JP2018520706A - 試料採取からｎｇｓライブラリ調製までの自動化 - Google Patents

Abstract

本発明は概して、生物学的試料から次世代シーケンシング準備済みの核酸ライブラリまでの完全自動化された処理のための自動化されたシステム及び自動化された方法のためのカートリッジに関する。特に本発明は、生物学的試料を受容するための区画と、その受容された試料から核酸を遊離及び／又は精製するための手段と、中に備えられた試薬を使用して該核酸からNGSライブラリを調製することができる区画へと該核酸を移送するための手段とを含む流体カートリッジに関する。特定の一態様においては、本発明はまた、生物学的試料からNGS核酸ライブラリを調製すると同時に又は逐次に、同じ生物学的試料に対してqPCRアッセイを実施するための自動化されたシステム及び自動化された方法のためのカートリッジに関する。
【選択図】図9

Description

本発明は概して、生物学的試料から次世代シーケンシング準備済みの核酸ライブラリまでの完全自動化された処理のための自動化されたシステム及び自動化された方法のためのカートリッジに関する。特に本発明は、生物学的試料を受容するための区画と、その受容された試料から核酸を遊離及び／又は精製するための手段と、中に備えられた試薬を使用して該核酸からNGSライブラリを調製することができる区画へと該核酸を移送するための手段とを含む流体カートリッジに関する。特定の一態様においては、本発明はまた、生物学的試料からNGS核酸ライブラリを調製すると同時に又は逐次に、同じ生物学的試料に対してqPCRアッセイを実施するための自動化されたシステム及び自動化された方法のためのカートリッジに関する。

格段に遅い古典的なサンガーのシーケンシングに対して、第二世代シーケンシング又は次世代シーケンシング（NGS）としても知られる高スループットシーケンシングの費用が絶えず減少していることで、この強力な高いカバレッジの診断技術が徐々に臨床診療へと取り入れられている。最近では、例えば商業上既知のIllumina（Solexa）式シーケンシング、Roche 454式シーケンシング、Iontorrent（Proton/PGM）式シーケンシング、又はSOLiD式シーケンシングを含む、多くの種々のNGSストラテジー及びプラットフォームが存在する。それら全ては詳細においては異なるが、一般に、しばしばシーケンシングプラットフォームに特有のアダプター配列を含むように修飾された多くの短い重複している核酸断片又は「リード」の生成を含む。特定の核酸源から調製されたそのような断片のコレクションは、NGS核酸ライブラリと呼ばれる。臨床試料からのそのような核酸ライブラリの調製方法は、時間がかかり、多くの準備段階を必要とする。すなわち、試料から取り出された核酸が十分に純粋である必要があり、かつ十分な量で回収される必要があるだけでなく、申し分のない遺伝情報のカバレッジを提供するために、それらの核酸は、厳しいクオリティー基準を満たすことも必要であり、かつライブラリ調製工程又はシーケンシング反応のいずれかを妨げ得る夾雑物を含まないことも必要である。結果として、NGSライブラリ調製は、それ自体依然として大きな労力を要するだけでなく、質の高い結果及びそれらの正しい解釈を保証するためには、シーケンシング工程の前に、精製された核酸又は構築されたNGSライブラリのいずれかの量及びクオリティーを評価する追加の工程を更に必要とする。このように、NGSを一層迅速にし、廉価にし、そして必要とされる人的資源を少なくするためになされた多大な改善にもかかわらず、その技術は、依然として、例えばターゲット特異的な定量的PCR又はリアルタイムPCR（qPCR）による診断的スクリーニングと比べて比較的高価であり、かつ格段に遅いものである。

現在、患者から採取された臨床試料をNGS準備済みにする処理は、大抵手動で行われており、
1．細胞溶解又は細胞液状化工程と、
2．核酸の遊離又は精製工程と、
3．当該技術分野において既知の任意の手段、例えば吸光度（光学密度）測定、アガロースゲル電気泳動、ピコグリーンのような蛍光DNA結合色素を使用する蛍光分析法、又は種々のタイプのクオリティーコントロールPCR（非特許文献1を参照）による、核酸のクオリティー及び量の測定工程と、
4．選択されたNGSプラットフォームに応じたストラテジーによるNGSライブラリの調製工程と、
5．しばしばこの工程を含むが、任意で、当該技術分野において既知の手段のいずれかによるDNAライブラリのクオリティー及び量の測定工程と、
を少なくとも含む。

Illumina社のような幾つかのNGS提供業者は、先に説明したワークフローを単純化するための最善の努力をしている。その例は、2015年1月にIllumina社によって紹介されたNeoPrepであり、それは、手動で単離されクオリティーが検証されたDNAからのライブラリ調製工程（工程4）を自動化している。しかしながら、現在、直接的で迅速な自動化された試料採取からNGS準備済みのライブラリ処理までの、特に、核酸のクオリティー及び量の評価を並行して可能にするようなプロトコルは存在しない。

Buehler et al. 2010

本発明は、事実上あらゆるタイプの生物学的試料（血液、大便、尿、FFPE、スワブ等を含む）からNGシーケンシング準備済みのライブラリまでの自動化された処理のための流体カートリッジを提供することによって上記要求及びその他の要求に取り組んでいる。本発明のカートリッジは、試料がカートリッジ中に導入された時点から一切の人の手による介入なく、自動化された試料液状化に続いて核酸の遊離及び／又は精製が行われ、その後に、遊離及び／又は精製された核酸の少なくとも一部からNGS準備済みのライブラリが調製されるために必要な全ての手段を含む。重要なことには、本発明のカートリッジはまた、自動化されたqPCR分析のために必要な手段を全て備え、この分析は、NGSライブラリ自身の由来と同じ遊離及び／又は精製された核酸の別の部分からのNGSライブラリの調製と並行して又は逐次に実施することができる。そのようなqPCRは、ライブラリ調製の前にカートリッジ中に供給される試料から精製された核酸のクオリティーを評価するための、又はライブラリが調製された後で、それをNGS分析にかける前のそのライブラリのクオリティーを評価するためのクオリティーコントロール（QC）qPCRであってよい。或いはそのようなqPCRは、臨床試料におけるアクショナブルなターゲット変異をスクリーニングするためのアッセイqPCRであってよい。

自動的にかつ並行して（a）NGS準備済みのライブラリを生成すると共に、（b）そのクオリティーを評価し、そして（c）同一処理された1つの生物学的試料からのターゲットのqPCRスクリーニングを実施することによって、時間及び熟練した人材を節約することとなるだけでなく、貴重な量的に限られた臨床試料のより良い管理を保証することにもなる。そのような解決策の更なる利点は、リアルタイム監視QC qPCR反応から得られる情報を核酸の量及びクオリティーの指標、ひいてはNGSライブラリ生成のためのその適性として直ちに使用することができることであろう。更なる利点は、アッセイqPCRの結果と、該qPCRと同じ機械を用いてその同じ機械において、同じ時点（すなわち、同時に）又はそのすぐ後（すなわち、逐次に）のいずれかで、かつ重要なことには、同じ処理がなされた核酸の同じプールを使用して並行して生成されたライブラリのNGS分析から得られた結果とを直接比較することができることであろう。さらに、こうしてqPCR分析と、ライブラリの形の遊離核酸の安定化との間の通常の時間的な分離を取り除くことによって、生物学的試料又は遊離核酸の長期の貯蔵期間及び潜在的な分解によって起こる、qPCR結果とNGS結果との間のあらゆる潜在的な分析的な分離を更にできるだけ小さくすることができる。

したがって、本発明のカートリッジ及び方法は、試料採取からNGSライブラリ生成までを自動的に行うと共に、試料又はライブラリのクオリティーの潜在的な検証を可能にするだけでなく、NGSの詳細なゲノム分析に先だって、ドライバー変異を即座に高深度で発見するための手段を更に提供する。本発明の上記利点及びその他の利点を、引き続き示す。

本発明は、添付の独立形式請求項に定義されている。好ましい実施の形態は、従属形式請求項に定義されている。特に本発明は、
生物学的試料を受容するための試料区画と、
試料区画中に受容された生物学的試料から核酸を遊離又は精製するための手段であって、上記試料区画と流体連通させることが可能な手段と、
上記試料区画及び上記核酸を遊離又は精製するための手段の下流に位置する核酸ライブラリを調製するためのライブラリ区画であって、遊離又は精製された核酸の少なくとも一部を受容するように構成されており、かつ核酸ライブラリを調製するための試薬を含むライブラリ区画と、
を含む、生物学的試料の自動化された処理のためのカートリッジに関する。

好ましい実施の形態においては、上記カートリッジは、核酸ライブラリ区画が、
ライブラリ区画中に受容された遊離又は精製された核酸の部分から核酸断片を生成することに、かつ、
上記生成された核酸断片の少なくとも一方の端部、好ましくは両方の端部にオリゴヌクレオチドアダプターを結合させることに適することを特徴とする。

更なる態様において、本発明はまた、次世代シーケンシング（NGS）核酸ライブラリを生物学的試料から調製するための自動化された方法であって、
a）生物学的試料を受容する工程と、
b）受容された生物学的試料から核酸の少なくとも一部を遊離又は精製する工程と、
c）上記遊離又は精製された核酸の少なくとも一部を、NGS核酸ライブラリを調製するための、核酸ライブラリを調製するための試薬を含むライブラリ区画中に供給する工程と、
d）生物学的試料の受容後に一切の人間の介入を必要としない、NGS核酸ライブラリを調製する工程と、
を含み、少なくとも工程b）〜工程d）は、自動化されたシステムにおいて実施される、方法を提供する。

最後に、本発明はまた、本発明によるカートリッジの、生物学的試料からの次世代シーケンシング（NGS）ライブラリの自動化された調製のための使用を提供する。

定義
本明細書においては、用語「定量的PCR」又は単純に「qPCR」には、標的DNA分子を増幅すると同時に、それを検出又は定量化するために使用される、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を基礎とする研究室用技術の定義が与えられる。反応産物がその終わりに、すなわち熱サイクル処理が完了した後に検出される標準的なPCRとは対照的に、qPCRの主な特徴は、DNA産物が、熱サイクル処理の間に反応が進行しながら「リアルタイム」で検出されることであり、したがってqPCRの代替名は、「リアルタイムPCR」である。最近では、多くの種々のタイプのqPCRが存在する。例えば、逆転写（RT）工程から開始する場合に、qPCRは、メッセンジャーRNAの数を定量するために使用することができ、その場合には、逆転写（reversetranscription）qPCR又はRT-qPCRと呼ばれる。本明細書で使用される場合に、用語「定量的PCR」又は単純に「qPCR」は、しばしばRT-PCRとも略記される逆転写PCRとの混同を避けるために、好ましくは用語「リアルタイムPCR」又は「RT-PCR」に関して使用されるものとする。ほとんどのqPCRは、産物増幅をリアルタイムで検出するための2つの最も一般的な方法：（a）非特異的蛍光色素の任意の二本鎖DNAでのインターカレーション、又は（2）プローブとその相補的ターゲット配列とのハイブリダイゼーション後にのみ検出が可能となる蛍光性リポーターで標識されたオリゴヌクレオチドからなる配列特異的DNAプローブのうちの一方を使用する。熱サイクル処理の間に生成される蛍光シグナルは、適切な光学検出システムによって検出され、蛍光シグナルがバックグラウンド閾値を通り過ぎてから反応がプラトーに達するまでの時点から突き止められる。ターゲット配列のコピー数は、相対定量化又は絶対定量化のストラテジーのいずれかを使用して、一般的に、得られた増幅曲線の形状を解析すること（検量線ストラテジー）によって、又はシグナルが幾つかの閾値より高く上昇する時点（しばしば、Ct値と呼ばれるが、Cp値又はCq値と呼ばれることもある（sometimes））を測定することによって推定することができる。相対定量化においては、所定の試料でCt又は検量線解析を使用して推定されたターゲット核酸レベルは、別の参照試料、例えば未処理の対照試料において同じターゲットについて得られた値と相対的に表現される。それに対して、絶対定量化においては、qPCRシグナルは、検量線を使用して投入コピー数に関連付けられるか、又はより最近のデジタルPCR法に従って計算することもできる。当面は、最初のストラテジーが依然としてより優勢であり、得られた値と事前に作成した検量線との比較によりターゲットDNA量を推定することを基礎とする。これらのqPCR定量化ストラテジー及びその他のqPCR定量化ストラテジーは、当該技術分野で広く知られており、それらの計算は、所定のアプリケーション及びqPCRシステムに依存して、多少異なっていてもよい。

本明細書で使用される場合に、用語「定量的PCRを実施するための手段」は、qPCRを実施するための試薬及びエレメントの必要最低限の取り合わせと解釈されるものとする。それらの手段は通常、核酸源から受容された核酸鋳型のリアルタイムPCRの熱サイクル処理において検出可能にするあらゆる試薬を含むものとする。そのような試薬は、限定されるものではないが、qPCRのタイプに応じて、PCRグレードのポリメラーゼ、少なくとも1つのプライマー組、検出可能な色素又はプローブ、dNTP、PCRバッファー等を含む。さらにまた、「定量的PCRを実施するための手段」は通常、以下の（1）リアルタイムで検出可能な熱サイクル処理を行うことができる適切な区画（さらに、「熱サイクル用qPCR区画」とも呼称される）を通常含むが、それに限定されるものではない当該技術分野で既知の任意の標準的な部材の最小限の集成物も含むものとする。そのような区画は、例えば、核酸を増幅するのに適したチャンバ、すなわち適切な材料からできており、また十分な内部温度制御をもたらし、更にそのような増幅の間に生成されるシグナルのリアルタイム検出を可能にする少なくとも1つの壁部、例えば透光性の壁部を含むチャンバによって形成され得る。さらに、このような手段は、（2）様々な既存の熱サイクル用装置から広範に知られるこのチャンバ又はその他の区画中の温度を変更するための手段を含む。さらに、このような手段は、（3）qPCR熱サイクル処理の間に生成されるシグナルを検出するための手段、例えばコンピュータに接続された光学検出器等を含む。要するに、そのような最小限の集成物は、通常は、熱サイクル用qPCR区画中での熱サイクル反応を開始及び維持し、その中の安定な熱サイクル条件を保証するために温度を調節及び制御することが可能な当該技術分野で既知の任意の1つ以上のシステム等を含むものとし、さらに、該集成物はまた、任意の適切な1つ以上の検出デバイス、データ処理のための手段（例えば、コンピュータ、或いはデータベースに接続されたコンピュータ）、及びqPCR反応の熱サイクル処理をリアルタイムに読み取り、監視することを可能にする出力システム（通常は、適切なグラフィックユーザインターフェースに反応の進捗を表示するコンピュータスクリーン）、並びに機構を操作する、及び／又は得られた結果の解釈を表示し、また場合によってはその解釈を補助するために適切な任意のソフトウェアパッケージを含むものとする。

さらに、本明細書で使用される場合に、用語「シーケンシングライブラリ」又は「シーケンシング核酸ライブラリ」とは、特に近年知られる次世代シーケンシング（NGS）ストラテジーのいずれかを使用した配列解析準備済みの一式のポリヌクレオチド、最も多くは、一式のDNAタイプを指す。こうして、本発明の現時点で好ましい実施の形態においては、シーケンシングライブラリは、選択される所定のNGSストラテジーと適合可能なアダプター分子（又はアダプター配列）と融合された、複数のPCR増幅されたDNA分子から構成される。シーケンシングライブラリのタイプ及びその調製方法の包括的概要は、van Dijk et al. Exp Cell Res. 2014のレビューに見ることができる。

同様に、本明細書で使用される場合に、用語「核酸ライブラリを調製するための手段」は、NGSに適した核酸ライブラリを調製するための必要最低限のエレメントと解釈されるものとし、これには、核酸源から受容された核酸を核酸ライブラリ調製に供することができる少なくとも1つの区画、ライブラリ調製のための必要最低限の試薬（例えば、適切な酵素又は酵素混合物、NGSストラテジーに特異的なアダプター配列又はアダプター、バッファー等）、並びに、更には例えばライブラリ調製手法を開始及び／又は指示するために適した標準的な当該技術分野で既知の機構及びソフトウェアが含まれる。本明細書で使用される場合に、用語「核酸ライブラリを調製するために必要な試薬」は、NGSのために使用することができる核酸ライブラリを調製するために十分な当該技術分野で既知の試薬の任意の混合物と解釈されるべきである。好ましくは、「核酸ライブラリを調製するために必要な試薬」は、NGSのために直接的に使用することができる、すなわち選択される所定のNGSストラテジーと適合可能なNGS特異的アダプター配列を含む核酸ライブラリを調製するために十分な当該技術分野で既知の試薬の任意の混合物と解釈され得る。そのような試薬は、NGS特異的アダプター配列がプライマーの配列中に含まれるプライマー配列を含んでよく、試薬の混合物は、酵素、基質及びそのようなプライマーによってライブラリPCRを実施することを可能にする緩衝条件を含む。代替的には、そのようなNGS特異的なアダプター配列は、ライゲーションのために適切であってよく、かつ酵素リガーゼも含む試薬混合物中に供給され得る。

さらに、用語「生物学的試料から核酸を遊離又は精製するための手段」は、生物学的試料中の細胞又はその他の構造物から核酸を遊離するために、そして精製の場合には、上記核酸を不所望な試料デブリから許容可能な純度の形へと（用語「許容可能な」は、そのような精製された核酸の更なる目的に依存する）通常は水溶液中で十分に分離するために使用することが知られる、当該技術分野で既知の任意の複数の（of）化学的試薬及び／又は物理的エレメントと解釈されるべきである。そのような目的のために適した化学的試薬は、組織又は細胞を破壊及び／又は液状化し、こうしてそこに含まれる核酸を溶液中に放出させるにあたり使用される任意の当該技術分野で既知の界面活性剤及び／又は界面活性剤、カオトロピック剤、ヌクレアーゼ阻害剤等を含むバッファーを含む。同様に、核酸の遊離／精製の目的のための様々な試料処理方法で使用されるべき当該技術分野で既知の物理的エレメントは、例えばシリカ固体担体、例えばスピンカラム中の樹脂、シリカ膜、ビーズ等、更なる機械的破壊装置又は破壊エネルギーを発生する機械、例えば超音波発生装置等を含む。

次いで、本明細書で使用される場合に、用語「核酸」及び同等の「ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチドサブユニットの間にホスホジエステル結合を含むリボヌクレオシド又はデオキシリボヌクレオシドの重合体を指す。核酸としては、限定されるものではないが、例えばゲノムDNA、ミトコンドリアDNA又はmeDNA、cDNA、mRNA、rRNA、tRNA、hnRNA、microRNA、lncRNA及びそれらの様々な改変物を含むDNA及びRNAが挙げられる。核酸は、最も一般的には、様々な種類の生物から得られる生物学的試料のような天然源から得ることができる。他方で、核酸は、既知のヒトにより編み出された方法（例えば、PCRのような核酸増幅法）のいずれかにおいて合成、組換え、又はさもなくば産生することもできる。

本明細書で使用される場合に、用語「核酸源」は、核酸を含む又は核酸を含むと予想される液体又は固体のどちらかの任意の物質と理解される。核酸源は、例えば、合成核酸又は組換え核酸を含む人工的に作製した溶液、例えばなかでもライゲーション産物、電気泳動マーカー（いわゆる「ラダー」）、プライマーストック等を含有する溶液であってよい。しかしながら最も一般的には、核酸源は、生物又はそれを形成する細胞若しくはそれに由来する細胞から得られる生物学的試料、好ましくは患者から得られた臨床試料であるものとする。

本明細書で使用される場合に、用語「生物学的試料」又は単純に「試料」は、核酸及び／又は細胞材料を含有する様々な生物学的源を含むと解釈され、これには例えば哺乳動物細胞のような細胞の培養物が含まれるが、他にも真核性微生物の培養物、体液、体液沈殿物、洗浄液検体、細針吸引物、生検試料、組織試料、癌細胞、患者から得られたその他の種類の細胞、組織由来の細胞、若しくは疾患若しくは感染症について試験及び／又は処置される個体からのin vitro培養細胞、又は法医学的試料が含まれる。体液試料の例としては、限定されるものではないが、全血、骨髄、脳脊髄液（CSF）、腹膜液、胸膜液、リンパ液、血清、血漿、尿、乳糜、大便、射出精液、痰、乳頭吸引液、唾液、スワブ検体、洗液若しくは洗浄液及び／又はブラシ検体が挙げられる。

生物学的試料が上記システム中に供給されると、又は本発明の方法を実施する間に、その試料は、通常、核酸が放出される溶解物を得るための組成物と接触されることとなる。本明細書で使用される場合に、「接触」とは、試料と該組成物とを一緒にすること、曝露すること、インキュベートすること、又は混合することを意味する。「放出」とは、遊離すること、獲得すること、及び／又は架橋を逆行させることを指す。試料から核酸を遊離するためには、プロテアーゼ活性及びpH緩衝が、該組成物から必要とされ得る。放出は、該組成物から、調査される試料中に存在する核酸以外の成分を沈殿させ、固定剤を除去／溶解する潜在的な活性を必要とし得る。放出は、加熱又は高密度焦点式超音波（HIFU）等の条件を必要とし得る。本発明の趣旨による一実施の形態においては、生物学的試料は、様々な溶液との接触及び核酸の放出を含む試料処理工程が行われる診断分析器等の自動化されたシステムと適合可能なカートリッジ中に導入される。

さらに、用語「カートリッジ」は、そのようなカートリッジを受け入れる又はそれと接続するために適切なより大きな機器の内側又は外側に嵌まるものとして移送又は移動することができる単独の物体として形成されるチャンバ及び／又はチャネルの自己充足型の集成物と理解される。カートリッジ中に含まれる幾つかの部材は、固く連結されていてよいが、その他はフレキシブルに連結されていてよく、カートリッジのその他のコンポーネントに対して可動であってよい。同様に、本明細書で使用される場合に、用語「流体カートリッジ」は、流体、好ましくは液体を処置、処理、排出、又は分析するために適切な少なくとも1つのチャンバ又はチャネルを含むカートリッジと理解される。本発明の好ましい実施の形態においては、カートリッジは、その中に受容された試料のその溶解及び液状化を補助する物理的又は機械的な操作の手段を更に備え得る。例えば、有益なカートリッジは、一方向入口弁、隔壁、1つ以上のフィルタ若しくは親和性膜、オーバーフロー部及び／又はHIFU処理と適合可能な区域を含み得る。さらに、有益なカートリッジは、その中に収容される液体の混合及び／又は適切な分配のための手段、例えば1つ以上のプランジャ又はマニホールドを含んでよい。さらに、有益なカートリッジは、幾つかの反応チャンバ及び／又は廃棄物チャンバを含んでよく、十分に収容された受容試料を外部環境と隔て得ることを可能にし、又はプラスチック及び／又はその他のポリマーのような手頃な材料から作製することができる。好適なカートリッジの一例は、国際公開第2007004103号に示されている。有益には、流体カートリッジは、マイクロ流体カートリッジであってよい。流体カートリッジに関しては、用語「下流」及び「上流」は、流体がそのようなカートリッジ中を流れる方向に対するものとして定義され得る。すなわち、流体が同じカートリッジ中の第二のセクションに向かって流れるカートリッジ中の流体路のセクションは、その第二のセクションの上流に位置しているものと解釈されるべきである。同様に、流体がその後に到達するセクションは、上記流体がその前に通過したセクションに対して下流に位置している。

概して、本明細書で使用される場合に、用語「流体」又は時々「マイクロ流体」とは、小さいスケール、通常少なくとも1つの次元又は2つの次元（例えば、幅及び高さ又はチャネル）においてミリメートル未満のスケールに幾何学的に制約される流体の挙動、制御及び操作を扱うシステム及び装置に対するものである。そのような小さい容量の流体は、小さいサイズ及び低いエネルギー消費しか必要としないマイクロスケールで移動、混合、分離又はさもなくば処理される。マイクロ流体システムは、マイクロニューマティックシステム等の構造物（圧力源、液体ポンプ、マイクロバルブ等）及びマイクロリットル、ナノリットル及びピコリットルの容量を取り扱うためのマイクロ流体構造物（マイクロ流体チャネル等）を含む。例示的なマイクロ流体システムは、欧州特許第1896180号、欧州特許第1904234号及び欧州特許第2419705号に記載されており、したがって、本明細書に示される発明の或る特定の実施の形態に導入し適用することができる。

本発明の本質のより完全な理解のためには、添付の図面と関連づけて考えて以下の詳細な説明を参照する。

液状化されたFFPE試料で実施された5プレックスqPCRの5つの産物に相当する電気泳動ゲル上の5つのDNAバンドを示す図である。 図1に示される5プレックスqPCRの5つの産物についてのqPCR増幅曲線を示す図である。 5プレックスqPCR産物のそれぞれの少なくとも4つの複製物についてのコピー数に対するCqの棒グラフを示す図である。 5プレックスqPCR産物のそれぞれについてのR二乗値の測定を示す図である。 5プレックスqPCRの、様々な程度の核酸断片化を区別する能力を示す図である。パネルAは、比較的インタクトなDNAを有する3つのFFPE試料から得られた結果を示している。パネルBは、より高い水準の断片化を有するもう一つの組の3つのFFPE試料からの結果を示している。最後に、パネルCは、かなり断片化されたDNAを含む6つの異なるFFPE試料からの結果を示している。 wt BRAF、V600M変異型BRAF又はV600K及びT1794C二重変異型BRAFのいずれかをコードする配列を含むプラスミドでそれぞれスパイクされた3つのFFPE試料で実施した、wtBRAFとV600K/R/M変異型のBRAFとを識別可能なBRAF特異的qPCRの結果を示す図である。 NGS特異的アダプターを含むプライマーを用いるライブラリPCRを使用する1つのタイプのNGS準備済みのライブラリの調製の原理を示す図である。野生型の配列（配列番号1）、V600Mの配列（配列番号2）及びV600K＋T1794Cの配列（配列番号3）が表されている。 wt BRAF、V600M変異型BRAF又はV600K及びT1794C二重変異型BRAFのいずれかをコードする配列を含むプラスミドでそれぞれスパイクされた3つのFFPE試料で実施したNGSの結果を示す図である。 本発明による最適化された試料採取から結果取得までのワークフロー（sample-to-result workflow）の一例を示す図である。

本発明は概して、生物学的試料からの次世代シーケンシング（NGS）ライブラリの自動的な調製に関する。特に、本発明は、あらゆるタイプの試料（血液、大便、尿、FFPE、スワブ等）からNGSライブラリを自動的に生成し、こうして得られたライブラリ又はその構築のために使用された核酸の量及びクオリティーをQC qPCRを使用して自動的に検証して、ほぼ即時的に上記核酸からアッセイqPCRを使用して臨床的情報を取得することができる包括的な方法に関する。この場合に、同一処理された全く同じ核酸のプールが、NGSライブラリの調製及びqPCRのために使用され、それによりさらに、アッセイqPCRによってスクリーニングされた主要なターゲット変異に対する診断情報と、NGSデータから後に得られるより広範な遺伝的背景とを直接的に比較するための独自の手段が提供されることに留意すべきである。

特に、本発明は、
生物学的試料を受容するための試料区画と、
試料区画中に受容された生物学的試料から核酸を遊離又は精製するための手段であって、チャネルによって上記試料区画に連結されるか、又は該試料区画中に全体的に若しくは部分的に配置されるかのいずれかによって、上記試料区画と流体連通させることが可能な手段と、
上記試料区画及び上記核酸を遊離又は精製するための手段の下流に位置する核酸ライブラリを調製するためのライブラリ区画であって、遊離又は精製された核酸の少なくとも一部を受容するように構成されており（例えば、抽出された核酸をチャネル中でライブラリ区画へと向けるポンプ作用の結果として）、かつ核酸ライブラリを調製するための試薬、例えば酵素、NGS特異的アダプター、任意の緩衝溶液等を含むライブラリ区画と、
を含む、自動化されたシステムでの生物学的試料の自動化された処理のための、該システムと係合可能な流体カートリッジを提供する。

本発明の課題のうちの一つは、少なくとも試料が本発明のカートリッジ中に挿入され、そのカートリッジがそれを操作する自動化されたシステムと係合され、そして自動化されたライブラリ調製手順が実行するように該自動化されたシステムに指示を出した時点からは人間の操作が最小限しか必要とされず、又は人間の操作が事実上一切必要とされない、迅速で使いやすい生物学的試料採取からNGSライブラリ処理までの手段を提供することである。このように、本発明の課題のうちの一つはまた、生物学的試料が供給され（例えば、カートリッジ中に挿入され、又はさもなくば該カートリッジと適合可能な自動化されたシステム中に導入され）、そして自動化された処理が利用者によって開始された時点から、ライブラリ調製過程が、一切の人間の介入を必要としないカートリッジ又はプラットフォームを提供することである。

有益には、本発明のカートリッジは、NGSライブラリを自動的に調製するだけでなく、上記ライブラリに関連する量及びクオリティーの情報を並行して提供すること、及び／又は該ライブラリが生成される元となる試料の幾つかの臨床的キャラクタリゼーションを実施することも可能である。これを実現するために、本発明は、ライブラリ調製と並行して、リアルタイムPCR（qPCR）の熱サイクル処理を行い、そして例えば透明な壁部を通じて監視することができるカートリッジを更に提供する。このように、好ましい実施形態においては、試料区画及び核酸を遊離又は精製するための手段の下流に位置し、かつその遊離若しくは精製された核酸の少なくとも一部又はライブラリ区画中で調製された核酸ライブラリの少なくとも一部を（例えばチャネルを通じたポンプ動作によって）受容するように構成された少なくとも1つの熱サイクル用qPCR区画を更に含み、上記熱サイクル用qPCR区画が、核酸を増幅し、そのような増幅の間に生成されるシグナルを検出可能にするために適しており、かつqPCRを実施するための試薬、例えば少なくとも1つのプライマー組、シグナルを発生する色素又はプローブ、DNAポリメラーゼ、dNTP、バッファー等を含むカートリッジが提供される。

好ましくは、熱サイクル用qPCR区画で実施されるqPCRは、マルチプレックスqPCR、すなわち単独反応において複数の配列を同時に増幅及び検出するqPCRである。マルチプレックスqPCRは、単独のqPCR混合物中で複数のプライマー組を使用するため、1つのチューブ、チャンバ又はその他のタイプのqPCR熱サイクル用区画において複数の産物を生成する。2種のプライマー組（通常は対）を使用するマルチプレックスqPCRは、デュプレックスと呼ばれ、しばしば2プレックスと示される。同様に、3種のプライマー組を用いるマルチプレックスqPCRは、トリプレックス又は3プレックスである。本発明において好ましいマルチプレックスqPCRの取り合わせは、2プレックス、3プレックス、4プレックス、5プレックス、6プレックス、7プレックス又はそれ以上を含む。

したがって好ましくは、PCRを実施するための試薬は、それぞれ異なるアンプリコンに対する、好ましくは2、3、4、5、6、7又はそれ以上である複数のプライマー組を含む。

ロバスト性のマルチプレックスqPCRを設計することが容易でないことは、当該技術分野では良く知られている。それというのも、そのアッセイは、多数の個々のプライマー組（通常は、プライマー対）が、1つの反応チューブにおいて、したがって一式の単独の反応条件の下で、それらの固有のアンプリコンを特異的にターゲティングすることが必要とされるからである。プライマー設計は、典型的には、プライマー純度（17塩基長〜30塩基長）を考慮に入れ、G/Cリッチドメイン及びA/Tリッチドメインのバランスを取り（20%〜70%のG+C）、55℃〜80℃の間の融解温度に設定し、相補的3’末端塩基対が生成されることを避け、プライマーの自己相補を避け、そして、特に真核性ゲノムDNAのような複雑な試料でマルチプレックスが実施されるべき場合にはプライマーの3’末端で1つ以上のC又はGを避ける。PCRプライマーの設計を補助する幾つかのウェブベースのプライマー設計ソフトウェアツールが利用可能である（例えば、Primer3Plus）。その他の要因、例えばプライマーの相対濃度、PCRバッファー成分の正確な濃度、塩化マグネシウム濃度とデオキシヌクレオチド濃度との間のバランス、サイクル温度及び熱サイクル用DNAポリメラーゼ等はまた、しばしば、マルチプレックスqPCRがうまくいくようにするために微調整する必要がある。とりわけ、アニーリング温度及びバッファー濃度の最適な組み合わせを見出すことは、マルチプレックスPCRにおいて、高度に特異的な増幅産物を得るためには必須である。塩化マグネシウム濃度は、dNTPの量と比例している必要があるが、一方で、それぞれのターゲットのためのプライマー濃度は、比較的ロバスト性であるべきである。適切なポリメラーゼの選択は、反応の成果に影響を及ぼすこともある。理論上、マルチプレックスPCRは、標準的なPCRポリメラーゼを用いて実施することができるが、実際には、高度にプロセッシブ型で高感度のDNAポリメラーゼ、例えばGoTaq又はAmpliTaqを使用することが好ましい。特に高感度な用途のためには、マルチプレックスqPCRの更なる変更、例えばDNAザイム又はMNAザイムを用いるマルチプレックスqPCRが、本発明における用途に有益であることがある。本明細書で述べられる要因の一覧及びマルチプレックス最適化のストラテジーは、決して外延的なものと解釈されるべきではなく、当業者によって直ちに理解されるものである。

本発明の好ましい実施形態においては、本発明のシステム及び方法におけるqPCRの定量化は、検量線法に基づくものであるが、その他の定量化ストラテジーを使用することもできることは、当業者によって直ちに理解されるものである。

同様に、多くの種々の一般的なタイプの蛍光色素又は検出プローブを、本発明のシステム及び方法において使用することができる。好ましい実施形態においては、配列特異的プローブ、例えばエキソヌクレアーゼプローブ、ハイブリダイゼーションプローブ又は分子ビーコンから選択されるプローブが使用されることとなる。そのようなプローブは、アッセイに特異性を与えるだけでなく、マルチプレックス用途を可能にするのに重要である。実施例に示されるように、本発明の方法は、Taqmanプローブを使用することで効果的に適用されたが、その他のプローブも同様に適切であろう。

有益には、NGSライブラリ調製と共に、本発明のカートリッジは、その中に供給された臨床試料の、治療に対してアクショナブルなアレル又は疾患関連配列の存在に関する同時のqPCRスクリーニングを可能にする。そのような配列の幾つかの例には、他にも多数あるなかでも、癌と関連した変異遺伝子配列、又は病原性生物による進行中の感染の指標である外来の病原性配列が含まれる。このように、好ましい一実施形態においては、qPCRを実施するための試薬が、少なくとも1つのプライマー組、好ましくは少なくとも1つの疾患関連のターゲット核酸配列を増幅するための複数のプライマー組を含むカートリッジが提供される。

本発明の更なる態様においては、本明細書で提供されるカートリッジはまた、有益には、精製された核酸又は既に得られたライブラリのクオリティーを評価するための手段を含み得る。このように、もう一つの好ましい実施形態においては、qPCRを実施するための試薬が、少なくとも1つのプライマー組、好ましくはクオリティーコントロール（QC）qPCRを実施するための複数のプライマー組を含むカートリッジが提供される。原則的に、QC qPCRを実施するために、ターゲットは、任意の遺伝子又はゲノム領域から選択することができる。しかしながら、癌のような遺伝学的に不安定な状態の診断のためには、それらの変異した配列又はコピー数の変化を有する可能性のある疾患感受性領域を避けることがより好ましい。したがって、好ましい一実施形態においては、クオリティーコントロールマルチプレックスqPCRのターゲットは、単一コピー遺伝子、例えばハウスキーピング遺伝子のエキソン内配列から選択される。上記解決策の更なる利点は、エキソン内領域に対する同じターゲット配列が、DNAクオリティー及びRNAクオリティー両方のライブラリ材料としての評価において使用することができるということである。このため、1つの試料からのゲノム及びトランスクリプトームの両方をシーケンシングすることが望ましく、DNAベース及びRNAベースの両方の構築が必要とされ、したがってその両方についてのクオリティー検証も必要とされる場合、このような本発明のクオリティーコントロールマルチプレックスqPCRの設計が特に有用である。このように、好ましい一実施形態においては、本発明のシステム及び方法で使用されるべきクオリティーコントロールマルチプレックスqPCRは、単一コピー遺伝子における少なくとも1つのエキソン内配列をターゲットとする。場合によっては、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ又はそれ以上の単一コピー遺伝子における1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ又はそれ以上のエキソン内配列がターゲットとされる。ハウスキーピング遺伝子の代わりに、DNAライブラリ構築において、反復配列（例えば、LINE又はSINE、例えばAluエレメント）が対象となるターゲットであってよい。実施例部に示される限定されない例としては、本発明の方法は、RNアーゼP遺伝子、HPRT1遺伝子、β−アクチン遺伝子、TRFC遺伝子及びABCB1遺伝子のエキソン内配列で効果的に実施される。

好ましい一実施形態においては、本発明のカートリッジは、QC qPCRに加え、疾患関連のターゲット核酸配列を増幅するアッセイqPCRを実施することができる。このように、有益な実施形態においては、試料区画及び核酸を遊離又は精製するための手段の下流に位置する少なくとも1つの第二の熱サイクル用qPCR区画を更に含むカートリッジであって、その少なくとも1つの第二の熱サイクル用qPCR区画が、遊離若しくは精製された核酸の少なくとも一部又はライブラリ区画において調製された核酸ライブラリの一部を受容するように構成され、かつ核酸のクオリティーコントロール（QC）qPCRを実施するための少なくとも1つのプライマー組を含む、カートリッジが提供される。

種々のサイズのアンプリコンを生成するマルチプレックスqPCRは、核酸のクオリティーを評価するために特に適していることが認められている。したがって、もう一つの好ましい実施形態においては、種々のサイズのアンプリコンを生成するための複数のプライマー組を含むカートリッジが提供される。アンプリコンのサイズ範囲は、より小さいサイズのAxからより大きいサイズのAy（ここで、x<y）までにおよび、典型的には50 bp〜600 bpのサイズ範囲である。好ましくは、より小さいAxのサイズは、50 bpから110 bpまでの範囲であり、その範囲の間のどの長さであってもよい。好ましくは、Axは、60 bp±10 bpの間である。本明細書で実施例において更に示されるように、Axは、63 bp又は105 bpである。好ましくは、より大きいAyのサイズは、300 bpから550 bpまでの範囲であり、その範囲の間のどの長さであってもよい。実施例に更に示されるように、Ayは、504 bp（例えば、TRFC遺伝子について）、或いは318 bp（例えば、β−アクチン遺伝子について）である。RNAシーケンシングの場合に、特にmicroRNA（例えば、15 bp〜35 bpのサイズ範囲）に焦点を絞った用途において、より小さいAxサイズ範囲を、相応して小さくする必要があることがある。当業者に理解されるように、本発明の目的のためのマルチプレックスqPCR設計の間に、好ましいアンプリコンサイズは、有益には、アンプリコンの長さによるNGSカバレッジについての最も適切な推定を提供するために、選択されたNGS用途に応じて選択され得る。

好ましい実施形態においては、生物学的試料は、ヒトの臨床試料である。臨床試料は、採取したての試料、採取したての凍結試料、細針吸引物、保存のために処理された固定化処置のため反応性部位の架橋を含み得る試料、ワックス接触試料若しくはワックス包埋試料、FFPE切片の形のFFPE試料、液体試料、例えば尿試料、血液試料、血清試料又は任意のその他の臨床試料であってよい。

本発明のカートリッジに導入されると、生物学的試料は、通常、核酸の放出をもたらす組成物と接触させることによって処理されることとなる。好ましい実施形態においては、該組成物は、マイクロ流体分析器で使用するように最適化されており、好ましくは、有機溶剤ではなくサーファクタントを含有する。上記組成物との混合は、通常は、そのような処理された試料のマイクロ流体システムを通じた輸送も容易にする。試料がFFPE試料である実施形態においては、上記組成物中に含まれるサーファクタントは、好ましくは非イオン性である。FFPE試料から得られる核酸は、一般的に、ヌクレオチドとヌクレオチドとの架橋及びヌクレオチドとタンパク質との架橋、塩基修飾並びに核酸の完全性に影響を及ぼすその他の化学的修飾を含む。本発明の好ましい方法は、非イオン性サーファクタントを導入し、有機溶剤を使用せずに、包埋されたワックスの自動化された除去及び成分の遊離を可能にする。このことが特に有益であるのは、そのサーファクタントが、遊離された核酸を、PCRを介した核酸増幅のような酵素活性を必要とする小規模用途と適合する条件及び環境に置くからである。一実施形態においては、試料から放出される溶解物及び／又は成分は、診断分析器においてマイクロ流体システムを使用して更に処理されることとなる。

任意に、遊離された核酸は、本発明によるqPCR及び核酸ライブラリ構築のための鋳型として直接的に使用するために十分に純粋な形で提供される。好ましい実施形態においては、核酸遊離手段は、流体装置又はマイクロ流体装置においてその機能を発揮する。そのような事例において、そのような核酸遊離手段を形成するエレメントは、一連の連続した、又はさもなくば流体連通したチャンバ又はチャネルのような区画を含んでよく、その少なくとも幾つかには、溶解バッファー、酵素溶液、抽出バッファー、結合バッファー、及び／又は洗浄バッファーのような試薬が供給されているか、又はその少なくとも幾つかは、任意に、機械的な試料洗浄又は核酸の結合、洗浄及び放出のような処理を容易にする、当該技術分野で既知の物理障壁、例えばフィルタ又は高親和性樹脂のいずれかを含む。核酸遊離のためのそのような手段及び代替的な手段は、当該技術分野で良く知られており、したがって本明細書においては、あまり詳細には論じないこととする。

通常は、本発明の流体カートリッジは、その中に受容された試料から遊離及び／又は精製された核酸を、少なくともライブラリ区画と熱サイクル用qPCR区画とに分割するための手段を含むものとする。そのような手段は、例えば、核酸源受容区画又は上記核酸源から遊離された核酸が核酸遊離過程の最終工程で堆積される区画から、熱サイクル用qPCR区画中及びライブラリ区画中のそれぞれに延びる2つの別々のチャネルを含むことができる。選択された区画の間に核酸を能動的に輸送するために、本発明の自動化されたシステムは、所望の量の流体を規定された方向へと押す又は引くことが可能な圧力勾配を提供することができる。ポンプ、吸引装置、マニホールド等によるそのような圧力勾配の生成は、現在のマイクロ流体システムで広く使用されており、したがって、当該技術分野で良く知られている。

当業者に理解されるように、本発明のために適した流体カートリッジ又はマイクロ流体カートリッジは、熱サイクル用qPCR区画及びライブラリ区画を含む少なくとも2つの反応チャンバ並びに1つ以上の流体チャンバを含み得る。流体チャンバの幾つかは、試料から溶解物を生成するために使用される流体を保持し得る。その他のチャンバは、洗浄流体及び増幅溶液等の流体を保持し得る。熱サイクル用qPCR区画及びライブラリ区画としては、別々の反応チャンバが使用される。熱サイクル用qPCR区画として機能するように構成されるチャンバは、その他の増幅試薬及びqPCRの実施のために必要な酵素と一緒に、多くのプライマー組を含む。ライブラリ区画として機能するように構成されるその他のチャンバは、選択されたNGS用途のための核酸ライブラリを構築する工程を実施するように適合される。試料の一部は、反応チャンバへ移送されることとなり、そのような移送を可能にするために、チャンバは、1つ以上の流体チャネルに連結される。これらの流体チャネルの少なくとも1つであるが、好ましくはそれぞれにおいて、バルブ手段が設けられていてよく、そのバルブ手段は、好ましくは通常、流体チャネルを閉じるが、該バルブ手段が動作したときに流体チャネルを開放し、それによりそれぞれ2つのチャンバが流体連通される。バルブ手段は、一方向弁として設計され得る。

もう一つの実施形態においては、本発明のカートリッジのライブラリ区画及び熱サイクル用qPCR区画の1つ以上は、該カートリッジを係合する自動化されたシステムにおいて同時又は逐次に操作され得る。つまり、3つの作業モードを想定することができる：（i）両方の区画は、核酸が区画に供給されたら作動し、こうしてライブラリ調製は、qPCRとは独立であり、qPCRと並行して進行する；（ii）まずqPCRが行われ、次いでライブラリが作製され、このように、qPCRの結果が分かったらシーケンシングのためのライブラリを調製する決断がなされ、その決断はこれらの結果に依存し得る；（iii）まずライブラリが作製され、次いでqPCRは、ライブラリクオリティーの検証のために、そのライブラリに対して行われる。

上記選択肢（i）は、核酸試料の一部からのNGSのためのライブラリの調製を、同じ核酸試料の別の部分に対するqPCRアッセイと同時に実行し、両者を、好ましくはカートリッジ式のマイクロ流体システム中で並行して行う同時の作業を記載している。本明細書で使用される場合に、用語「同時に」又は「並行して」とは、同じ時点で起こる又は同じ時点で行うことを指す。そのような取り合わせにおいては、qPCRは、核酸試料からの一部に対して行われるのと同時に、NGS用途のための核酸ライブラリが、同じ核酸試料からの別の部分から構築される。すなわち、同時の作業の間に、qPCRを介した試料の分析及びライブラリ構築の両方が、本発明の自動化されたシステムによって同時に実行される。

それに対して、上記選択肢（ii）及び（iii）は、両方とも「逐次に」作動されるものとして記載され得る。逐次の作業の可能な一実施形態においては、少なくとも2つの熱サイクル用qPCR区画が、本発明の自動化されたシステムにおいて作動する。例えば、第一のqPCRは、対象となるマーカーの発現を読み取り、そして該システム中に供給される核酸源のクオリティーを検証するために行われ得る。この第一のqPCRの後に（逐次）、又は時間を節約するために、上記第一のqPCRと並行して（同時に）、ライブラリが構築される。次いで、第二のqPCR又はコントロールqPCRを、このようにして構築されたライブラリに対して、そのクオリティーが該ライブラリを更なる用途、例えばシーケンシングにかけるために十分であるかどうかを検証するために実施することができる。

NGシーケンシングライブラリの調製又は構築に関しては、最近では、シーケンシング準備済みのライブラリを生成する多くの様々な方法が存在し、それらの選択は、通常は、どのNGSストラテジーを実施することを意図しているかに依存する。一般に、NGSライブラリ生成は、所定のNGSと適合可能な核酸断片の生成を含む。したがって、好ましい実施形態において、ライブラリにおいて核酸ライブラリを調製するための試薬が、
ライブラリ区画中に受容された遊離又は精製された核酸の部分から核酸断片を生成することを可能にし、かつ、
上記生成された核酸断片の少なくとも一方の端部、好ましくは両方の端部にオリゴヌクレオチドアダプターを結合させることを可能にする、カートリッジが提供される。

ほとんどの商業的に利用可能なNGSプラットフォームに関して、核酸断片の増幅は、シーケンシング用鋳型の十分なコピーを生成する必要がある。このように、好ましくは、核酸断片の生成が、更に「ライブラリPCR」と呼ばれるPCRによって実施され、かつオリゴヌクレオチドアダプターの、ライブラリPCRで生成された核酸断片への結合が、そのライブラリPCR中に使用される少なくとも1つのプライマーの配列中にアダプター配列を含めることによって実施されるカートリッジが提供される。適切なライブラリPCRは、当該技術分野で既知であり、ブリッジ増幅又はエマルジョンPCR等の方法を含む。

既に上述したように、核酸ライブラリの構築は、DNAシーケンシング、RNAシーケンシング、及びその他の用途、例えばシーケンシングベースのメチル化解析のために必要とされる。RNAシーケンシング（RNA-seq）は、生物のトランスクリプトームを、ディープシーケンシング技術を使用して調査する方法である。トータルRNAは、一般的に、非常に小さい割合にすぎないコーディングRNA又は機能的RNA、リボソームRNA（rRNA：トータルRNAの80%〜90%まで）、そしてより少ない程度のトランスファーRNA（tRNA）を含み、それらが試料中のRNAの大部分を構成する。しばしば、反復rRNA配列に対するそのシーケンシング能力の80%〜90%を使用しないために、rRNAを、シーケンシング前に試料から除去することができる。rRNAの除去後のRNAが、ライブラリにされる。これは、RNA（又は断片化されたRNA）からの逆転写による二本鎖cDNAの作製を含む。次いで、この二本鎖cDNAは、それを適切なNGSストラテジーに特異的なアダプターと結合させることを含む残りのライブラリ構築過程全体を通じて、通常のゲノムDNAとして取り扱うことができる。

本発明のカートリッジが、NGSと、QC qPCRによる試料のクオリティー評価と、場合により幾つかのターゲット特異的qPCRアッセイとを含む幾つかのアッセイから並行したデータセットを生成するための使いやすい方法を提供する場合に、特に実践的な実施形態においては、本発明のカートリッジは、有益には、1つのカートリッジ又は1人の患者由来の試料に対して行われる全てのアッセイのトラックを簡単に保持することが可能となる、カートリッジ又は患者に特有の情報を記憶可能なエレメント、すなわち識別子を備えていてよい。そのような識別子は、例えば、カートリッジ番号、そのバッチ番号又は連番、製造日及び有効期限、そのカートリッジが担うターゲット特異的アッセイのタイプ等のようなデータを含むカートリッジ固有のコード又はバーコードであってよい。或いは該識別子は、ディスク又はマイクロチップのような読み出し可能であるだけでなく書き込みも可能な記憶媒体であってよく、ここで、自動化された患者の特定を容易にし、試料の混同を最小限にするために、患者に特有のデータ（名前、年齢、アッセイ日等のようなデータ）を取り込み、記憶し、次いで自由自在に検索することができる。該識別子は、適宜にスキャンすることができるか、又はさもなくば、そのようなカートリッジと係合し、それを処理する自動化されたシステム中に導入することができ、こうして、操作者が実行を行う時間が必要なデータのタイピング分だけ節減され、ワークフロー中に人為ミスが起こり得る段階が排除されることとなる。さらに、実行と1つの特有のカートリッジ識別子又は患者識別子との関連付けのおかげで、同じ患者由来の試料に対して行われた異なる試験を、自動的にも、容易にたどることが可能となり、検索可能となり、互いに関連付け可能となり得る。このように、有益な実施形態においては、本発明は、先の実施形態によるカートリッジであって、固有コード、バーコード又はマイクロチップ等のような、カートリッジに特有の情報を記憶するためのカートリッジに特有の識別子を更に含むカートリッジを提供する。

別の態様では、以下：
試料区画中に受容された生物学的試料の一部、
試料区画中に受容された生物学的試料から遊離又は精製された核酸の一部、
ライブラリ区画中で調製された核酸ライブラリの少なくとも一部、
のいずれかの回収を可能にする、試料区画の下流に位置する回収区画を更に含む、カートリッジが提供される。

そのような回収区画は、本発明のシステムの作動の間に反応が行われない別のチャンバを含んでもよく、又は単純に該チャンバでできていてよい。そのような回収は、好ましくは、本発明の自動化されたシステム又は自動化されたシステムのカートリッジの外側から容易にアクセス可能であるものとする。例えば、上記回収区画は、シリンジの針又はピペットによって穴を空けることができ、こうしてその内容物を吸引することが可能となる穴を空けることができる材料（例えば、フォイル又はフィルム）でできた壁部を含み得る。代替的には、回収区画を、上記のいずれかと選択的に流体連通させて、そしてポンプ動作によって、本発明の自動化されたシステムのインターフェースを通じて利用者により示される指示に従ってそれを充填することができる。

可能な実施形態においては、そのような回収区画は、本発明の自動化されたシステムと係合可能又は連結可能な外部容器、例えばプラスチックチューブ又はバイアルであってよい。そのような事例においては、以下のような区画：
カートリッジ中に導入される生物学的試料の少なくとも一部又は上記試料から遊離された核酸の少なくとも一部を収容する区画、
ライブラリ区画、
少なくとも1つの熱サイクル用qPCR区画、
のいずれかは、その区画と回収区画とを、上記の列挙された区画のいずれか1つに含まれる内容物の少なくとも一部を回収区画中に移送することが可能な任意の手段によって流体連通させる（bringing）ことが可能な構造（例えば、チャネル又はチャネルを形成するエレメントと係合可能な区域のような延長部）を含み得る。

有益な実施形態においては、ライブラリ区画は、その区画とNGSが行われる区画とを直接的に流体連通させることができる構造を含んでよく、場合により上記区画は、カートリッジの処理を行う自動化されたシステムの一部である自動シーケンサを含む別のサブシステム中に含まれている。

更なる態様においては、本発明はまた、次世代シーケンシング（NGS）核酸ライブラリを生物学的試料から調製するための自動化された方法であって、
a）生物学的試料を受容する工程と、
b）受容された生物学的試料から核酸の少なくとも一部を遊離又は精製する工程と、
c）遊離又は精製された核酸の少なくとも一部を、NGS核酸ライブラリを調製するための、核酸ライブラリを調製するための試薬を含むライブラリ区画中に供給する工程と、
d）NGS核酸ライブラリを調製する工程と、
を含み、少なくとも工程b）〜工程d）は、自動化されたシステムにおいて、少なくとも生物学的試料が上記自動化されたシステム中に受容された後に一切の人の手による介入なく行われる、方法を提供する。

好ましい一実施形態においては、NGS核酸ライブラリを調製する工程は、PCRによって実施される。

本発明の方法の上記実施形態により特に好ましいもう一つの実施形態においては、上記方法は、qPCRを、上記自動化されたシステムにおいて、NGS核酸ライブラリを調製する工程に対して逐次又は同時のいずれかで実施する工程を更に含み、ここで、上記qPCRは、遊離又は精製された核酸の第二の部分に対して、核酸を増幅し、かつそのような増幅の間に生成されるシグナルの検出を可能にするために適した熱サイクル用qPCR区画において実施される。

先に説明されるように、本発明の態様の一つは、NGSライブラリを調製するのと並行して、同じ試料から得られた核酸を使用してアッセイqPCR及び／又はQC qPCRのいずれかを実行することを含む。したがって、もう一つの実施形態においては、上記少なくとも1つのqPCRが、少なくとも1つの疾患関連のターゲット核酸配列を増幅するものであるか、又はクオリティーコントロール（QC）qPCRである方法が提供される。

特に好ましい実施形態においては、本発明の方法は、自動化されたシステムと係合可能な1つのカートリッジにおいて実施される。こうして、最も好ましくは、上述の試料から核酸を取得する工程、NGSライブラリ調製工程、アッセイqPCR工程及びQC PCR工程は、1つのカートリッジ中で、好ましくは分析器型の装置と係合可能な流体カートリッジ又はマイクロ流体カートリッジである1つのカートリッジ中で実施されるので、そのカートリッジは、本発明による方法の工程を実施するための自己充足型の使い捨てプラットフォームである。そのような有益な実施形態においては、本発明の方法を実施するために必要とされる試薬の全ては、好ましくは乾燥形又は凍結乾燥形における貯蔵を考慮して、そのようなカートリッジ内に事前配置される。

もう一つの好ましい実施形態においては、上記の考慮すべき有益な事項のために、望ましくは、カートリッジが、カートリッジに特有の情報を記憶するためのカートリッジに特有の識別子を含む方法であって、該カートリッジに特有の識別子に記憶された情報を自動化されたシステムへと取り込む工程を更に含む、方法が提供される。

まとめると、本発明は、「試料を取り入れ、クオリティーが確認された核酸ライブラリを出力する」統合されたストラテジーを有するワークフローの効果的な自動化をもたらす。本明細書に表されるアプローチは、最小の所用時間、より低い費用、そして改善されたNGS成功率をもたらすための大きな可能性を有する。さらに、本発明のカートリッジ、自動化されたシステム及び方法は、ライブラリを構築するワークフローの単純化及び加速をもたらすだけでなく、それらは、種々の試料タイプでの使用のために、FFPE試料のような難しい試料でさえも汎用的に適合可能でもある。このように、本発明の最後の態様においては、生物学的試料からの次世代シーケンシング（NGS）ライブラリの自動化された調製のための、本発明のカートリッジ、自動化されたシステム及び方法の使用が提供される。

上記の一般的な記載及び詳細な説明は両者とも例示的かつ説明的なものであるにすぎず、特許請求の範囲に記載の発明を何ら制限するものではないと理解されるべきである。本出願において、単数形の使用は、特に記載がない限り複数を含む。本出願において、「又は」の使用は、特に記載がない限り「及び／又は」を意味する。用語「含む、挙げられる（"including", "includes" or "included"）」の使用は、非限定的である。

実施例1：核酸の試料採取から出力までの自動化された評価のためのQC qPCRの開発
最初に、試料中に存在する核酸の量及びクオリティーを完全に自動的に評価する目的のために、クオリティーコントロール（QC）qPCRアッセイを開発した。それぞれ異なる単一コピーのヒト遺伝子から得られる様々な長さのアンプリコンの存在についての当該QC qPCRは、NGS用途のための核酸の適性を評価するために役立つ。アンプリコン及びそれらの長さは、以下の通りである：（1）ヒトRNアーゼP遺伝子由来の63 bp断片、（2）HPRT由来の105 bp断片、（3）TFRC由来の149 bp断片、（4）ABCB由来の213 bp断片、及び（5）β−アクチン由来の318 bp断片。1度のPCR反応での複数の断片の増幅（5プレックス）を、最初に液状化されたFFPE試料（Horizon FFPE試料）に対してGoTaqポリメラーゼ及びTaqmanプローブ（供給元によって特定された組成）を用いて行われたqPCRを使用して検証した。qPCRプログラムは、95℃で5分間保持し、引き続き95℃で5秒間、64℃で44秒間を50サイクルであった。図1は、TBE中での電気泳動後のSYBRグリーン染色された10%ポリアクリルアミドゲル上の得られた断片（左のレーン）とその隣のDNAラダー（右のレーン）とを示している。同じ試料の相応のqPCRプロファイルは、図2に示されている（アンプリコンのサイズは、相応の曲線の隣に示される）。Biorad社製CFX Manager 3.1に内蔵される回帰アルゴリズムで決定されたCq値は、（1）63 bp断片（RNアーゼP）に関して26.1であり、（2）105 bp断片（HPRT）に関して25.6であり、（3）149 bp断片（TFRC）に関して26.0であり、（4）213 bp断片（ABCB）に関して26.2であり、かつ（5）318 bp断片（β−アクチン）に関して27.4である。

次に、断片化されていないヒトゲノムDNAに対する5プレックス性能を評価することで、検量線と一緒に5つのアンプリコンのそれぞれについてのR二乗値を得た。そのために、173 μg/mlの断片化されていないヒトゲノムDNA（Promega）を基質として使用し、そして3.3 pg／半数体のゲノムを前提として用いてコピー数を推定した。1つのPCR当たりに24000コピーで4複製物が、6000コピーで4複製物が、1500コピーで8複製物が、375コピーで8複製物が、94コピーで12複製物が、23コピーで16複製物が、5.9コピーで20複製物が、そして1つのPCR当たりに1.5コピーで24複製物が増幅され、上記のようにCqが決定された。Cqの中央値を、非増幅（いわゆる、フラットライナー）を省いて決定した。この実験を表す棒グラフは、図3に示されている。検量線は、それぞれのアンプリコンについて対数回帰を使用して推定し、R二乗値は、図4で例示されるように、完全なデータセット並びに1つのPCR当たりそれぞれ5.9コピー及び1.5コピーの両方からのCq値を含まないデータセットについて測定した。予想されるように、R二乗値は、2桁のコピー数におけるデータ点だけでは、より良好に1に近づく。34未満のCq値に関しては、最も高いR二乗値を有する等式を使用した。とりわけ、34を上回るCq値については、その定量化は、確率的影響のためあまり正確でないことが分かる。こうして上記等式に従って計算された5種のアンプリコンのそれぞれのコピー数は、所定の試料における有用なDNA含量及び核酸断片化の程度の両方の測定を可能にする。log2（投入コピー数）とCqとの間の線形回帰の方向係数の分析は、アンプリコンのそれぞれの5プレックスqPCRにおける増幅の効率の更なる指標を提供する。当該技術分野で既知のように、完璧なqPCRは、1サイクル当たりアンプリコンの量（したがってまた、正味のTaqman蛍光）を二倍にすると推定され、絶対方向係数1から離れることとなる。こうして、図4に示されるように、318 bpの最大のアンプリコンを除く全てのアンプリコンについての絶対方向係数は、0.9又はそれより高く、そのことは、1PCRサイクル当たりTaqmanプローブ分解の倍に近いロバスト性の増幅を指摘している。最も大きいアンプリコンサイズは、0.8より高い絶対方向係数を示し、そのことは、最も大きい断片が、より遅く増幅すること、そしてこのタイプのTaqmanプローブベースのアッセイについてより長いアンプリコンを用いてPCR QC試験を設計することにほとんど意味がないことを指摘している。

実施例2．自動化されたFFPE試料処理、核酸クオリティー評価、アクショナブルなターゲットマーカーのスクリーニング及びライブラリ構築
本発明の実現可能性を実証する目的のために、それぞれのカートリッジが、別々のPCRチャンバ中に、（i）上記の5プレックスQC qPCRを実施するための試薬と、（ii）wt及びV600M／R変異型のBRAFを検出するためのターゲットqPCRを実施するための試薬と、（iii）Illumina社製MiSeqシーケンサと適合可能なDNAライブラリを構築するための試薬とを含む一式のBiocartis社製Idyllaカートリッジを準備した。次いで、上記カートリッジで分析されるべき一式のFFPE試料を、ヒトBRAFをコードするプラスミドでスパイクした。臨床的な現実をシミュレートするために、野生型（wt）BRAF配列を含む断片、V600M変異をコードする断片、並びに2つの変異V600K及びT1794Cをコードする断片を含む種々のBRAF配列を使用した。2つの変異した断片を、FFPE試料中に存在する野生型コピーの量に対して種々の量でスパイクすることで、それぞれ10%及び5%の相対濃度を得た。種々のBRAFでスパイクされたFFPE試料のそれぞれを、個別のカートリッジ中に導入し、Biocartis社製Idylla機器で完全に自動的に処理した。要するに、その処理は、試料液状化（例えば、国際公開第2014128129号中に記載される）に引き続き、カートリッジ中に設けられるシリカ膜での核酸精製を行い、次いで並行して実施される3つの独立した個別に制御されたPCR反応を行うことを含み、それらのPCR反応は、（i）上記のクオリティーコントロール5プレックスQC qPCRによる精製された核酸のクオリティーの検証と、（ii）選択されたBRAFターゲットのリアルタイム検出（アクショナブルなターゲット変異に関するqPCR）と、（iii）Illumina社製のMiSeqシーケンサと適合可能なリンカーを含むBRAF特異的又は標準的なランダムプライムするプライマーを使用したDNAライブラリの構築とを含んでいた。このライブラリ構築PCRは、Q5高忠実度ホットスタートポリメラーゼ（New England Biolabs）を使用して実施し、以下のプログラム：95℃で5分間及び60℃で90秒間、94℃で5秒間の50サイクルに従ってサイクル処理した。

図5は、種々のFFPE試料に対する5プレックスQC qPCRの結果を示しており、それらは、上記試料中に存在するDNAの完全性に関する情報を提供する。パネルAは、比較的インタクトなDNAを含むFFPE組織試料の3つの例を示す。パネルBは、わずかにより高い程度のDNA断片化を有するその他の3つの例を示す。最後に、パネルCは、かなり断片化されたDNAを含むFFPE組織試料の6つの例を示す。パネルCは、そのような試料をNGSによる更なる分析に供するための反対指標である。

その5プレックスQC qPCRの結果に基づいて、比較的インタクトなDNAを有し、3種の異なる形のスパイクされたBRAF（wt、V600M変異体、又はV600K＋T1794C二重変異体）を含む3つの試料を、更なる調査に選択した。最初に、wt BRAF及びV600M BRAF変異体を検出可能なアッセイqPCRから得られた結果を検討することで、正確なBRAF形の存在を確認した。結果を図6に示す。それらの結果は、スクリーニングされた3つのFFPE試料の全てにおいて、wtBRAFシグナルを検出することができることを裏付けている（図6、左欄、用語「ターゲット」とは、wt BRAF配列を指す）。種々のBRAFプラスミドでスパイクする前の全てのFFPE試料が、wtゲノムBRAF配列を含むことは分かっているので、この結果は予測された。V600M変異体の検出に関して（図6、右欄、用語「ターゲット」とは、V600M／K BRAF配列を指す）、予想されるように、wt BRAFをコードするプラスミドでのみスパイクされた試料においては、V600M変異体は検出することができなかった（図6、右の上部、ターゲットに関しては平坦なシグナル線）。しかしながら、V600M変異体又はV600K＋T1794C二重変異体のいずれかでスパイクされたFFPE試料においては、変異V600Mは、予想される量で正しく検出された（図6、右欄、下部と中央部）。本明細書で使用されるBRAF特異的なqPCRは、T1794C変異について特異的なプローブを含まなかったので、その変異は、二重変異型BRAFでスパイクされた試料において検出することはできなかった。

実施例3．選択されたNGSライブラリのシーケンシング
BRAF特異的なqPCRの結果を確認するとともに、未検出のT1794C変異の存在を検出するためにも、同じ3つの選択されたFFPE試料のプラスミド（wt、V600M、又はV600K及びT1794C）から構築されたNGSライブラリを、次いで、Illumina社製MiSeqシーケンシングにかけた。これらのライブラリを構築するために使用したライブラリPCRは、図7に概略的に示される。該ライブラリPCRは、上述のように5プレックス（5plex）QC PCR及びBRAF特異的アッセイqPCRと同じカートリッジで、それと並行して実施した。そのライブラリPCRは50サイクルを含み、単純化されたBRAF特異的融合プライマー（テイルドプライマーとしても知られる）を使用した。融合プライマー（図7の中央部に示される）は、ターゲット（BRAF）特異的配列以外にも、シーケンシング用プライマー配列及びフローセル結合のためのタグ（P5及びP7）を含んでいた。さらに、リバースプライマーはまた、シーケンシング実行の間に、種々の起源から得られた試料を識別することを可能にするバーコード（及び／又はインデックス）を含んでいた。そのようなバーコードを導入する理由は、一般的に、種々の試料又は患者から構築されたライブラリは、同じNGS機器でプールされ、シーケンシングされるからである。こうして、3つの異なるFFPE試料から得られたライブラリを区別するために、それぞれのカートリッジは、固有バーコード配列を有する僅かに異なるリバースプライマーを含んでいた。

シーケンシング前に、3つのNGSライブラリを、それぞれのカートリッジから針付きシリンジを使用して回収し、その後に試料をプールし、ベンチで更に精製することで、あらゆる未反応のプライマー及びプライマーダイマーを除去した。この精製工程は、自動的に実施することもできることに留意すべきである。最後に、精製されたNGSライブラリを、Illumina社製MiSeq機器のフローセル中にロードし、シーケンシングした。

シーケンシング実行の結果は、図8に示されている。BRAF特異的qPCRの上記結果と一緒に、wt BRAFのみを含む第一の試料においては、変異は検出されなかった。その他の2つの試料については、全ての予想されたBRAF遺伝子変異は、BRAF特異的qPCRで捕捉することができなくても、シーケンシングの間に正しく同定された。特に、NGSは、ターゲット特異的qPCRで見逃されたT1794C BRAF変異を検出しただけでなく、変異体及び二重変異体でスパイクされたFFPE試料のそれぞれにおいてV600M変異とV600K変異とを識別することを可能にし、こうして、既に検出された変異のより一層正確な同定が提供される。当該結果は、本発明の前例のないロバスト性を裏付け、ここで、所望の結果が、迅速かつ効率的に提供されるだけでなく、より深い洞察が望ましい場合に、自由自在に効果的にフォローアップすることができる。

本発明のより完全な理解のために、上記のワークフローが、図9に図示されている。FFPE試料をカートリッジ中に供給することから始まり、その後に後続工程は、最終qPCRの結果（QC qPCR及びアクショナブルなターゲットマーカーqPCR、ここではBRAF）及び使用準備済みのライブラリが得られるまで、完全に自動的にかつ迅速に実施される（リアルタイムの枠組みが提供される）。全てのこれらの結果及びライブラリは、同一処理された同じ試料から得られ、それは、異なるアッセイからのデータの高い比較性を保証することに留意すべきである。とりわけ、並行したNGSライブラリ構築及び上記ライブラリのクオリティーに関する情報を提供することによって、本発明のアプローチは、所定の試料をNGSの臨床的フォローアップに迅速に供することを可能にするだけでなく、そのようなかなり費用のかかるフォローアップが、その試料のクオリティーを考慮して可能かどうかを決定することもできる。上記の点で、本発明は、現在の診断業務における新たな可能性を開く。

図面訳
図1
5plex 5プレックス
b-actin b-アクチン
RNaseP RNアーゼP

図2
Amplification 増幅
Cycles サイクル数

図3
unfragmented human DNA 断片化されていないヒトDNA

図4
Linear 線形
copy number コピー数

図5
little fragmentation ほとんど断片化されていない
slightly more fragmented わずかにより断片化されている
heavily fragmented かなり断片化されている
Cq regression no normalization Cqの正規化なしの回帰
amplicon length, in bp アンプリコンの長さ（bp）

図6
Sample 試料
exon エキソン
Wild type 野生型
Positive control ポジティブコントロール
Target ターゲット
Arbitrary fluorescence units 任意の蛍光単位
Cycle サイクル数

図7
wild type 野生型
F. Seq primer フォワードシーケンシングプライマー
R. Seq primer リバースシーケンシングプライマー
F. primer フォワードプライマー
R. primer リバースプライマー
index インデックス
F. Seq フォワードシーケンシング
R. Seq リバースシーケンシング

図8
Sample 試料
exon エキソン
wild type 野生型
Color by 色は以下の通り
A percentage Aのパーセンテージ
C percentage Cのパーセンテージ
G percentage Gのパーセンテージ
T percentage Tのパーセンテージ
Gap percentage ギャップのパーセンテージ
Frequency 頻度

図9
plasmid プラスミド
Liquefied sample 液状化された試料
library ライブラリ
automated 自動的
Purified library 精製されたライブラリ
MiSeq run MiSeqの実行

Claims (15)

1. 生物学的試料を受容するための試料区画と、
   前記試料区画中に受容された生物学的試料から核酸を遊離又は精製するための手段であって、前記試料区画と流体連通させることが可能な手段と、
   前記試料区画及び前記核酸を遊離又は精製するための手段の下流に位置する、核酸ライブラリを調製するためのライブラリ区画であって、遊離又は精製された核酸の少なくとも一部を受容するように構成されており、かつ核酸ライブラリを調製するための試薬を含むライブラリ区画と、
   を含む、生物学的試料の自動化された処理のためのカートリッジ。
2. 前記試料区画及び前記核酸を遊離又は精製するための手段の下流に位置し、かつ遊離若しくは精製された核酸の少なくとも一部又は前記ライブラリ区画中で調製された核酸ライブラリの少なくとも一部を受容するように構成された少なくとも1つの熱サイクル用qPCR区画を更に含み、前記熱サイクル用qPCR区画は、核酸を増幅し、そのような増幅の間に生成されるシグナルを検出可能にするために適しており、かつqPCRを実施するための試薬を含む、請求項1に記載のカートリッジ。
3. 前記qPCRを実施するための試薬が、少なくとも1つのプライマー組又は少なくとも1つの疾患関連のターゲット核酸配列を増幅するための複数のプライマー組を含む、請求項2に記載のカートリッジ。
4. 前記試料区画及び前記核酸を遊離又は精製するための手段の下流に位置する少なくとも1つの第二の熱サイクル用qPCR区画を更に含み、該少なくとも1つの第二の熱サイクル用qPCR区画は、遊離若しくは精製された核酸の少なくとも一部又は前記ライブラリ区画において調製された核酸ライブラリの一部を受容するように構成され、かつ核酸のクオリティーコントロール（QC）qPCRを実施するための少なくとも1つのプライマー組を含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載のカートリッジ。
5. 種々のサイズのアンプリコンを生成するための複数のプライマー組を含む、請求項4に記載のカートリッジ。
6. 前記核酸ライブラリを調製するための試薬が、
   前記ライブラリ区画中に受容された遊離又は精製された核酸の部分から核酸断片を生成することを可能にし、かつ、
   前記生成された核酸断片の少なくとも一方の端部若しくは両方の端部にオリゴヌクレオチドアダプターを結合させることを可能にする、請求項1〜5のいずれか一項に記載のカートリッジ。
7. 核酸断片の生成が、更に「ライブラリPCR」と呼ばれるPCRによって実施され、かつオリゴヌクレオチドアダプターの、ライブラリPCRで生成された核酸断片への結合が、該ライブラリPCR中に使用される少なくとも1つのプライマーの配列中にアダプター配列を含めることによって実施される、請求項6に記載のカートリッジ。
8. カートリッジに特有の情報を記憶するためのカートリッジに特有の識別子を更に含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載のカートリッジ。
9. 以下：
   前記試料区画中に受容された生物学的試料の一部、
   前記試料区画中に受容された生物学的試料から遊離又は精製された核酸の一部、
   前記ライブラリ区画中で調製された核酸ライブラリの少なくとも一部、
   のいずれかの回収を可能にする、前記試料区画の下流に位置する回収区画を更に含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載のカートリッジ。
10. 次世代シーケンシング（NGS）核酸ライブラリを生物学的試料から調製するための自動化された方法であって、
    e）生物学的試料を受容する工程と、
    f）前記受容された生物学的試料から核酸の少なくとも一部を遊離又は精製する工程と、
    g）前記遊離又は精製された核酸の少なくとも一部を、NGS核酸ライブラリを調製するための、核酸ライブラリを調製するための試薬を含むライブラリ区画中に供給する工程と、
    h）NGS核酸ライブラリを調製する工程と、
    を含み、少なくとも工程b）〜工程d）は、自動化されたシステムにおいて実施される、方法。
11. qPCRを、前記自動化されたシステムにおいて、NGS核酸ライブラリを調製する工程に対して逐次又は同時のいずれかで実施する工程を更に含み、前記qPCRは、前記遊離又は精製された核酸の第二の部分に対して、核酸を増幅し、かつそのような増幅の間に生成されるシグナルの検出を可能にするために適した熱サイクル用qPCR区画において実施される、請求項10に記載の自動化された方法。
12. 前記少なくとも1つのqPCRが、少なくとも1つの疾患関連のターゲット核酸配列を増幅するものであるか、又はクオリティーコントロール（QC）qPCRである、請求項11に記載の自動化された方法。
13. 前記自動化されたシステムと係合可能なカートリッジにおいて実施される、請求項10〜12のいずれか一項に記載の自動化された方法。
14. 前記カートリッジが、カートリッジに特有の情報を記憶するためのカートリッジに特有の識別子を含み、前記方法は、該カートリッジに特有の識別子に記憶された情報を前記自動化されたシステムへと取り込む工程を更に含む、請求項13に記載の自動化された方法。
15. 請求項1〜9のいずれか一項に記載のカートリッジの、生物学的試料からの次世代シーケンシング（NGS）ライブラリの自動化された調製のための使用。