CN116042770B - 尿液中miRNA文库制备和表达定量的方法及试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及一种尿液中游离miRNA文库制备的方法，所述方法包括步骤：(a)从尿液中提取miRNA；(b)将所述miRNA加接头、反转录第一链、第二链合成及扩增，获得预扩增产物；(C)对预扩增产物进行二次扩增，对二次扩增产物进行回收，获得游离miRNA测序文库。

Description

尿液中miRNA文库制备和表达定量的方法及试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体地，涉及尿液中miRNA文库制备和表达定量的方法及试剂盒。
背景技术
微小RNA(microRNA，miRNA)，是一类长度约为19-25个核苷酸的非编码短RNA，能够降解靶基因mRNA或抑制其翻译。研究表明miRNA在细胞内发挥重要的生物学功能，参与了多种调节途径，包括发育、病毒防御、造血过程、器官形成、细胞增殖与死亡等等。miRNA水平变化可作为潜在的多种疾病的无创性分子标志物，与癌症的发生和发展也有紧密关联。尿液及血液等样本中存在miRNA，这些样本中的miRNA的含量很低，例如，通常100μl的全血提取出的游离RNA量约为0.2ng–3.5ng，200μl的尿液提取出的RNA量约为0.2ng–3.5ng，远达不到常规建库试剂盒对起始量的要求，因此，miRNA的文库制备及高通量测序方法需要进行不断改进。
中国专利CN112359093A，公开了血液中游离miRNA文库制备和表达定量的方法及试剂盒，将血液中游离miRNA与外源RNA混合，再进行加接头、反转录及一步建库。其中，引入外源RNA是实现miRNA少量样本建库成功的关键点。但是，尿液中miRNA种类远远少于血液中游离miRNA的种类，使用该方法建库时会因为外源RNA引入导致最后获得的文库中尿液miRNA含量偏少，而致使生成的测序数据中有效数据含量偏低。
并且，虽然增加尿液样本的量比较容易，通过增加尿液的量可以增加样本中含有的miRNA的量，但是在目前的提取技术下，提取出的miRNA浓度依然很低，而且纯度也低，常规的核酸浓缩装置极容易出现RNA降解和总量损失厉害的问题。因此，针对尿液样本，本申请提供一种尿液中微量游离miRNA的文库制备方法与数据分析方法以及对应的试剂盒，以便满足实际应用需要。同时，常规的miRNA文库由于miRNA较短(19-25nt)，即使是一般的添加barcode构建的文库插入片段也较短(参考中国专利CN112359093A，选用10个随机核苷酸作为barcode，4个碱基的固定序列，插入片段在33-39bp)，而常规测序策略中最短的也是PE50/SE50，这导致测完插入序列后有10多个碱基均为一致的接头序列，这直接导致了测序质量下降(Q30)，现在常规的解决方法都是在测序时混入其他种类的文库来减弱这一部分影响。
发明内容
本发明的目的在于，提供尿液中游离miRNA文库制备、表达定量的方法及试剂盒，适用于尿液(包括微量尿液)游离miRNA的文库构建、二代测序及数据分析。
本申请的尿液中游离miRNA文库制备方法，由于尿液中miRNA的种类很少，若引入外源RNA来进行扩增会导致获得的文库中尿液miRNA含量偏少，有效数据含量偏低。在此情况下，本申请设计了二次扩增的方式进行建库，与常规的二次扩增不同的是，第一方面，采用两端加barcode的方法来延长插入片段(两端均为4个碱基的固定序列和8个随机序列作为barcode，这样插入片段总长度达到43-49bp),这样构建的miRNA可以直接采用PE50来测序，不需要混入其他种类的文库依然有较高的测序质量(Q30)。第二方面，引入了UMI来分析测序数据，去除PCR重复序列从而实现对微量尿液游离miRNA更为精准的测序定量。第三方面，RA3和RA5中随机序列长度是受样本中miRNA种类数量影响的，通过实验确定优化的适合尿液中miRNA建库测序的随机序列为7-9个碱基，同时这个长度也保证了miRNA文库有足够的长度。第四方面，二次扩增时，P5和P7都带index的方法，组合起来区分样本可以实现在测序的时候有更多的样本可以混样同时上机测序。本申请人在此基础上完成了本申请。
本申请的第一方面，涉及一种尿液中游离miRNA文库制备的方法，所述方法包括步骤：
(a)从尿液中提取miRNA；
(b)将所述miRNA加接头、反转录第一链、第二链合成及扩增，获得预扩增产物；
(C)对预扩增产物进行二次扩增，对二次扩增产物进行回收，获得游离miRNA测序文库。
在一些实施方式中，在步骤(a)中，尿液样品的总体积为100μl–1ml，从尿液中提取200pg–15ng游离RNA。
在一些实施方式中，步骤(b)包括：
(b1)将所述miRNA与衔接子RA3进行连接反应，所述衔接子RA3与RNA的3’端连接，形成核酸-衔接子RA3复合物；所述衔接子RA3的序列包括固有结构R1-R2-R3；
(b2)将核酸-衔接子RA3复合物与衔接子RA5进行连接反应，所述衔接子RA5与所述RNA的5’端连接，形成衔接子RA5-核酸-衔接子RA3复合物；所述衔接子RA5的序列包括固有结构S1-S2-S3；
(b3)将所述衔接子RA5-核酸-衔接子RA3复合物与反转录引物混合，进行反转录反应，得到DNA第一链；
(b4)将所述DNA第一链与特异性结合于RA3的引物和特异性结合于RA5的引物进行混合，获得预扩增产物。
进一步的，在步骤(b1)中，所述衔接子RA3的R1的序列为SEQ ID NO:1，R2为随机标签序列，是长度为7～9个碱基的随机核苷酸序列(N7-N9)，R3为长度为4个碱基的固定序列。
进一步的，所述R3选自：CAGT、CATG、CTAG、CTGA、CGAT、CGTA种的一种。
进一步的，在步骤(b2)中，所述衔接子RA5的S1的序列为SEQ ID NO:2，S2为随机标签序列，是长度为7～9个碱基的随机核苷酸序列(N7-N9)，S3为长度为4个碱基的固定序列。
进一步的，所述S3选自：GCUA、GAUC、GACU、GUAC、GUCA、AUCG、ACUG、AGCU、AGUC、AUGC中的一种。
进一步的，在步骤(b3)中，反转录引物为能够特异性结合于衔接子RA3的反转录引物RT Primer，RT Primer的序列从5’端到3’为：CCTTGGCACCCGAGAATTCCA，即SEQ ID NO:3。
进一步的，在步骤(b4)中，能够特异性结合于衔接子RA3的引物为Primer1，Primer1的序列从5’端到3’为：GTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA，即SEQ ID NO:4；能够特异性结合于衔接子RA5的引物为Primer2，Primer2的序列从5’端到3’为：GTTCAGAGTTCTACAGTCCGA，即SEQ ID NO:5。
在一些实施方式中，在步骤(C)包括：
(c1)将预扩增产物与特异性结合的测序引物P5和P7进行混合，获得二次扩增产物；所述测序引物P5和P7均带有index序列；
(c2)将所述二次扩增产物进行6％聚丙烯酰胺凝胶电泳，胶块经染色后在紫外灯下识别各DNA条带，割取所需的目标DNA片段(对应于miRNA)并回收，得到制备完成的miRNA测序文库。
进一步的，在步骤(c1)中，所述测序引物P5的序列从5’端到3’为：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTATAGCCTGTTCAGAGTTCTACAGTCCGA，即SEQ ID NO:6；所述测序引物P7的序列从5’端到3’为：CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGAGTAATGTGACTGGAGTT，即SEQ ID NO:7。
进一步的，所述测序引物P5序列中标下划线的8个碱基“TATAGCCT”为P5端的index序列(索引序列，用于区分不同样品的测序数据)，该index序列可用以下八种index序列替换：TATAGCCT、ATAGAGGC、CCTATCCT、GGCTCTGA、AGGCGAAG、TAATCTTA、CAGGACGT、GTACTGAC；所述测序引物P7序列中标下划线的8个碱基“CGAGTAAT”为P7端的index序列(索引序列，用于区分不同样品的测序数据)，该index序列可用以下十二种index序列替换：CGAGTAAT、TCTCCGGA、AATGAGCG、GGAATCTC、TTCTGAAT、ACGATTC、AGCTTCAG、GCGCATTA、CATAGCCG、TTCGCGGA、GCGCGAGA、CTATCGCT。
进一步的，在步骤(c2)中，所述目标DNA片段对应了miRNA，所述目标DNA片段的长度为miRNA的长度+测序接头的长度+R2的长度+R3的长度+S2的长度+S3的长度，其中，所述miRNA的长度为15～30bp，测序接头的长度为130bp，R2的长度为7～9bp，R3的长度为4bp，S2的长度为7～9bp，S3的长度为4bp。切胶范围设定为R2+S2+160bp±10bp。
本申请的第二方面，涉及一种尿液中游离miRNA表达定量的方法，所述方法包括上述的步骤(a)、步骤(b)和步骤(c)，以及如下步骤：
(d)将所述miRNA测序文库进行二代测序，获得下机数据；
(e)通过质控工具对所述下机数据进行数据质控和预处理，得到去除了低质量序列和测序接头的有效数据，将所诉衔接子RA3种的R2随机标签序列以及R3固定碱基和所述衔接子RA5中的S2随机标签序列以及S3固定碱基，从有效数据的序列3’端和5’端移除，再将其与人类参考基因组序列比对，获得定位于所述人类参考基因组序列的位置信息；
(f)利用所述位置信息以及对应的所述随机标签序列，对PCR重复序列进行去除，再将获得的已去除PCR重复的序列的位置与所述人类参考基因组中的miRNA位置相比较，确定样本中所有的miRNA的表达量。
在一些实施方式中，在步骤(d)中，所述miRNA测序文库进行二代测序前，进行片段长度范围检测和浓度定量，使用Agilent 2100Bioanalyzer进行片段长度范围检测，使用Invitrogen Qubit进行浓度定量，然后送至Illumina高通量测序平台进行测序，并获得下机数据(raw data)。
进一步的，测序平台为Illumina HiSeq、NovaSeq、或NextSeq测序平台中的一种，测序读长为50bp，测序模式为单端测序或者双端测序。
在一些实施方式中，在步骤(e)中，质控工具为FastQC、Cutadpat、和Trimmomatic，使用序列比对软件，如Bowtie，与人类参考基因组序列进行比对。
在一些实施方式中，在步骤(f)中，被序列比对软件比对到参考基因组同一位置(即序列的5’和3’端在参考基因组的位置相同)的序列若带有相同的随机标签序列R2和相同的随机标签序列S2，则视为PCR重复，并将其合并为同一条序列。
进一步的，miRNA位置信息取自于miRBase(http://www.mirbase.org/)数据库，当某序列的5’端与某miRNA的5’端位置一致时，此序列记为此miRNA的测序序列。
进一步的，利用获得的miRNA的测序序列计算miRNA的表达量RPM(reads permillion)，某个miRNA的表达量RPM为该miRNA测序序列的总量占该样品所有可比对至人类参考基因组的测序序列总量的百万分比。
本申请的第三方面，涉及一种尿液中游离miRNA文库制备的试剂盒，包括：衔接子RA3、衔接子RA5、反转录引物、引物Primer1、引物Primer2、测序引物P5和P7，所述衔接子RA3与尿液样本中的游离miRNA的3’端连接，衔接子RA5与所述miRNA的5’端连接，形成RA5-核酸-衔接子RA3复合物，所述复合物与反转录引物混合进行反转录得到DNA第一链，所述DNA第一链与引物Primer1和引物Primer2混合进行PCR反应，获得预扩增产物；预扩增产物与测序引物P5和P7混合进行二次扩增，获得二次扩增产物。
在一些实施方式中，所述试剂盒还包括：超纯水、酶以及缓冲液。
在一些实施方式中，采用所述试剂盒获得的测序文库，对二代测序的数据进行分析时，可利用衔接子RA3的R2随机标签序列和RA5的S2随机标签序列作为定量化标签，去除PCR重复序列，提高检测的准确性。
本申请的第四方面，涉及尿液中游离miRNA文库制备的方法和试剂盒的用途，以及尿液中游离miRNA表达定量的方法的用途。
在一些实施方案中，本申请涉及尿液中游离miRNA文库制备的方法和试剂盒的用途，用于尿液中游离短RNA的扩增或/和文库制备。
在一些实施方式中，本申请涉及尿液中游离miRNA表达定量的方法的用途，用于获得样本中每个miRNA的表达量，可进一步用于分析高等生物的各类特征，如发育、病毒防御、肿瘤或癌症的水平、器官形成、细胞增殖。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
(1)由于尿液中提取的miRNA的浓度低，设计采用二次扩增的方式进行建库，使得常规建库方法亦能成功构建来源于微量尿液的游离miRNA测序文库；同时，若单纯的PCR产物扩大将引入PCR偏好性带来的对测序结构的影响，因此，本申请在二次扩增的过程中，引入了UMI来分析测序数据，去除PCR重复序列从而实现对微量尿液游离miRNA更为精准的测序定量；
(2)二次扩增产物通过使用目的DNA片段回收的方法从文库中去除了二次扩增引进的非目的片段扩增产物，保证了下机数据中的高有效数据占比，节约了成本；
(3)RA3和RA5都带随机标签序列和固定序列的结构，即增加了barcode的复杂程度，又实现了对于miRNA文库的进一步延长，延长后的文库可以直接进行PE50或SE50的测序，就算不混入其他种类的文库依然有较高的测序质量(Q30)，保证了高质量的下机测序数据；
(4)RA3和RA5中随机序列长度是受样本中miRNA种类数量影响的，要复杂度足以覆盖样本中miRNA的种类，同时随机序列越长连接效率越低，我们根据尿液中miRNA的种类来设计不同长度随机序列，通过实验结果最终确定优化的适合尿液中miRNA建库测序的随机序列为7-9个碱基，同时这个长度也保证了miRNA文库有足够的长度；
(5)二次扩增时，P5和P7都带index的方法，组合起来区分样本可以实现在测序的时候有更多的样本可以混样同时上机测序；
(6)本发明适合于100μl以上尿液样品的游离miRNA的文库构建，由于所需尿液很少且建库成本较低，在科研和临床实践中可用性较强，具有广阔的应用前景；
(7)本发明提出的实验方法难度较低，所需都是常规实验技术以及容易购买到的试剂和药品,条件易得,操作简便,且后续数据分析方法亦不复杂，因此可被普通技术人员较快掌握。
附图说明
结合以下附图一起阅读时，将会更加充分地描述本申请内容的上述和其他特征。可以理解，这些附图仅描绘了本申请内容的若干实施方式，因此不应认为是对本申请内容范围的限定。通过采用附图，本申请内容将会得到更加明确和详细地说明。
图1为尿液游离miRNA的建库实验流程示意图。
图2为实施例1中Agilent 2100 Bioanalyzer对由本发明提出的文库制备方法所制备的测序文库的质检结果。
图3为实施例2中经过分析得到的miRNA的表达量箱线图。
图4为实施例3中，本发明的方法和主流Illumina建库试剂盒得到的游离miRNA表达值的散点图(作图过程中RPM均已加1)。
图5为随机标签序列所含的碱基数量与连接效率的关系。
具体实施方式
描述以下实施例以辅助对本申请的理解，实施例不是也不应当以任何方式解释为限制本申请的保护范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规实验条件，例如Sambrook等人的分子克隆实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非有特别说明，否则实施例所用的材料均为市售产品。
实施例1：获得游离miRNA测序文库
对尿液样本，采用如下方法获得游离miRNA测序文库：
(1)收集适量的人体尿液，于4℃静置半小时以上，小心吸取1ml尿液至EP管中；
(2)使用miRNeasy Serum/Plasma Kit(Qiagen，货号217184)，从尿液样品中提取总量1ng的游离RNA，用超纯水(无DNA酶和RNA酶,下同)稀释至总体积为5μl，并置于200μl薄壁PCR管中。
(3)在提取好的游离RNA中加入1μl浓度为10μM的衔接子RA3,其中R1的碱基序列为5’-TGGAATTCTCGGGTGCCAAGG-3’，R2是长度为8的随机核苷酸序列N8，R3选用CAGT，混匀后于70℃反应2分钟,立即置于冰上冷却；
(4)在步骤(3)获得的溶液中加入2μl HML(Ligation Buffer，Illumina，货号15013206),1μl RNase Inhibitor(Illumina，货号15003548)，1μl T4 RNA Ligase 2Deletion Mutant(Epicentre，货号LR2D11310K)
混匀,28℃孵育1小时；
(5)在步骤(4)获得的溶液中加入1μl STP(Stop Solution，Illumina，货号15016304)混匀,28℃孵育15分钟；
(6)取一支新的PCR管加入1.1μl衔接子RA5，其中S1的碱基序列为5’-GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUC-3’，S2是长度为8的随机核苷酸序列N8，S3选用GCUA，RA5浓度为10μM,70℃孵育2分钟,反应后立即置于冰上冷却；
(7)在步骤(6)获得的溶液中加入1.1μl 10mM ATP(Illumina，货号15007432),再分别加入1.1μl T4 RNA连接酶(Illumina，货号1000587)并混匀；
(8)从步骤(7)获得的溶液中取3μl加入步骤6获得的溶液中并混匀,28℃反应1小时；
(9)在步骤(8)获得的溶液中加入1μl RNA RT Primer(10μM)并混匀,70℃反应2分钟,反应后立即置于冰上冷却；
(10)在步骤(9)获得的溶液中分别加入2μl 5×First Strand Buffer(Thermo，货号1889832),0.5μl dNTP Mix(12.5mM，Illumina，货号11318102),1μl 100mM DTT(Thermo，货号1850670),1μl RNase Inhibitor和1μl SuperScript II Reverse Transcriptase(Thermo，货号2008270)混匀,50℃孵育1小时；
(11)在步骤(10)获得的溶液中加入25μl PML(PCR Mix)(Illumina，货号15022681),2μl Primer1(10μM),2μl Primer2(10μM)，混匀后进行PCR反应：98℃预变性30s，98℃变性10s，60℃退火30s，72℃延伸15s，执行18个循环后，72℃延伸10min，4℃保存；
(12)在步骤(11)获得的溶液中加入50μlNEBNext High Fidelity 2x PCR MasterMix(NEB，货号M0541)，5μl P5(10μM)，5μl P7(10μM)，混匀后进行二次扩增：98℃预变性30s，98℃变性10s，60℃退火30s，72℃延伸15s，执行15个循环后，72℃延伸10min，4℃保存；
(13)将步骤(12)获得的二次扩增产物进行6％聚丙烯酰胺凝胶电泳，电压120V，时间1h，万分之一Gelred染液染色5分钟，然后置紫外灯下观察并拍照，割取160～180间的条带并回收，得到制备完成的miRNA测序文库。尿液游离miRNA的建库实验流程示意图见图1所示。
使用Agilent 2100 Bioanalyzer对上述miRNA测序文库进行片段长度范围检测，检测结果如图2所示：图中横坐标表示片段长度(碱基数)，纵坐标表示荧光吸光值，图中有3个明显的峰，最左和最后的峰为marker呈现的峰，中间的峰对应了文库的片段长度分布范围；再使用Invitrogen Qubit进行浓度定量，测定浓度为1.3ng/μl。
实施例2：miRNA的表达定量
将获得的miRNA测序文库经过如下二代测序及数据分析，获得miRNA的表达量RPM：
(1)将miRNA测序文库送至Illumina NextSeq 500测序平台进行测序，测序读长为50bp，测序模式为单端测序，并获得下机数据；
(2)对下机数据，使用FastQC,Cutadpat和Trimmomatic进行数据质控和预处理(使用默认参数)，以得到去除了低质量序列和测序接头的有效数据；随后将RA3中的随机标签序列R2以及固定碱基R3和RA5中的随机标签序列S2以及固定碱基S3从有效数据的序列3’端和5’端移除；随后使用序列比对软件Bowtie将得到的序列再比对到人类参考基因组序列上(允许最多1个碱基错配)，获得定位于参考基因组的位置信息；
(3)根据获得的序列比对位置以及对应的随机标签序列R2和S2，对结果进行PCR重复序列的去除。具体而言，被Bowtie比对到参考基因组同一位置(即序列的5’和3’端在参考基因组的位置相同)的序列若带有相同的随机标签序列R2和S2，则视为PCR重复，将其合并为同一条序列，即在后续表达值的计算中只算一条序列；
(4)将步骤(3)中获得的已去除PCR重复的序列的位置与人类参考基因组中的miRNA位置相比较,确定样品中所有miRNA的表达量。其中，miRNA位置信息取自于miRBase数据库(http://www.mirbase.org/)；当某序列的5’端与某miRNA的5’端位置一致时，此序列记为此miRNA的测序序列；每个miRNA表达量RPM(reads per million)为该miRNA测序序列的总量占该样品所有可比对至参考基因组的测序序列总量的百万分比；所有表达的miRNA的表达量箱线图见图3。
实施例3：本申请的方法与现有技术的比较
为了验证本申请的尿液游离miRNA的文库制备与表达量定方法能够产生可靠的结果，在此与使用现有主流Illumina建库试剂盒得到的miRNA测序结果进行了比较。
从实施例1中的同一个体，在同一时间和地点，收集尿液30ml，并使用和实施例1中同样的方法获得总量约为1ug的游离RNA；随后，对照组：使用Illumina TruSeq Small RNA文库制备试剂盒(货号：RS-200-0012)进行文库制备，建库方法见试剂盒操作说明(该试剂盒为一次扩增的建库试剂盒)测序文库制备完毕后，送至Illumina NextSeq 500测序平台进行测序，测序读长为50bp，测序模式为单端测序，并获得下机数据；后续的miRNA表达定量分析流程不再包含与衔接子RA3和RA5中随机标签序列相关的去除PCR重复的步骤，其余分析流程与实施例2一致，最终确定样品中所有miRNA的表达量RPM。
比较实施例2中获得的miRNA表达值与使用上述Illumina建库试剂盒获得的miRNA表达值，可以发现这两种方法产生的miRNA定量结果一致性很高(Pearson相关系数R＝0.96；图4)，这样的结果表明：本发明即使只需要微量的尿液(低至100μl)也能成功建库并获得与使用常规入口量(20ml尿液)的主流方法较为一致的游离miRNA定量结果，不仅说明了本发明的定量可靠性亦体现了本发明在尿液入口量方面的优越性。
二次扩增作为本发明的主要技术特征之一，具有不可忽视的重要性：当尿液体积低于500μl时，本申请的建库方法中若不加入二次扩增的步骤则会导致超过70％的建库失败率；另外，随机标签序列对于准确定量miRNA亦发挥了重要作用，本发明的建库方法中若不含随机标签序列则会导致miRNA的定量结果与上述Illumina建库试剂盒的定量结果一致性变差(相关系数R降低0.1以上)。
本发明中随机标签序列包含7～9个碱基是经过反复试验并优化后的决定,当碱基的数量<7时，则随机标签复杂度较低，所能标记的miRNA数量不够覆盖样品中的miRNA数量；当碱基的数量>9时，则导致连接反应效率低下，难以达到建库的要求(碱基数量与连接效率的关系如图5所示)。固定碱基序列作为每一个miRNA序列的起始标签，可以为测序数据的提取和分析提供方便，且经过优化的固定序列组合与现有miRNA的前四个碱基序列都没有相似之处，在后续数据分析中不会造成混淆，因此非常适合作为起始标签。
本发明中RA3和RA5都加入随机标签序列和固定碱基的方法即有效增加了brcode的复杂程度，又通过实现miRNA文库的延长解决了现在miRNA文库在测序时需要混入其他文库的问题。
尽管本申请已公开了多个方面和实施方式，但是其它方面和实施方式对本领域技术人员而言将是显而易见的，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。本申请公开的多个方面和实施方式仅用于举例说明，其并非旨在限制本申请，本申请的实际保护范围以权利要求为准。

Claims (5)

1.一种尿液中游离miRNA文库制备的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
（a）从尿液中提取miRNA；
（b）将所述miRNA加接头、反转录第一链、第二链合成及扩增，获得预扩增产物，包括以下步骤：
（b1）将所述miRNA与衔接子RA3进行连接反应，所述衔接子RA3与RNA的3’端连接，形成核酸-衔接子RA3复合物；所述衔接子RA3的序列包括固有结构R1-R2-R3，所述衔接子RA3的R1序列为SEQ ID NO:1,R2为随机标签序列，是长度为7～9个碱基的随机核苷酸序列，R3为长度为4个碱基的固定序列;
（b2）将核酸-衔接子RA3复合物与衔接子RA5进行连接反应，所述衔接子RA5与所述RNA的5’端连接，形成衔接子RA5-核酸-衔接子RA3复合物；所述衔接子RA5的序列包括固有结构S1-S2-S3，所述衔接子RA5的S1的序列为SEQ ID NO:2，S2为随机标签序列，是长度为7～9个碱基的随机核苷酸序列，S3为长度为4个碱基的固定序列；
（b3）将所述衔接子RA5-核酸-衔接子RA3复合物与反转录引物混合，进行反转录反应，得到DNA第一链，反转录引物为能够特异性结合于衔接子RA3的反转录引物RT Primer，RTPrimer的序列从5’端到3’为：CCTTGGCACCCGAGAATTCCA，即SEQ ID NO:3；
（b4）将所述DNA第一链与特异性结合于RA3的引物和特异性结合于RA5的引物进行混合，获得预扩增产物，能够特异性结合于衔接子RA3的引物为Primer1，Primer1的序列从5’端到3’为：GTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA，即SEQ ID NO:4；能够特异性结合于衔接子RA5的引物为Primer2，Primer2的序列从5’端到3’为：GTTCAGAGTTCTACAGTCCGA，即SEQ IDNO:5；
（C）对预扩增产物进行二次扩增，对二次扩增产物进行回收，获得游离miRNA测序文库，包括以下步骤：
（c1）将预扩增产物与特异性结合的测序引物P5和P7进行混合，获得二次扩增产物；所述测序引物P5和P7均带有index序列，所述测序引物P5的序列从5’端到3’为：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTATAGCCTGTTCAGAGTTCTACAGTCCGA，即SEQ ID NO:6；所述测序引物P7的序列从5’端到3’为：CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGAGTAATGTGACTGGAGTT，即SEQ ID NO:7；所述测序引物P5序列中标下划线的8个碱基“TATAGCCT”为P5端的index序列，该index序列可用以下八种index序列替换：TATAGCCT、 ATAGAGGC、 CCTATCCT、 GGCTCTGA、AGGCGAAG、TAATCTTA、CAGGACGT、GTACTGAC；所述测序引物P7序列中标下划线的8个碱基“CGAGTAAT”为P7端的index序列，该index序列可用以下十二种index序列替换：CGAGTAAT、TCTCCGGA、AATGAGCG、GGAATCTC、TTCTGAAT、ACGATTC、 AGCTTCAG、GCGCATTA、CATAGCCG、TTCGCGGA、GCGCGAGA、CTATCGCT；
（c2）将所述二次扩增产物进行6%聚丙烯酰胺凝胶电泳，胶块经染色后在紫外灯下识别各DNA条带，割取所需的目标DNA片段并回收，得到制备完成的miRNA测序文库，所述目标DNA片段对应了miRNA，所述目标DNA片段的长度为miRNA的长度+测序接头的长度+R2的长度+R3的长度+S2的长度+S3的长度，其中，所述miRNA的长度为15～30bp，测序接头的长度为130bp，R2的长度为7～9bp，R3的长度为4bp，S2的长度为7～9bp，S3的长度为4bp，切胶范围设定为R2+S2+160bp±10bp。
2.如权利要求1所述的尿液中游离miRNA文库制备的方法，其特征在于，包括选自下组的一个或多个特征：
（1）所述R3选自：CAGT、CATG、CTAG、CTGA、CGAT、CGTA中的一种；
（2）所述S3选自：GCUA、 GAUC、 GACU、 GUAC、GUCA、AUCG、 ACUG、 AGCU、AGUC、AUGC中的一种。
3.一种尿液中游离miRNA表达定量的方法，其特征在于，所述方法包括上述权利要求1-2任一项所述的步骤（a）、步骤（b）和步骤（c），以及如下步骤：
（d）将所述miRNA测序文库进行二代测序，获得下机数据；
（e）通过质控工具对所述下机数据进行数据质控和预处理，得到去除了低质量序列和测序接头的有效数据，将所述衔接子RA3中的R2随机标签序列以及R3固定碱基和RA5中的S2随机标签序列以及S3固定碱基，从有效数据的序列3’端和5’端移除，再将其与人类参考基因组序列比对，获得定位于所述人类参考基因组序列的位置信息；
（f）利用所述位置信息以及对应的所述随机标签序列，对PCR重复序列进行去除，再将获得的已去除PCR重复的序列的位置与所述人类参考基因组中的miRNA位置相比较，确定样本中所有的miRNA的表达量。
4.如权利要求3所述的尿液中游离miRNA表达定量的方法，其特征在于，包括选自下组的一个或多个特征：
（1）在步骤（d）中，所述miRNA测序文库进行二代测序前，进行片段长度范围检测和浓度定量，使用Agilent 2100 Bioanalyzer进行片段长度范围检测，使用Invitrogen Qubit进行浓度定量，然后送至Illumina高通量测序平台进行测序，并获得下机数据；
（2）在步骤（e）中，质控工具为FastQC、Cutadpat、和Trimmomatic，使用序列比对软件为Bowtie，与人类参考基因组序列进行比对；
（3）在步骤（f）中，被序列比对软件比对到参考基因组同一位置的序列若带有相同的随机标签序列R2和S2，则视为PCR重复，并将其合并为同一条序列；miRNA位置信息取自于miRBase数据库，当某序列的5’端与某miRNA的5’端位置一致时，此序列记为此miRNA的测序序列；利用获得的miRNA的测序序列计算miRNA的表达量RPM，某个miRNA的表达量RPM为该miRNA测序序列的总量占样品所有可比对至人类参考基因组的测序序列总量的百万分比。
5.一种尿液中游离miRNA文库制备的试剂盒，其特征在于，包括：衔接子RA3、衔接子RA5、反转录引物、引物Primer1、引物Primer2、测序引物P5和P7，所述衔接子RA3与尿液样本中的游离miRNA的3’端连接，衔接子RA5与所述miRNA的5’端连接，形成RA5-核酸-衔接子RA3复合物，所述复合物与反转录引物混合进行反转录得到DNA第一链，所述DNA第一链与引物Primer1和引物Primer2混合进行PCR反应，获得预扩增产物；预扩增产物与测序引物P5和P7混合进行二次扩增，获得二次扩增产物，所述衔接子RA3的序列包括固有结构R1-R2-R3，所述衔接子RA3的R1序列为SEQ ID NO:1，R2为随机标签序列，是长度为7～9个碱基的随机核苷酸序列，R3为长度为4个碱基的固定序列；所述衔接子RA5的序列包括固有结构S1-S2-S3，所述衔接子RA5的S1的序列为SEQ ID NO:2，S2为随机标签序列，是长度为7～9个碱基的随机核苷酸序列，S3为长度为4个碱基的固定序列；反转录引物为能够特异性结合于衔接子RA3的反转录引物RT Primer，RT Primer的序列从5’端到3’为：CCTTGGCACCCGAGAATTCCA，即SEQ ID NO:3；能够特异性结合于衔接子RA3的引物为Primer1，Primer1的序列从5’端到3’为：GTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA，即SEQ ID NO:4；能够特异性结合于衔接子RA5的引物为Primer2，Primer2的序列从5’端到3’为：GTTCAGAGTTCTACAGTCCGA，即SEQ ID NO:5；所述测序引物P5的序列从5’端到3’为：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTATAGCCTGTTCAGAGTTCTACAGTCCGA，即SEQ ID NO:6；所述测序引物P7的序列从5’端到3’为：CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGAGTAATGTGACTGGAGTT，即SEQ ID NO:7；所述测序引物P5序列中标下划线的8个碱基“TATAGCCT”为P5端的index序列，该index序列可用以下八种index序列替换：TATAGCCT、 ATAGAGGC、 CCTATCCT、 GGCTCTGA、AGGCGAAG、 TAATCTTA、CAGGACGT、GTACTGAC；所述测序引物P7序列中标下划线的8个碱基“CGAGTAAT”为P7端的index序列，该index序列可用以下十二种index序列替换：CGAGTAAT、TCTCCGGA、AATGAGCG、GGAATCTC、TTCTGAAT、ACGATTC、 AGCTTCAG、GCGCATTA、CATAGCCG、TTCGCGGA、GCGCGAGA、CTATCGCT。
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