CN110195056A - 一种双引物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，涉及一种双引物及其应用，具体涉及一种用于滚环扩增/鉴定环形核酸的双引物，其组成的反应体系，其组成的试剂盒及其应用，所述双引物为分散型引物，所述双引物中的第一引物和第二引物的3’端的距离为0‑1000bp，所述双引物能够对环形DNA/RNA进行分子鉴定，所述鉴定方法准确、快速、便捷、直观，为新型环形DNA/RNA的发现提供有效手段。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种双引物及其应用，具体涉及一种用于滚环扩增/鉴定环形核酸的双引物，其组成的反应体系，其组成的试剂盒及其应用。
背景技术
Phi29 DNA polymerase(简称Phi29酶)是一种具有较高连续合成能力以及链置换的核酸聚合酶，是常用的PCR扩增酶。一般的PCR扩增往往具有偏好性导致扩增时产生大量的冗余，导致扩增不准、并影响扩增产物在测序中的检测结果。Phi29酶扩增方向为5'→3'，具有3'→5'外切酶校正活性，可切掉沿3'→5'反向非特异性扩增的产物，以减少非特异性扩增。因此，近年来Phi29酶多作为测序分析前扩增核酸的一种工具被开发，用来扩增待测DNA/RNA。
目前，基于phi29酶扩增的测序技术主要有多重置换扩增(Multipledisplacement amplification，简称MDA)和多次退火环状循环扩增技术(Multipleannealing and looping based amplification cycles，简称MALBAC)(谢晓亮，2012)。这些技术主要面向单细胞测序或全基因组扩增测序，他们使用多种引物引导Phi29酶扩增基因组的多处的DNA，新生成的链会置换掉旧链，形成基因组多处多个高保真拷贝，以此达到全基因组测序片段的要求。然而，对于分子量相对较小的环状DNA/RNA来说，这种方法并不实用。首先，多个引物的设计会增加反应过程的复杂程度，其次，也会在测序时增加碱基读取的难度。
以环形核酸分子为模版，启用Phi29酶时的扩增方式为滚环扩增(Rolling circleamplification，简称RCA)，在不同数量的引物下，扩增方式有所不同，包括单一引物时线性扩增RCA(图1A)，多引物时多支链网状结构的RCA扩增方式(图1B，1C)，且扩增产物在凝胶电泳中呈现连续状态，说明产物分子量连续，结构多样(图1D)，但无论是哪种扩增方式，Phi29酶催化下的碱基增长速度极快，且错配率较其他核酸聚合酶低，在分子鉴定、基因检测、克隆技术上都有巨大的应用潜力和商业价值。目前，基于RCA反应的检测技术主要有以下几种：(1)Ali MM等(2009)通过在RCA反应时掺入染料标记的dNTP来标记RCA扩增产物，以达到测定待测模版链的拷贝数的目的，并建立了基于RCA反应的real-time PCR实验方法；(2)在滚环扩增基础上被开发出了面向单核苷酸多态性检测的锁式探针技术(Padlock probe)(Lizardi PM等，1998；Gomez A等，2014；Shi D等，2014)，反应时待测物为较短的线性DNA(RCA的模版DNA)，反应原理为，只有在和引物互补的情况下，模版DNA才会两头与引物互补成环，并在Phi29或其他DNA聚合酶的催化下发生RCA反应，这项技术中互补的引物即为探针，类似于将待测线性DNA分子锁定在探针上，通过设计探针的DNA序列，可以很好的应用在单核苷酸多态相关的基因诊断中；(3)传统对免疫芯片信号扩散能力不足，无法兼顾高通量和高灵敏度，但将RCA、微阵列技术和免疫相结合的RCA反应的免疫芯片，却可以克服该难题，实现多元高通量并行分析蛋白质芯片(Miller等，2003；Zhou H等，2004；Cheng等，2010)。
目前，国内外基于Phi29酶RCA反应的、专门面向环形DNA/RNA分子的快速鉴定的技术尚未有报道。然而，(1)质粒/DNA载体(环形DNA分子)的测序占据了测序市场上很大的份额，普通的测序技术只能读取到测序引物后300～500bp作用的位置，全长测序的费用又非常昂贵，Phi29酶高保真、快速的扩增能力及RCA反应特征适用于传统质粒/DNA载体分子的快速鉴定；(2)环形RNA作为近年来被发现的新型RNA分子，因其独特的环形结构不被RNA酶分解而被看作是稳定的具有极大潜力的biomarker，同时环形RNA相关的机制研究也为近年的热点，建立一种快速鉴定环形RNA甚至测定环形RNA的方法，无论是在临床应用或是科研上，都有很大的市场应用前景。
发明内容
针对现有技术的不足及实际需求，本发明提供一种双引物及其应用，具体涉及一种可高效扩增的双引物设计方法及其应用，所述双引物能够对环形DNA/RNA进行分子鉴定，所述鉴定方法准确、快速、便捷、直观，为新型环形DNA/RNA的发现提供有效手段。
为达到此发明的目的，本发明采用以下技术方案：
一方面，本发明提供了一种双引物，所述双引物为分散型引物，所述双引物中的第一引物和第二引物的3’端的距离为0-1000bp。
本发明中，所述分散型引物指的是在特定的距离上，使得一个引物正向扩增，一个引物反向扩增，且第一引物与第二引物的5’端以相离的方式进行设计，其中3’端的距离为0-1000bp，发明人意外发现，采用分散型引物相比于聚集型引物(第一引物与第二引物的5’端以相对的方式进行设计)效果更好，不仅如此，发明人还发现第一引物与第二引物的3’端具有特定的距离，能够显著提高扩增效率。
根据本发明，所述双引物中的第一引物和第二引物的3’端的距离为0-1000bp，例如可以是0bp、1bp、2bp、3bp、4bp、5bp、6bp、7bp、8bp、9bp、10bp、12bp、15bp、18bp、20bp、22bp、25bp、28bp、30bp、32bp、35bp、38bp、40bp、42bp、45bp、48bp、50bp、51bp、52bp、53bp、55bp、58bp、60bp、62bp、65bp、68bp、70bp、75bp、80bp、85bp、90bp、95bp、100bp、110bp、120bp、130bp、140bp、150bp、160bp、180bp、200bp、220bp、230bp、250bp、280bp、300bp、320bp、350bp、380bp、400bp、420bp、450bp、460bp、480bp、500bp、520bp、530bp、550bp、560bp、580bp、600bp、620bp、650bp、680bp、700bp、720bp、750bp、780bp、800bp、820bp、850bp、900bp、920bp、950bp、980bp或1000bp等，优选为0-800bp，进一步优选为0-500bp，最优选为0-200bp。
根据本发明，所述第一引物的长度为19-26bp，例如可以是19bp、20bp、21bp、22bp、23bp、24bp、25bp或26bp。
根据本发明，所述第二引物的长度为19-26bp，例如可以是19bp、20bp、21bp、22bp、23bp、24bp、25bp或26bp。
根据本发明，所述第一引物的Tm值为53-67℃，例如可以是53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃或67℃等。
根据本发明，所述第二引物的Tm值为53-67℃，例如可以是53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃或67℃等。
本发明中，所述第一引物和第二引物的设计可以根据需要滚环扩增或鉴定的环形DNA/RNA模板进行设计，需要满足上述条件的同时，能够保证所设计的双引物不会形成稳定二聚体或自连接、不会相互互补、具有引物特异性，在此不对具体的碱基做限制，本领域技术人员可以根据需要进行设计并调整。
第二方面，本发明提供一种滚环扩增的反应体系，所述反应体系包括第一方面所述的双引物。
根据本发明，所述反应体系中还包括模板，所述模板为DNA或RNA模板。
根据本发明，所述模板的摩尔浓度为(1-5)×10-13mol，例如可以是1×10-13mol、1.2×10-13mol、1.5×10-13mol、1.8×10-13mol、2×10-13mol、2.2×10-13mol、2.5×10-13mol、2.8×10-13mol、3×10-13mol、3.2×10-13mol、3.5×10-13mol、3.8×10-13mol、4×10-13mol、4.2×10-13mol、4.5×10-13mol、4.8×10-13mol或5×10-13mol等。
根据本发明，所述模板：第一引物：第二引物的摩尔比为1:(102-103):(102-103)，例如可以是1:102:102、1:200:200、1:300:300、1:400:400、1:500:500、1:600:600、1:700:700、1:800:800、1:900:900或1:103:103等，发明人发现，在模板与第一引物和第二引物在所述比例下，其扩增效率有显著提高。
根据本发明，所述反应体系还包括dNTP、BSA、Phi29酶、Phi29酶反应缓冲液。
根据本发明，所述dNTP的浓度为5-20μM，例如可以是5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、11μM、12μM、13μM、14μM、15μM、16μM、17μM、18μM、19μM或20μM等，优选为8-15μM。
根据本发明，所述BSA的浓度为200-600μg/ml优选为400μg/ml；
根据本发明，所述Phi29酶的用量为1-5U每20ul体系，例如可以是1U、2U、3U、4U或5U，优选为2-3U。
根据本发明，所述Phi29酶反应缓冲液相对于20μL的总反应体系的加入量为1.5-2.5μL，例如可以是1.5μL、1.8μL、2μL、2.2μL或2.5μL等，优选为2μL。
本发明中，发明人对各个浓度进行了多次试验，通过反应体系各个物质浓度的配合调整，发现在上述各物质浓度配比下，能够提高待检测物的扩增效率。
第三方面，本发明提供一种鉴定环形DNA/RNA的反应体系，包括如第一方面所述的双引物。
根据本发明，所述反应体系还包括dNTP、BSA、T4DNA连接酶、T4DNA连接酶缓冲液、限制性内切酶和限制性内切酶缓冲液。
根据本发明，所述dNTP的浓度为5-20μM，例如可以是5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、11μM、12μM、13μM、14μM、15μM、16μM、17μM、18μM、19μM或20μM等，优选为8-15μM。
根据本发明，所述BSA的浓度为800-1200μg/ml；
根据本发明，所述T4DNA连接酶使用量为0.3-1.5U，例如可以是0.3U、0.6U、0.9U、1.2U或1.5U，优选为0.6-1U。
根据本发明，所述T4DNA连接酶反应缓冲液相对于40μL的总反应体系的加入量为3.5-4.5μL，例如可以是3.5μL、3.8μL、4μL、4.2μL或4.5μL等，优选为4μL。
根据本发明，所述限制性内切酶不作特殊限定，酶切的选择可以通过查找在生物信息学分析过程中，和该预测的环形RNA相匹配的靶基因，通过靶基因序列，挑选若干单一位点酶切的限制性内切酶，所述限制性内切酶的浓度为2-10U，例如可以是2U、3U、4U、5U、6U、7U、8U、9U或10U，优先为4-8U，发明人发现，对限制性内切酶的浓度的调整，对后续的检测结果有影响，通过采用上述浓度，能够提高后续检测的精准度。
所述限制性内切酶的酶切温度和反应时间本领域技术人员可以根据需要进行调整，在此不作特殊限定。
本发明中，发明人对各个浓度进行了多次试验，通过反应体系各个物质浓度的配合调整，发现在上述各物质浓度配比下，能够提高待检测物的扩增效率，提高后续检测的精准度。
第四方面，本发明提供一种用于滚环扩增的试剂盒，其包括如第一方面所述的双引物或如第二方面所述的反应体系。
第五方面，本发明提供一种用于环形DNA/RNA鉴定的试剂盒，其包括如第一方面所述的双引物或如第三方面所述的反应体系。
第六方面，本发明提供一种滚环扩增的方法，采用如第一方面所述的双引物和/或第二方面所述的反应体系，包括如下步骤：
(1)引物与模板退火互补结合；
(2)滚环扩增，得到所述滚环扩增的产物。
根据本发明，步骤(1)所述互补结合的条件为93-98℃反应2-5min，优选为95℃反应3min。
根据本发明，所述滚环扩增的条件为1-5℃1-3min，26-32℃12-30h，60-68℃5-20min，1-5℃2min以上保存；
根据本发明，所述滚环扩增的条件为4℃1min，30℃18h，65℃10min，4℃2min以上保存。
第七方面，本发明提供一种鉴定环形DNA/RNA的方法，采用如第一方面所述的双引物和/或第三方面所述的反应体系，包括如下步骤：
(1’)将权利要求7所述的滚环扩增的产物进行补齐成双链，得到双链产物；
(2’)将步骤(1)得到的双链产物采用限制性内切酶进行酶切，并鉴定；
本发明中，经过RCA(滚环扩增)反应后，反应产物为分支结构DNA链(无论模版是环形DNA还是环形RNA分子)，分支链中部分DNA仍处于单链结构，这一步在T4DNA链接酶的作用下可使得所有单链DNA分子均被dNTP补齐为双链，为下一步的酶切做准备。
本发明中，补齐双链后，所有核酸链都处于双链状态，可采用常用的限制性内切酶对扩增产物进行切割，为凝胶电泳实现RCA反应的可视化检测做准备。
根据本发明，所述补齐成双链的条件为1-5℃1-3min，15-24℃0.5-3.5h，1-5℃2min以上保存。
根据本发明，所述补齐成双链的条件为4℃1min，20℃1h，4℃2min以上保存。
作为优选技术方案，所述鉴定环形DNA/RNA的方法，包括如下步骤：
(1)引物与模板退火互补结合，所述互补结合的条件为93-96℃反应2-5min；
(2)滚环扩增，得到所述滚环扩增的产物，所述滚环扩增的条件为1-5℃1-3min，26-32℃15-22h，60-68℃6-12min，1-5℃2min以上保存。
(3)将步骤(2)得到的滚环扩增的产物进行补齐成双链，得到双链产物，所述补齐成双链的条件为1-5℃1-3min，16-22℃0.5-3h，1-5℃2min以上保存；
(4)将步骤(1)得到的双链产物采用限制性内切酶进行酶切，并鉴定。
在一个具体的实施例中，在面向血液/组织样本来源的环形RNA检测时，可采取以下方法处理样本，或适当调整实验室的溶液配方，以此达到检测环形RNA类的标志物的目的：
1)提取样本全转录组RNA后，用RNase处理样品过夜后，富集环形RNA；
2)将残留的环形RNA样本富集可以采用NucleicAcidPurificationSpinColumns试剂盒结合PCR扩增(复制生成多份环形RNA或以目标环形RNA为模版的环形双链DNA)的方式富集；
3)富集产物之后可采用本发明的实验步骤，结合引物，及限制性内切酶的选择，简单鉴定目的环形RNA。
在一个具体的实施例中，当待测样本环形RNA富集效果不佳时，也可以采用增高滚环扩增体系中引物浓度的方式，提高退火的效率，反应步骤中原设定的最终反应体系为50μL，可采用扩大终反应体系、改变试剂配方中水和缓冲液等配方的方式达到可鉴定目标环形RNA的效果(即等比例的调节反应试剂分量，减少初始反应时待测样本环形RNA所需浓度)。例如，当环形RNA为10ng/μL时，可采用混入干粉式引物的方式使滚环扩增体系中提高环形RNA的分量；在补齐双链体系中采用1μL反应缓冲液(10倍的Phi29酶反应缓冲液)、2U的酶，其他不变并使总反应体系体积为10μL；酶切反应体系中、反应试剂[iv]中所有试剂都减半，最终反应体系为25μL，后采用较深的细小的孔径的凝胶跑电泳，以鉴定样本。
与现有技术相比，本申请具有如下有益效果：
(1)本发明通过采用特定方式设计的双引物，提高了待测物扩增后的分子丰度，有利于分子检验；同时，相对于多引物RCA反应时，双向引物介导的RCA产物在酶切后的各个DNA条段结构简洁很多，能够在分子丰度相对低的情况下有效读取较长的待测片段；
(2)通过本发明方法既可以验证出环形RNA的真实存在性，又可以通过凝胶电泳判断出环形RNA大致的大小；另外，凝胶电泳结果中的条段可以切出纯化之后，加上测序用的接头，结合不同的测序技术进行测序，以此可揭发被预测的环形RNA的真实序列；
(3)本发明方法可快速定性的鉴定质粒或其他环形DNA分子是否和目标序列大体一致，鉴定内容包括分子大小，酶切位点位置，该方法相对于现存测序方法经济、快速；
(4)本发明方法还可用于验证环形RNA是否真实存在，在环形RNA的发现中，本发明可直接证明预测得来的环形RNA是否真实存在，为新型环形DNA/RNA的发现提供有效手段。
附图说明
图1为RCA反应的基本原理与产物特征；
图2为本申请Phi29酶催化下环形核酸分子的双向引物RCA反应原理图；
图3为本申请Phi29酶催化下环形核酸分子的双向引物RCA的可视化鉴定的结果图，其中，图3(A)为不同酶浓度下扩增产物被切割后的凝胶电泳图，图3(B)为图3(A)中1-5拷贝的条段被提取后二次电泳图片；
图4为本申请分散型引物和聚集型引物扩增效果的结果图，其中，图4(A)为分散型引物和聚集型引物设计位点的示意图，图4(B)为反应产物酶切后的凝胶电泳图，图4(C)为反应产物酶切后的产物产量结果图；
图5为本申请不同长度引物及不同酶量扩增效果的结果图，其中，图5(A)为反应产物酶切后的凝胶电泳图，图5(B)为反应产物酶切后的产物产量结果图；
图6为本申请DNA扩增效果随引物位置变化的结果图。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
材料：
Phi29DNA聚合酶 NEB公司；
T4DNA连接酶 NEB公司；
实施例1环形DNA/RNA的鉴定
根据图2的原理，以大小为1467bp的环形DNA/RNA为模板设计双引物，所述双引物为分散型引物，所述双引物中的第一引物和第二引物的3’端的距离为200bp，具体序列如下：
第一引物(SEQ ID NO.1)：GGCTTCAAGTGGGAGAGATTCA
第二引物(SEQ ID NO.2)：GGATGTCGGCAGGGTGTTTA
将设计的双引物进行环形DNA/RNA的鉴定，具体步骤如下：
1)引物与模板退火互补反应
引物与模板链退火互补结合，具体的反应体系如下表1所示：
表1
进行PCR反应，具体条件：95℃3min，4℃保存2min以上；
2)滚环扩增反应
将步骤1)得到的产物进行滚环扩增，具体体系如表2所示：
表2
| 组分 | 体积/μL |
| 步骤1)产物 | 2 |
| Phi29酶 | 0.2 |
| Phi29酶反应缓冲液 | 2 |
| dNTP | 1 |
| BSA | 0.4 |
| ddH<sub>2</sub>O | 14.4 |
| 总计 | 20 |
进行滚环扩增，具体条件：4℃1min，30℃18h，65℃10min，4℃2min以上保存；
3)补齐为双链反应
采用T4 DNA连接酶将所得的DNA分子单链产物补齐为双链，具体反应体系如表3所示：
表3
进行双链补齐，具体条件：4℃1min，20℃1h，4℃2min以上保存；
4)酶切反应
将步骤3)的产物选用具体的限制性内切酶进行酶切反应，具体反应体系如下表4所示：
表4
| 组分 | 体积/μL |
| 步骤3)产物 | 40 |
| 限制性内切酶(8U) | 0.5 |
| 限制性内切酶反应缓冲液 | 5 |
| ddH<sub>2</sub>O | 4.5 |
| 总计 | 50 |
进行酶切反应，具体条件为：37℃反应1-1.5h；
5)电泳检测
将步骤4)得到的产物进行电泳验证。
实施例2
与实施例1相比，其区别仅在于限制性内切酶的酶量为0.5U，其他试剂与方法与实施例1相同。
实施例3
与实施例1相比，其区别仅在于限制性内切酶的酶量为1U，其他试剂与方法与实施例1相同。
实施例4
与实施例1相比，其区别仅在于限制性内切酶的酶量为2U，其他试剂与方法与实施例1相同。
实施例5
与实施例1相比，其区别仅在于限制性内切酶的酶量为2U，其他试剂与方法与实施例1相同。
实施例6
与实施例1相比，其区别仅在于限制性内切酶的酶量为4U，其他试剂与方法与实施例1相同。
实施例7
与实施例1相比，其区别仅在于限制性内切酶的酶量为6U，其他试剂与方法与实施例1相同。
实施例8
与实施例1相比，其区别仅在于限制性内切酶的酶量为10U，其他试剂与方法与实施例1相同。
检测
将实施例1-8的结果进行电泳检测，凝胶电泳反应前需根据待测物的分子量，以将1～10拷贝大小的DNA片段都可以展现在凝胶图中为基准，估算出大概的反应时间和配胶浓度，通常分子量越大，胶体浓度越低，反应时间约长，适用电压范围为20-50伏特，电压过大不利于条段在凝胶电泳中展开，结果如图3(A)所示，并将1-5拷贝的条段进行提取后二次电泳，结果如图3(B)和表5所示所示。
表5
从图3(A)可以看出，以未加酶的反应物为阴性对照(N.C.)，发现扩增产物呈现高分子状态，无法进入凝胶中，以同一酶消化的模版环形DNA分子为阳性对照(P.C.)对比酶切后扩增产物的位置，可见酶切成功的产物呈现多个条段，但当酶量在1U以下，条带不明显，不能实现检测。
从图3(B)和表5可以看出，通过此图可直观的断定反应模板(环形DNA/RNA分子)大致的碱基对数，并可结合酶切及引物的设计断定待测物(环形DNA/RNA分子)是否为目标物质。另外，此反应可提高环形DNA/RNA分子的丰度，酶切后的产物也相对于多引物时结构简单，有利于与现有的测序技术连用，开发新的面向质粒、环形DNA/RNA载体、环形RNA的测序技术。
依据参照的DNA marker大小，在紫外光下切割凝胶，切割取出1-5拷贝的DNA片段后采用magnetic beads回收富集DNA。
实施例9
采用pBluescript II KS-质粒作为模板，第一引物和第二引物的3’端的距离为600bp，其他试剂与方法与实施例1相同。
实施例10
采用pBluescript II KS-质粒作为模板，第一引物和第二引物的3’端的距离为800bp，其他试剂与方法与实施例1相同。
对比例1
采用pBluescript II KS-质粒作为模板，第一引物和第二引物为聚集型引物，设计原理如图4(A)所示，其他试剂与方法与实施例1相同。
对比例2
采用pBluescript II KS-质粒作为模板，所述双引物中的第一引物和第二引物的3’端的距离为10bp，其他试剂与方法与实施例1相同。
检测
将实施例1、实施例9-10和对比例1-2的结果进行电泳检测，结果如图4(B)-图4(C)、图5(A)-图5(B)所示。
从图4(B)-图4(C)可以看出，分散型的引物设计方式更有助于RCA反应的可视化，有利于提高扩增产物丰度，利于检测、鉴定或测序连用，且在第一引物和第二引物的3’端的距离10-200bp范围内，10bp时明显没有条带，随着具体进一步加大，扩增效率提高。
从图5(A)和5(B)可以看出，随着第一引物和第二引物的3’端的距离进一步加大，加大到600-800bp，其扩增效率显著降低。
对比例3-7
与实施例1相比，其区别仅在于所述双引物中的正向引物的起始位点不同，其他试剂与方法与实施例1相同，取1500ng/μL的pBluescript II KS-质粒1μL,5.0×10-10mol/μL正负引物各1μL进行反应(平行样n＝3)，具体如下表所示：
检测
将实施例1和对比例3-7的结果进行电泳检测，结果如图6所示，从图6可以看出，实施例1的的扩增效果优于其他对比例的扩增效果，从而确定分散性引物比集中性引物扩增效率更高。
综上所述，本发明通过采用特定方式设计的双引物，提高了待测物扩增后的分子丰度，有利于分子检验；同时，相对于多引物RCA反应时，双向引物介导的RCA产物在酶切后的各个DNA条段结构简洁很多，能够在分子丰度相对低的情况下有效读取较长的待测片段；通过本发明方法既可以验证出环形RNA的真实存在性，又可以通过凝胶电泳判断出环形RNA大致的大小；另外，凝胶电泳结果中的条段可以切出纯化之后，加上测序用的接头，结合不同的测序技术进行测序，以此可揭发被预测的环形RNA的真实序列。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (10)
1.一种双引物，其特征在于，所述双引物为分散型引物，所述双引物中的第一引物和第二引物的3’端的距离为0-1000bp。
2.根据权利要求1所述的双引物，其特征在于，所述双引物中的第一引物和第二引物的3’端的距离为0-800bp，优选为0-500bp，进一步优选为0-200bp；
优选地，所述第一引物的长度为19-26bp；
优选地，所述第二引物的长度为19-26bp；
优选地，所述第一引物的Tm值为53-67℃；
优选地，所述第二引物的Tm值为53-67℃。
3.一种滚环扩增的反应体系，其特征在于，所述反应体系包括权利要求1或2所述的双引物；
优选地，所述反应体系中还包括模板；
优选地，所述模板为DNA或RNA模板；
优选地，所述模板的摩尔浓度为(1-5)×10-13mol；
优选地，所述模板：第一引物：第二引物的摩尔比为1:(102-103):(102-103)；
优选地，所述反应体系还包括dNTP、BSA、Phi29酶、Phi29酶反应缓冲液；
优选地，所述dNTP的浓度为5-20μM，优选为8-15μM；
优选地，所述BSA的浓度为200-600μg/ml优选为400μg/ml；
优选地，所述Phi29酶的单位为1-5U，优选为2-3U；
优选地，所述Phi29酶反应缓冲液相对于20μL的总反应体系的加入量为0.1-0.5μL，优选为0.2-0.3μL。
4.一种鉴定环形DNA/RNA的反应体系，其特征在于，包括如权利要求1或2所述的双引物；
优选地，所述反应体系还包括dNTP、BSA、T4DNA连接酶、T4DNA连接酶缓冲液、限制性内切酶和限制性内切酶缓冲液；
优选地，所述dNTP的浓度为5-20μM，优选为8-15μM；
优选地，所述BSA的浓度为800-1200μg/ml；
优选地，所述T4DNA连接酶使用量为0.3-1.5U，优选为0.6-1U；
优选地，所述T4DNA连接酶反应缓冲液相对于40μL的总反应体系的加入量为0.1-0.5μL，优选为0.2-0.3μL；
优选地，所述限制性内切酶的用量为2-10U，优选为4-8U；。
5.一种用于滚环扩增的试剂盒，其特征在于，其包括如权利要求1或2所述的双引物或如权利要求3所述的反应体系。
6.一种用于环形DNA/RNA鉴定的试剂盒，其特征在于，其包括如权利要求1或2所述的双引物或如权利要求4所述的反应体系。
7.一种滚环扩增的方法，其特征在于，采用如权利要求1或2所述的双引物和/或权利要求3所述的反应体系，包括如下步骤：
(1)引物与模板退火互补结合；
(2)滚环扩增，得到所述滚环扩增的产物。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述互补结合的条件为93-98℃反应2-5min，优选为95℃反应3min；
优选地，所述滚环扩增的条件为1-5℃1-3min，26-32℃12-30h，60-68℃5-20min，1-5℃2min以上保存；
优选地，所述滚环扩增的条件为4℃1min，30℃18h，65℃10min，4℃2min以上保存。
9.一种鉴定环形DNA/RNA的方法，其特征在于，采用如权利要求1或2所述的双引物和/或权利要求4所述的反应体系，包括如下步骤：
(1’)将权利要求7所述的滚环扩增的产物进行补齐成双链，得到双链产物；
(2’)将步骤(1)得到的双链产物采用限制性内切酶进行酶切，并鉴定；
优选地，所述补齐成双链的条件为1-5℃1-3min，15-24℃0.5-3.5h，1-5℃2min以上保存；
优选地，所述补齐成双链的条件为4℃1min，20℃1h，4℃2min以上保存。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)引物与模板退火互补结合，所述互补结合的条件为93-96℃反应2-5min；
(2)滚环扩增，得到所述滚环扩增的产物，所述滚环扩增的条件为1-5℃1-3min，26-32℃15-22h，60-68℃6-12min，1-5℃2min以上保存。
(3)将步骤(2)得到的滚环扩增的产物进行补齐成双链，得到双链产物，所述补齐成双链的条件为1-5℃1-3min，16-22℃0.5-3h，1-5℃2min以上保存；
(4)将步骤(1)得到的双链产物采用限制性内切酶进行酶切，并鉴定。
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