CN108136389A

CN108136389A - 样品到ngs文库的自动制备

Info

Publication number: CN108136389A
Application number: CN201680042820.4A
Authority: CN
Inventors: N·维尔高威; G·米尔瑟曼
Original assignee: Biocartis SA
Current assignee: Biocartis SA
Priority date: 2015-07-23
Filing date: 2016-07-19
Publication date: 2018-06-08
Also published as: CA2991267A1; JP2018520706A; US20180243719A1; WO2017013103A1; EP3325152A1; EP3325152B1

Abstract

本发明一般性涉及用于自动系统和自动方法的盒，所述自动系统和自动方法用于将生物样品全自动处理成下一代测序就绪的核酸文库。具体而言，本发明涉及流体盒，其包括用于接收生物样品的区室，用于从接收的样品中释放和/或纯化核酸的工具和用于将所述核酸运输至其中可以使用其中提供的试剂从所述核酸制备NGS文库的区室的工具。在具体方面，本发明还涉及用于自动系统和自动方法的盒，所述自动系统和自动方法用于用生物样品制备NGS核酸文库，同时或顺序地对相同的生物样品进行qPCR测定。

Description

样品到NGS文库的自动制备

技术领域

发明背景

高通量测序(相对于慢得多的经典Sanger测序也被称为第二代或下一代测序(NGS))的不断降低的成本正逐渐将这种强大的高覆盖率诊断技术引入临床实践。目前，存在许多不同的NGS策略和平台，包括例如商业上已知的Illumina(Solexa)测序，Roche 454测序，Ion Torrent(Proton/PGM)测序或SOLiD测序。它们全部在细节上不同，但一般涉及许多短的重叠核酸片段或“读取”的产生，通常被修饰以包括测序平台特异性衔接子序列。由核酸的特异性来源制备的这种片段的集合被称为NGS核酸文库。从临床样品制备这种核酸文库的过程是耗时的，并且需要多个预备步骤。也就是说，不仅从样品中回收的核酸必须足够纯净并以足够的量回收，而且为了提供令人满意的遗传信息覆盖率，它们必须满足经常是严格的质量标准并且没有可能阻碍文库制备步骤或测序反应的污染。因此，NGS文库的制备不仅本身仍是劳动密集型的，而且还需要在测序步骤之前额外地评估纯化的核酸或构建的NGS文库的数量和质量的步骤，以确保高质量的结果及其正确解释。因此，尽管为了使NGS更快、更便宜并且需要更少的人力已作出了巨大的改进，但与通过例如靶特异性定量或实时PCR(qPCR)诊断筛选的相比，该技术仍然相对昂贵并且慢得多。

迄今为止，从患者采集的临床样品到NGS就绪的处理大部分是手动完成的，并且至少包括以下步骤：

1.细胞裂解或液化；

2.核酸的释放或纯化；

3.通过本领域已知的任何工具(例如吸光度(光密度)测量，琼脂糖凝胶电泳，用picogreen等荧光DNA结合染料进行荧光测定或不同类型的质量控制PCR(参见Buehler等，2010))测定核酸的质量和数量；

4.根据选择NGS平台的策略制备NGS文库；和

5.通常但任选地，通过本领域已知的任何工具来测定DNA文库的质量和数量。

诸如Illumina之类的一些NGS提供商尽其最大努力来简化上述工作流程，其示例在2015年1月由Illumina NeoPrep引入，其从手动分离和质量验证的DNA自动进行文库制备步骤(步骤4)。然而，迄今为止还没有关于样品到NGS就绪文库的直接、快速和自动处理的操作方案，特别是没有这样提供伴随的核酸质量和数量评估。

本发明通过提供用于将实际上任何类型的生物样品(包括血液，粪便，尿液，FFPE，拭子等)自动处理成NG测序就绪文库的流体盒来解决这个和其他需要。本发明的盒包括以下必需的全部工具：自动样品液化，然后是核酸释放和/或纯化，然后从释放和/或纯化的核酸的至少一部分制备NGS就绪文库，而从样品引入盒的那一刻起无需任何人工干预。重要的是，本发明的盒还提供了自动qPCR分析所需的所有工具，其可以与从与用于NGS文库本身相同的释放和/或纯化的核酸的另一部分进行NGS文库制备平行或顺序地进行。这样的qPCR可以是质量控制(QC)qPCR，用于在文库制备之前评估从提供到盒中的样品中纯化的核酸的质量，或者用于在文库制备之后和在对其进行NGS分析之前评估文库的质量。或者，这样的qPCR可以是用于筛选临床样品中的靶可操作性突变的测定qPCR。

通过从一个和相同处理的生物样品自动且伴随生成(a)NGS就绪文库连同(b)其质量评价并进行(c)靶qPCR筛选，不仅将节省时间和训练有素的人力资源，而且将确保更好地管理珍贵和有限量的临床样品。这种解决方案的另一个优点是其能够立即使用获得自实时监测的QC qPCR反应的信息用于指示核酸数量和质量的能力，和由此其对NGS文库生成的适用性。进一步的优点是能够直接比较测定qPCR结果和从相同时间(即同时)或仅仅很短时间之后(即顺序地)通过与所述qPCR在同一机器上伴随产生的文库的NGS分析获得的结果并且重要的是通过使用相同处理的核酸的相同库的能力。此外，通过如此去除qPCR分析和文库形式的游离核酸稳定化之间的通常时间上的分开，可以进一步最小化qPCR和NGS结果之间任何潜在的分析分歧，其源自生物样品或游离核酸的延长的存储和潜在的降解。

因此，本发明的盒和方法不仅允许自动的样品至NGS文库生成的同时潜在验证样品的质量或文库的质量，而且还提供了在NGS深度基因组分析之前立即高深度发现驱动突变的工具。本发明的这个优点和其它优点在后续中给出。

发明概述

在所附的独立权利要求中定义了本发明。在从属权利要求中定义了优选实施方案。具体而言，本发明涉及用于自动处理生物样品的盒，所述盒包括：

-用于接收生物样品的样品区室；

-用于从接收于样品区室中的生物样品中释放或纯化核酸的工具，所述工具能够与所述样品区室流体连通；

-位于样品区室下游和用于释放或纯化核酸的工具下游的用于制备核酸文库的文库区室，文库区室被配置为接收释放或纯化的核酸的至少一部分并且包括用于制备核酸文库的试剂。

在优选的实施方案中，上述盒的特征在于文库区室适于：

-从接收到文库区室的释放或纯化的核酸部分产生核酸片段，和适于

-将寡核苷酸衔接子附接到所述产生的核酸片段的至少一个、优选两个末端。

在进一步的方面，本发明还提供用于从生物样品制备下一代测序(NGS)核酸文库的自动方法，所述方法包括以下步骤：

a)接收生物样品；

b)从所接收的生物样品中释放或纯化核酸的至少一部分；

c)将释放或纯化的核酸的至少一部分提供到用于制备NGS核酸文库并包括用于制备核酸文库的试剂的文库区室；和

d)制备NGS核酸文库，所述制备在接收生物样品后不需要任何人工干预；

其中至少步骤b)至d)在自动系统上进行。

最后，本发明还提供根据本发明的盒用于从生物样品自动制备下一代测序(NGS)文库的用途。

定义

在本文中，术语“定量PCR”或简称为“qPCR”给出基于聚合酶链式反应(PCR)的实验区室技术的定义，其用于扩增并同时检测或定量靶向的DNA分子。与反应产物在其结束时(即热循环结束后)被检测到的标准PCR相比，qPCR的关键特征是当反应“实时”进行时，在热循环期间检测到DNA产物；因此，qPCR的替代名称为“实时PCR”。目前存在许多不同类型的qPCR。例如，当从逆转录(RT)步骤开始时，可以使用qPCR来定量信使RNA的数量，然后qPCR称为逆转录酶qPCR或RT-qPCR。如本文所用，术语“定量PCR”或简称为“qPCR”将优先于术语“实时PCR”或“RT-PCR”使用，以避免与逆转录PCR混淆，逆转录PCR也常常缩写为RT-PCR。大多数qPCR使用实时检测产物扩增的两种最常用方法之一：(a)非特异性荧光染料嵌入任何双链DNA，或(2)用荧光报道分子标记的由寡核苷酸组成的序列特异性DNA探针，其只有在探针与其互补的靶序列杂交后才能检测到。在热循环期间产生的荧光信号由适当的光学检测系统检测，并且从通过背景阈值的时刻开始追踪，直到反应达到平台。靶序列的拷贝数可以使用相对或绝对定量策略来估算，典型地通过分析所获得的扩增曲线的形状(标准曲线策略)或通过确定信号何时升高超过某个阈值(通常称为Ct值，但是有时也称为Cp值或Cq值)。在相对定量中，使用Ct或标准曲线分析在给定样品中估算的靶核酸水平表示为相对于另一参考样品(例如未处理的对照样品)中的相同靶标获得的值。相反，在绝对定量中，qPCR信号与使用标准曲线输入拷贝数相关，或者也可以根据更近的数字PCR方法计算。目前，第一种策略仍然更为普遍，并基于通过比较获得的值与之前制作的标准曲线来估算靶DNA量。这些和其他qPCR定量策略在本领域中是广泛已知的，并且它们的计算可以根据给定的应用和qPCR系统有更小或更大的不同。

如本文所用，术语“用于进行定量PCR的工具”应被理解为用于执行qPCR的试剂和元件的最小必需配置。它们通常将包括允许在从核酸源接收的核酸模板的实时PCR热循环中可检测的任何试剂。取决于qPCR的类型，此类试剂包括但不限于PCR级的聚合酶，至少一个引物组，可检测的染料或探针，dNTP，PCR缓冲液等。此外，“用于进行定量PCR的工具”将通常还包括本领域已知的任何标准，最小的部件组装通常包括但不限于以下内容：(1)合适的区室(还称为“热循环qPCR区室”)，其中可以发生可实时检测的热循环。此类区室可以例如由适于扩增核酸的腔室形成，即由合适的材料制成并提供足够的内部温度调节，并且还包括至少一个允许实时检测在这种扩增期间产生的信号的壁，例如，透光的壁。此外，(2)用于改变该区室或其他区室中的温度的工具，如从各种现有的热循环机广泛已知的。然后，(3)用于检测在qPCR热循环期间产生的信号的工具，如耦合到计算机的光学检测器等。简而言之，这种最小的组装通常将包括本领域任何已知的能够启动和维持在热循环qPCR区室中进行热循环反应，调整和调节温度以确保其中的稳定热循环条件等的系统；此外，它还将包括任何适当的检测装置，用于数据处理的工具(例如，可选连接到数据库的计算机)以及允许实时读取和监测qPCR反应的热循环的输出系统(通常是在适当的图形用户界面中显示反应进程的计算机屏幕)；以及适于操作机器和/或显示并且可能还帮助解释所获得的结果的任何软件包。

此外，如本文所用，术语“测序文库”或“测序核酸文库”是指一组多核苷酸(最经常是DNA型的多核苷酸)准备用于序列分析，特别是使用任何目前已知的下一代测序(NGS)策略。与此相一致，在本发明目前优选的实施方案中，测序文库由多个PCR扩增的与给定的所选NGS策略相容的衔接子分子(或衔接子序列)融合的DNA分子组成。在van Dijk等人ExpCell Res.2014的综述中可以找到关于测序文库类型及其制备方式的全面综述。

类似地，如本文所用，术语“用于制备核酸文库的工具”应理解为用于制备适合于NGS的核酸文库的最小必需元件，其包括至少一个区室，其中从核酸源接收的核酸可以经受核酸文库制备；用于文库制备的最小必需试剂(例如适当的酶或酶的混合物，NGS策略特异性衔接子序列或衔接子，缓冲液等)；也是适用于例如本领域已知的机器和软件的标准，例如启动和/或指导文库制备程序。如本文所用，术语“制备核酸文库所必需的试剂”应被理解为本领域已知的足以制备可用于NGS的核酸文库的任何试剂混合物。优选地，“制备核酸文库所必需的试剂”可以被解释为本领域已知的足以制备可直接用于NGS的核酸文库的任何混合物，即包括与给定的所选NGS策略相容的NGS特异性衔接子序列。这样的试剂可以包括引物序列，其中NGS特异性衔接子序列被包括在引物序列中，并且试剂混合物包括允许用这样的引物进行文库PCR的酶，底物和缓冲条件。或者，此类NGS特异性衔接子序列可以适合于连接，并且可以在还包括酶连接酶的试剂混合物中提供。

此外，术语“用于从生物样品中释放或纯化核酸的工具”应理解为本领域已知的任何多种或化学试剂和/或物理元件，已知用于从生物样品中的细胞或其他结构释放核酸，并且在纯化的情况下，通常在水溶液中将所述核酸与不希望的样品碎片充分分离成可接受的纯形式(其中术语“可接受”取决于这种纯化的核酸的进一步目的)。适用于这样的目的的化学试剂包括例如本领域任何已知的用于组织或细胞破碎和/或液化并因此将其中所含的核酸释放到溶液中的去污剂和/或缓冲剂，包括去污剂，离液剂，核酸酶抑制剂等。类似地，本领域已知用于核酸释放/纯化的目的的各种样品处理方法的物理元件包括例如，二氧化硅固体载体如旋转柱树脂，硅胶膜，珠等；进一步的机械破碎机或产生破坏性能量的机器，如超声波发生器等。

然后，如本文所用，术语“核酸”及其等同物“多核苷酸”是指核苷酸亚单位之间包括磷酸二酯键的核糖核苷或脱氧核糖核苷的聚合物。核酸包括但不限于DNA和RNA，例如包括基因组DNA，线粒体或meDNA，cDNA，mRNA，rRNA，tRNA，hnRNA，微RNA，lncRNA及其各种修饰形式。核酸最常见地可以从天然源获得，如从不同类型的生物获得的生物样品。另一方面，核酸也可以在任何已知的人工设计的方法(例如如PCR的核酸扩增方法)中合成、重组或以其它方式产生。

如本文所用，术语“核酸源”应理解为包括或预期包括核酸的液体或固体的任何物质。核酸源可以例如是包括合成或重组核酸的人工产生的溶液，例如含有连接产物、电泳标志物(所谓的“梯状物”)，引物原液等的许多其他溶液中。然而，最常见的核酸源可以是从生物或由其形成或衍生的细胞获得的生物样品，优选从患者获得的临床样品。

如本文所用，术语“生物样品”或简称为“样品”旨在包括含有核酸和/或细胞物质的各种生物源，例如包括：例如哺乳动物细胞还包括真核微生物的细胞培养物，从患者获得的体液，体液沉淀物，灌洗标本，细针抽出物，活检样品，组织样品，癌细胞，其他类型的细胞，被测试和/或治疗疾病或感染来自个体的组织的细胞或体外培养细胞，或法医样品。体液样品的非限制性实例包括全血，骨髓，脑脊液(CSF)，腹膜液，胸膜液，淋巴液，血清，血浆，尿液，乳糜，粪便，精液，痰，乳头抽出物，唾液，拭子标本，洗涤液或灌洗液和/或刷子标本。

一旦将生物样品提供到系统中或在进行本发明的方法期间，通常将其与组合物接触以提供其中释放核酸的裂解物。如本文所用，“接触”是指将样品和组合物放在一起，暴露，温育或混合。“释放(releasing)”是指释放(liberating)，获得和/或逆转交联。为了从样品中释放核酸，可能需要组合物的蛋白酶活性和pH缓冲作用。释放可能需要来自组合物潜在的除了研究样品中存在的核酸以外的组分的沉淀活性和去除/溶解固定剂。释放可能需要如加热或高强度聚焦超声(HIFU)的条件。在根据本发明的精神的一个实施方案中，将生物样品引入与自动系统如诊断分析仪相容的盒中，其中涉及与各种溶液接触和释放核酸的样品处理步骤发生。

此外，术语“盒”应理解为区室和/或通道的独立(self-contained)组件，其形成为单个物体，该单个物体可作为一个装配件在适合于接收或连接到这样的盒的较大的仪器的内部或外部被转移或移动。容纳在盒中的一些部件可以被牢固连接，而其他部件可以活动连接并且可以相对于盒的其他部件移动。相似地，如本文所用，术语“流体盒”应理解为包括适于处理、加工、排出或分析流体、优选液体的至少一个区室或通道的盒。在本发明的优选实施方案中，盒可另外装备有物理或机械操纵其中容纳的样品的帮助其裂解和液化的工具。例如，有利的盒可以包括单向入口阀，隔膜，一个或多个过滤器或亲和膜，溢流和/或与HIFU治疗相容的区域。此外，有利的盒可以包括用于混合和/或适当分配容纳在其中的液体的工具(例如一个或多个柱塞或歧管)。接下来，有利的盒可以包括多个反应腔室和/或废物腔室，可以提供将所接收的样品完全容纳以与外部环境分开，或者由诸如塑料和/或其他聚合物的可负担得起的材料制成。在WO2007004103中给出了合适的盒的实例。有利地，流体盒可以是微流体盒。在流体盒的上下文中，术语“下游”和“上游”可以定义为与流体在这种盒中流动的方向有关。也就是说，流体流向同一盒中的第二部分的盒中的流体路径的一部分被解释为定位于后者的上游。相似地，流体稍后到达的部分相对于所述流体较早通过的部分位于下游。

一般来说，如本文所用，术语“流体”或有时“微流体”是指处理流体的行为，控制和操纵的系统和布置，所述流体在几何上被约束到小的、通常至少一个或两个维度(例如宽度和高度或通道)的亚毫米级。这种小体积的流体以需要小尺寸和低能量消耗的微尺度被移动、混合、分开或以其它方式处理。微流体系统包括诸如微气动系统(压力源、液体泵、微型阀等)的结构和用于处理微、纳和皮升体积(微流体通道等)的微流体结构。在EP1896180、EP1904234和EP2419705中已经描述了示例性的微流体系统，并且因此可以并入在本文提出的本发明的某些实施方案中。

附图简要说明

为了更全面地理解本发明的性质，参考以下结合附图的详细描述，其中：

图1：在电泳凝胶上显示5条DNA条带，对应于在液化FFPE样品上进行的5重(plex)qPCR的5种产物。

图2：显示图1所示5重qPCR的5种产物的qPCR扩增曲线。

图3：显示5重qPCR产物中的每一种的至少4次重复的Cq拷贝数直方图。

图4：显示5重qPCR产物中的每一种的R平方值确定。

图5：显示5重qPCR区分不同程度的核酸断裂的能力。图A显示了从具有相对完整的DNA的3个FFPE样品获得的结果；图B显示来自另一组具有较高断裂水平的3个FFPE样品的结果；最后，图C显示来自含有严重断裂DNA的6个不同FFPE样品的结果。

图6：显示对三个FFPE样品进行的能够辨别wt和V600K/R/M BRAF突变体的BRAF特异性qPCR的结果，所述三个FFPE样品各自掺入含有编码wt BRAF、V600M突变BRAF或V600K和T149C双突变BRAF的序列的质粒。

图7：显示使用文库PCR、用含有NGS特异性衔接子的引物的一种NGS就绪文库类型的制备原理。代表了野生型(Seq ID NO.:1)、V600M(Seq ID NO.:2)和V600K+V1794C(SeqID NO.:3)的序列。

图8：显示对三个FFPE样品进行NGS的结果，每个样品掺入含有编码wt BRAF、V600M突变BRAF或V600K和T149C双突变BRAF的序列的质粒。

图9：显示根据本发明的优化的样品到结果工作流程的示例。

发明详述

本发明总体上涉及从生物样品中自动制备下一代测序(NGS)文库。具体而言，本发明涉及从任何类型的样品(血液，粪便，尿液，FFPE，拭子，...)以自动方式生成NGS文库的通用方法，并且可以使用QC qPCR自动验证由此获得文库或用于其构建的核酸的数量和质量，和可以使用测定qPCR从所述核酸几乎即时获得临床信息。如果是后者，则需要注意的是，NGS文库制备和qPCR都使用完全同样且相同处理的核酸库，其还提供了用于将由测定qPCR筛选的关键靶突变的诊断信息与后来从NGS数据中获得更广泛的遗传图谱直接比较的独特工具。

具体而言，本发明提供本发明提供了一种用于在自动系统上自动处理生物样品并可与所述系统接合的流体盒，该盒包括：

-用于接收生物样品的样品区室；

-用于从接收于样品区室中的生物样品中释放或纯化核酸的工具，所述工具能够通过通道连接到所述样品区室或通过完全或部分地位于样品区室内与所述样品区室流体连通；

-位于样品区室下游和用于释放或纯化核酸的工具下游的用于制备核酸文库的文库区室，文库区室被配置为接收释放或纯化的核酸的至少一部分(例如，作为将通道中的提取的核酸引导至文库区室的泵送动作的结果)，并且包括用于制备核酸文库的试剂，例如酶，NGS特异性接头，任何缓冲溶液等。

本发明的目的之一是提供用于生物样品到NGS文库处理的工具，该工具是快速的、易于使用的，并且需要最少的或基本上不需要人工处理，至少从样品是插入本发明的盒中，盒与其操作的自动系统接合，并且自动系统接受指令运行自动文库制备程序。因此，提供一种盒或平台也是本发明的目的之一，其中文库制备过程从提供生物样品的那一刻起不需要任何人工干预(例如插入到盒中或以其他方式引入与盒相容的自动系统)，自动处理由用户发起。

有利的是，本发明的盒不仅自动制备NGS文库，而且能够同时提供与所述文库相关的数量和质量信息，和/或还能够进行样品的一些临床表征，其中所述文库从所述样品产生。为了实现这一点，在本发明中进一步提供了盒，其中平行于文库制备，实时PCR(qPCR)可以被热循环和监测，例如通过透明的壁。因此，在优选的实施方案中，提供了盒，其进一步包括位于样品区室下游和用于释放或纯化核酸的工具下游并且被配置为接收释放的或纯化的核酸的至少一部分或在文库区室中制备的核酸文库的至少一部分(例如通过泵送通过通道)的至少一个热循环qPCR区室，其中所述热循环qPCR区室适于扩增核酸并且允许检测在这样的扩增期间产生的信号并且包括用于进行qPCR的试剂，例如至少一组引物，信号产生染料或探针，DNA聚合酶，dNTP，缓冲液等。

优选地，在热循环qPCR区室中进行的qPCR是多重qPCR，即在单个反应中同时扩增和检测多个序列的qPCR。多重qPCR在单个qPCR混合物中使用多个引物组，并从而在一个管、腔室或其他类型的qPCR热循环区室中产生多个产物。使用两个引物组(通常是引物对)的多重qPCR称为双重qPCR，通常表示为2重qPCR(2plex)。类似地，具有三个引物组的多重qPCR是三重qPCR或3重qPCR。在本发明中优选的多重qPCR配置包括2重qPCR，3重qPCR，4重qPCR，5重qPCR，6重qPCR，7重qPCR或更多重qPCR。

因此，优选地，用于进行qPCR的试剂包括多个引物组，每个引物组涉及不同的扩增子，其中所述多个优选为2、3、4、5、6、7个或更多个。

本领域众所周知，设计稳健的多重qPCR并不容易，因为该测定要求多个单独的引物组(通常是引物对)将在一个反应管中并因而在单组反应条件下特异地靶向其独特的扩增子。引物设计通常会考虑引物纯度(长度为17到30个碱基)；平衡富含G/C和A/T的结构域(20到70％G+C)；设定解链温度在55-80℃；避免产生互补的3'末端碱基对；避免引物自身互补；并且避免在引物3'末端的1个或多个C或G，特别是对复杂样品如真核生物基因组DNA进行多重qPCR。有几种基于网络的引物设计软件工具可以帮助设计PCR引物(如Primer3Plus)。其他因素，例如引物的相对浓度，PCR缓冲液组分的正确浓度，氯化镁和脱氧核苷酸浓度之间的平衡，循环温度和DNA热循环聚合酶等也经常必须被微调以成功进行多重qPCR。值得注意的是，在多重PCR中找到退火温度和缓冲液浓度的最佳组合是获得高度特异性扩增产物的关键。氯化镁浓度需要与dNTP的量成正比，而每个靶的引物浓度应该相对稳定。选择合适的聚合酶也会影响反应的结果。理论上，可以用标准PCR聚合酶进行多重PCR；然而在实践中，优选使用高度进行性和灵敏的DNA聚合酶，如GoTaq或AmpliTaq。对于特别灵敏的应用，多重qPCR的进一步修饰，例如使用DNA酶或MNA酶的修饰对于本发明的应用可能是有利的。本文提及的因素和多重优化策略的列表绝不被解释为充分的，这将被本领域技术人员立即认识到。

在本发明的优选实施方案中，本发明的系统和方法中qPCR的定量基于标准曲线法；然而，也可以使用其他定量策略，正如本领域技术人员将立即认识到的那样。

类似地，在本发明的系统和方法中可以使用许多不同的一般类型的荧光染料或检测探针。在优选的实施方案中，将使用序列特异性探针，例如选自外切核酸酶探针，杂交探针或分子信标。这样的探针不仅增加了测定的特异性，而且也是能够多重应用的关键。如实施例中所示，使用Taqman探针成功地应用了本发明的方法，但是其它探针也是合适的。

有利的是，与NGS文库制备一起，本发明的盒提供了其中提供的临床样品的同时qPCR筛选存在治疗可操作性等位基因或疾病相关序列。众多中的这样的序列的一些例子包括与癌症相关的突变基因序列或指示持续感染致病生物体的外源致病序列。与此一致，在优选的实施方案中，提供了盒，其中用于进行qPCR的试剂包括用于扩增至少一种疾病相关靶核酸序列的至少一组引物，优选多组引物。

在本发明的进一步方面，本文提供的盒还可以有利地包括用于评估纯化的核酸或已经获得的文库的质量的工具。因此，在另一个优选的实施方案中，提供了盒，其中用于进行qPCR的试剂包括用于进行质量控制(QC)qPCR的至少一组引物，优选多组引物。原则上，可以从任何基因或基因组区域中选择靶用于进行QC qPCR。但是，对于像癌症这样的遗传不稳定的疾病的诊断，最好避免疾病敏感的区域，这些区域可能发生序列突变或者发生拷贝数的变化。因此，在优选实施方案中，质量控制多重qPCR的靶选自单拷贝基因的内部外显子(intra-exon)序列，例如看家基因。所述解决方案的另一个优点是针对内部外显子区域的相同靶序列可用于评估作为文库材料的DNA和RNA质量。由于后者，当需要从一个样品测序基因组和转录组二者时，本发明的质量控制多重qPCR多重性的这种设计是特别有用的，这需要基于DNA和RNA的构建并因此也对其质量控制。因此，在一个优选的实施方案中，待用于本发明的系统和方法的质量控制多重qPCR靶向单个拷贝基因中的至少一个内部外显子序列。可能靶向一个，两个，三个，四个，五个，六个，七个或更多个单拷贝基因中的一个，两个，三个，四个，五个，六个，七个或更多个内部外显子序列。作为管家基因的替代，在DNA文库构建中，重复序列(例如LINE或SINE如Alu元件)可以是感兴趣的靶标。作为实施例部分中显示的非限制性实例，成功地对RNaseP，HPRT1，β-肌动蛋白，TRFC和ABCB1基因的内部外显子序列实施本发明的方法。

在一个优选的实施方案中，除了扩增靶疾病相关核酸序列的测定qPCR之外，本发明的盒可以进行QC qPCR。因此，在有利的实施方案中，提供了盒，其进一步包括位于样品区室下游和用于释放或纯化核酸的工具下游的至少一个第二热循环qPCR区室，所述至少一个第二热循环qPCR区室被配置为以接收文库区室中制备的释放或纯化的核酸的至少一部分或核酸文库的一部分，并且包括用于进行核酸质量控制(QC)qPCR的至少一组引物。

已经观察到，产生不同大小的多重qPCR扩增子特别适用于评估核酸质量。因此，在另一个优选的实施方案中，提供了盒，其包括用于产生不同大小的扩增子的多组引物。扩增子的大小范围从较小的尺寸Ax变化到较大的尺寸Ay(x<y)，通常在50-600bp的大小范围内。优选地，较小的Ax尺寸范围从50到110bp，并且可以具有在该范围之间的任何长度。优选地，Ax在60bp+/-10bp之间。如本文在实施例中进一步显示的，Ax是63bp或105bp。优选地，较大的Ay大小范围从300到550bp，并且可以是在该范围之间的任何长度。如实施例中进一步显示的，Ay是504bp(例如对于TRFC基因)或可选地318bp(例如对于β-肌动蛋白基因)。在RNA测序的情况下，特别是在聚焦于微RNA(例如15-35bp大小范围)的应用中，可能需要相应地降低较小的Ax大小范围。如本领域技术人员将会理解的，在用于本发明目的的多重qPCR设计期间，可以根据所选择的NGS应用来有利地选择优选的扩增子大小，以提供关于根据扩增子的长度NGS覆盖的最充分估算。

在优选的实施方案中，生物样品是人临床样品。该临床样品是新鲜样品，新鲜冷冻样品，细针抽出物，已经处理过的用于保存并且可以含有由于固定处理而引起的反应位点的交联的样品，与蜡接触或蜡包埋的样品，FFPE切片形式的FFPE样品，液体样品如尿液样品，血液样品，血清样品或任何其他临床样品。

一旦被引入到本发明的盒中，通常通过使生物样品与提供核酸释放的组合物接触来处理生物样品。在优选的实施方案中，组合物被优化用于微流体分析仪中，并且优选含有表面活性剂而不是有机溶剂。与所述组合物混合通常也有利于将这种处理过的样品通过微流体系统输送。在其中样品是FFPE样品的实施方案中，包括在所述组合物中的表面活性剂优选是非离子型的。从FFPE样品获得的核酸通常含有影响核酸完整性的核苷酸与核苷酸和核苷酸与蛋白质的交联，碱基修饰和其他化学修饰。本发明的优选方法整合了非离子表面活性剂，并允许在不使用有机溶剂的情况下自动去除包埋的蜡并释放组分。这是特别有利的，因为它将释放的核酸置于与需要酶促活性的下调应用(downscale application)(例如经由PCR的核酸扩增)接合的条件和环境中。在一个实施方案中，从样品释放的裂解物和/或组分将在使用微流体系统的诊断分析仪中进一步处理。

任选地，释放的核酸以足够纯足以直接用作根据本发明的qPCR和核酸文库构建的模板的形式提供。在优选的实施方案中，核酸释放工具以流体或微流体配置方式执行其功能。在这种情况下，形成这样的核酸释放工具的元件可以包括一系列连续的或以其他方式流体互连的区室，如腔室或通道，其中至少一些区室提供有诸如裂解缓冲液，酶溶液，提取缓冲液，结合缓冲液和/或洗涤缓冲液；或任选地包括任何本领域已知的物理屏障，例如过滤器或高亲和树脂，其促进机械样品清除或核酸结合，洗涤和释放等过程。用于释放核酸的这种和可选的工具在本领域中是众所周知的，因此在此不作更详细的讨论。

通常，本发明的流体盒将包括用于在至少文库区室和热循环qPCR区室之间分开从接收于其中的样品释放和/或纯化的核酸的工具。这种工具可以例如包括两个分开的通道，从核酸源接收区室或在核酸释放过程的最后步骤中从所述源释放核酸的区室分别延伸进入热循环qPCR区室和进入文库区室。为了主动地在选择的区室之间输送核酸，本发明的自动系统可以提供能够将所需量的流体推入或抽入规定方向的压力梯度。通过泵，抽出装置，歧管等产生这样的压力梯度被广泛用于当前的微流体系统中，并且因此在本领域中是众所周知的。

如本领域技术人员将会理解的，适于本发明的流体或微流体盒可以含有至少两个包括热循环qPCR区室和文库区室的反应腔室以及一个或多个流体腔室。一些流体腔室可容纳用于从样品产生裂解物的流体。其他腔室可容纳如清洗液和扩增溶液的流体。分开的反应腔室用作热循环qPCR区室和文库区室。构造成用作热循环qPCR区室的腔室包括许多引物组，连同进行qPCR所需的其他扩增试剂和酶。构造成用作文库区室的另一腔室适于进行构建用于选择的NGS应用的核酸文库的步骤。样品的一部分将被转移到反应腔室，并且为了使得这种转移成为可能，将腔室连接到一个或多个流体通道。在这些流体通道中的至少一个、但优选每个流体通道中可以设置阀工具，所述阀工具优选地正常关闭流体通道，但是在阀工具的致动下打开流体通道，从而使相应的两个腔室流体连通。阀工具可以被设计成单向阀。

在另一实施方案中，本发明盒的的文库区室和一个或多个热循环qPCR区室可以在接合盒的自动系统中被同时或顺序地操作。这意味着可以设想三种操作模式：(i)一旦核酸进入它们，两个区室都运行，因此文库制备是独立于qPCR的并且与qPCR平行进行；(ii)首先，完成qPCR，然后制成文库；像这样，一旦qPCR的结果已知并且可以取决于这些结果，就制定制备用于测序的文库的决定；(iii)首先，制成文库，然后对文库进行qPCR以验证文库的质量。

上述选项(i)描述了同时操作，其中从核酸样品的一部分制备用于NGS的文库与对同一核酸样品的另一部分的qPCR测定同时进行，并且两者都是优选在基于盒的微流体系统中平行进行。如本文所使用的，术语“同时”或“平行”是指同时发生或完成。在这样的配置中，在对来自核酸样品的一部分进行qPCR的同时，从由来自同一核酸样品的另一部分构建用于NGS应用的核酸文库。换句话说，在同时操作期间，通过qPCR进行的样品分析和文库构建都同时由本发明的自动系统执行。

相反，上面的选项(ii)和(iii)二者都可以被描述为“顺序地”操作。在顺序操作的一个可能的实施方案中，至少两个热循环qPCR区室在本发明的自动系统上操作。例如，可以完成第一qPCR以读取感兴趣的标志物的表达并验证进入系统的核酸源的质量。在第一qPCR之后(连续)，或为了节省时间与所述第一qPCR平行地(同时)构建文库。然后，可以对这样构建的文库进行第二或对照qPCR以验证其质量是否足以使其经受进一步的应用，例如测序。

关于NG测序文库的制备或构建，目前存在用于生成测序就绪文库的许多不同方式，并且其选择自然取决于打算执行哪种NGS策略。一般而言，NGS文库生成涉及产生与给定的NGS相容的核酸片段。因此，在优选实施方案中，提供了盒，其中用于制备核酸文库的试剂允许：

-从接收到文库区室的释放或纯化的核酸部分产生核酸片段，和

对于大多数可商业获得的NGS平台，核酸片段的扩增对于产生足够的测序模板拷贝是必需的。因此，优选地，提供盒，其中核酸片段的产生是在还称为“文库PCR”的PCR中进行的，并且其中通过在所述文库PCR中使用的至少一种引物的序列中包括衔接子序列来将寡核苷酸衔接子附接至文库PCR产生的核酸片段。合适的文库PCR是本领域已知的并且包括诸如桥式扩增或乳液PCR的方法。

如上所述，DNA测序、RNA测序和例如基于测序的甲基化分析的其他应用需要核酸文库构建。RNA测序(RNA-seq)是一种使用深度测序技术研究生物的转录组的方法。总RNA通常只含有非常小百分比的编码或功能性RNA；核糖体RNA(rRNA：高达总RNA的80-90％)和较小程度的转运RNA(tRNA)组成了样品中的大部分RNA。通常，为了不对重复性rRNA序列使用80-90％的测序能力，可以在测序之前从样品中去除rRNA。去除rRNA后的RNA被制成文库。这涉及通过从RNA(或断裂的RNA)逆转录产生双链cDNA。这种双链cDNA随后可以在整个剩余的文库构建过程中作为正常的基因组DNA处理，包括将其与合适的NGS策略特异性衔接子连接起来。

由于本发明的盒提供了一种用于从包括NGS在内的多种测定生成平行数据集的方便方式，通过QC qPCR的样品质量评估以及可能的几个靶特异性qPCR测定，在特别实用的实施方案中，本发明的盒可以有利地配备能够存储盒特异性或患者特异性信息的元件，即标识，这将允许容易地跟踪一个病人在一个盒上或对样品进行的所有测定。这样的标识例如可以是盒特异性的代码或者含有诸如盒号、其批号或系列号、生产和过期日期、盒携带的靶特异性测定的类型等的数据的条形码。或者，标识可以是不仅可以读取，而且可写入的存储介质，如光盘或微芯片，其中可以随意引入、存储和随后取回患者特异性数据(如姓名、年龄、测定日期等)，以便于自动识别患者并尽量减少样品的混合。标识可以被方便地扫描或以其他方式引入接合和处理这种盒的自动系统，这将节省操作员在键入所需数据时执行运行的时间，并且还消除工作流程中可能出现可引入人为错误的阶段。此外，由于运行与一个特异性盒标识或患者标识相关联，对同一患者的样品进行的不同测试可以变得易于追溯，可检索，并且也可以以自动方式相互关联。因此，在有利的实施方案中，本发明提供了根据前述实施方案的盒，进一步包括用于存储盒特异性信息的盒特异性标识，如独特的代码、条形码或微芯片等。

另一方面，提供了盒，其进一步包括位于所述样品区室下游的回收区室，所述回收区室提供用于回收以下任一项：

-接收到样品区室中的生物样品的一部分；

-从接收到样品区室中的生物样品中释放或纯化的核酸的一部分；

-在文库区室中制备的核酸文库的至少一部分

这样的回收区室可以包括或者简单地由另一个腔室构成，其中在本发明的系统运行期间不发生反应。这样的回收将优选地从本自动系统或自动系统的盒的外部可容易地使用。例如，它可以包括由可刺穿材料(例如箔或膜)制成的壁，其可以被注射器的针或移液管刺穿，从而允许抽出其内容物。或者，可以通过抽出和遵循由用户通过本发明的自动系统的界面给出的指令的方式来选择性地使回收区室与上述中的任何一个流体连通和填充。

在可能的实施方案中，这样的回收区室可以是外部容器，例如塑料管或小瓶，可与本发明的自动系统接合或连接。在这种情况下，

-容纳引入到盒中的生物样品的至少一部分或从所述样品释放的至少一部分核酸的区室；

-文库区室；

-至少一个热循环qPCR区室；

上述区室中任何一个可以包括能够使其与回收区室流体连通的结构(例如像通道或可与形成通道的元件接合的区域的延伸部)，所述流体连通是通过能够将上述所列区室中任何一个中所包括的至少一部分内容物运送入回收区室的任何方式进行的。

在有利的实施方案中，文库区室可以包括能够将其与其中进行NGS的区室直接流体连通的结构，可能其中所述区室包括在作为处理盒的自动系统的一部分的另一个包括自动测序仪的子系统中。

在进一步的方面，本发明还提供了一种从生物样品制备下一代测序(NGS)核酸文库的自动方法，所述方法包括以下步骤：

a)接收生物样品；

b)从所接收的生物样品中释放或纯化至少一部分核酸；

c)将释放或纯化的核酸的至少一部分提供到文库区室以制备NGS核酸文库并包括用于制备核酸文库的试剂；和

d)制备NGS核酸文库；

其中至少在所述自动系统中接收到生物样品之后，至少步骤b)到d)在自动系统上进行而无需任何人工干预。

在优选的实施方案中，制备NGS核酸文库的步骤通过PCR进行。

在根据本发明的方法的上述实施方案的另一个特别优选的实施方案中，所述方法进一步包括在所述自动系统上相对于制备NGS核酸文库的步骤顺序地或同时进行qPCR的步骤，其中所述qPCR是在热循环qPCR区室中对释放或纯化的核酸的第二部分进行的，所述热循环qPCR区域适于扩增核酸并允许检测在这样的扩增期间产生的信号。

如上所解释的，本发明的方面之一涉及使用从相同样品获得的核酸制备NGS文库同时运行测定qPCR和/或QC qPCR。因此，另一个实施方案提供了一种方法，其中所述至少一种qPCR扩增至少一种疾病相关的靶核酸序列，或者是质量控制(QC)qPCR。

在特别优选的实施方案中，本发明的方法在可与自动系统接合的盒上进行。因此，最优选前述从样品获得核酸，NGS文库制备，测定qPCR和QC PCR的步骤在一个盒中执行，优选是可与分析仪型设备接合的流体或微流体盒，使得该盒是用于执行根据本发明的方法的步骤的独立的一次性平台。在这样的有利实施方方案中，为了存储考虑，执行本发明的方法所需的所有试剂优选以干燥或冻干的形式被预先置于该盒内。

在另一个优选的实施方式中，为了如上所述的有利考虑，理想地提供了一种方法，其中，所述盒包括用于存储盒特异性信息的盒特异性标识，并且其中所述方法进一步包括向自动系统引入存储在盒特异性标识中的信息的步骤。

总之，本发明提供了集成“样品进入，通过质量检查的核酸文库输出”策略的有效自动化的工作流程。本文介绍的方法有很大的潜力提供最小的周转时间，降低成本和提高NGS成功率。此外，本发明的盒、自动系统和方法不仅能够简化和加速文库构建工作流程，而且也通用性适用于不同样品类型的用途，甚至是如FFPE样品的具有挑战性的样品类型。因此，在本发明的最后一个方面中，提供了本发明的盒、自动系统和方法用于从生物样品中自动制备下一代测序(NGS)文库的用途。

应当理解的是，前面的概述和详述二者仅仅是示例性和解释性的，并不限制所要求保护的本发明。在本申请中，除非另有特别说明，否则单数的使用包括复数。在本申请中，除非另有说明，“或”的使用意味着“和/或”。术语“包括”(“including”、“includes”或“included”)的使用不是限制性的。

实施例

实施例1：开发用于核酸的自动化样品至输出评估的QC qPCR

首先，开发了质量控制(QC)qPCR测定，用于以完全自动化的方式评估样品中存在的核酸的量和质量。目前的QC qPCR测试各种长度的扩增子的存在，每种扩增子都来源于不同的单拷贝人类基因，并且用于评估核酸用于NGS应用的适用性。扩增子及其长度如下：(1)来自人RNaseP基因的63bp片段；(2)来自HPRT的105bp片段；(3)来自TFRC的149bp片段；(4)来自ABCB的213bp片段；和(5)来自β-肌动蛋白的318bp片段。使用采用GoTaq聚合酶和Taqman探针(供应商指定的组成)对液化FFPE样品(Horizon FFPE样品)进行qPCR初步验证一个PCR反应(5重)中片段的扩增。qPCR程序为95℃保持5分钟，接着50个循环的95℃5秒和64℃44秒。图1显示了在TBE中电泳之后，在SYBR green染色的10％聚丙烯酰胺凝胶上的DNA梯状物(右侧泳道)旁边获得的片段(左侧泳道)。图2中显示的相同样品的相应qPCR图谱(相应曲线旁边显示的扩增子的大小)。用Biorad CFX Manager 3.1中包括的回归算法确定的Cq值为：(1)63bp片段(RNaseP)为26.1；(2)105bp片段(HPRT)为25.6；(3)149bp片段(TFRC)为26.0；(4)213bp片段(ABCB)为26.2；和(5)318bp片段(β-肌动蛋白)为27.4。

接下来，评估了完整人基因组DNA的5重表现，以获得5个扩增子中的每一个的带有R平方值的标准曲线。为此，以173μg/ml的完整人基因组DNA(Promega)作为底物，以3.3pg/单倍体基因组作为前提推导拷贝数。每个PCR 24000个拷贝4个重复，6000个拷贝4个重复，1500个拷贝8个重复，375个拷贝8个重复，94个拷贝12个重复，23个拷贝16个重复，5.9个拷贝20个重复和每个PCR 1.5个拷贝24个重复被扩增并且如上所述确定Cq。确定Cq值的中位数，同时省略非扩增(所谓的flatliner)。代表这个实验的直方图显示在图3中。使用对数回归推导每个扩增子的标准曲线，并且如图4中分别对于完整数据集和没有来自每个PCR5.9和1.5个拷贝的Cq值的数据集如所示确定R平方值。正如所料，只有两位数拷贝数的数据点，R平方值更接近1。对于低于34的Cq值，使用R平方值最高的方程。值得注意的是，对于高于34的Cq值，由于随机效应，已知定量不太准确。根据所述方程由此计算的5个扩增子中的每一个的拷贝数允许确定给定样品中有用的DNA含量和核酸断裂程度。对log2(拷贝数输入)和Cq之间的线性回归的方向系数的分析进一步指示了每个扩增子的5重qPCR中的扩增效率。如本领域所知，理想的qPCR将被假定为每个循环的扩增子的量翻倍(因此也是净Taqman荧光)，得到绝对方向系数为1。与此一致，如图4所示，除了318bp的最大扩增子以外，所有扩增子的绝对方向系数均为0.9或更高，表明接近每PCR循环Taqman探针降解两倍的稳健扩增。最大的扩增子大小显示>0.8的绝对方向系数，表明最大的片段扩增较慢，并且对于这种类型的基于Taqman探针的测定，设计具有较长扩增子的PCR QC测试没有多大意义。

实施例2.自动FFPE样品处理，核酸质量评估，靶可操作性标志物筛选和文库构建

为了证实本发明的可行性，制备一套Biocartis Idylla盒，每个盒在分开的PCR腔室中包括：(i)用于进行上述QC 5重qPCR的试剂，(ii)用于检测wt和V600M/R突变BRAF的靶qPCR的试剂，和(iii)用于构建与Illumina MiSeq测序仪相容的DNA文库的试剂。接下来，将待在所述盒上分析的一组FFPE样品掺入编码人BRAF的质粒。为了模拟临床现实，使用不同的BRAF序列，包括含有野生型(wt)BRAF序列的片段，编码V600M突变的片段和编码两个突变V600K和T149C的片段。将两种突变片段相对于FFPE样品中存在的野生型拷贝的量以不同的量掺入，以分别获得10％和5％的相对浓度。将不同的掺有BRAF的FFPE样品中的每一个引入分开的盒中，并以Biocartis Idylla仪器以全自动的方式进行处理。简而言之，涉及样品液化的处理(如在WO2014128129中所述)，然后在盒中提供的硅胶膜上进行核酸纯化，然后进行三个平行进行的独立和单独控制的PCR反应，其包括:(i)如上所述通过质量控制5重QCqPCR验证纯化的核酸的质量；(ii)实时检测选定的BRAF靶(用于靶可操作性突变的qPCR)；和(iii)使用包括与Illumina MiSeq测序仪兼容的接头的BRAF特异性或标准随机引物引物构建DNA文库。后一种文库构建PCR使用Q5高保真热启动聚合酶(New England Biolabs)进行并根据以下程序进行循环：95℃5分钟和50个循环的60℃90秒和94℃5秒。

图5显示不同FFPE样品上的5重QC qPCR的结果，其提供关于所述样品中存在的DNA的完整性的信息。图A显示了含有相对完整的DNA的FFPE组织样品的三个实例。图B显示了具有稍高程度的DNA断裂的另外三个实例。最后，图C显示了含有严重断裂DNA的FFPE组织样品的6个实例，这是对这些样品通过NGS进一步分析的反指示。

基于5重QC qPCR的结果，选择了具有相对完整的DNA并含有三种不同形式的掺入BRAF(wt、V600M突变体或双突变体V600K+T149C)的三个样品用于进一步研究。首先，检查从能够检测wt BRAF和V600M BRAF突变的测定qPCR获得的结果，以确认存在正确的BRAF形式。结果显示在图6中。它们证明，在所有筛选的三个FFPE样品中，可以检测到wt BRAF信号(图6，左栏，术语“靶”是指wt BRAF序列)。预期到这个结果是因为在用不同的BRAF质粒掺入之前所有的FFPE样品已知含有wt基因组BRAF序列。关于V600M突变体的检测(图6，右栏，术语“靶”是指V600M/K BRAF序列)，如所预期的，在仅掺入wt BRAF编码质粒的样品中，不能检测到V600M突变体(图6，右上图；靶的平信号线)。然而，在掺入了V600M突变体或双突变体V600K+T149C的FFPE样品中，在预期量正确检测到突变V600M(图6，右栏，底部和中部图)。因为本文使用的BRAF特异性qPCR不包括针对T1794C突变的特异性探针，所以在掺有双重突变体BRAF的样品中不能检测到所述突变。

实施例3.选择的NGS文库的测序

为了确认BRAF特异性qPCR的结果并且还检测未检测到的T1794C突变的存在，然后对从相同的三个选择的FFPE样品质粒(wt、V600M或V600K和T149C)构建的NGS文库进行Illumina MiSeq测序。用于构建这些文库的文库PCR在图7中示意性地示出，并且如上所述，在与5重QC PCR和BRAF特异性测定qPCR相同并且与之平行的盒上进行。文库PCR包括50个循环，并使用简化的BRAF特异性融合引物(也称为加尾引物)。除了靶(BRAF)特异性序列之外，融合引物(图7的中部图中显示)还含有测序引物序列和用于流动池附着的标签(P5和P7)。另外，反向引物还含有条形码(或和索引)，其在测序运行期间允许辨别从不同源获得的样品。引入这样的条形码的原因是，通常将从不同样品或患者构建的文库合并并在相同的NGS仪器上进行测序。因此，为了区分从三个不同的FFPE样品获得的文库，每个盒含有具有独特条形码序列的稍微不同的反向引物。

在测序之前，使用带有针的注射器从各个盒回收三个NGS文库，之后将样品合并，并在台上进一步纯化以除去任何未反应的引物和引物二聚体。应该指出的是，后者的纯化步骤也可以自动进行。最后，将纯化的NGS文库加载到MiSeq Illimina仪器的流动池中并测序。

测序运行的结果显示在图8中。与BRAF特异性qPCR的上述结果一致，在仅含有wtBRAF的第一样品中未检测到突变。对于另外两个样品，即使在BRAF特异性qPCR中不能捕获所有预期的BRAF基因突变，在测序过程中也能正确识别它们。具体而言，NGS不仅检测到在靶特异性qPCR中漏掉的T1794C BRAF突变，而且还分别区分掺入突变体和双重突变体的FFPE样品中的V600M和V600K突变，从而更加确切地鉴定已经检测到的突变。本发明的结果表明了本发明的前所未有的稳健性，其中所期望的结果不仅以快速而有效的方式提供，而且如果需要更深入的洞察力，也能够成功地进行随意跟踪。

为了更充分地理解本发明，上述工作流程在图9中示意性地示出。它从将FFPE样品提供到盒中开始，之后的后续步骤直到获得最终的qPCR结果(QC qPCR和靶可操作性标志物qPCR二者，这里是BRAF)和即可使用的文库是以全自动和快速的方式执行的(提供实时框)。应该注意的是，所有这些结果和文库都是从相同的同样处理的样品中获得的，这确保了来自不同测定的数据的高度可比性。值得注意的是，通过伴随的NGS库构建并提供关于所述文库的质量的信息，本发明的方法不仅允许将给定的样品快速地进行NGS临床追踪，而且还允许决定这样相当昂贵的追踪鉴于样品质量是否可行。鉴于上述情况，本发明在当前的诊断实践中开辟了新的可能性。

序列表

<110> Biocartis NV

<120> 样品到NGS文库的自动制备

<130> BCT-070

<150> EP15178158.0

<151> 2015-07-23

<160> 3

<170> BiSSAP 1.3.6

<210> 1

<211> 11

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Seq ID No: 1野生型

<400> 1

agctacagtg a 11

<210> 2

<211> 11

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Seq ID NO: 2 V600M

<400> 2

agctacaatg a 11

<210> 3

<211> 11

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Seq ID No: 3 V600K - T1794C

<400> 3

agccacaaag a 11

Claims

1.用于自动处理生物样品的盒，所述盒包括：

-用于接收生物样品的样品区室；

2.根据权利要求1所述的盒，所述盒进一步包括位于所述样品区室下游和所述用于释放或纯化核酸的工具下游并且被配置为接收释放或纯化的核酸的至少一部分或在文库区室中制备的核酸文库的至少一部分的至少一个热循环qPCR区室，其中所述热循环qPCR区室适于扩增核酸并允许检测在这样的扩增过程中产生的信号，并包括用于进行qPCR的试剂。

3.根据权利要求2的盒，其中用于进行qPCR的试剂包括用于扩增至少一种疾病相关的靶核酸序列的至少一组引物、优选多组引物。

4.根据前述权利要求中任一项所述的盒，所述盒进一步包括位于所述样品区室下游和所述用于释放或纯化核酸的工具下游的至少第二个热循环qPCR区室，所述至少第二个热循环qPCR区被配置为接收释放或纯化的核酸的至少一部分或在文库区室中制备的核酸文库的一部分，并且包括用于进行核酸质量控制(QC)qPCR的至少一组引物。

5.根据权利要求4所述的盒，其包括用于产生不同大小的扩增子的多组引物。

6.根据前述权利要求中任一项所述的盒，其中用于制备核酸文库的试剂允许：

7.根据权利要求6的盒，其中所述核酸片段的产生通过还称为“文库PCR”的PCR进行，并且其中将寡核苷酸衔接子附接到所述文库PCR产生的核酸片段是通过在所述文库PCR中使用的至少一种引物序列中包括衔接子序列进行的。

8.根据前述权利要求中任一项所述的盒，进一步包括用于存储盒特异性信息的盒特异性标识。

9.根据前述权利要求中任一项所述的盒，进一步包括位于所述样品区室下游的回收区室，所述回收区室提供用于回收以下任一项：

-接收到样品区室中的生物样品的一部分；

-在文库区室中制备的核酸文库的至少一部分。

10.用于从生物样品制备下一代测序(NGS)核酸文库的自动方法，所述方法包括以下步骤：

e)接收生物样品；

f)从所接收的生物样品中释放或纯化核酸的至少一部分；

g)将释放或纯化的核酸的至少一部分提供到用于制备NGS核酸文库并包括用于制备核酸文库的试剂的文库区室；和

h)制备NGS核酸文库；

其中至少步骤b)至d)在自动系统上执行。

11.根据权利要求10所述的自动方法，所述方法进一步包括以下步骤：相对于制备NGS核酸文库的步骤，顺序地或同时在所述自动系统上进行qPCR，其中在适于扩增核酸并允许检测在这样的扩增期间产生的信号的热循环qPCR区室中对释放或纯化的核酸的第二部分进行所述qPCR。

12.根据权利要求11所述的自动方法，其中所述至少一个qPCR扩增至少一种疾病相关的靶核酸序列，或者所述至少一个qPCR是质量控制(QC)qPCR。

13.根据权利要求10至12中任一项所述的自动方法，所述方法在可与所述自动系统接合的盒上执行。

14.根据权利要求13所述的自动方法，其中所述盒包括用于存储盒特异性信息的盒特异性标识，并且其中所述方法进一步包括向所述自动系统引入存储在所述盒特异性标识中的信息的步骤。

15.根据权利要求1-9所述的盒用于从生物样品自动制备下一代测序(NGS)文库的用途。