CN104212792A - 基于切刻内切酶的网状滚环扩增体系及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种基于切刻内切酶的网状滚环扩增体系及其应用，该扩增体系在现有第二代超分支滚环扩增技术的基础上，通过引入一种特殊的核酸内切酶，即切刻内切酶Nb.BsrDI，从而发展出第三代滚环扩增技术，即网状滚环扩增技术（NRCA）。本发明的网状滚环扩增所产生的荧光信号强度随靶标DNA浓度的增加而增加，并且荧光信号强度明显高于线性滚环扩增和超分支滚环扩增，检测限达到0.1fM。该技术与第一代线性滚环扩增和第二代超分支滚环扩增相比，不仅保持了原有技术在操作性、使用成本、扩增所需时间等方面的优势，而且在原有技术基础上进一步实现了信号放大，从而为超低丰度核酸样本的分析检测提供了良好的技术条件，其应用前景非常广阔。

Description

基于切刻内切酶的网状滚环扩增体系及其应用

技术领域

本发明涉及一种网状滚环扩增体系及其应用，特别是一种基于切刻内切酶的网状滚环扩增体系及其应用，实现DNA的高效扩增和信号放大，并对超低浓度的靶标DNA进行检测。

发明背景

随着基因检测与研究的不断升温,各种相应的分子生物学技术不断涌现。要实现基因的快速灵敏检测，需要针对其物质基础即核酸发展相应的检测方法。现有的微量核酸检测主要依赖于核酸扩增技术，这一分子生物学领域的常用技术。聚合酶链反应（PCR）是目前使用最为广泛的DNA扩增技术, 不仅可以扩增和分离目的基因, 在临床诊断、基因突变检测、法医鉴定等方面也有重要用途。然而,常规PCR 技术也存在一定缺陷：（1）在应用上依赖于高质量的热循环仪，因此难以在基层推广应用；（2）多因素影响扩增效果；（3）常引起非特异性扩增；（4）扩增反应时间长等，急需更新的方法来替代。

自20世纪90年代初以来很多实验室尝试发展无需热变性的核酸恒温扩增技术。滚环扩增技术（RCA）是其中最典型的之一。滚环扩增技术是1998年建立的通过借鉴自然界中环状病原微生物DNA分子的滚环式的复制方式而建立的一种可在恒温下发生的核酸扩增技术。在第一代线性滚环扩增反应（LRCA）中，当有环形DNA模板、引物、dNTP、以及聚合酶时，通过DNA 聚合酶的作用，以环形DNA为模板进行复制，引物被延伸并最后形成了一条与环形DNA模板互补的具有重复序列的线状DNA单链，该技术具有快速、灵敏、特异的特点。

 1998年Lizardi等在第一代线性滚环扩增基础上建立了第二代超分支滚环扩增（HRCA）技术。它通过增加一条与环形DNA部分序列相同的通用引物序列，与线性滚环扩增的产物结合，在DNA聚合酶的作用下延伸并置换下游引物的延伸产物，被置换的延伸产物又可以作为互补模板由环形DNA的滚环扩增的起始引物进行延伸，从而得到更多拷贝的扩增产物。与线性滚环扩增技术相比,超分支滚环扩增技术具有更高的灵敏度。

随着人们对检测分析的需求进一步加大和提高，以及一些超低丰度的核酸物质如小RNA等逐渐成为重要的分子标记物，这对核酸扩增技术提出了更高的要求。发展更快速，更特异，更灵敏以及更节约成本的核酸扩增技术成为科研工作者关注的焦点问题，也是研究新型核酸扩增模式亟待解决的问题。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种基于切刻内切酶的网状滚环扩增体系。

本发明的目的之二在于提供该网状滚环扩增体系的扩增方法。

为达到上述目的，本发明采用如下机理：在超分支滚环扩增反应体系中加入切刻内切酶Nb.BsrDI，它通过识别DNA双链特定的核苷酸序列，在特定位点切割双链中的一条单链，这些切割下来的单链与环形DNA模板部分互补并可以充当引物，在DNA聚合酶和dNTP存在下，继续诱发超分支滚环扩增反应，从而大幅提高扩增效率（附图 1）。

根据上述机理，本发明采用如下技术方案：

一种基于切刻内切酶的网状滚环扩增体系，其特征在于 该网状滚环扩增体系中有组成及浓度为：

环状DNA模板                                                      100 nM；

靶标DNA                                                             1 μM；

引物                                                                    1 μM；

dNTP                                                                    400 μM；

Bst DNA聚合酶大片段                                       8 U；

切刻内切酶Nb. BsrDI                                         10 U；

1×Bst DNA聚合酶大片段缓冲溶液                        v/v；

所述的环状DNA模板是包含了三部分序列的环状碱基序列，第一部分是与标靶DNA序列互补的序列；第二部分是包含有切刻内切酶Nb. BsrDI的识别位点的所述的引物的序列相同的碱基序列；第三部分是随机序列，用于将第一部分序列与第二部分序列进行连接； 

所述引物能与线性滚环扩增的产物结合，在Bst DNA聚合酶的作用下延伸并置换下游引物的延伸产物；

所述的1×Bst DNA聚合酶大片段缓冲溶液中含有20 mM Tris-HCl，10 mM KCl，10 mM （NH₄）₂SO₄，2 mM MgSO₄，0.1% Triton X-100，其pH 8.8。

一种标靶DNA的扩增方法，采用上述的基于切刻内切酶的网状滚环扩增体系，其特征在于将待扩增的标靶DNA加入到上述扩增体系中，使待扩增的标靶DNA的浓度达到0.1 fM～1μM；该方法的反应条件是：保持恒温65 ℃ ，每60 秒终点读板一次，共读取199次。

与现有超分支滚环扩增反应体系的主要不同点即在于切刻内切酶Nb. BsrDI的使用。在靶标DNA与环状DNA模板存在下，二者相互杂交，并在Bst DNA聚合酶的扩增下将靶标DNA进行线性延伸，延伸出的序列是连续重复的与环状DNA序列互补的序列（包含序列I、序列II、以及随机序列的互补序列）（该过程即LRCA）。由此，该线性滚环扩增的产物可以与引物（序列II’）进一步互补杂交，并在Bst DNA聚合酶的作用下产生分支扩增（该过程即HRCA）。除此以外，在本发明中引入的切刻内切酶Nb. BsrDI可以识别线性滚环扩增的产物与引物杂交的双链，并切割线性滚环扩增的产物产生若干片段，每个片段均可在环状DNA模板作用下继续扩增，从而实现进一步的信号放大，其最终产物在原子力显微镜观察下呈现网状结构，故而命名为网状滚环扩增。

运用本发明的网状滚环扩增技术对不同浓度靶标DNA进行扩增，并采用荧光定量PCR进行实时监测的结果表明，网状滚环扩增所产生的荧光信号强度随靶标DNA浓度的增加而增加，并且荧光信号强度明显高于线性滚环扩增和超分支滚环扩增（附图2A-C）。由附图2D可以看出，我们选取其中1 pM的靶标DNA浓度进行比较，网状滚环扩增、超分支滚环扩增和线性滚环扩增的荧光信号分别达到1848，137，以及一个可忽略不计的数值。这说明在线性滚环扩增和超分支滚环扩增的基础上，加入的切刻内切酶（Nb. BsrDI）对扩增效率的提高发挥了明显的作用。并且在网状滚环扩增中，荧光信号强度与靶标DNA在0.1 fM到1 μM呈线性相关的关系，线性方程为I _f = 435.5 + 478.3 lg c（R²=0.994），I _f和c 分别是荧光信号强度和靶标DNA的浓度，检测限达到0.1 fM（图 3）。该技术与第一代线性滚环扩增和第二代超分支滚环扩增相比，不仅保持了原有技术在操作性、使用成本、扩增所需时间等方面的优势，而且在原有技术基础上进一步实现了信号放大，从而为超低丰度核酸样本的分析检测提供了良好的技术条件，其应用前景非常广阔。

附图说明

图1 为DNA网状超分支滚环扩增技术以及线性滚环扩增技术和超分支滚环扩增技术的原理图。

图2A-C为不同浓度靶标DNA的网状滚环扩增、超分支滚环扩增、线性滚环扩增的荧光定量PCR图。图 2D 为靶标DNA浓度为1 pM的网状滚环扩增、超分支滚环扩增、线性滚环扩增的荧光强度比较图。

图 3为网状滚环扩增反应中靶标DNA浓度在0.1 fM到 1 μM范围内的lg值与荧光强度的关系图。

图4 为不同浓度靶标DNA的网状滚环扩增（泳道2-5分别为0.01 μM、0.05 μM、0.2 μM、1 μM）和超分支滚环扩增（泳道6-9分别为0.01 μM、0.05 μM、0.2 μM、1 μM）的琼脂糖凝胶电泳图。

图5为不同错配碱基数的靶标DNA的网状滚环扩增（泳道2-6分别为靶标DNA，与靶标DNA分别错配1个碱基的DNA，与靶标DNA分别错配3个碱基的DNA，与靶标DNA分别错配5个碱基的DNA，与靶标DNA完全不相关的DNA）和超分支滚环扩增（泳道7-11分别为靶标DNA，与靶标DNA错配1个碱基的DNA，与靶标DNA错配3个碱基的DNA，与靶标DNA错配5个碱基的DNA，与靶标DNA完全不相关的DNA）的琼脂糖凝胶电泳图。

图6为不同扩增产物（从A到C分别为线性滚环扩增、超分支滚环扩增、网状滚环扩增）的原子力显微镜表征图。

具体实施方法

实施例一：不同浓度靶标DNA扩增产物的电泳表征

将100 nM的环状DNA模板，不同浓度的靶标DNA，1 μM的引物，400 μM的dNTP，8 U的Bst DNA聚合酶大片段，10 U的切刻内切酶Nb. BsrDI，1×Bst DNA聚合酶大片段缓冲溶液（20 mMTris-HCl，10 mMKCl，10 mM（NH₄）₂SO₄，2 mM MgSO₄，0.1% Triton X-100，PH 8.8）混合，加双蒸水使反应体系总体积达到50 μL，放在金属浴65 ℃反应1小时后，于95 ℃下10分钟终止反应。与现有超分支滚环扩增反应体系的主要不同点即在于切刻内切酶Nb. BsrDI的使用。将5 μL样品和上样缓冲溶液6×loading buffer（1 μL）混合均匀，点入上样孔。设置电压80 V，时间30 min进行琼脂糖凝胶电泳，电泳完毕后紫外凝胶分析仪下观察扩增条带情况并分别照相。由附图4可以看出，对于网状滚环扩增反应，各泳道可以明显观察到弥散的扩增条带，并且随着靶标DNA浓度的增加，扩增条带的亮度是逐渐增加的，还可以观察到留在加样孔的扩增产物逐渐增加，说明扩增产物的DNA片段是逐渐增大的。对于超分支滚环扩增反应，当靶标DNA浓度为0.05 μM时，可以观察到微弱条带，靶标DNA浓度为0.2 μM时，条带清晰明显，并且随着靶标DNA浓度的增加，条带的亮度也是逐渐增加，还可以观察到留在加样孔的扩增产物逐渐增加，说明扩增产物的DNA片段也是逐渐增大的。探针、靶标、错配靶标和引物序列见下表1

实施例二：对靶标DNA扩增特异性的电泳表征

将100 nM的环状DNA模板，1 μM的靶标DNA，与靶标DNA分别错配1、3、5个碱基的DNA，以及与靶标DNA完全不相关的DNA，1 μM的引物，400 μM的dNTP，8 U的Bst DNA聚合酶大片段，10 U的切刻内切酶Nb. BsrDI，1×Bst DNA聚合酶大片段缓冲溶液（20 mMTris-HCl，10 mMKCl，10 mM（NH₄）₂SO₄，2 mM MgSO₄，0.1% Triton X-100，PH 8.8）混合，加双蒸水使反应体系总体积达到50 μL，放在金属浴65 ℃反应1小时后，于95 ℃下10分钟终止反应。与现有超分支滚环扩增反应体系的主要不同点即在于切刻内切酶Nb. BsrDI的使用。将5 μL样品和上样缓冲溶液6×loading buffer（1 μL）混合均匀，点入上样孔。设置电压80 V，时间30 min进行琼脂糖凝胶电泳，电泳完毕后紫外凝胶分析仪下观察扩增条带情况并分别照相。由附图5可以看出，相比于超分支滚环扩增反应，对于网状滚环扩增反应，随着错配碱基数的增加，电泳条带逐渐微弱，说明非特异的扩增产物逐渐减少，结果显示，网状滚环扩增反应对靶标DNA扩增的特异性比超分支滚环扩增反应更好。

实施例三：线性滚环扩增、超分支滚环扩增、网状滚环扩增反应扩增产物的原子力显微镜表征

通过原子力显微镜对线性滚环扩增、超分支滚环扩增、网状滚环扩增反应扩增产物进行表征。

由附图6A可以看到，线性滚环扩增反应的扩增产物是若干条线性单链，这与理论上滚环复制反应，即通过靶标DNA杂交到1个环状单链DNA分子，生成的延伸产物就是这个环状DNA模板分子的互补配对产物的多个连接，形成一定长度的线性单链DNA。

由附图6B可以看到，超分支滚环扩增反应的扩增产物DNA呈现分支状的双链结构，这与超分支滚环扩增反应的原理是一致的。当在超分支滚环扩增反应体系中加入切刻内切酶Nb. BsrDI后，由附图6C可以看到，网状滚环扩增反应的扩增产物形成密集的网络状结构，说明切刻内切酶 Nb. BsrDI通过识别DNA双链特定的核苷酸序列，在特定位点切割双链中的一条单链，这些切割下来的单链与环形DNA模板部分互补，在Bst DNA聚合酶大片段和dNTP存在下，继续诱发超分支滚环扩增反应，依次循环，从而提高HRCA反应的扩增效率。

以上结果表明，这种新型恒温核酸扩增技术很好的特异性，实验操作简单、快速；耗时少，可以在30～60 分钟可完成反应过程；灵敏度高，检测限可以达到0.1 fM；同时由于对设备和试剂的要求低，因此成本也比较低。这种新型核酸扩增技术可以与纳米技术，电化学等技术联用，用于microRNA，DNA和适体底物的检测，以及用于研究生物传感器，核酸与蛋白相互作用。伴随着其技术的日趋成熟，其应用范围还将会更加广泛。 

<120> 检测谷胱甘肽的电化学生物传感器及其制备方法

<160> 2

<210> 1

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

5'-TACTC ATACG CTCAT ACGTT CATCA CGACT AAAAA-C₆-SH-3'

 

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

5'- AGTCG TGATG AACGT ATGAG CGTAT GAGTA-3'     

Claims (2)

1.一种基于切刻内切酶的网状滚环扩增体系，其特征在于 该网状滚环扩增体系中有组成及浓度为：

环状DNA模板                                                  100 nM；

靶标DNA                                                          1 μM；

引物                                                                    1 μM；

dNTP                                                                  400 μM；

Bst DNA聚合酶大片段                                    8 U；

切刻内切酶Nb. BsrDI                                      10 U；

1×Bst DNA聚合酶大片段缓冲溶液                      v/v；

所述的环状DNA模板是包含了三部分序列的环状碱基序列，第一部分是与标靶DNA序列互补的序列；第二部分是包含有切刻内切酶Nb. BsrDI的识别位点的所述的引物的序列相同的碱基序列；第三部分是随机序列，用于将第一部分序列与第二部分序列进行连接； 

所述引物能与线性滚环扩增的产物结合，在Bst DNA聚合酶的作用下延伸并置换下游引物的延伸产物；

所述的1×Bst DNA聚合酶大片段缓冲溶液中含有20 mM Tris-HCl，10 mM KCl，10 mM （NH₄）₂SO₄，2 mM MgSO₄，0.1% Triton X-100，其pH 8.8。

2.一种标靶DNA的扩增方法，采用根据权利要求1所述的基于切刻内切酶的网状滚环扩增体系，其特征在于将待扩增的标靶DNA加入到上述扩增体系中，使待扩增的标靶DNA的浓度达到0.1 fM～1μM；该方法的反应条件是：保持恒温65 ℃ ，每60 秒终点读板一次，共读取199次。