合反应偶联起来，可以实现对T4 DNA连接酶活性的快速、简便的表征，为后续DNA连接酶活性的精确测定奠定了基础。
本方法的原理如图1所示。
实施例2. T4 DNA连接酶活性-荧光强度曲线的绘制及EC50计算
以2#-12#的T4 DNA连接酶活性单位(mU)的log值为横坐标，荧光强度为纵坐标，用GraphPad Prism5做非线性回归曲线。我们发现，这些数据点可以很好地拟合出一条倒S型曲线，如图2所示。
通过多次重复实验并计算曲线的半最大效应浓度 (EC50)，我们发现，EC50值在多次实验间保持稳定：
| 实验 | EC50 (mU) |
| 1 | 12.84 |
| 2 | 13.02 |
| 3 | 13.75 |
| 4 | 13.58 |
| 5 | 12.49 |
| 平均值 (mU) | 13.14 |
| 标准差SD (U) | 0.52 |
| 变异系数 CV (%) | 3.98 |
实施例3. 不同来源的DNA连接酶活性-荧光强度标准曲线的绘制及“转化法”活性定义
我们又选择了一种不同种属的DNA连接酶，即E.coli DNA连接酶(enzymatics L6090L)，按照实施例1和实施例2的方法，绘制活性-荧光强度标准曲线并计算EC50。所有DNA连接酶活性均用标准的半定量检测方法测定。常用来描述连接酶活性的单位是粘性末端单位（CEU）：1个粘性末端活性单位指在20μL 1×T4 DNA 连接反应缓冲液中，16℃反应条件下，30min能使50%的经HindⅢ消化的λDNA片段[5’端浓度为0.12μM（300μg/mL）]连接所需的酶量。结果如图3所示。
| 种属 | 来源 | EC50 (mU) |
| T4噬菌体 | NEB 大肠杆菌重组表达 | 12.84±0.17* |
| 大肠杆菌 | Enzymatics大肠杆菌重组表达 | 11.30±0.22 |
| 平均 | 12.07±0.12。 |
*根据实施例2.
结果表明，不同种属、不同来源的DNA连接酶在“转化法”测活体系中， DNA连接酶活性-荧光强度曲线的EC50高度一致。因此，这一EC50值可作为本方法即“转化法”的活性定义。即在实施例1的反应体系中，使荧光强度达到最大值一半的DNA连接酶酶量定义为1个转化法单位（Transformation Unit, TU）；1 TU=12.07 mU。
上面结合附图和具体实施例对本发明的实施方式作了详细的说明，但是本发明不限于上述实施方式，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化。
Claims (7)
1. 一种DNA连接酶活性测定方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：首先根据单链DNA模板合成毗连的两段引物，其中按引物的5’至3’方向来说，5’方向的引物的3’端与3’方向的引物的5’相邻，并且5’方向的引物为正常引物，而3’方向的引物为3’末端被磷酸化的引物；然后将这两段引物与单链DNA模板退火，形成单链DNA模板/正常引物-3’末端磷酸化引物复合物；接着以该单链DNA模板/正常引物-3’末端磷酸化引物复合物为底物，在DNA连接酶存在下进行连接反应；随后以连接反应的产物为底物，在具有链置换活性的聚合酶作用下进行聚合反应，聚合反应完成后检测双链DNA或单链DNA的相对量，并以该相对量为基础推导出DNA连接酶的活性程度。
2. 如权利要求1所述的DNA连接酶活性测定方法，其特征在于，双链DNA或单链DNA的相对量是利用荧光染料，通过荧光法测得的，并且双链DNA或单链DNA的相对量是以荧光强度表示的。
3. 如权利要求2所述的DNA连接酶活性测定方法，其特征在于，所采用的荧光染料是双链DNA特异性荧光染料。
4. 如权利要求3所述的DNA连接酶活性测定方法，其特征在于，所采用的染料是picogreen染料。
5. 如权利要求1所述的DNA连接酶活性测定方法，其特征在于，所采用的单链DNA模板是单链环状DNA模板，聚合反应所形成的双链DNA是在该单链环状DNA模板上形成互补链而形成的双链环状DNA。
6. 如权利要求5所述的DNA连接酶活性测定方法，其特征在于，所采用的单链DNA模板是M13噬菌体单链DNA。
7. 如权利要求1所述的DNA连接酶活性测定方法，其特征在于，所采用的具有链置换活性的聚合酶是大肠杆菌聚合酶I。
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