CN112011834A - 一种用于miRNA的高通量测序文库制备方法 - Google Patents

一种用于miRNA的高通量测序文库制备方法 Download PDF

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Abstract

由于目前缺乏一种专门精确定量常规样品中miRNA的高通量测序文库制备方法，故本发明提出一种精确定量化的针对miRNA的高通量测序文库制备方法，其主要包括如下步骤：取一定量RNA样品与衔接子RA3混合进行连接反应，再与衔接子RA5进行连接反应，接着与特异性结合于衔接子RA3的反转录引物RT Primer混合，进行反转录反应，得到DNA第一链；然后与特异性结合于衔接子RA3相应区域的通用引物RNA primer1和特异性结合于衔接子RA5相应区域的特异引物RNA primer index混合，进行PCR反应，获得扩增产物；最后将扩增产物进行6％凝胶电泳，割取所需的目的DNA片段并回收，此即制备完成的测序文库，经长度范围检测和浓度定量之后即可用于Illunima高通量测序平台直接测序。

Description

一种用于miRNA的高通量测序文库制备方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体地，涉及一种用于miRNA(英文全称为microRNA，中文名称为微小RNA)的高通量测序文库的制备方法。
背景技术
miRNA是一类内生的、长度约为22个核苷酸的小RNA，其在细胞内具有多种重要的调节作用。目前针对miRNA的序列组成和功能研究渐成热点，市场上主流的用于miRNA高通量文库制备试剂盒诸如Illumina公司的TruSeqSmall RNA文库制备试剂盒，NEB针对Illumina测序平台研发的Small RNA建库试剂盒(NEB Multiplex Small RNA LibraryPrep Set for Illumina)等。这些商用试剂盒都是针对miRNA进行建库的，实验流程大体类似，但构建的测序文库都没有精准定量，难以满足精确定量分析的需求。已有Saiful Islam等报道针对单细胞测序时采用的定量化标签(unique molecular identifiers，UMI)方法(Nature Methods,11(2),2014:163-166)，但不能直接用于常规样品中各类RNA的建库和定量分析。目前尚无报道针对常规样品的RNA尤其是miRNA的完全定量化的文库制备技术，因此无法满足精准医学和定量生物学的实际需要。综上所述，本领域尚缺乏一种专门针对常规样品中miRNA的精确定量需求的高通量测序文库制备方法。
发明内容
在上海交通大学邵志峰教授的帮助下，本发明提供了一种精确定量化的针对miRNA的高通量测序文库制备方法。
一种用于miRNA的高通量测序文库制备方法，其包括如下步骤：
(1)提供一用于制备测序文库的常规RNA样品，来源不限，总体积为5μl，总量为10ng～1μg；
(2)提供一用于连接步骤(1)中所述的RNA样品3’端的衔接子RA3，RA3的序列为TGGAATTCTCGGGTGCCAAGG；
(3)提供一用于连接步骤(1)中所述RNA样品5’端的衔接子RA5，衔接子RA5的序列包括固有结构S1-S2-S3，其中S1的碱基序列为GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUC，S2是长度为10～15个的简并碱基N10-15，S3是长度为4个的固定碱基，且S3选自ACGA、CCGA、CGAT、CGTA、CGTT、GACG、GCCA、GCGT、GGAA、GTCG、GTCT中的一种；
(4)取一定量步骤(1)所述的RNA样品与适量步骤(2)所述的衔接子RA3混合进行连接反应，从而形成核酸-衔接子RA3的复合物；
(5)将步骤(4)中获得的核酸-衔接子RA3的复合物与衔接子RA5进行连接反应，从而形成衔接子RA5-核酸-衔接子RA3的复合物；
(6)将步骤(5)获得的衔接子RA5-核酸-衔接子RA3的复合物与特异性结合于衔接子RA3的反转录引物RT Primer混合，进行反转录反应，得到DNA第一链；
(7)将步骤(6)获得的DNA第一链与特异性结合于衔接子RA3相应区域的通用引物RNA primer1和特异性结合于衔接子RA5相应区域的特异引物RNA primer index混合，进行PCR反应，获得扩增产物；
(8)将步骤(6)获得的扩增产物进行6％聚丙烯酰胺凝胶电泳，胶块经染色后在紫外灯下识别各DNA条带，割取所需的目的DNA片段并回收，此即制备完成的测序文库，经长度范围检测和浓度定量之后即可用于Illunima高通量测序平台直接测序。
进一步的，所述的常规RNA样品是指从各种来源，包括但不限于使用各类提取方法从各类动植物细胞中获得的总量在10ng～1μg的总RNA，且纯度和质量符合一般RNA要求，不含DNA、蛋白质等其他杂质。
进一步的，所述的目的DNA片段的长度为miRNA的长度+测序接头的长度+S2的长度+S3的长度，其中，miRNA的长度为15～30bp(平均长度为22bp)，测序接头的长度为125bp，S2的长度为10～15bp，S3的长度为4bp。理论上，目的DNA片段的长度将分布在22bp+125bp+S2+4bp±10bp之间，因此，切胶范围设定为22bp+125bp+S2+4bp±10bp。
进一步的，采用本发明的方法制备的测序文库，测序读长在50bp到150bp之间，测序模式为单端测序或者双端测序。
本发明的用于miRNA的高通量测序文库制备方法，具有如下优点：
(1)本发明通过特殊设计的衔接子RA5，引入一段专有的碱基序列，其中包括长度为10～15的简并碱基N10-15，以及紧接其后长度为4的固定碱基。本发明中简并碱基数量选择10～15个是经过反复试验并优化后的决定,当简并碱基的长度<10时，则标签数量少，所能标记的miRNA数量远不够覆盖样品中的miRNA数量；当简并碱基的长度>15时，则导致连接反应效率低下，达不到建库的要求。简并碱基长度与连接效率的关系如图1所示。固定碱基序列作为每一个miRNA序列的起始标签，可以为测序数据的提取和分析提供方便。同时，经过优化的固定序列组合与现有miRNA的前四个碱基序列都没有相似之处，在后续数据分析中不会造成混淆，因此非常适合作为起始标签。
(2)本发明中长度为10～15个简并碱基作为定量化标签，是衔接子RA5的一部分，与样品核酸片段连接之后，每个特定的碱基排列组合便成为每一条核酸片段的标签，不会在建库、测序以及后期生物信息学分析过程中丢失或混淆，在通过去除PCR重复序列的精准定量分析过程中起到关键性的作用，能够精准的确定不同miRNA在表达量上的大小关系。
(3)与现有技术相比，本发明利用简单易行的操作实现高通量测序文库的制备。对低至10ng，高至1μg的RNA样品也能顺利建库，通过对样品进行割胶回收纯化，文库质量高，杂质少，可以直接上机测序。
(4)本发明适合于针对常规样品的miRNA制备高通量测序文库，且所需都是常规实验技术以及容易购买到的试剂和药品，条件易得，且操作简便，一般实验技术人员皆可独立操作完成。
附图说明
图1为简并碱基长度与连接效率的关系。
图2为PCR产物的凝胶电泳图，泳道1-4黑框中所示即为割胶回收目标产物的位置。
图3为基于定量化标签去除PCR重复序列后计算的10种miRNA相对表达量与qPCR结果的一致性，横、纵坐标均为各miRNA相对于hsa-miR-500a-3p的表达量，且相对表达量经过了以2为底的对数转换。
图4为未使用简并碱基序列去除PCR重复而直接计算得到的10种miRNA相对表达量与qPCR结果的一致性，横、纵坐标均为各miRNA相对于hsa-miR-500a-3p的表达量，且相对表达量经过了以2为底的对数转换。
下面将结合具体的实施例和附图对本发明做出进一步的描述。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold SpringHarbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
具体实施方式
实施例1：
3’端加接头
1、将总量为10ng，提取自HeLa细胞的总RNA用超纯水(无DNA酶和RNA酶，下同)稀释至总体积为5μl，置于200μl薄壁PCR管中；
2、加入1μl衔接子RA3，混匀后于70℃孵育2分钟，立即置于冰上冷却；
3、加入2μl HML(Ligation Buffer),1μl RNase Inhibitor，1μl T4RNA Ligase混匀，28℃孵育1小时；
4、加入1μl STP(浓度为10mM的Stopoligo溶液)混匀，28℃孵育15分钟；5’端加接头
5、取新的PCR管加入1.1μl衔接子RA5(其中S2是长度为10的简并碱基N10，S3选自ACGA)；
6、简并碱基N10浓度为10μM，70℃孵育2分钟，反应后立即置于冰上冷却；
6、加入1.1μl 10mM ATP，再加入1.1μl T4RNA连接酶混匀；
7、取3μl的上述混合物加入步骤4的反应液混匀，28℃孵育1小时；
反转录第一链
8、上述反应液加入1μl RNA RT Primer混匀，70℃孵育2分钟，反应后立即置于冰上冷却；
9、.加入2μl 5×First Strand Buffer,0.5μl dNTP Mix(12.5mM),1μl 100mMDTT,1μl RNase Inhibitor和1μl SuperScriptⅡReverse Transcriptase混匀，50℃孵育1小时；
第二链合成及扩增
10、上述反应液中加入:
8.5μl超纯水
25μl PML(PCR Mix)
2μl RP1(RNA PCR Primer)
2μl RPIX(RNA PCR Primer Index)
11、混匀后进行PCR反应，98℃预变性30秒，98℃变性10秒，60℃退火30秒，72℃延伸15秒，执行15个循环，最后72℃延伸10分钟，4℃保存；
12、上述PCR产物进行6％聚丙烯酰胺凝胶电泳，电压为120伏，1小时，万分之一Gelred染液染色5分钟，然后置紫外灯下观察并拍照，如附图1所示为PCR产物的凝胶电泳图，割取图2中泳道1，2黑框内的151～171bp之间的条带并回收，经定性和定量检测DNA长度和浓度，即可用于Illumina高通量测序平台测序。测序读长在50bp到150bp之间，测序模式为单端或双端测序；
13、根据已知标签(index)序列将上一步产生的测序数据进行拆分，获得(1)中所述的RNA样品对应的测序数据，随后使用FastQC、cutadapt、Trimmomatic对本样品的测序数据进行质控和预处理，接着将步骤(5)中加入衔接子RA5的简并碱基N10以及固定碱基从序列5’端移除，得到的序列再比对到标准人类基因组序列上，获得定位于人类基因组的位置信息。
14、根据上一步获得的序列比对位置以及对应的简并碱基序列，对数据进行PCR重复序列的去除。具体而言，比对到同一位置(即序列的5’和3’端位置相同)的序列若带有相同的简并碱基序列，则视为PCR重复，将其合并为同一条序列，即在后续表达值的计算中只算一条序列。
15、将上一步中获得的已去除PCR重复的序列的位置与人类基因组中的miRNA(均指成熟miRNA，下同)位置相比较，确定此样品的miRNA的表达量。其中，miRNA的位置信息取自于miRBase数据库。当某序列的5’端与某miRNA的5’端位置一致的时候，此序列记为此miRNA的测序序列。每个miRNA表达量(单位为RPM,即reads per million)的计算方法为该miRNA测序序列的总量除以该样品的测序总量(样品测序总量的单位为百万)。表2展示了使用本方法定量后表达量排名靠前的10种miRNA，同时也显示了在未使用定量化标签去除PCR重复时这些miRNA在所有miRNA中的表达量排名(第四列)。
表2：表达量排名靠前的10种miRNA列表
Figure BDA0002076911870000061
从表2中可以看出，在使用定量化标签去除PCR重复后，miRNA的表达量排名发生了变化，这说明建库过程中某些miRNA具有PCR扩增偏好性，与预期相符。
16、测序后得到的miRNA序列一端会带有随机标签序列，其中随机序列标签为长度是10的简并碱基序列，且随机序列标签的复杂度取决于简并碱基的数量)，由于这些随机序列标签在PCR扩增放大过程中忠实保留了miRNA拷贝数信息，因此可以用于更为精确的miRNA定量。为了准确体现该定量标签的作用，这里分别统计了有无该标签在定量计算HeLa细胞10种miRNA的相对表达量上的区别。以hsa-miR-500a-3p为参照，分别计算各个miRNA相对于hsa-miR-500a-3p的表达量。可以看到，与qPCR的验证结果(同样换算成相对于hsa-miR-500a-3p的表达量)相比，使用本方法的定量化标签去除PCR重复序列后的相关性(图3)比不用本方法去重的相关性(图4)有明显提高。由于这10种miRNA是随机挑选的，且表达量从小到大覆盖了整个miRNA表达谱，因此上述结果能够从整体上表明本方法在miRNA定量上具有优势，而且这个结论具有普遍的适用性。
实施例2：
3’端加接头
1、将总量为1μg，提取自A549细胞的总RNA用超纯水稀释至总体积为5μl，置于200μl薄壁PCR管中；
2、加入1μl衔接子RA3，混匀后于70℃孵育2分钟，立即置于冰上冷却；
3、加入2μl HML(Ligation Buffer),1μl RNase Inhibitor，1μl T4RNA Ligase2，Deletion Mutant混匀，28℃孵育1小时；
4、加入1μl STP(浓度为10mM的Stop oligo溶液)混匀，28℃孵育15分钟；5’端加接头
5、取新的PCR管加入1.1μl衔接子RA5(其中S2是长度为15的简并碱基N15，N15浓度为10μM，S3选自CCGA)，70℃孵育2分钟，反应后立即置于冰上冷却；
6、加入1.1μl 10mM ATP，再加入1.1μl T4RNA连接酶混匀；
7、取3μl的上述Mix加入步骤4的反应液混匀，28℃孵育1小时；
反转录第一链
8、上述反应液加入1μl RNA RT Primer混匀，70℃孵育2分钟，反应后立即置于冰上冷却；
9、.加入2μl 5×First Strand Buffer,0.5μl dNTP Mix(12.5mM),1μl 100mMDTT,1μl RNase Inhibitor和1μl SuperScriptⅡReverse Transcriptase混匀，50℃孵育1小时。
第二链合成及扩增
10、上述反应液中加入:
Figure BDA0002076911870000071
Figure BDA0002076911870000081
11、混匀后进行PCR反应，98℃预变性30秒，98℃变性10秒，60℃退火30秒，72℃延伸15秒，执行11个循环，最后72℃延伸10分钟，4℃保存。12、上述PCR产物进行6％聚丙烯酰胺凝胶电泳，电压120伏，1小时，万分之一Gelred染液染色5分钟，然后置紫外灯下观察并拍照，如附图1所示为PCR产物的凝胶电泳图，割取图2泳道3，4黑框内的156～176bp之间的条带并回收，经定性和定量检测DNA长度和浓度，即可用于Illumina平台测序。
13、根据已知标签(index)序列将上一步产生的测序数据进行拆分，获得(1)中所述的RNA样品对应的测序数据，随后使用FastQC、cutadapt、Trimmomatic对本样品的测序数据进行质控和预处理，接着将步骤(5)中加入衔接子RA5的简并碱基N15以及固定碱基从序列5’端移除，得到的序列再比对到标准人类基因组序列上，获得定位于人类基因组的位置信息。
14、根据上一步获得的序列比对位置以及对应的简并碱基序列，对数据进行PCR重复序列的去除。具体而言，比对到同一位置(即序列的5’和3’端位置相同)的序列若带有相同的简并碱基序列，则视为PCR重复，将其合并为同一条序列(即在后续表达值的计算中只算一条序列)。
15、将上一步中获得的已去除PCR重复的序列的位置与人类基因组中的miRNA位置相比较，确定此样品的miRNA的表达量。其中，miRNA的位置信息取自于miRBase数据库。当某序列的5’端与某miRNA的5’端位置一致的时候，此序列记为此miRNA的测序序列。每个miRNA表达量(单位为RPM,即reads per million)的计算方法为该miRNA测序序列的总量除以该样品的测序总量(样品测序总量的单位为百万)。表3展示了使用本方法定量后表达量排名靠前的10种miRNA，同时也显示了在未使用定量化标签去除PCR重复时这些miRNA在所有miRNA中的表达量排名(第四行)。
表3：表达量排名靠前的10种miRNA列表
Figure BDA0002076911870000082
Figure BDA0002076911870000091
从表3中可以看出，在使用定量化标签去除PCR重复后，miRNA的表达量排名发生了变化，这说明建库过程中某些miRNA具有PCR扩增偏好性，与预期相符。
16、测序后得到的miRNA序列一端会带有长度为15的简并碱基序列。同实施例1，这里分别统计了有无该标签在定量计算A549细胞10种miRNA的相对表达量上的区别(miRNA随机挑选且表达量从小到大覆盖了整个miRNA表达谱)，并与qPCR的结果进行比较。这10个miRNA为：hsa-miR-27b-3p，hsa-miR-28-3p，hsa-miR-3184-3p，hsa-miR-345-5p，hsa-miR-125a-3p，hsa-miR-218-5p，hsa-miR-659-5p，hsa-miR-3121-3p，hsa-miR-204-5p，hsa-miR-105-5p(其中hsa-miR-125a-3p为参照，分别计算各个miRNA相对于hsa-miR-125a-3p的表达量)。同实施例1，这里计算了使用本方法的定量化标签去除PCR重复后的相对表达量与qPCR定量结果的相关性(R＝0.962)，以及不用本方法去重的结果与qPCR结果的相关性(R＝0.937)。与实施例1的结论一致，相关性分析同样表明了本方法在miRNA定量上具有优势。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (7)

1.一种用于miRNA的高通量测序文库制备方法，其特征在于：其包括如下步骤：
(1)提供一用于制备测序文库的常规RNA样品，来源不限，总体积为5μl，总量为10ng～1μg；
(2)提供一用于连接步骤(1)中所述的RNA样品3’端的衔接子RA3，RA3的序列为TGGAATTCTCGGGTGCCAAGG；
(3)提供一用于连接步骤(1)中所述RNA样品5’端的衔接子RA5，衔接子RA5的序列包括固有结构S1-S2-S3，其中S1的碱基序列为GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUC，S2是长度为10～15个的简并碱基N10-15，S3是长度为4个的固定碱基，且S3选自ACGA、CCGA、CGAT、CGTA、CGTT、GACG、GCCA、GCGT、GGAA、GTCG、GTCT中的一种；
(4)取一定量步骤(1)所述的RNA样品与适量步骤(2)所述的衔接子RA3混合进行连接反应，从而形成核酸-衔接子RA3的复合物；
(5)将步骤(4)中获得的核酸-衔接子RA3的复合物与衔接子RA5进行连接反应，从而形成衔接子RA5-核酸-衔接子RA3的复合物；
(6)将步骤(5)获得的衔接子RA5-核酸-衔接子RA3的复合物与特异性结合于衔接子RA3的反转录引物RT Primer混合，进行反转录反应，得到DNA第一链；
(7)将步骤(6)获得的DNA第一链与特异性结合于衔接子RA3相应区域的通用引物RNAprimer1和特异性结合于衔接子RA5相应区域的特异引物RNA primer index混合，进行PCR反应，获得扩增产物；
(8)将步骤(6)获得的扩增产物进行6％聚丙烯酰胺凝胶电泳，胶块经染色后在紫外灯下识别各DNA条带，割取所需的目的DNA片段并回收，此即制备完成的测序文库，经长度范围检测和浓度定量之后即可用于Illunima高通量测序平台直接测序。
2.如权利要求1所述的用于miRNA的高通量测序文库制备方法，其特征在于：所述的常规RNA样品是指从各种来源，包括但不限于使用各类提取方法从各类动植物细胞中获得的总量在10ng～1μg的总RNA，且纯度和质量符合一般RNA要求，不含DNA、蛋白质等其他杂质。
3.如权利要求1所述的用于miRNA的高通量测序文库制备方法，其特征在于：所述的目的DNA片段的长度为miRNA的长度+测序接头的长度+S2的长度+S3的长度，其中，miRNA的长度为15～30bp，测序接头的长度为125bp，S2的长度为10～15bp，S3的长度为4bp。
4.如权利要求1所述的用于miRNA的高通量测序文库制备方法，其特征在于：所述的目的DNA片段的长度为22bp+125bp+S2+4bp±10bp。
5.采用权利要求1的方法制备出来的测序文库。
6.如权利要求5所述的测序文库，其特征在于：测序读长在50bp到150bp之间，测序模式为单端测序或双端测序。
7.应用权利要求1的方法制备出来的测序文库的分析方法，其特征在于：还包括对数据进行PCR重复序列的去除。
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