CN112126986B - 一种定量miRNA的测序文库制备和分析方法 - Google Patents

Abstract

为了解决miRNA的精确定量问题，本发明提供一种定量miRNA的测序文库制备和分析方法，其主要步骤包括在RNA两端连接衔接子RA5与RA3；使用反转录引物RT Primer获得DNA第一链并对溶液进行不同倍数的稀释；使用Primer1和Primer2进行PCR并对扩增产物中目的DNA片段进行切胶回收；使用Illumina测序平台进行测序；使用生物信息学工具分析下机数据并使用算法校正miRNA的表达量。本发明设计的包含随机标签序列的衔接子RA5能有效去除PCR扩增带来的重复序列，实现对miRNA进行更为精准的表达定量；本发明提出的稀释法以及对应的算法，有效避免了因miRNA的不同拷贝连接上同样的随机标签序列而造成表达量低估的情况，因此进一步提高了定量的准确性。

Description

一种定量miRNA的测序文库制备和分析方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地，涉及一种用于精确定量miRNA(英文全称为microRNA，中文名称为微小RNA)的高通量测序文库的制备和分析方法。

背景技术

miRNA是一类平均长度仅为22个核苷酸的非编码RNA,在细胞内发挥重要的生物学功能。目前市场上用于miRNA高通量文库制备的主流试剂盒，如Illumina公司和NEB公司的miRNA建库试剂盒，构建的测序文库都难以实现精准定量，其结果往往和qPCR定量(qPCR的英文全名为Real-time Quantitative PCR Detecting System，中文解释为实时荧光定量核酸扩增检测系统，也叫实时定量基因扩增荧光检测系统)结果有一定的差距。尽管SaifulIslam等人报道的针对单细胞测序的定量化标签方法(Nature Methods,2014,11:163-166)能大幅提高定量的准确性，但此法不适用于取自大量细胞的RNA样品的建库和定量分析。目前，有人提出在miRNA文库制备过程中加入随机标签序列以实现精确定量的效果。尽管此方法在整体上大幅的提高了miRNA的定量精确度，但在定量某些表达丰度很高的miRNA时，效果仍然不够理想。综上所述，为了实现对miRNA的精确定量，特别是表达丰度很高的miRNA的精确定量，目前需要建立一种高通量测序文库的制备和分析方法，以更好地满足精准医学和定量生物学的实际需要。

发明内容

本发明的目的是提供一种定量miRNA的测序文库制备和分析方法。其步骤如下:

(1)提供一种用于制备测序文库的RNA样品,总体积为5μl,总量为2μg以上；

(2)提供一种用于连接步骤(1)中所述的RNA样品3’端的衔接子RA3，RA3的序列为5’-TGGAATTCTCGGGTGCCAAGG-3’；

(3)提供一种用于连接步骤(1)中所述RNA样品5’端的衔接子RA5，衔接子RA5的序列包括固有结构S1-S2-S3，其中S1的碱基序列为5’-GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUC-3’，S2是长度为11～15个的随机核苷酸序列N_11-15，S2定义为随机标签序列，S3是长度为4个的固定碱基，且S3选自ACGA、CCGA、CGAU、CGUA、CGUU、GACG、GCCA、GCGU、GGAA、GUCG、GUCU中的一种；

(4)取一定量步骤(1)所述的RNA样品与适量步骤(2)所述的衔接子RA3混合进行连接反应，从而形成核酸-衔接子RA3的复合物；

(5)将步骤(4)中获得的核酸-衔接子RA3的复合物与衔接子RA5进行连接反应，从而形成衔接子RA5-核酸-衔接子RA3的复合物；

(6)将步骤(5)获得的衔接子RA5-核酸-衔接子RA3的复合物与特异性结合于衔接子RA3的反转录引物RT Primer混合，进行反转录反应，得到DNA第一链，其中反转录引物RTPrimer的序列为5’-CCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3’；

(7)从步骤(6)获得的含有DNA第一链的溶液中按照体积比例取出6份，使它们的体积分别占原溶液的1/2,1/5,1/10,1/20,1/50和1/100,随后用水分别稀释2倍、5倍、10倍、20倍、50倍和100倍至与原溶液相等体积,并将稀释后的含有DNA第一链的溶液依次标记为样品C、样品D、样品E、样品F、样品G和样品H；

(8)将步骤(7)获得的样品C、样品D、样品E、样品F、样品G和样品H分别与特异性结合于衔接子RA3相应区域的引物Primer1和特异性结合于衔接子RA5相应区域的引物Primer2进行混合,进行PCR反应,获得扩增产物；其中，Primer1的序列为5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTCGTGATGTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3’，Primer2的序列为5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTTCAGAGTTCTACAGTCCGA-3’，其中标下划线的8个碱基“GTCGTGAT”为index序列(index序列的中文翻译为索引序列)，所述的index序列至少还可用以下十种index序列替换：ACCACTGT,TGGATCTG,CCGTTTGT,TGCTGGGT,GAGGGGTT,AGGTTGGG,GTGTGGTG,TGGTCACA,TTGACCCT,CCACTCCT；样品C-H中的每个样品选择使用一个index序列，且不同的样品使用的index序列各不相同，较为具体的，样品C-H选择的index序列包括但不限定于GTCGTGAT、ACCACTGT,TGGATCTG,CCGTTTGT,TGCTGGGT,GAGGGGTT,AGGTTGGG,GTGTGGTG,TGGTCACA,TTGACCCT,CCACTCCT；

(9)将步骤(8)获得的6份扩增产物进行6％聚丙烯酰胺凝胶电泳,胶块经染色后在紫外灯下识别各DNA条带,割取所需的目的DNA片段并回收,此即制备完成的测序文库,通过Agilent 2100 Bioanalyzer进行片段长度范围检测和Invitrogen Qubit进行定量之后即可用于Illumina高通量测序平台直接测序；其中，测序平台使用NextSeq 500，测序读长为75bp，测序模式为单端测序；所述的目的DNA片段的长度为miRNA的长度+测序接头的长度+S2的长度+S3的长度，其中，所述的miRNA的长度为15～30bp，且所述的miRNA平均长度为22bp，测序接头的长度为120bp，S2的长度为11～15bp，S3的长度为4bp。所以，理论上，目的DNA片段的长度分布在22bp+120bp+S2+4bp±10bp之间，因此，切胶范围设定为22bp+120bp+S2+4bp±10bp，即S2+146bp±10bp。

(10)根据测序接头中用于区分不同样品的index序列将步骤(9)产生的测序数据拆分,随后使用软件(如FastQC,Cutadpat,Trimmomatic)对样品C-H的测序数据进行质控和预处理以得到去除了低质量序列和测序接头的有效数据(英文全称为clean data)；随后将RA5中的随机标签序列S2以及固定碱基S3从有效数据的序列5’端移除；随后使用序列比对软件(如Bowtie)将得到的序列再比对到参考基因组序列上,获得定位于参考基因组的位置信息；进一步的，参考基因组包括但不限于人类和小鼠的参考基因组；

(11)根据步骤(10)获得的序列比对位置以及对应的随机标签序列S2,对样品C-H分别进行PCR重复序列的去除。具体而言,被序列比对软件比对到参考基因组同一位置(即序列的5’和3’端在参考基因组的位置相同)的序列若带有相同的随机标签序列S2,则视为PCR重复,并将其合并为同一条序列；

(12)将步骤(11)中获得的已去除PCR重复的序列的位置与参考基因组中的miRNA(均指成熟miRNA,下同)位置相比较,确定样品C-H中所有miRNA的表达量；

(13)通过对样品C-H中miRNA表达量的比较，从而对样品C-H的高表达丰度的miRNA进行表达量的校正。

进一步的，步骤(1)中所述的RNA样品是指从各种来源，包括但不限于使用各类提取方法从各类动植物细胞中获得的总RNA，且纯度和质量符合一般RNA要求，不含DNA、蛋白质等其他杂质。

进一步的，参考基因组中的miRNA的位置信息取自于miRBase数据库，当某序列的5’端与参考基因组中的某miRNA的5’端位置一致的时候,将所述的某序列记为参考基因组中的miRNA的测序序列。

进一步的，所述的miRNA的表达量RPM(英文全称为reads per million)为所述的miRNA测序序列的总量占该样品所有miRNA的测序序列总量的百万分比。

进一步的，步骤(13)中，当miRNA在样品C中RPM≥100时，则判定此miRNA为高表达丰度；当miRNA在样品C中1＜RPM＜100时，则判定此miRNA为中表达丰度；当miRNA在样品C中RPM≤1时，则判定此miRNA为低表达丰度。

进一步的，设定x_i为稀释倍数，y_i为此稀释倍数下的log₂RPM值，其中i＝1,2,…,6，分别对应样品C-H，令k即为点(x_i，y_i)与点(x_i+1,y_i+1)之间的斜率；对于样品C中的高表达丰度的miRNA，当i不断变大，一旦出现k<0.05时，认为所述miRNA的RPM的增长进入平台期，此时使用相应的y_i作为该miRNA的校正表达量；对于样品C中的中低表达丰度的miRNA，直接使用其在C样品中的表达量y₁作为所述miRNA的校正表达量，此时不需要考虑所述miRNA在样品D-H中的表达量。

由此可见，采用不同比例的稀释条件将对高表达丰度的miRNA定量效果产生明显影响。本发明通过步骤(13)中的算法来计算这些miRNA的校正表达量。通过实验发现，稀释50倍时已经能够对表达丰度极高的miRNA实现精准的定量，而这种表达丰度值可以覆盖几乎所有的组织和细胞样品(详见实例1)。应理解，除本发明中提及的6种稀释倍数和斜率k<0.05以外，选择其他的稀释倍数和斜率从而构成新的或优选的技术方案，亦属于本发明的专利权保护范围之内。

本发明的定量miRNA的测序文库制备和分析方法主要优点包括:

(1)本发明通过将包含一段长度为11-15个随机核苷酸序列的衔接子RA5与样品核酸片段连接，使得每个特定的碱基排列组合成为每一条核酸片段的标签；这些标签在建库、测序以及后期生物信息学分析过程中不会丢失或混淆，能有效去除PCR扩增带来的重复序列，因此能够对miRNA进行更为精准的表达定量。

(2)本发明通过稀释法,将高表达丰度的miRNA稀释至可准确定量的浓度范围内,尽可能保证了每一个miRNA分子都有唯一的标签与之对应,有效避免了因miRNA的不同拷贝连接上同样的标签而造成表达量低估的情况，且通过算法对这些miRNA的表达量进行了可靠的计算，因此对于某些表达量很高的miRNA亦能进行精确的定量。

(3)本发明将稀释步骤放在DNA第一链合成后，避免了对同一样品的不同稀释条件进行重复建库，这不仅节约了大量的实验试剂成本，同时也减少了因实验操作带来的误差放大效应，因此具有重要的意义。

(4)本发明适合于针对常见的总量为2μg以上的RNA样品进行高通量测序文库的制备,所需都是常规实验技术以及容易购买到的试剂和药品,条件易得,操作简便,且后续数据分析方法亦不复杂，因此可被普通技术人员较快掌握。

附图说明

下面将结合具体的实施例和附图对本发明做出进一步的描述。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold SpringHarbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

图1中为具体实施案例1中的表达量水平高的miR-122-5p,表达量中水平的miR-350-3p和表达量低水平的miR-344-5p在不同的稀释倍数下的miRNA表达量的示意图，且稀释倍数作为横坐标，表达量log₂RPM作为纵坐标，其中最上面的一条曲线为miR-122-5p的表达量的示意图，中间的一条曲线为miR-350-3p的表达量示意图，最下面的一条曲线为miR-344-5p的表达量的示意图。图1的三条曲线上均包含有8个点，其中稀释倍数为1时，每条曲线上对应有两点，分别用“▲”和“█”表示，“▲”表示样品A采用传统的不使用随机标签序列并且不做稀释时的测序结果，“█”表示样品B采用随机标签序列但是不进行稀释的测序结果；稀释倍数≥2时，每条曲线上均对应有六点，分别用“●”表示，“●”表示样品C-H采用随机标签序列并且进行相应倍数的稀释后的测序结果，每条曲线上的“↙”标识分别代表三种miRNA的校正表达值。

图2为10个表达量水平高的miRNA的测序定量结果log₂RPM与对应的qPCR定量结果log₂qPCR定量值的相关性分析的示意图。横坐标表示表达量水平高的miRNA的测序定量结果log₂RPM，纵坐标表示对应的qPCR定量结果log₂qPCR定量值。

具体实施方式

实施例1：miRNA高通量测序文库的制备

1、从小鼠肝脏组织中提取总量为6μg的总RNA，用超纯水(无DNA酶和RNA酶,下同)稀释至总体积为15μl,平均分成3份，每份为5μl，分别置于3个200μl薄壁PCR管中；

选取肝脏组织的优点在于：肝脏细胞中某些miRNA具有极高的表达丰度，且由于细胞分裂快速，会出现多种不同核型不同状态的肝脏细胞，发挥调控作用的miRNA种类相比大多数的正常组织和细胞更丰富，因此作为此次实例的研究对象。此实验方法除了对各类组织适用以外，也同样适用于各类细胞样品。

2、在步骤1获得的3份溶液中均加入1μl浓度为10μM的衔接子RA3,混匀后于70℃反应2分钟,立即置于冰上冷却；

3、在步骤2获得的3份溶液中均加入2μl HML(Ligation Buffer)(Illumina，货号15013206),1μl RNase Inhibitor(Illumina，货号15003548)，1μl T4 RNA Li gase 2Deletion Mutant(Epicentre，货号LR2D11310K)混匀,28℃孵育1小时；

4、在步骤3获得的3份溶液中均加入1μl STP(Stop Solution)(Illumina，货号15016304)混匀,28℃孵育15分钟；

5、取两支新的PCR管(分别标记为R2和R3)加入1.1μl衔接子RA5(其中S1的碱基序列为5’-GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUC-3’，S2是长度为13的随机核苷酸序列N₁₃，S3选用ACGA)，RA5浓度为10μM,70℃孵育2分钟,反应后立即置于冰上冷却；取一支新的PCR管(标记为R1)加入1.1μl的衔接子S1(不带S2与S3)，S1浓度为10μM，70℃孵育2分钟,反应后立即置于冰上冷却；

6、步骤5获得的3份溶液均分别加入1.1μl 10mM ATP(Illumina，货号15007432),再分别加入1.1μl T4 RNA连接酶(Illumina，货号1000587)，然后分别混匀；

7、从步骤6获得的3份溶液中各取3μl分别加入步骤4得到的3份溶液并混匀,28℃反应1小时；

8、在步骤7获得的3份溶液中加入1μl RNA RT Primer(10μM)混匀,70℃反应2分钟,反应后立即置于冰上冷却；

9、在步骤8获得的3份溶液中分别加入2μl 5×First Strand Buffer(Thermo，货号1889832),0.5μl dNTP Mix(12.5mM，Illumina，货号11318102),1μl 100mM DTT(Thermo，货号1850670),1μl RNase Inhibitor和1μl SuperScript II Reverse Transcriptase(Thermo，货号2008270)混匀,50℃孵育1小时；

10、将步骤9获得的与R1对应的溶液标记为A，与R2对应的溶液标记为B，并从R3对应的溶液中按体积比例取出六份，使它们的体积分别占原溶液的1/2、1/5、1/10、1/20、1/50和1/100,随后用水稀释至与A、B相等体积，此时稀释倍数分别为2、5、10、20、50和100,并将这6份溶液依次标记为样品C-H；

11、样品A-H均用水补齐至18μl，分别再加入25μl PML(PCR Mix)(Illumina，货号15022681),2μl Primer1(10μM),2μl Primer2(10μM)，样品A-H分别选用的index序列为：GTCGTGAT,ACCACTGT,TGGATCTG,CCGTTTGT,TGCTGGGT,GAGGGGTT,AGGTTGGG,GTGTGGTG；混匀后进行PCR反应,98℃预变性30s，98℃变性10s，60℃退火30s，72℃延伸15s，执行11个循环后，72℃延伸10min，4℃保存；

12、将上一步获得的样品A-H的PCR产物进行6％聚丙烯酰胺凝胶电泳，电压120V，时间1h，万分之一Gelred染液染色5分钟，然后置紫外灯下观察并拍照，割取149～169之间的条带并回收，经定性和定量检测DNA长度和浓度，即可用于Illumina平台测序，测序读长在50－150bp之间，测序模式为单端或双端测序；

13、根据测序接头中的index序列将上一步产生的测序数据进行拆分，使用FastQC,Cutadpat,Trimmomatic对样品A-H的测序数据进行质控和预处理以得到去除了低质量序列和测序接头的有效数据；随后将衔接子RA5中的随机标签序列N₁₃(即S2)以及固定碱基ACGA(即S3)从样品A-H的有效数据的序列5’端移除(建库不含S2和S3的样品则不作移除)；随后使用序列比对软件Bowtie将得到的序列再比对到小鼠参考基因组序列上，获得定位于小鼠基因组的位置信息；

14、根据上一步获得的序列比对位置以及对应的随机标签序列，对样品A-H分别进行PCR重复序列的去除(建库不含随机标签序列的样品则不去重)。具体而言，比对到同一位置(即序列的5’和3’端位置相同)的序列若带有相同的随机标签序列，则视为PCR重复，将其合并为同一条序列，即在后续表达值的计算中只算一条序列。

将上一步获得的已去除PCR重复的序列位置与小鼠基因组中miRNA(均指成熟miRNA，下同)位置相比较，确定样品A-H中所有miRNA的表达量。其中，miRNA位置信息取自于miRBase数据库。当某序列的5’端与某miRNA的5’端位置一致时，此序列记为此miRNA的测序序列。每个miRNA表达量RPM(reads per million)为该miRNA测序序列的总量占该样品所有miRNA的测序序列总量的百万分比。通过对样品C-H中miRNA表达量的比较，从而对来自R3的miRNA进行表达量的校正。具体而言，在此设定x_i为稀释倍数，y_i为此稀释倍数下的log₂RPM值(i＝1,2,…,6，分别对应样品C-H)，同时令即为点(x_i，y_i)与点(x_i+1,y_i+1)之间的斜率。对于C样品中RPM≥100的高表达丰度的miRNA，当i不断变大，一旦出现k<0.05时，认为RPM的增长进入平台期，此时使用相应的yi作为该miRNA的校正表达量；对于样品C中的中低表达丰度的miRNA，直接使用其在样品C的表达量y1作为该miRNA的校正表达量。如图1所示，为表达量水平高的miR-122-5p,表达量中水平的miR-350-3p和表达量低水平的miR-344-5p在不同的稀释倍数下的miRNA表达量的示意图，且稀释倍数作为横坐标，表达量log₂RPM作为纵坐标，其中最上面的一条曲线为miR-122-5p的表达量的示意图，中间的一条曲线为miR-350-3p的表达量示意图，最下面的一条曲线为miR-344-5p的表达量的示意图。图1的三条曲线上均包含有8个点，其中稀释倍数为1时，每条曲线上对应有两点，分别用“▲”和“█”表示，“▲”表示样品A采用传统的不使用随机标签序列并且不做稀释时的测序结果，“█”表示样品B采用随机标签序列但是不进行稀释的测序结果；稀释倍数≥2时，每条曲线上均对应有六点，分别用“●”表示，“●”表示样品C-H采用随机标签序列并且进行相应倍数的稀释后的测序结果，每条曲线上的“↙”标识分别代表三种miRNA的校正表达值。可以看出，在加入随机标签序列S2后，miR-122-5p与miR-350-3p在样品B-H中的RPM均明显低于其在样品A(未加随机标签序列)中的RPM，这表明文库中含有大量的这两个miRNA的PCR重复。以miR-122-5p为代表的高表达miRNA在不断稀释的条件下RPM逐渐升高并最终到达平台期；以miR-350-3p为代表的中等表达量的miRNA的RPM随着稀释倍数增加只发生很小的变化，且其校正表达值与样品B中的表达值基本一致；miR-344-5p的表达值在稀释后的表现与另外两种miRNA相比有很大不同，这是因为表达值非常低的miRNA经过高倍稀释之后，由于其在溶液中的拷贝数变得极低，此时测序结果的随机性很大，因此这些miRNA的定量准确度在高倍稀释后变得不可靠，所以直接选用最低稀释倍数的样品C表达值作为校正表达值，且校正表达值与样品B中的表达值基本一致。

进一步的，为了验证经校正后的miRNA表达量的准确性，随机选择了10个RPM≥100的miRNA进行qPCR绝对定量，每个miRNA重复三次后取均值，随后计算qPCR定量结果与校正后的miRNA表达量、A样品中的miRNA表达量、B样品中的miRNA表达量的相关性。qPCR定量值见表1，qPCR引物及茎环序列见表2。图2的比较结果显示，通过对表1中10个RPM≥100的高表达miRNA的qPCR绝对定量发现，这10个miRNA的校正表达值与qPCR定量值的皮尔森相(Pearson)关系数R为0.98，未使用随机标签序列的样品A的miRNA表达值与qPCR定量值的皮尔森相关系数R为0.93，使用随机标签但未稀释的样品B的miRNA表达值与qPCR定量值的皮尔森相关系数R为0.95，由此可见10个miRNA的校正表达值与qPCR定量值的皮尔森相关系数最高。另外，对于RPM<100的miRNA，其校正表达量与其在B样品中的表达量基本一致(随机抽取的100个miRNA的平均log₂RPM差异<1％)，且B样品的定量准确性优于A样品：表1中，10个中低表达水平的miRNA在B样品中的表达值与qPCR定量值的皮尔森相关系数R为0.97，高于它们在A样品中的表达值与qPCR定量值的皮尔森相关系数R 0.94。因此，这些结果表明，本发明中提出的方法对于高表达丰度的miRNA具有更好的定量准确性，同时也适用于中低表达丰度的miRNA的定量。

表1：20个miRNA在A-H样品中的表达量以及它们的qPCR定量结果。排在前10位的miRNA是从C样品中RPM≥100的miRNA中随机挑选出来的；排在后10位的miRNA是从C样品中1<RPM<100以及RPM≤1的miRNA中各随机挑选出来了5个。20个miRNA按照在A样品中的RPM进行排序。加粗字标出的数值即为这20个miRNA的校正表达值。qPCR为绝对定量且定量值对应了2μg的总RNA。本表格展示了经log₂转换的qPCR定量值。

从表1数据可以看到，一，样品B在使用随机标签序列去除PCR重复后，miRNA表达值与未使用随机标签序列的样品A相比发生了显著的变化。二、在使用稀释的方法后，我们发现这些高丰度的10个miRNA表达水平均有所上升，这说明尽管随机标签序列的复杂度没有变化，但由于稀释后miRNA的拷贝数大幅降低，同一种miRNA的不同拷贝使用同一个随机标签序列的情况也减少了，经过上述分析步骤便能够对miRNA进行定量的校正。此外从表1中还可以看出稀释的方法并不能明显改变对中等或低表达水平的miRNA的定量。三，当稀释倍数到达50倍(G组)时，即使是小鼠肝脏中表达量最高的miR-122-5p也已进入RPM的增长平台期(其他表达量极高的miRNA亦是如此)，因此可以认为绝大多数其他类型的细胞只需要稀释到某个倍数，例如50倍甚至更低的20倍，即可为其细胞内的所有miRNA进行表达量的校正，从而节约成本和降低建库难度。

表2：20个miRNA的qPCR引物以及茎环序列。表格中碱基序列从左至右均为5’至3’。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 苏州京脉生物科技有限公司

<120> 一种定量miRNA的测序文库制备和分析方法

<160> 88

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tggaattctc gggtgccaag g 21

<210> 2

<211> 26

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

guucagaguu cuacaguccg acgauc 26

<210> 3

<211> 4

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

acga 4

<210> 4

<211> 4

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ccga 4

<210> 5

<211> 4

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cgau 4

<210> 6

<211> 4

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cgua 4

<210> 7

<211> 4

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cguu 4

<210> 8

<211> 4

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gacg 4

<210> 9

<211> 4

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gcca 4

<210> 10

<211> 4

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gcgu 4

<210> 11

<211> 4

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ggaa 4

<210> 12

<211> 4

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gucg 4

<210> 13

<211> 4

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gucu 4

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ccttggcacc cgagaattcc a 21

<210> 15

<211> 65

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

caagcagaag acggcatacg agatgtcgtg atgtgactgg agttccttgg cacccgagaa 60

ttcca 65

<210> 16

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

aatgatacgg cgaccaccga gatctacacg ttcagagttc tacagtccga 50

<210> 17

<211> 8

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

accactgt 8

<210> 18

<211> 8

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

tggatctg 8

<210> 19

<211> 8

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

ccgtttgt 8

<210> 20

<211> 8

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

tgctgggt 8

<210> 21

<211> 8

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

gaggggtt 8

<210> 22

<211> 8

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

aggttggg 8

<210> 23

<211> 8

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

gtgtggtg 8

<210> 24

<211> 8

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

tggtcaca 8

<210> 25

<211> 8

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

ttgaccct 8

<210> 26

<211> 8

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

ccactcct 8

<210> 27

<211> 8

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

gtcgtgat 8

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

cgcgtggagt gtgacaatgg 20

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

agtgcagggt ccgaggtatt 20

<210> 30

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgaccaaaca 50

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

gcgcgctgac ctatgaattg 20

<210> 32

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

agtgcagggt ccgaggtatt 20

<210> 33

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgacggctgt 50

<210> 34

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

cgcgttcaag taatccagga 20

<210> 35

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

agtgcagggt ccgaggtatt 20

<210> 36

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgacagccta 50

<210> 37

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

cgcgtgtaac agcaactcca 20

<210> 38

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

agtgcagggt ccgaggtatt 20

<210> 39

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgactccaca 50

<210> 40

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

gcgtggctca gttcagcag 19

<210> 41

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 41

agtgcagggt ccgaggtatt 20

<210> 42

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 42

gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgacctgttc 50

<210> 43

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 43

gcgcgtaaag tgcttatagt gc 22

<210> 44

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 44

agtgcagggt ccgaggtatt 20

<210> 45

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 45

gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgacctacct 50

<210> 46

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 46

gcgcgtacca cagggtagaa 20

<210> 47

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 47

agtgcagggt ccgaggtatt 20

<210> 48

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 48

gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgacccgtgg 50

<210> 49

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 49

gcgcgttcac agtggctaag 20

<210> 50

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 50

agtgcagggt ccgaggtatt 20

<210> 51

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 51

gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgacgcggaa 50

<210> 52

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 52

gtgaggggca gagagcga 18

<210> 53

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 53

agtgcagggt ccgaggtatt 20

<210> 54

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 54

gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgacaaagtc 50

<210> 55

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 55

cgcgattcct ggaaatactg 20

<210> 56

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 56

agtgcagggt ccgaggtatt 20

<210> 57

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 57

gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgaccaagaa 50

<210> 58

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 58

gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgaccaagaa 50

<210> 59

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 59

cgtctcacac agaaatcgca 20

<210> 60

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 60

agtgcagggt ccgaggtatt 20

<210> 61

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 61

gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgaccaaaca 50

<210> 62

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 62

gccgtttttc attattgctc ct 22

<210> 63

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 63

agtgcagggt ccgaggtatt 20

<210> 64

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 64

gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgacggctgt 50

<210> 65

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 65

gcgttcacaa agcccataca c 21

<210> 66

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 66

agtgcagggt ccgaggtatt 20

<210> 67

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 67

gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgacagccta 50

<210> 68

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 68

cggtacgtca tcgtcgtcat 20

<210> 69

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 69

agtgcagggt ccgaggtatt 20

<210> 70

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 70

gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgactccaca 50

<210> 71

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 71

gcaggctctg actttattgc ac 22

<210> 72

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 72

agtgcagggt ccgaggtatt 20

<210> 73

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 73

gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgacctgttc 50

<210> 74

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 74

cggaagccct ggaggggctg 20

<210> 75

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 75

agtgcagggt ccgaggtatt 20

<210> 76

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 76

gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgacctacct 50

<210> 77

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 77

cgcgggatat catcatatac tgt 23

<210> 78

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 78

agtgcagggt ccgaggtatt 20

<210> 79

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 79

gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgacccgtgg 50

<210> 80

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 80

gcacttgagg atgtaccacc 20

<210> 81

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 81

agtgcagggt ccgaggtatt 20

<210> 82

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 82

gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgacgcggaa 50

<210> 83

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 83

gagtcaggct cctggctaga 20

<210> 84

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 84

agtgcagggt ccgaggtatt 20

<210> 85

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 85

gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgacaaagtc 50

<210> 86

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 86

gcagaacaca cccagctaac 20

<210> 87

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 87

agtgcagggt ccgaggtatt 20

<210> 88

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 88

gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgaccaagaa 50

Claims (5)

1.一种定量miRNA的测序文库制备和分析方法，其包括如下步骤:

(1)提供一种用于制备测序文库的RNA样品,总体积为5μl,总量为2μg以上；

(2)提供一种用于连接步骤(1)中所述的RNA样品3’端的衔接子RA3，RA3的序列为5’-TGGAATTCTCGGGTGCCAAGG-3’；

(3)提供一种用于连接步骤(1)中所述RNA样品5’端的衔接子RA5，衔接子RA5的序列包括固有结构S1-S2-S3，其中S1的碱基序列为5’-GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUC-3’，S2是长度为11～15个的随机核苷酸序列N_11-15，S2定义为随机标签序列，S3是长度为4个的固定碱基，且S3选自ACGA、CCGA、CGAU、CGUA、CGUU、GACG、GCCA、GCGU、GGAA、GUCG、GUCU中的一种；

(4)取一定量步骤(1)所述的RNA样品与适量步骤(2)所述的衔接子RA3混合进行连接反应，从而形成核酸-衔接子RA3的复合物；

(5)将步骤(4)中获得的核酸-衔接子RA3的复合物与衔接子RA5进行连接反应，从而形成衔接子RA5-核酸-衔接子RA3的复合物；

(6)将步骤(5)获得的衔接子RA5-核酸-衔接子RA3的复合物与特异性结合于衔接子RA3的反转录引物RT Primer混合，进行反转录反应，得到DNA第一链，其中反转录引物RTPrimer的序列为5’-CCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3’；

(7)从步骤(6)获得的含有DNA第一链的溶液中按照体积比例取出6份，使它们的体积分别占原溶液的1/2,1/5,1/10,1/20,1/50和1/100,随后用水分别稀释2倍、5倍、10倍、20倍、50倍和100倍至与原溶液相等体积,并将稀释后的含有DNA第一链的溶液依次标记为样品C、样品D、样品E、样品F、样品G和样品H；

(8)将步骤(7)获得的样品C、样品D、样品E、样品F、样品G和样品H分别与特异性结合于衔接子RA3相应区域的引物Primer1和特异性结合于衔接子RA5相应区域的引物Primer2进行混合,进行PCR反应,获得扩增产物；其中，Primer1的序列为5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTCGTGATGTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3’，Pr imer2的序列为5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTTCAGAGTTCTACAGTCCGA-3’，其中标下划线的8个碱基“GTCGTGAT”为index序列，所述的index序列至少还可用以下十种index序列替换：ACCACTGT,TGGATCTG,CCGTTTGT,TGCTGGGT,GAGGGGTT,AGGTTGGG,GTGTGGTG,TGGTCACA,TTGACCCT,CCACTCCT；样品C-H中的每个样品选择使用一个index序列，且不同的样品使用的index序列各不相同，较为具体的，样品C-H选择的index序列包括但不限定于GTCGTGAT、ACCACTGT,TGGATCTG,CCGTTTGT,TGCTGGGT,GAGGGGTT,AGGTTGGG,GTGTGGTG,TGGTCACA,TTGACCCT,CCACTCCT；

(9)将步骤(8)获得的6份扩增产物进行6％聚丙烯酰胺凝胶电泳,胶块经染色后在紫外灯下识别各DNA条带,割取所需的目的DNA片段并回收,此即制备完成的测序文库,通过Agilent 2100 Bioanalyzer进行片段长度范围检测和Invitrogen Qubit进行定量之后即可用于Illumina高通量测序平台直接测序；其中，测序读长在50bp到150bp之间，测序模式为单端测序或者双端测序；所述的目的DNA片段的长度为miRNA的长度+测序接头的长度+S2的长度+S3的长度，其中，所述的miRNA的长度为15～30bp，且所述的miRNA平均长度为22bp，测序接头的长度为120bp，S2的长度为11～15bp，S3的长度为4bp；所以，理论上，目的DNA片段的长度分布在22bp+120bp+S2+4bp±10bp之间，因此，切胶范围设定为22bp+120bp+S2+4bp±10bp，即S2+146bp±10bp；

(10)根据测序接头中用于区分不同样品的index序列将步骤(9)产生的测序数据拆分,随后使用软件，所使用的软件为：FastQC、Cutadpat、Trimmomatic，对样品C-H的测序数据进行质控和预处理以得到去除了低质量序列和测序接头的有效数据；随后将RA5中的随机标签序列S2以及固定碱基S3从有效数据的序列5’端移除；随后使用序列比对软件Bowtie将得到的序列再比对到参考基因组序列上,获得定位于参考基因组的位置信息；所述参考基因组包括但不限于人类和小鼠的参考基因组；

(11)根据步骤(10)获得的序列比对位置以及对应的随机标签序列S2,对样品C-H分别进行PCR重复序列的去除，具体而言,被序列比对软件比对到参考基因组同一位置的序列若带有相同的随机标签序列S2,则视为PCR重复，所述同一位置的序列即序列的5’和3’端在参考基因组的位置相同的序列,并将其合并为同一条序列；

(12)将步骤(11)中获得的已去除PCR重复的序列的位置与参考基因组中的miRNA位置相比较,所述miRNA均指成熟miRNA，确定样品C-H中所有miRNA的表达量；

(13)通过对样品C-H中miRNA表达量的比较，从而对样品C-H的高表达丰度的miRNA进行表达量的校正。

2.如权利要求1所述的定量miRNA的测序文库制备和分析方法，其特征在于：步骤(1)中所述的RNA样品是指从各种来源，包括但不限于使用各类提取方法从各类动植物细胞中获得的总RNA。

3.如权利要求1所述的定量miRNA的测序文库制备和分析方法，其特征在于：参考基因组中的miRNA的位置信息取自于miRBase数据库，当某序列的5’端与参考基因组中的某miRNA的5’端位置一致的时候,将所述的某序列记为参考基因组中的miRNA的测序序列。

4.如权利要求1所述的定量miRNA的测序文库制备和分析方法，其特征在于：所述的miRNA的表达量RPM为所述的miRNA测序序列的总量占该样品所有miRNA的测序序列总量的百万分比，在步骤(13)中，当miRNA在样品C中RPM≥100时，则判定此miRNA为高表达丰度；当miRNA在样品C中1＜RPM＜100时，则判定此miRNA为中表达丰度；当miRNA在样品C中RPM≤1时，则判定此miRNA为低表达丰度。

5.如权利要求1所述的定量miRNA的测序文库制备和分析方法，其特征在于：设定x_i为稀释倍数，y_i为此稀释倍数下的log₂RPM值，其中i＝1,2,…,6，分别对应样品C-H，令k即为点(x_i，y_i)与点(x_i+1,y_i+1)之间的斜率；对于样品C中的高表达丰度的miRNA，当i不断变大，一旦出现k<0.05时，认为所述miRNA的RPM的增长进入平台期，此时使用相应的y_i作为该miRNA的校正表达量；对于样品C中的中低表达丰度的miRNA，直接使用其在C样品中的表达量y₁作为所述miRNA的校正表达量。