CN112513291A

CN112513291A - 用于进行定量实时pcr的反应混合物、方法和试剂盒

Info

Publication number: CN112513291A
Application number: CN201980051441.5A
Authority: CN
Inventors: S·库尔默; T·弗兰克
Original assignee: Robert Bosch GmbH
Current assignee: Robert Bosch GmbH
Priority date: 2018-08-03
Filing date: 2019-06-26
Publication date: 2021-03-16
Also published as: DE102018213027A1; US20210310047A1; WO2020025222A1; EP3830294A1

Abstract

在提供用于进行定量实时PCR的反应批次的反应混合物的情况下，在该反应混合物中包含至少一种至少部分与待定量的DNA片段对应的靶DNA（11），和至少一种具有特定序列和特定量的参比DNA（12），和至少两种具有不同序列的不同荧光探针，它们在不同波长下生成信号，和引物和脱氧核苷酸和DNA聚合酶。靶DNA（11）和参比DNA（12）具有相同的引物结合位点（13、14）和不同的探针结合位点（17，18）。所述荧光探针的至少一种被设置用于在扩增子中与引物结合位点（13、14）之外的靶DNA（11）片段结合，并且所述荧光探针的至少一种被设置用于在扩增子中与引物结合位点（13、14）之外的参比DNA（12）片段结合。

Description

用于进行定量实时PCR的反应混合物、方法和试剂盒

本发明涉及反应混合物，其提供用于进行定量实时PCR的反应批次，以及涉及用于进行定量实时PCR的方法和涉及试剂盒。

现有技术

聚合酶链反应（PCR）是一种非常灵敏的生物分析方法。借助于酶，即DNA聚合酶，基于作为模板的DNA序列扩增DNA。在此，在各个循环中形成的产物用作各自下一个循环的模板。待复制的DNA在此被称为模板（模板DNA）。此外，需要所谓的引物，其在DNA的单链上分别规定DNA合成的起点。DNA合成在使用脱氧核苷酸的情况下通过温度稳定的DNA聚合酶被催化。对于各个PCR循环，首先进行双链DNA变性（解链），然后再进行引物杂交，即引物可结合到单链DNA的互补序列片段上（引物退火）。接着，DNA聚合酶附着，并且在所谓的延伸步骤（延伸）中发生引物的互补延伸。这些各个步骤由温度循环来控制。

PCR的一个实施方案是实时PCR（qPCR），在其中可以借助于荧光探针来追踪反应进程。在此，实时PCR允许定量模板DNA的起始量。通常，为此需要在并行反应批次中随同进行的参比测量。除定量参比测量外，在标准方式中也随同进行定性对照，以便能够排除假阳性或假阴性结果。

发明公开内容

发明优点

本发明提供了反应混合物，其被设置用于提供用于进行定量实时PCR的反应批次。利用该反应混合物，可以定量DNA序列，例如基因片段的DNA序列，其中，并行标准反应已经被集成到各自的反应批次或反应混合物中，因此不需要随同进行并行标准反应和对照反应。在此，特别的优点在于，可以在同一个反应批次（PCR批次）中测量所述定量和质量控制。就此而言，反应批次应理解为是指反应在一个反应容器中进行。因此，没有必要随同进行参比测量，从而可以大大节省PCR批次的费用。这可以提供相当大的优势，例如特别是在即时检测（PoC）应用中，因为在这种应用中通常直接为患者进行检查。在传统方法中，通常为此需要为各个患者准备相应的参比测量并且并行地随同进行。当使用本发明的反应混合物时，不需要这样。因此，可以有利地特别是在医学诊断中使用本发明的反应混合物和可借其进行的方法。

本发明的反应混合物包含至少一种靶DNA，其至少部分地与待定量的DNA序列对应。在下文中该靶DNA也称为定量子。此外，所述反应混合物包含至少一种参比DNA，其具有特定的人工序列并且以特定的量存在于该反应混合物中。该参比DNA在下文也称为人工子。此外，设置了至少两种具有不同序列的不同荧光探针，它们在不同波长下生成信号。此外包含引物、脱氧核苷酸和热稳定的DNA聚合酶。取决于应用，引物是一种或多种引物对。靶DNA和参比DNA具有相同的引物结合位点（引物杂交位点）。另外，在靶DNA和参比DNA上设置了不同的探针结合位点，其中，探针结合位点位于各自的扩增子中的引物结合位点之外。在此，术语扩增子通常是指应复制的DNA。所述荧光探针的至少一种被设置用于在扩增子中与引物结合位点之外的靶DNA片段杂交或结合。所述荧光探针的至少一种被设置用于在扩增子中与引物结合位点之外的参比DNA片段杂交或结合。因此，荧光探针中的一种与靶DNA结合，而另一种荧光探针与参比DNA结合。所述荧光探针优选是单链DNA序列片段，其各自与至少一个报告染料分子和至少一个猝灭分子偶联。这种本身已知的荧光探针的作用原理是基于：荧光信号在荧光探针完整或荧光探针的DNA分子完整的情况下由于报告染料分子和猝灭分子的空间接近而熄灭。在PCR反应过程中，荧光探针附着在模板DNA的各自互补片段上（引物结合位点之外）。在扩增过程中，DNA聚合酶沿着模板DNA的待复制的链移动，并且在此不可避免地碰到积聚的荧光探针。通过DNA聚合酶的5'-3'核酸外切酶活性，切断了荧光探针，从而消除了报告染料分子和猝灭染料分子的空间接近，从而产生了荧光信号。因此，由这种可测量的荧光信号可以推断出扩增完成。因此，通过使用两种不同的荧光探针，其中一种与靶DNA相互作用或另一种与参比DNA相互作用，在反应批次中通过不同的荧光信号既可以追踪基于靶DNA的扩增，又可以追踪基于参比DNA的扩增。在此，适宜的是这样地选择探针的荧光团，以使得可以借助于检测器装置和合适的滤光片组将颜色或荧光信号彼此区分。

适宜的是，参比DNA的特定的人工序列与靶DNA的序列不相同（正交），即不同源，其中，GC含量，即序列中的鸟嘌呤（G）和胞嘧啶（C）的总含量不依赖于其在序列本身中的位置而优选与靶DNA的GC含量尽可能相同。“尽可能相同”在本文中应理解为是指靶DNA和参比DNA的GC含量百分比的偏差可例如为至多15％，优选为至多10％。此外优选的是，靶DNA序列和参比DNA序列的碱基对长度尽可能相同，其中，例如至多15％，优选至多10％的最大偏差可以是可接受的。

用于进行定量实时PCR的所述反应混合物所基于的概念是，将特定组成和量的人工参比DNA添加到反应批次中。参比DNA使得可以内部校准，并且还可以执行阳性和阴性对照的任务。在此，原则上进行多模板PCR，其中，在扩增反应中并行产生多种不同的特异性扩增物。在此，设置了至少两种模板，即靶DNA和参比DNA。在此，不同模板的扩增原则上用仅一种与靶DNA和参比DNA杂交的引物对来进行。通过使用不同的探针，其中，用于靶DNA的探针和用于参比DNA的探针是特异性的（或者任选多种探针），可以检测不同的荧光信号或荧光颜色，其中，由不同荧光信号彼此之间的比率可获得测试结果。

由于集成的参比物和对照物，用所述反应混合物进行的PCR过程特别适合于自动化和小型化，特别是在微流体应用的范畴中。在此可能特别有利的是，该反应混合物的不同组分以冻干形式被提供。因此，尤其可以以冻干形式提供和呈送靶DNA和/或参比DNA和/或引物和/或脱氧核苷酸和/或DNA聚合酶。这可以例如以一种或多种所谓的冻干珠的形式实现。冻干珠通常可以被理解为是指在制造后（在所述制造后物质通常作为粉末存在）被压制成球形的冻干物。因此，可以例如以冻干形式提供PCR批次所需的组分，特别是DNA聚合酶、脱氧核苷酸、靶DNA和参比DNA以及反应缓冲剂组分以及任选引物和/或探针。以这种方式，可以通过添加待定量的样品以及任选其它所需组分以对于用户非常友好的方式直接开始PCR过程。特别地，冻干形式的提供非常有利于自动化应用。

提供冻干珠形式的反应混合物或反应混合物的至少一些部分还具有这样的优点，即通过将标准物和/或对照物集成到反应批次中，可以大大减少冻干珠的制造费用以及研发费用。由于所需反应批次的量的减少，集成到微流体系统中也是特别有利的，因为与传统PCR过程相比，所需的反应室更少，并且不必为微流体平台扩展另外的室。此外，可以缩短实时PCR的运行时间，因为本发明所基于的概念使得能够通过预定量的模板将反应条件引入特别有效或理想的反应范围中，从而总是可以预期荧光信号。

在此描述的PCR过程的另一个特别优点是，由于标准物和/或对照物集成到反应批次中，标准物、对照物和实际样品的条件与待定量的DNA是相同的。如果例如反应批次中存在空气泡（这在罕见的情况下，例如在微流体系统中可能是这样的情况），则与此相关的对反应效率的影响对于所有模板而言，即例如对于质量控制、校准和对于实际样品反应而言是相同的，以使得整个实验在各个情况下都可比较和可评估。

在传统方式中，通常在定量实时PCR的范畴中创建一条标准线，其中，为此对该标准线通常假定至少三个不同的浓度，这些浓度在期望的样品浓度范围内。出于统计原因，通常为标准反应选择更多的浓度，并且这些标准反应还以多次执行的方式处理。在本文描述的用于实时PCR的概念中，借助于不同荧光探针的多信号概念及其相互之间的比率来进行校准，因此需要仅一个反应并且仍然可以进行定量。就为此所需的操作费用和工艺费用而言以及就昂贵化学品的有利最少化和样品需求或所需少的样品量而言，这具有相当大的优势。

在反应混合物的一个优选实施方式中，参比DNA的量可以与待定量的DNA片段的检测极限对应的浓度存在。此外，取决于应用，可以设置靶DNA和参比DNA以1:1的比率存在，并且此外以特定的量存在。

本发明还包括用于进行定量实时PCR的方法，其中，在该方法中使用至少一种如上所述的反应混合物。通常，还将具有（任选）包含待定量的DNA片段的核酸材料的实际样品添加到该反应混合物中。用这种完整的反应批次使PCR过程在一定程度上作为双重反应进行，其中，通过本身已知的热循环过程中温度的变化而以本身已知的方式进行PCR循环。在此，一方面使靶DNA和待定量的DNA片段（只要存在于样品中）以及参比DNA扩增。通过检测和评估不同荧光探针的荧光信号，其中这些信号分别对靶DNA（且同时对待定量的DNA片段）和参比DNA而言是特异性的，可以检测靶DNA和同时具有待定量的DNA片段的实际样品的扩增以及参比DNA的扩增并且可区分地跟踪它们。可以从这些信号彼此之间的比率确定测试结果，尤其是定量测试结果。

在所述方法的一个特别优选的实施方式中，该方法在具有多个阵列容器的PCR阵列中进行。这可以特别有利地在微流体应用中进行，所述应用特别是也可用于自动化。在此，可以为PCR阵列的各个阵列容器装入不同的反应混合物，从而可以实现最大的多重程度。所述装入例如可以通过为各个阵列容器沾入不同的反应混合物来实现。由此可以尤其在微流体PCR阵列中将具有待定量的DNA片段或待检验的核酸材料的样品溶液例如作为整体添加到阵列上。以这种方式，样品溶液到达各个单独阵列容器并与各自不同的反应混合物形成各自的反应批次。在此特别的优点在于，各个反应室不必单独填充和控制。在传统方法中存在的问题是，在PCR阵列中被设置用于标准反应的阵列容器中不允许装有样品材料。就这方面来说，在传统PCR阵列中通常需要的是，必须单独填充和控制各个反应室，其中，用于标准反应的反应容器的填充不同于被设置用于具有实际样品的PCR过程的反应室。相反，用于进行根据本文描述的概念的PCR过程的PCR阵列一方面允许明显更大量的PCR批次与待测量的样品在一个阵列中，因为无需为标准反应提供单独的反应批次。另一方面，如上所述，本申请的概念还允许整个阵列作为整体被样品溶液填充。

本文描述的用于实时PCR的概念的另一个特别的优点是，不必为了各个光源对反应体系进行校准，因为测试结果由信号的比率得出，其中信号的比率归因于各个扩增进程中所保持的比率。在设备类型不同的情况下，光源和光学检测器通常不同。因此，在传统方式中，各个设备类型都需要校准测量。即使在安装了两个相同LED光源的设备中，在传统方式中也必须对这两个光源进行校准，以使得它们提供经由标准线进行评估所需的相同绝对数。在根据本发明的实时PCR的概念中，由于使用批次内的相对比率进行操作，因此省去了这些复杂的校准测量。

在医学应用中，特别是在医学诊断中，从患者那里获得的样品量通常少。此外，在即时检测应用中使用的分析系统是为小的空间需求而设置的并且应具有尽可能高的自动化程度，以减少操作费用。就这方面来说，本文描述的PCR批次的尤其微流体实现方式特别适用于这些应用，其中，可以自动化、小型化和并行化，这一方面减少了应用中的费用，并且还将错误操作时的错误可能性最小化了。此外，少的样品量可以转移到小体积中，以使反应浓度变得更大。在传统方法中，并行化与操作时的挑战相关联，因为反应混合物的分配以及所需化学品的预存储和制备由于小型化而通常困难。根据本文描述的概念的实时PCR使PCR过程操作中的费用最小化，因为一方面反应批次的数量减少到基本上一个批次。在此，所需的试剂可以容易地预存储在例如芯片实验室系统中。由于可以进行冻干，试剂也可以例如在室温和最小的空间中例如以冻干珠的形式被提供。

在所述方法的一个特别优选的实施方式中，该方法可以用于嵌套式PCR过程。嵌套式PCR过程以本身已知的方式包括预扩增和至少一个随后的检测反应。在此，本文描述的概念可以在使用一个批次中的靶DNA和参比DNA的情况下用于估计预扩增的PCR产物量。在此，可以这样地设计靶DNA和参比DNA，以使得第一引物对用于预扩增，并且至少一种第二引物对用于（一个或多个）检测反应。靶DNA和参比DNA各自具有与引物序列互补的序列片段（引物结合位点），其中，第二引物对的互补序列片段（用于所述（一个或多个）检测反应的引物对的引物结合位点）位于第一引物对的互补序列片段（用于预扩增的引物对的引物结合位点）之内。这意味着，用于各种引物对的引物结合位点在一定程度上彼此嵌套在靶DNA和参比DNA上。

嵌套式PCR过程尤其可以用于点突变检测。在此，在根据本文描述的概念确定其PCR产物量的预扩增后，可以使用突变敏感性引物和/或突变敏感性荧光探针进行检测反应。

嵌套式PCR过程可以是多重过程，在其中应检测基因组中的至少两种特定基因片段。在此，为了预扩增的定量，可以进行对照反应，在其中并行地从基因组中扩增对照外显子。在这种情况下，靶DNA和参比DNA与对照外显子匹配，其中，由根据本文描述的概念的对照外显子扩增的定量推断出在预扩增过程中待检测的基因片段扩增时的量。

总体而言，本文描述的用于PCR过程的概念不仅可以集成定量标准线和质量反应，而且可以集成参比测量和阈值测量，其例如在肿瘤学中的点突变测定中是必需的。尽管各种待检验的DNA片段在检测中都需要两个颜色通道，但是该概念允许多重方式，并且可以在一个批次中解决多种不同的DNA片段（靶）。特别是在具有预扩增和随后的例如点突变分析的定性测量的嵌套式PCR的范畴中，可以这样地应用该方法，即通过定量所述预扩增来估计第二反应的起始量。在此，可以将这两个PCR过程，即预扩增和随后的检测反应在微流体系统中全自动地相互连接，而无需在中间步骤中单独测量DNA浓度，或无需纯化在预扩增时产生的PCR产物。嵌套式PCR过程可以例如这样地设计，即根据来自预扩增的PCR产物量的估计而通过稀释设定用于随后的（一个或多个）检测反应的最佳DNA浓度。这可以例如原位地、也以自动化的方式进行。

最后，本发明包括用于进行定量实时PCR的试剂盒。试剂盒包含至少一种靶DNA，其至少部分与待定量的DNA序列对应。此外，试剂盒包含至少一种参比DNA，其具有特定的人工序列和特定的量。此外，存在至少两种具有不同序列的不同荧光探针，它们在不同波长下生成信号。任选地，可以设置引物和/或脱氧核苷酸和/或DNA聚合酶和/或缓冲剂组分。靶DNA和参比DNA具有相同的引物结合位点，但是具有不同的探针结合位点，其中，探针结合位点位于各自的扩增子中的引物结合位点之外。所述荧光探针的至少一种被设置用于在扩增子中与引物结合位点之外的靶DNA片片段杂交（结合），并且所述荧光探针的至少一种被设置用于在扩增子中与引物结合位点之外的参比DNA片段杂交（结合）。试剂盒的成分可以特别地以冻干的形式，例如以冻干珠的形式被提供。有关该试剂盒的其它特征，参考上面的描述。

本发明的其它特征和优点从以下对实施例的描述中得出。在此，各个特征可以分别单独地或相互组合地实现。

在附图中：

图1显示了靶DNA和参比DNA的设计示意图，以说明进行定量实时PCR的概念的基本原理；

图2显示了用于定量实时PCR的模板DNA的示意图，和在定量样品中特定DNA片段时可能的测试结果的示意图；

图3显示了用于定量实时PCR的DNA模板的示意图（图3A），和在定量嵌套式PCR的范畴中应用所述概念时可能的测试结果的示意图（图3B）；

图4显示了在点突变测定的范畴中参比DNA的可能设计的示意图；

图5显示了用于解释嵌套式PCR的多重实施的模板DNA的示意图；

图6显示了在微流体PCR阵列中实施定量实时PCR的示意图。

实施例的描述

依据图1解释所使用的DNA模板，即靶DNA 11和参比DNA 12的设计原理。可以将经典的TaqMan®系统用作PCR反应批次的基础，其中，如开始所述，使用两种不同的荧光探针。在此，靶DNA与实际待分析或待定量的DNA序列，例如基因片段的DNA序列对应。靶DNA 11补充有人工参比DNA，其具有特定的序列并且以特定的量使用。靶DNA 11和参比DNA 12具有相同的引物结合位点，即各一个用于正向引物的结合位点13和各一个用于反向引物的结合位点14。这些模板DNA 11、12在其余的碱基对序列15、16方面不同。特别地，它们对于所使用的探针具有不同的结合位点17、18。这两种模板DNA 11和12也称为待定量的扩增子的定量子11以及人工扩增子的人工子12。下表总结了定量子（靶DNA）11和人工子（参比DNA）12的设计：

。

选择荧光探针的荧光团，以使得借助于检测器（滤光片组）可将这两种颜色彼此区分。适宜的是，参比DNA 12的正交序列16与靶DNA 11的靶序列15不相同。GC含量应与靶DNA的靶序列15的GC含量尽可能相同。定量子，即靶DNA 11和人工子，即参比DNA 12的碱基对长度也应相同长。由此，两种扩增子11、12的解链温度非常相似，从而在有效的PCR中原则上产生相同量的扩增物。利用这些模板DNA进行定量实时PCR，其中，在相同反应容器中使定量子11和人工子12作为准双重反应进行扩增。在此期间，例如在各个PCR循环后或连续地记录这两种探针。人工子12可在此以检测极限范围内或之上的预定量提供，并且必须在成功PCR的情况下作为探针B的信号被检测。在这种情况下，人工子12用作反应对照。定量子11和任选还存在于反应批次中的待定量的基因片段（靶）的扩增可作为探针A的信号被检测。探针A和B的信号现在处于特定的比率中。如果存在相同起始量的人工子12和定量子11，则这两个扩增曲线是一致的。如果存在更多的定量子11，则更早地检测到它，并且人工子12的曲线取决于其浓度而产生。这可以通过反应效率和固定特定的人工子12量来计算。提供的人工子12量在此是绝对参照点，其是已知的。反应效率可以借助于指数阶段的曲线形状来确定。由此可以利用绝对参照点来计算定量子11的未知起始量。

图2显示了在样品材料（样品）作为基因组存在的情况下反应体系的实施方式。例如，当应检测裂解物中的特定基因片段时，可以使用这一方式。与图1的原理相比，在此使用定量子11（Q）和人工子12（A）。另外，待扩增的基因片段20（S）作为具有由（一个或多个）细胞的基因组形成的基因材料的细胞裂解物位于该反应批次中。在这种情况下，定量子11和人工子12以预定量以1:1的比率提供。所选择的量可以例如在检测极限之上附近。另一个可能方式是使该量与PCR反应的理想功能范围匹配，以使得PCR特别有效地进行。通常，各种定量实时PCR（qPCR）都有极限，在该极限内反应有效进行。在此，检测到的C_T值（其描述了曲线的指数增长的起点）与所使用的对数化起始量处于线性比率。如果在该范围内选择定量子11和人工子12的使用量，则在各个成功PCR的情况下都应检测到信号。人工子12的信号是按时间顺序必定最后测出的信号。如果缺了这一信号，则反应对照是阴性的。如果与人工子12的信号同时检测到定量子11的信号，这意味着反应混合物中仅存在定量子11和人工子12，而没有样品20。这种情况在图2的图表A中示出并用作PCR批次的原理功能的检测对照。在此，线11和12代表各自定量子11（荧光团A）和人工子12（荧光团B）的荧光信号。如果基因组中或样品20中存在与定量子11相同的DNA片段，则来自样品20的该片段也一起被高度扩增。这导致，较早地检测到定量子11的信号（图2中的图表B），其中，检测到的信号由定量子11和样品20的扩增组成。如已经依据图1原则上解释的那样，现在可以计算样品20（样品）的待检验的DNA片段的起始量。在此，人工子12和定量子11的预定量不仅为计算定量提供了绝对参照点，而且还确保了信号并用作对照。

在PCR过程的另一个实施方式中，该过程可以动态地进行，这通过使定量子11的信号代表反应的终止标准以可以在出现定量子11的信号之后结束PCR过程来实现。由于可以将定量子11的量转移到PCR过程的有效范围中，因此检测大致可以在所计划的过程持续时间的时间中点，即在平均循环数下进行。在阳性样品的情况下，即样品20中存在所搜寻的DNA片段的情况下，定量子11的信号（与样品20的信号一起）出现在人工子12的信号之前，因此可以缩短用于测量的过程时间。在这种情况下，反应终止后只能进行定性说明。

图3A和3B显示了在定性嵌套式PCR（嵌套式PCR）的范畴中的所述概念。这样的PCR方法可以例如用于检测突变。为此，从细胞的基因组DNA中高度复制突变所在的靶区域。然后测量野生型与突变的比率。为此，在实际的检测反应之前进行预扩增，以确保存在足够的材料用于检测。当存在较少细胞材料时，例如在具有循环肿瘤细胞的液体活检中，这尤其重要。如图3A所示，本文描述的概念在这样的系统中实施，即首先利用特定的引物对在足够大的片段中高度复制突变位点35（靶DNA）。在样品30的基因组DNA上，对于该第一引物对存在用于正向引物和反向引物的相应结合位点33、34。为了控制、监测和定量该过程，选择紧邻引物结合位点33的第一荧光探针A的探针结合位点37。与样品30中的扩增子一致地设计了定量子21，即靶DNA 21，其具有相应的引物结合位点23、24以及用于荧光探针A的相应的探针结合位点27。此外，设计了具有相同的引物结合位点23、24和不同的用于荧光探针B的探针结合位点28的人工子22（参比DNA）。这些组分30、21、22提供了用于预扩增的基础，其可根据依据图2解释的原理来定量。另外，为随后的检测反应102设置了用于具有第二正向引物和第二反向引物的另一引物对的另外的引物结合位点43、44，其中，在基因组基因片段30中，用于第二正向引物的结合位点43与用于荧光探针A的结合位点37连接。用于第二反向引物的结合位点44位于实际靶DNA 35（其代表要检测的基因片段）的下游。相应的引物结合位点43、44位于参比DNA 22（用于预扩增的人工子）上。在靶DNA 21（用于预扩增的定量子）上，在与人工子序列22的引物结合位点43、44对应的位置143、144上，设置了不同的，即正交的序列。定量子序列21上的序列143、144之间的序列对应于样品30的待定量的DNA片段的靶DNA序列35。

在添加第一引物对之后进行的预扩增100之后，存在扩增的待定量的基因片段30'（扩增的样品）作为PCR产物。此外还存在扩增的人工子22'。同样扩增的定量子21从序列来说基本上对应于扩增的样品30'。在随后的检测反应102的用于第二引物对的引物结合位点43、44内，与正向引物的引物结合位点43相连地存在用于另一荧光探针A'的结合位点47，其用于随后的检测反应102。人工子22或扩增的人工子22'相应地在引物结合位点43之后具有用于另一荧光探针B'的另一探针结合位点48，其同样用于随后的检测反应102。在人工子22或扩增的人工子22'上连接有正交序列26，该正交序列与待检验的样品30的靶序列35正交。与之连接的是随后的检测反应102的反向引物的结合位点44和预扩增的反向引物的结合位点24。如上已说明，人工子22与样品30和定量子21中相应片段之间的碱基对序列的GC含量和长度应大致相等。

预扩增100的定量原则上如已经依据图2所解释的那样进行，并且在图3B的上部分中示出。此处分别显示了来自探针A和B的信号。图表A显示了定量子21的信号（探针A）和人工子22的信号（探针B）重叠的情况。在这种情况下，样品30中没有待检测的DNA片段。图表B显示了扩增的定量子21与来自样品30的扩增的基因片段一起的信号在时间上出现在扩增的人工子22的信号之前的情况。在这种情况下，样品30中存在所搜寻的基因片段。如果无法检测到样品（样品）（图表A），则可以停止整个过程并且说明未进行检测（阴性检测结果）。如果根据图B检测到样品，则可以继续进行PCR过程，直到检测到人工子22。然后，任选可以终止该过程。替代地，也可以执行预定量的PCR循环。可以由样品30与定量子21一起的扩增曲线计算效率。可以借助于预定的人工子22计算所有扩增物的最终浓度以及起始浓度。在此基础上，可以这样地稀释和用新的母料混合物配置批次（步骤101），以使得该批次对应于随后的一个或多个检测测定（步骤102）的理想输入浓度。稀释可以手动进行，例如如果反应在批量系统中，例如经典qPCR循环仪中进行。所述过程优选地在全自动化流体处理器中进行，其中，微流体系统是特别合适的。在此，可以借助于微流体泵送和等分系统来稀释和分配液体。

对于例如用于点突变检测的实际的检测反应102，用为此所需的引物（第二引物对）使反应混合物扩增，并观察和评估探针A'（曲线470）和探针B'（曲线480）的信号走向。根据反应概念，人工子22'占少数，即存在的人工子22'的起始材料少于样品30'的起始材料。这是因为在预扩增100时产生更多的样品扩增子，其由扩增的样品30'和扩增的定量子21组成。因此，在立即检测之后动态终止PCR是非常有利的，因为在指数阶段中人工子22'和样品30'使得扩增子量的估计比在饱和阶段的检测时更准确。由于人工子22'现在再次以特定的量存在并且样品30'充当新的定量子，第二qPCR，即检测反应102也可以完全被定量。因此已知从过程开始到结束的拷贝数。由于相应位置143、144被选择为与预扩增的靶DNA序列21上的引物结合位点43、44正交，即不同，因此在第二反应（检测反应102）中不考虑第一反应（预扩增100）的扩增的定量子21。

对于检测反应102，可以还将另一人工子混入到其母料混合物中。在此，代替第一预扩增的人工子，添加新的人工子用于第二检测反应。这是有用的，因为通常将第一反应混合物稀释，并且由此检测人工子（但不检测增加的实际样品）。因此，稀释后再次添加特定量的人工子，以进行更准确的测定。该另一人工子可以例如被预存储在检测反应所需的（第二）冻干珠中。这对于在点突变检测中确定野生型和突变型的比率而言特别有利。也使用具有相同引物结合序列的另一定量子。然后必须这样地稀释第一反应100的扩增物，以使得它对应于提供的第二定量子的浓度。

图4显示了用于点突变检测的人工子（参比DNA）52、62的可能设计的实施方案。人工子52、62被设置用于在点突变测定的范畴中的嵌套式PCR。通常，在点突变检测中使用两个通用的PCR检测策略。在此，选择突变敏感性引物（a）或突变敏感性探针或阻滞剂（b）。在方法（a）中，这样地设计引物，以使得其仅在存在突变的情况下才能结合。这样的实例是所谓的ARMS（扩增阻碍突变系统）系统。在方法（b）中，使用仅在存在突变的情况下才结合的突变敏感性探针或阻滞剂（例如PNA-CLAMP系统——肽核酸（PNA）介导的PCR钳制；H.Ørum等，Nucleic Acids Res. 21：5332-5336，1993）。但是，由于这些结合不是100％有效的，因此随同测量了野生型的参比信号。因此，对于根据本发明的概念的实施而言，对于这样的检测有用的是包含第二定量子。为了实施，对于人工子52、62将突变301引入到正交序列中。因此应包括突变的结合位点。因此，在具有突变敏感性引物的版本62中，人工子62包括以下片段：用于第一正向引物的结合位点23、用于探针B的结合位点28、用于突变特异性引物（其代表用于检测反应102的第二引物对的正向引物）的结合位点63、正交序列26、用于检测反应102的反向引物的结合位点44和用于预扩增的反向引物的结合位点24。对于具有突变敏感性阻滞剂或突变敏感性探针的检测系统，这样地设计人工子52，以使得用于该探针或该阻滞剂的结合位点在与突变型中的完全相同的位置上包括突变位点301。在其余方面，人工子52对应于人工子62或人工子22。现在，利用这样的构造，可以在反应中测量100％野生型反应的信号（第二定量子）和100％突变的信号（人工子52或62），并与样品进行比较。所有这些都可以在一个反应批次中进行，从而可以极大地简化例如在即时检测应用中的全自动化。如果相应的母料混合物以冻干物形式被提供，则是特别有利的。

图5显示了嵌套式PCR的多重实施，其中，可以在一个批次中进行两个检测反应。在该实施方式中，从少数细胞，例如10至1000个细胞的裂解物出发。在该裂解物中可存在来自富集，例如来自循环肿瘤细胞的富集或来自免疫细胞例如特异性T细胞的富集、来自体液例如血液、尿液、脊髓液或其它体液的细胞。这些细胞以小体积被裂解，并提供用于进行该方法的样品。在所述细胞裂解物中，应检测两种基因片段70、80，即例如外显子A（基因片段70）和外显子B（基因片段80）。首先，基因片段70、80扩增（预扩增），以使得在随后的步骤中，可以在一个或多个检测反应中检测这些基因片段的异常，例如突变或功能典型基因序列，例如抗原表位的遗传编码。在预扩增的第一步骤中，首先从裂解细胞的基因材料中扩增两种靶外显子，即基因片段70和80。此外进行样品对照。为了样品对照，扩增对照外显子C作为基因片段90。例如，这可以是不存在异常的所搜寻的基因的外显子。如果其被扩增，则该反应被认为是成功的并证明样品中存在样品材料，即基因材料。为了检测和定量对照外显子90的扩增，按照上述相应的方式使用靶DNA（定量子）21和参比DNA（人工子）22，根据上述原理，它们在结构和组分方面与对照外显子90匹配。如果扩增子70、80和90全部具有大致相同的长度和相同的GC含量，则在三重反应中的反应批次中应当对于各种模板产生大致相同的拷贝数。如果长度和GC含量存在偏差，则扩增的扩增子保持比率，其中，该比率还可受到DNA结构和表观遗传修饰的影响。这意味着，即使在外显子之一的扩增中反应效率可能较低，所形成的扩增子拷贝的比率仍然恒定。这允许就定量而言测量仅一种扩增子，即对照外显子C，由此能够确定所有外显子的扩增子数。因此不需要复杂的三探针设计，而是通常仅使用双探针系统就足以定量所述对照外显子C（基因片段90）。因此，首先通过对照外显子90对预扩增进行定量，从而可以如上所述估计用于随后的检测反应的扩增物，并且为了检测反应中的最佳反应条件而任选地原位分配和稀释。在分配和稀释后，添加新的母料混合物，其被设置用于检测反应的特定测定并且也可以根据图2的说明进行定量。

各种扩增子的设计优选如下：外显子A（基因片段70）在扩增子的外围具有用于预扩增的引物的结合位点71、72。外显子B（基因片段80）和对照外显子C（基因片段90）具有相应的引物结合位点81、82和91、92，但是具有不同的序列。在随后的检测反应中待检验的外显子A和B中，在基因片段70和80上分别接着用于第二反应（检测反应）的引物的结合位点73、74和83、84。如果探针被设置用于检测反应，则其结合位点包含在该序列中。对照外显子C（基因片段90）在引物结合位点91之后具有用于荧光探针A的结合位点97。相应地，如依据图2所解释，为了对照外显子C（基因片段90）的定量而补充了定量子或靶DNA 21和人工子或参比DNA 22，它们设有与对照外显子C（基因片段90）相同的引物结合位点91、92。靶DNA 21还具有相同的用于探针A的结合位点97。参比DNA 22也具有探针结合位点98，但是具有用于结合荧光探针B的不同序列。由用该反应批次待生成的信号推断出所形成的拷贝N_C和起始量N₀。由保持的比率计算外显子A和B（基因片段70和80）的量。在此，可以在测定研发的范畴中得出所述比率。该比率对于各自的测定而言是特异性的。该比率本质上是恒定的，但是必须对于各种应用进行测量，即参数化。根据依据图2解释的方法，对于外显子A和外显子B的随后两个单独且可并行处理的特异性检测的母料混合物可以各自具有定量子和人工子，它们具有与各自的靶外显子A和B相同的引物结合位点。为了检测点突变，如依据图4所解释，定量子可以具有野生型序列，且人工子可以具有突变体序列。在图5的图的中间部分中，示意性地显示了整个反应进程。首先进行预扩增200，其中，外显子A、外显子B、对照外显子C和定量子和人工子作为模板存在于批次中。在进行扩增反应后，获得定量结果210（N₀对照外显子C、N_C对照外显子C、由此可算出N_C、N₀外显子A；N_C、N₀外显子B）。为了达到对于外显子A和外显子B的随后的检测反应的最佳开始条件，在步骤220中，通过分配和任选稀释所述批次来设定外显子A（N_S，2外显子A）和外显子B（N_S，2外显子）的最佳浓度。随后，通过在步骤230中添加用于各自检测反应的母料混合物，例如进行各自特异性的突变检测，其中，为此除了外显子A和外显子B外分别添加相应设计的定量子A和人工子A以及定量子B和人工子B，如图5的下部分中说明。

图6示出了在微流体qPCR阵列500中的所述PCR概念的实施。阵列500例如集成在由结构化硅构成的芯片中，其中，阵列500位于微流体室中，该微流体室设有流入口501和流出口502。在一个可能的实施方式中，阵列500的各个反应容器可以整体被控制或向其中加入液体。例如，可以将预扩增的样品冲洗到阵列500上，从而填充阵列500的各个反应容器。通过密封可以防止在第二流体步骤中各个反应容器之间经由扩散连通。如果现在例如用冻干的母料混合物和/或用引物和探针序列预先沾入阵列500的各个反应容器，则使用n x m阵列的方法可以实现包括定量和质量控制在内的最大n x m的多重程度。优选地，根据本发明概念的反应批次可以基于TaqMan®系统来研发。各种模板DNA，特别是定量子和人工子的合成可以利用常规核酸合成来进行。优选地，包含模板DNA的母料混合物可以作为冻干物进行预存储。微光流体系统特别适合于过程自动化。

Claims

1.反应混合物，其提供用于进行定量实时PCR的反应批次以定量至少一种DNA片段（20；30；90），其特征在于，所述反应混合物包含

-至少一种靶DNA（11；21），其至少部分与待定量的DNA片段（20；30；90）对应，和

-至少一种参比DNA（12；22），其具有特定的序列和特定的量，和

-至少两种具有不同序列的不同荧光探针，它们在不同波长下生成信号，和

-引物和脱氧核苷酸和DNA聚合酶，

并且其中，靶DNA（11；21）和参比DNA（12；22）具有相同的引物结合位点（13、14；23、24）和不同的探针结合位点（17、18；27、28），并且其中，所述荧光探针的至少一种被设置用于与引物结合位点（13、14；23、24）之外的靶DNA片段（17；27）结合并且所述荧光探针的至少一种被设置用于与引物结合位点（13、14；23、24）之外的参比DNA片段（18；28）结合。

2.根据权利要求1所述的反应混合物，其特征在于，靶DNA（11；21）的GC含量和参比DNA（12；22）的GC含量以至多15％的偏差是相同的。

3.根据权利要求1或权利要求23所述的反应混合物，其特征在于，靶DNA（11；21）和参比DNA（12；22）的碱基对长度以至多15％的偏差是相同的。

4.根据前述权利要求中任一项所述的反应混合物，其特征在于，靶DNA（11；21）和/或参比DNA（12；22）和/或引物和/或脱氧核苷酸和/或DNA聚合酶以冻干形式被提供。

5.根据前述权利要求中任一项所述的反应混合物，其特征在于，参比DNA（12；22）的量以与待定量的DNA片段（20；30；90）的检测极限对应的浓度存在。

6.根据前述权利要求中任一项所述的反应混合物，其特征在于，所述方法被设置用于检测和任选地定量来自基因组的DNA片段（20），其中，靶DNA（11）和参比DNA（12）以1:1的比率以特定的量包含在所述反应批次中。

7.用于进行定量实时PCR的方法，其特征在于，使用至少一种根据权利要求1至6中任一项所述的反应混合物进行PCR过程，并且其中，添加具有待定量的DNA片段（20）的样品，并且其中，检测所述至少两种荧光探针的荧光信号。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，由所述荧光探针的信号的比率来确定测试结果。

9.根据权利要求7或权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法在具有多个阵列容器的PCR阵列（500）中进行。

10.根据权利要求7至9中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法用于具有预扩增（100）和至少一个随后的检测反应（102）的嵌套式PCR过程，其中，所述预扩增（100）的PCR产物量通过所述定量来估计。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，第一引物对用于预扩增（100），并且至少一种第二引物对用于检测反应（102），其中，靶DNA（21）和参比DNA（22）分别具有与引物序列互补的序列片段（23、24、43、44），并且其中，与第二引物对互补的序列片段（43、44）位于与第一引物对互补的序列片段（23、24）之间的片段内。

12.根据权利要求10或权利要求11所述的方法，其特征在于，所述嵌套式PCR过程用于点突变检测，其中，突变敏感性引物和/或突变敏感性荧光探针用于所述检测反应。

13.根据权利要求10至12中任一项所述的方法，其特征在于，所述嵌套式PCR过程是用于检测基因组中至少两种特定基因片段（70、80）的多重过程，其中，为了定量所述预扩增，进行对照反应，在该对照反应中从基因组中扩增对照外显子（90），并且其中，与所述对照外显子（90）匹配地设计了靶DNA（21）和参比DNA（22），并且其中，由所述对照外显子（90）的扩增的定量推断出在预扩增过程中待检测的基因片段（70、80）扩增时的量。

14.用于进行定量实时PCR以定量至少一种DNA片段的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含

-至少一种靶DNA（11；21），其至少部分与待定量的DNA片段对应，和

-任选引物和/或脱氧核苷酸和/或DNA聚合酶和/或缓冲剂组分，

并且其中，靶DNA（11；21）和参比DNA（12；22）具有相同的引物结合位点（13、14；23、24）和不同的探针结合位点（17、18；27、28），并且其中，所述荧光探针的至少一种被设置用于与引物结合位点（13、14；23、24）之外的靶DNA片段结合并且所述荧光探针的至少一种被设置用于与引物结合位点（13、14；23、24）之外的参比DNA片段结合。

15.根据权利要求14所述的试剂盒，其还包含根据权利要求2至6中任一项所述的至少一个特征。