EP3830294A1 - Reaktionsgemisch, verfahren und kit zur durchführung einer quantitativen echtzeit-pcr - Google Patents

Reaktionsgemisch, verfahren und kit zur durchführung einer quantitativen echtzeit-pcr

Info

Publication number
EP3830294A1
EP3830294A1 EP19734358.5A EP19734358A EP3830294A1 EP 3830294 A1 EP3830294 A1 EP 3830294A1 EP 19734358 A EP19734358 A EP 19734358A EP 3830294 A1 EP3830294 A1 EP 3830294A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
dna
reaction
reaction mixture
pcr
amplification
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
EP19734358.5A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Sonja Kuellmer
Tino Frank
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Robert Bosch GmbH
Original Assignee
Robert Bosch GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Robert Bosch GmbH filed Critical Robert Bosch GmbH
Publication of EP3830294A1 publication Critical patent/EP3830294A1/de
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Definitions

  • the present invention relates to a reaction mixture for providing a reaction mixture for carrying out a quantitative real-time PCR and a method for carrying out a quantitative real-time PCR and a kit.
  • PCR polymerase chain reaction
  • template DNA The DNA to be reproduced is referred to as template (template DNA).
  • primers are also required, each of which determines the starting point of DNA synthesis on the individual strands of DNA.
  • DNA synthesis is catalyzed by the temperature-stable DNA polymerase using deoxy nucleotides.
  • the double-stranded DNA is first denatured (melting) before the primer hybridization, ie the binding of the primers to the complementary sequence section of the
  • primer annealing single-stranded DNA
  • the DNA polymerase then attaches and the primers are complementarily extended in the so-called elongation step (extending). These individual steps are controlled by temperature cycles.
  • PCR real-time PCR
  • the real-time PCR allows a quantification of the initial amount of the template DNA.
  • reference measurements that are carried out in parallel reaction batches are required for this.
  • the invention provides a reaction mixture which is provided to provide a reaction batch for carrying out a quantitative real-time PCR.
  • This reaction mixture can be used to quantify a DNA sequence, for example a DNA sequence of a gene segment, parallel standard reactions already being integrated in the respective reaction mixture or in the reaction mixture, so that it is not necessary to carry out parallel standard and control reactions ,
  • the particular advantage is that quantification and quality control can be measured in one and the same reaction approach (PCR approach).
  • PCR approach reaction approach
  • a reaction batch is to be understood to mean that the reaction takes place in a reaction vessel. It is therefore not necessary for reference measurements to be carried out in parallel, which means considerable
  • reaction mixture of the present invention and the method that can be carried out with it can therefore be used with particular advantage in medical diagnostics.
  • the reaction mixture of the present invention comprises at least one target DNA which corresponds at least in part to the DNA sequence to be quantified.
  • this target DNA is also called Quanticon.
  • the reaction mixture contains at least one reference DNA which has a defined, artificial sequence and which is present in the reaction mixture in a defined amount. This reference DNA is also referred to below as an articon. Furthermore, at least two are different
  • Fluorescence probes with different sequences are provided, which generate a signal at different wavelengths. It also contains primers, deoxy nucleotides and a heat-stable DNA polymerase. Depending on the application, the primer is one or more
  • Primer pairs The target DNA and the reference DNA have the same primer binding sites (primer hybridization sites). Furthermore are the same primer binding sites (primer hybridization sites). Furthermore are the primer binding sites (primer hybridization sites). Furthermore are the primer binding sites (primer hybridization sites). Furthermore are the primer binding sites (primer hybridization sites). Furthermore are the primer binding sites (primer hybridization sites). Furthermore are the primer binding sites (primer hybridization sites). Furthermore are the primer binding sites (primer hybridization sites). Furthermore are examples of the same primer binding sites.
  • the term amplicon generally refers to the DNA that is to be reproduced. At least one of the fluorescent probes is provided for hybridization or binding with a section of the target DNA outside the primer binding sites in the amplicon.
  • At least one of the fluorescent probes is provided for hybridization or binding with a section of the reference DNA outside the primer binding sites in the amplicon.
  • One of the fluorescent probes thus binds to the target DNA and the other fluorescent probe binds to the reference DNA.
  • Fluorescence probes are preferably single-stranded DNA sequence sections which are each coupled to at least one reporter dye molecule and to at least one quencher molecule.
  • the principle of operation of such known fluorescence probes is based on the fact that the fluorescence signal is extinguished by the spatial proximity of the reporter dye molecule and the quencher molecule when the fluorescence probe is intact or the fluorescence probe is intact DNA molecule.
  • the fluorescent probes attach themselves to the complementary sections of the template DNA (outside the primer binding sites).
  • the DNA polymerase migrates along the strand of the template DNA to be copied and inevitably encounters the attached one
  • Fluorescent probe The fluorescent probes are cut by a 5'-3 'exonuclease activity of the DNA polymerase, so that the spatial proximity of the reporter dye molecules and the quencher dye molecules is canceled, whereby a fluorescence signal is generated. This measurable The fluorescence signal therefore indicates the amplification that has taken place.
  • the fluorophores of the probes are expediently selected such that the colors or fluorescence signals can be distinguished from one another by means of a detector device and a suitable filter set.
  • the defined, artificial sequence of the reference DNA is expediently not the same (orthogonal), i.e. thus not homologous to the sequence of the target DNA, the GC content, ie the total proportion of guanine (G) and cytosine (C) in the sequence, regardless of their positions in the sequence itself, preferably being as identical as possible to the GC Content of the target DNA is.
  • “as identical as possible” is to be understood as meaning that the percentage GC content of the target DNA and the reference DNA deviates from
  • the base pair length of the target DNA sequence and the reference DNA sequence is as equal as possible, with deviations of, for example, up to 15%, preferably up to 10%, being acceptable.
  • the reference DNA allows internal calibration and can also perform the tasks of positive and negative controls.
  • a multi-template PCR is carried out, with several different, specific amplificates being produced in parallel in the amplification reaction.
  • At least two templates, ie the target DNA and the reference DNA, are provided.
  • the different templates are amplified using only one pair of primers that hybridize with the target DNA and the reference DNA.
  • different probes one for the target DNA and one for If the reference DNA is specific (or possibly several probes), different fluorescence signals or fluorescent colors can be detected, the test result being able to be obtained from the relationships of the different fluorescence signals to one another.
  • a PCR process that is carried out with the reaction mixture described is particularly suitable for automation and miniaturization, in particular in the context of a microfluidic application, on account of the integrated references and controls. It can be particularly advantageous here if the various components of the
  • Reaction mixture can be provided in lyophilized form.
  • the target DNA and / or the reference DNA and / or the primers and / or the deoxy nucleotides and / or the DNA polymerase can be provided and presented in lyophilized form.
  • This can be implemented, for example, in the form of one or more so-called lyobeads.
  • a lyobead is generally understood to mean a lyophilisate which, according to the
  • the substances are usually in powder form, pressed into a spherical shape.
  • the components required for the PCR approach can be provided in lyophilized form, in particular the DNA polymerase, the deoxy nucleotides, the target DNA and the reference DNA and the reaction buffer components and optionally also the primers and / or the probes , That way, in a lot
  • the PCR process can be started in a user-friendly manner by adding the sample to be quantified and, if necessary, other necessary components.
  • the provision in lyophilized form is particularly advantageous for automated applications.
  • reaction mixture or at least parts of the reaction mixture as a lyobead has the further advantage that the integration of standards and / or controls in a reaction batch can significantly reduce the manufacturing effort and also the development effort for the lyobeads.
  • the reduction in the number of reaction batches required also makes integration into a microfluidic system particularly advantageous, since fewer reaction chambers are required than in conventional PCR processes, and the microfluidic one Platform does not have to be expanded by additional chambers.
  • runtime of the real-time PCR can be shortened, since that of the invention
  • the underlying concept enables the reaction conditions to be brought into a particularly efficient or ideal reaction range by predefined quantities of the templates, so that fluorescence signals can always be expected.
  • Another particular advantage of the PCR process described here is that the integration of standards and / or controls in one
  • Templates are identical, for example for quality control
  • a standard straight line is often created as part of a quantitative real-time PCR, often requiring at least three different concentrations for the standard straight line that lie in the range of the sample concentration to be expected. For statistical reasons, more concentrations are often chosen for the standard reactions and these standard reactions are also processed in multiple executions.
  • the calibration is carried out with the aid of a multi-signal concept of the different fluorescent probes and their relationship to one another, which is why only one reaction is required and quantification is nevertheless possible. This has considerable advantages in terms of the work and process effort required for this, as well as in terms of advantageously minimizing expensive chemicals and the need for samples or the small amount of samples required.
  • the amount of the reference DNA can be present in a concentration which corresponds to a detection limit for the DNA section to be quantified. Furthermore, it may vary Application should be provided that the target DNA and the reference DNA are present in a ratio of 1: 1 and beyond in defined amounts.
  • the invention further comprises a method for carrying out a quantitative real-time PCR, with this method at least one
  • Reaction mixture as described above is used.
  • the actual sample is usually added to this reaction mixture with the
  • the PCR process is carried out to a certain extent as a duplex reaction, the PCR cycles being carried out in a manner known per se by varying the temperature in a thermocycling process known per se.
  • the target DNA and the DNA section to be quantified, if present in the sample, and the reference DNA are amplified.
  • the amplification of the target DNA and, at the same time, of the actual sample with the DNA segment to be quantified as well as the amplification of the reference DNA are recorded and traceably tracked.
  • a test result and in particular a quantitative test result can be determined from the ratio of these signals to one another.
  • Each array vessel of the PCR array can be equipped with different reaction mixtures, so that a maximum degree of multiplexing is possible.
  • the assembly can be carried out, for example, by spotting each array vessel with a different reaction mixture. This makes it possible that, in particular in a microfluidic PCR array
  • Sample solution with the DNA section to be quantified or the nucleic acid material to be investigated can, for example, be passed as a whole over the array. In this way, the sample solution gets into each individual array vessel and forms with each different
  • Reaction mixture a respective reaction batch.
  • the particular advantage here is that the individual reaction chambers do not have to be individually filled and controlled. This is the case with conventional methods
  • Standard reactions are provided, must not be loaded with sample material. In this respect, it is generally necessary with conventional PCR arrays that the individual reaction chambers have to be individually filled and controlled, the reaction vessels for the standard reactions being filled differently than the reaction chambers that are used for the PCR processes with the
  • the PCR array with which a PCR process is carried out according to the concept described here allows a much larger number of PCR batches with the sample to be measured in an array, because no separate reaction batches have to be provided for the standard reactions .
  • the concept of the present application also allows, as above
  • Another particular advantage of the concept described here for a real-time PCR is that the reaction system does not have to be calibrated for every light source, since the test results are obtained from the ratio of the signals, which is based on the conserved conditions in the individual amplification processes.
  • Light sources and optical detectors are often different for different device types. Therefore, calibration measurements are traditionally required for each type of device. Even in a device that has two identical LED light sources installed
  • both light sources are calibrated so that they provide the same absolute numbers that are required for the evaluation over standard straight lines.
  • these complex calibration measurements are dispensed with, since relative conditions are used within one approach.
  • the sample quantities obtained from the patient are often small.
  • analysis systems that are used in point-of-care applications are provided for a small space requirement and should have the highest possible degree of automation in order to reduce the operating effort.
  • microfluidic implementations of the PCR approach described here are particularly suitable for these applications, automation, miniaturization and parallelization being possible, which on the one hand reduces the effort required for use and also minimizes the potential for errors in the event of incorrect operation.
  • the reagents can also be prepared for lyophilization at room temperature and in the smallest space, for example in the form of lyobeads.
  • a nested PCR process comprises one in a manner known per se
  • Pre-amplification and at least one subsequent detection reaction Pre-amplification and at least one subsequent detection reaction.
  • the concept described here can be used in one approach for estimating the PCR product amount of the pre-amplification using a target DNA and a reference DNA.
  • the target DNA and the reference DNA can be designed so that a first pair of primers for the pre-amplification and at least a second pair of primers for the
  • the target DNA and the reference DNA each have complementary sequence segments to the primer sequences (primer binding sites), the complementary sequence segments for the second pair of primers (primer binding sites for the primer pair of Detection reaction (s) within the complementary sequence segments for the first pair of primers (primer binding sites for the pair of primers)
  • Pre-amplification This means that the primer binding sites for the individual primer pairs are to a certain extent nested within one another on the target DNA and the reference DNA.
  • the nested PCR process can be especially for one
  • Point mutation detection can be used.
  • the mapping of Point mutation detection can be used.
  • Fluorescence probe can be performed.
  • the nested PCR process can be a multiplex process in which at least two specific gene segments are to be detected in a genome.
  • a control reaction can be carried out for a quantification of the pre-amplification, in which a control exon from the genome is amplified in parallel.
  • the target DNA and the reference DNA are matched to the control exon, it being possible to draw conclusions from the quantification of the amplification of the control exon in accordance with the concept described here for the amounts in the amplification of the gene segments to be detected during the pre-amplification.
  • Point mutation assays are needed in oncology. Although two color channels are required for the detection of each DNA section to be examined, the concept allows multiplexing and several can
  • Pre-amplification is estimated.
  • the two PCR processes ie the pre-amplification and the subsequent detection reaction are linked to one another fully automatically in a microfluidic system, without the DNA concentration having to be measured separately in an intermediate step or without having to purify PCR products formed during the pre-amplification.
  • the nested PCR process can be
  • they can be designed so that after the PCR product quantity from the pre-amplification has been estimated, an optimal DNA concentration for the subsequent detection reaction (s) is set by dilution. This can be done in-situ, for example, also in an automated manner.
  • the invention comprises a kit for carrying out a quantitative real-time PCR.
  • the kit comprises at least one target DNA which corresponds at least in part to the DNA sequence to be quantified.
  • the kit comprises at least one reference DNA with a defined, artificial sequence and in a defined amount. Furthermore, at least two are different
  • Fluorescence probes with different sequences are available that generate a signal at different wavelengths.
  • primers and / or deoxy nucleotides and / or a DNA polymerase and / or buffer components can be provided.
  • the target DNA and the reference DNA have the same primer binding sites, but different probe binding sites, the probe binding sites being outside the primer binding sites in the respective amplicon. At least one of the
  • Fluorescent probes are for hybridization (binding) with a portion of the target DNA outside the primer binding sites in the amplicon and at least one of the fluorescent probes is for hybridization (binding) with a portion of the reference DNA outside the primer binding sites in the amplicon.
  • the components of the kit can be in particular in lyophilized form
  • Fig. 1 is a schematic representation of the design of the target DNA and the reference DNA to illustrate the basic principle of the concept
  • Fig. 2 is a schematic representation of the for real-time quantitative PCR
  • Fig. 3 shows a schematic representation of a quantitative real-time PCR
  • FIG. 3A DNA templates used (FIG. 3A) and schematic representation of possible test results (FIG. 3B) when using the concept in the context of a quantitative nested PCR;
  • FIG. 4 shows a schematic representation of possible designs for a reference DNA in the context of a point mutation assay
  • Fig. 5 shows a schematic representation of the template DNA used
  • Template DNAs that is, the target DNA 11 and the reference DNA 12 explained.
  • a classic TaqMan ® system can be used as the basis for the PCR reaction approach, using two different fluorescence probes, as explained at the beginning.
  • the target DNA corresponds to the DNA sequence that is actually to be analyzed or quantified, for example the DNA sequence of a gene segment.
  • the target DNA 11 is provided with an artificial reference DNA, which has a defined sequence and in a defined amount is used, supplemented.
  • the target DNA 11 and the reference DNA 12 have the same primer binding sites, ie one binding site 13 for the forward primer and one binding site 14 for the reverse primer.
  • These template DNAs 11, 12 differ in the remaining base pair sequence 15, 16. In particular, they have different binding sites 17, 18 for the probes used.
  • Quanticon 11 for the amplicon to be quantified
  • Articon 12 for the artificial amplicon.
  • the following table summarizes the design of the Quanticon (target DNA) 11 and the Articon (reference DNA) 12:
  • the fluorophores of the fluorescent probes are selected so that the two colors can be distinguished from one another by means of a detector (filter set).
  • the orthogonal sequence 16 of the reference DNA 12 is more appropriately different from the target sequence 15 of the target DNA 11.
  • the GC content should be as identical as possible to the GC content of the target sequence 15 of the target DNA. Also the
  • the base pair length of Quanticon, ie target DNA 11, and Articon, ie reference DNA 12, should be of the same length.
  • the melting temperatures of the two amplicons 11, 12 are very similar, so that, in principle, the same amounts of amplificate are produced in an efficient PCR.
  • a quantitative real-time PCR is carried out with these template DNAs, with Quanticon 11 and Articon 12 being amplified as a quasi-duplex reaction in the same reaction vessel.
  • both probes are recorded, for example after each PCR cycle or continuously.
  • the Articon 12 can be presented in a predefined amount in the range or above the detection limit and must be detected as signals from probe B if the PCR is successful. In this case, the Articon 12 serves as a reaction control.
  • Amplification of Quanticon 11 and, if necessary, additionally in The reaction mixture of the gene section to be quantified (target) can be detected as a signal from probe A.
  • the signals from probe A and B are now in defined ratios. If the same starting quantity of Articon 12 and Quanticon 11 is available, the two amplification curves are congruent. If more Quanticon 11 is present, then this is detected earlier and the curve of the Articons 12 follows depending on its concentration. This can be calculated from the reaction efficiency and from the defined amount of Articons 12.
  • the amount of Articon 12 presented is an absolute one
  • Quanticons 11 can be calculated.
  • the reaction system in the event that the sample material is present as a genome. This can be used, for example, if certain gene segments from a lysate are to be detected. Comparable to the principle from FIG. 1, a Quanticon 11 (Q) and an Articon 12 (A) are used here.
  • the gene section 20 (S) to be amplified is located in the reaction mixture as a cell lysate with genetic material which is formed by the genome of the cell (s).
  • the Quanticon 11 and the Articon 12 are presented in a predefined amount in a ratio of 1: 1. For example, the selected amount may be close to above the detection limit. Another option is to set the amount to a range that is ideally functional for the PCR reaction
  • any real-time quantitative PCR has limits within which the reaction proceeds efficiently.
  • the detected Ci values which describe the beginning of the exponential growth of a curve, are in a linear relationship to the logarithmic start quantity used. If the amount of Quanticon 11 and Articon 12 used is selected in this range, a signal should be detected with every successful PCR process. The signal of the articon 12 is the signal that must be measured last in the chronological order. If this is missing, the reaction control is negative. If the signal of the Quanticon 11 is detected at the same time as the signal for the Articon 12, this means that only Quanticon 11 and Articon 12 was present and no sample 20. This case is shown in diagram A in FIG.
  • Lines 11 and 12 represent the respective fluorescence signals of quanticone 11 (fluorophore A) and articon 12 (fluorophore B). If the same DNA section as in Quanticon 11 was present in the genome or in sample 20, this section from sample 20 is also amplified. This leads to the signal of the quanticon 11 (diagram B in FIG. 2) being detected earlier, the detected signal being composed of the amplification of the quanticone 11 and the sample 20. As already explained in principle with reference to FIG. 1, the starting amount of the DNA section to be examined can now be calculated from the sample 20 (sample).
  • the predefined quantities of Articon 12 and Quanticon 11 not only offer the absolute reference point for calculating the
  • the process can be carried out dynamically, in that the signal of the Quanticon 11 represents a termination criterion for the reaction, so that after the signal of the
  • Quanticons 11 the PCR process can be ended. Since the quantity of the quanticone 11 can be transferred into an efficient area for the PCR process, detection is possible approximately in the middle of the time of the planned process duration, that is to say with medium number of cycles. In the case of a positive sample, that is to say the DNA section sought is present in sample 20, the signal from quanticon 11 (together with the signal from sample 20) lies before the signal from articon 12, so that the process time for the measurement can be shortened , In this case, only a qualitative statement is possible after stopping the reaction.
  • 3A and 3B illustrate the concept described in the context of a qualitative nested PCR (nested PCR).
  • a PCR method can e.g. B. can be used to detect mutations.
  • the target region in which the mutation is located is copied up from the genomic DNA 30 of cells.
  • the ratio of wild type to mutation is then measured.
  • the actual detection reaction is preceded by a pre-amplification to ensure that there is enough material for a detection is available. This is particularly important when there is little cell material, such as. B. in a liquid biopsy with circulating tumor cells. As illustrated in FIG.
  • the implementation of the concept described here takes place in such a system that the locus of mutation 35 (target DNA) is first copied up in a sufficiently large section with a defined pair of primers.
  • Corresponding binding sites 33, 34 for a forward primer and a reverse primer are present on the genomic DNA of sample 30 for this first pair of primers.
  • a probe binding site 37 for a first fluorescent probe A in the immediate vicinity of the primer binding site 33 is monitored and quantification of the process.
  • a Quanticon 21 that is to say a target DNA 21, is designed which has corresponding primer binding sites 23 and 24 and a corresponding probe binding site 27 for the fluorescent probe A.
  • an Articon 22 reference DNA with the same primer binding sites 23, 24 and a different probe binding site 28 is designed for a fluorescent probe B.
  • Pre-amplification ready which can be quantified according to the principle explained with reference to FIG. 2.
  • further primer binding sites 43, 44 are provided for a further primer pair with a second forward primer and a second reverse primer, the binding site 43 for the second forward primer being located in the genomic gene segment 30 the binding site 37 for the fluorescent probe A connects.
  • the binding site 44 for the second reverse primer is located downstream of the actual target DNA 35, which represents the gene segment to be detected.
  • Pre-amplification there are corresponding primer binding sites 43, 44.
  • the target DNA 21 (Quanticon for the pre-amplification), different, that is to say orthogonal, sequences are provided at positions 143, 144, which correspond to the primer binding sites 43, 44 of the Articon sequence 22.
  • the sequence between the sequences 143, 144 on the Quanticon sequence 21 corresponds to the target DNA sequence 35 of the DNA section to be quantified in the sample 30.
  • the amplified gene segment 30 '(amplified sample) to be quantified is present as the PCR product.
  • the amplified Articon 22 ' is also present.
  • the Quanticon 21, also amplified corresponds essentially to the sequence of the amplified sample 30 '.
  • Detection reaction 102 is located after the primer binding site 43 for the forward primer, one binding site 47 for another
  • Fluorescence probe A ' which is used in the subsequent detection reaction 102.
  • the articon 22 or the amplified articon 22 ' has, after the primer binding site 43, a different probe binding site 48 for a further fluorescent probe B', likewise for the following one
  • Detection reaction 102 An orthogonal sequence 26 adjoins the articon 22 or the amplified articon 22 ', which is orthogonal to the target sequence 35 of the sample 30 to be examined. This is followed by the binding site 44 for the reverse primer of the subsequent detection reaction 102 and the binding site 24 for the reverse primer from the pre-amplification.
  • the GC content and the length of the base pair sequences between Articon 22 and the corresponding section in the sample 30 and the Quanticon 21 should correspond approximately, as already explained above.
  • the preamplification 100 is quantified in principle as already explained with reference to FIG. 2 and is illustrated in the upper part of FIG. 3B.
  • the signals from probes A and B are shown here.
  • Diagram A shows the case where the signal of the Quanticons 21 (probe A) and the signal of the Articons 22 (probe B) are superimposed. In this case, there is no DNA section to be detected in sample 30.
  • Diagram B shows the case in which the signal of the amplified quanticone 21 together with the amplified gene section from the sample 30 occurs before the signal of the amplified one
  • Quanticon 21 can calculate the efficiency.
  • the final concentration and the starting concentration of all amplificates can be calculated using the predefined articon 22.
  • the batch can be diluted and prepared with a new master mix (step 101) so that the batch corresponds to the ideal input concentrations for the subsequent detection assay (s) (step 102).
  • the dilution can be done manually, for example if the reactions in a bulk system,
  • microfluidic systems for example, a classic qPCR cycler.
  • the process is preferably carried out in a fully automated fluid handler, microfluidic systems being particularly suitable.
  • microfluidic systems being particularly suitable.
  • the reaction mixture is amplified with the necessary primers (second pair of primers) and the signal curve of probe A '(curve 470) and probe B' (curve 480) is observed and evaluated.
  • the articon 22 ' is outnumbered, that is to say there is less starting material of the articon 22' than starting material of the sample 30 '. This is because the pre-amplification 100 results in more sample amplicon, consisting of the amplified sample 30 'and the amplified Quanticon 21.
  • a dynamic termination of the PCR after immediate detection is therefore of great advantage, because the Articon 22 'and the sample 30' in the exponential phase make the estimation of the amplicon amounts more accurate than in the case of detection in the saturation phase.
  • the second qPCR ie the detection reaction 102
  • the amplified Quanticon 21 of the first reaction is not considered in the second reaction (detection reaction 102), since the corresponding positions 143, 144 to the primer binding sites 43, 44 on the target DNA sequence 21 of the pre-amplification are orthogonal, were chosen differently.
  • an additional Articon can also be added to its master mix. Instead of the articon, the first
  • the first reaction mixture is usually diluted and the Articon (but not the increased actual sample) is detected. Therefore, after dilution, a defined amount of Articon is added for a more precise determination.
  • This further Articon can, for example, be stored in a (second) Lyobead required for the detection reaction. This is particularly advantageous to determine the relationship between wild and mutation type in a point mutation detection.
  • Another Quanticon is also used, which has the same primer binding sequences. The amplified product of the first reaction 100 must then be diluted so that it corresponds to the concentration of the second quanticone presented.
  • Fig. 4 are embodiments for a possible design of the art icons
  • Articons 52, 62 are intended for the use of a nested PCR as part of a point mutation assay. Generally, at
  • mutation sensitive probes or blockers selected.
  • the primer is designed so that it can only bind if the mutation is present. Examples of this are so-called ARMS (Amplification Refractory Mutation System) systems.
  • ARMS Amplification Refractory Mutation System
  • a mutation-sensitive probe or blocker is used which only binds if the mutation is present (e.g. PNA-CLAMP systems - peptide nucleic acid (PNA) -mediated PCR
  • the inventive concept makes sense for such a proof to include a second Quanticon.
  • 62 mutation 301 is built into the orthogonal sequences. The binding site of the mutation should thus be included.
  • Mutation-sensitive primers Articon 62 therefore comprises the following sections: Binding site 23 for the first forward primer, binding site 28 for probe B, binding site 63 for a mutation-specific primer which is the forward primer of the second pair of primers for the detection reaction 102, an orthogonal sequence 26, a binding site 44 for the reverse Primer of the detection reaction 102 and a binding site 24 for the reverse primer of the pre-amplification.
  • the Articon 52 is designed so that the binding site for this probe or the blocker comprises the mutation site 301 at exactly the same location as in the mutation type. Otherwise, the Articon 52 corresponds to the Articon 62 or Articon 22.
  • FIG. 5 shows a multiplex version of a nested PCR, two detection reactions being able to be carried out in one approach.
  • a lysate of a few cells for example 10 to 1000 cells.
  • This lysate can contain, for example, cells from an accumulation, for example from an accumulation of circulating tumor cells or from an accumulation of immune cells, for example specific T cells, from a body fluid, such as blood, urine, spinal fluid or the like. These cells are lysed in a small volume and provide the sample for carrying out the method.
  • Two gene segments 70, 80 are to be detected in this cell lysate, for example an exon A (gene segment 70) and an exon B (gene segment 80).
  • the gene segments 70, 80 are amplified (pre-amplification), so that in the subsequent step in one or more detection reactions, abnormalities on these gene segments, such as mutations or function-typical gene sequences, for example the genetic coding of an antigen epitope, can be detected.
  • the genetic material of the lysed cells first becomes the two target exons, ie gene sections 70 and 80 were amplified.
  • a sample check is also carried out.
  • a control exon C is amplified as gene segment 90 for the sample control. This can be, for example, an exon of the gene sought, on which the anomaly is not present. If this is amplified, the reaction is considered successful and as proof that the sample material, i.e. genetic material, was present in the sample.
  • the control exon 90 for the detection and quantification of the amplification of the control exon 90, in
  • a target DNA (Quanticon) 21 and a reference DNA (Articon) 22 are used in a corresponding manner as already described, which according to the above
  • control exon 90 in terms of their structure and their components. If the amplicons 70, 80 and 90 all have approximately the same length and the same GC content, then that should
  • the reaction approach in a triplex reaction produces approximately the same number of copies for each template. If there are deviations in the length and in the GC content, there are conserved ratios of the amplified amplicons, the ratios additionally being able to be influenced by the DNA structure and epigenetic modifications. That is, even if the reaction may be less efficient when amplifying one of the exons, the ratios of the amplicon copies produced are still constant. This allows only one amplicon, namely the control exon C, in the
  • control exon C gene segment 90.
  • the pre-amplification is first quantified by the control exon 90, so that the amplificates for the subsequent one
  • Reaction conditions in the detection reaction can optionally be distributed and diluted in situ. After the distribution and dilution, a new master mix is added which is intended for the specific assay of the detection reaction and which can also be quantified in accordance with the statements relating to FIG. 2.
  • Exon A (gene segment 70) has the on the periphery of the amplicon Binding sites 71, 72 for the primers of the pre-amplification.
  • Exon B (gene segment 80) and the control exon C (gene segment 90) have corresponding primer binding sites 81, 82 and 91, 92, but with different sequences.
  • the binding site for the primers of the second reaction (detection reaction) 73, 74 and 83, 84 follows on gene segments 70 and 80 respectively. Is a probe for
  • control exon C (gene segment 90) has the binding site 97 for a fluorescent probe A after the primer binding site 91.
  • a Quanticon or a target DNA 21 and an Articon or a reference DNA 22 are supplemented, which have the same primer binding sites 91 , 92 are labeled as control exon C (gene segment 90).
  • the target DNA 21 also has the same binding site 97 for probe A.
  • the reference DNA 22 also has a probe binding site 98, but with a different sequence for binding a fluorescent probe B. From the signals to be generated with this reaction mixture, conclusions can be drawn about the copies Nc produced and the starting quantity No.
  • the quantities of exons A and B are calculated from the conserved ratios.
  • the conditions can be
  • the ratios are specific to the particular assay.
  • the ratios are intrinsically constant, but must be measured for each application, i.e. can be parameterized.
  • the master mixes of the following two separate and parallel processable specific proofs for exon A and for exon B each have a quanticon and an articon, which have the same primer binding sites as the respective target exon Have A or B.
  • the quanticon has the wild-type sequence and the articon has the mutant sequence.
  • the entire reaction sequence is shown schematically in the middle part of the illustration in FIG. 5.
  • the pre-amplification 200 takes place first, with exon A, exon B, control exon C and the quanticon and the articon being present as templates in the approach.
  • the quantification result 210 is obtained (No control exon C, Nc control exon C, can be calculated therefrom Nc, N o Exon A; Nc, No Exon B).
  • the optimal concentrations of exon A (Ns, 2 exon A) and exon B (Ns, 2 exon) are determined in step 220 by distributing and, if necessary, diluting the batches B) set.
  • the specific mutation detection is carried out, for which, in addition to exon A or exon B, a correspondingly designed Quanticon A and Articon A or
  • Quanticon B and Articon B are added as illustrated in the lower part of FIG. 5.
  • the array 500 is integrated, for example, in a chip made of structured silicon, the array 500 being located in a microfluidic chamber which has an inflow 501 and a Drain 502 is provided.
  • individual reaction vessels of the array 500 can be controlled globally or liquids can be added.
  • a pre-amplified sample can be rinsed over the array 500 so that the individual reaction vessels of the array 500 are filled.
  • a seal can be used to prevent communication via diffusion between the individual reaction vessels in a second fluidic step.
  • Each reaction vessel of the array 500 is now, for example, with a lyophilized master mix and / or with the primers and
  • concept of the invention may preferably based on TaqMan ® - developed systems.
  • the synthesis of the individual template DNAs, in particular the Quanticons and the Articons, can be carried out with more conventional methods
  • Nucleic acid synthesis take place.
  • the master mixes, including the template DNAs, can preferably be stored upstream as lyophilisates.
  • Microoptofluidic systems are particularly suitable for process automation.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Bei einem Reaktionsgemisch zur Bereitstellung eines Reaktionsansatzes für die Durchführung einer quantitativen Echtzeit-PCR sind in dem Reaktionsgemisch wenigstens eine Ziel-DNA (11), die zumindest in Teilen dem zu quantifizierenden DNA-Abschnitt entspricht, und wenigstens eine Referenz-DNA (12) mit definierter Sequenz und in definierter Menge und wenigstens zwei verschiedene Fluoreszenzsonden mit unterschiedlicher Sequenz, die bei unterschiedlichen Wellenlängen ein Signal generieren, und Primer und Desoxy-Nukleotide und eine DNA-Polymerase enthalten. Die Ziel-DNA (11) und die Referenz-DNA (12) weisen die gleichen Primer-Bindungsstellen (13, 14)und unterschiedliche Sonden-Bindungsstellen (17, 18) auf. Wenigstens eine der Fluoreszenzsonden ist zur Bindung mit einem Abschnitt der Ziel-DNA (11) außerhalb der Primer-Bindungsstellen (13, 14) im Amplikon und wenigstens eine der Fluoreszenzsonden ist zur Bindung mit einem Abschnitt der Referenz-DNA(12) außerhalb der Primer-Bindungsstellen (13, 14) im Amplikon vorgesehen.

Description

Beschreibung
Titel
Reaktionsgemisch, Verfahren und Kit zur Durchführung einer quantitativen
Echtzeit- PCR
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Reaktionsgemisch zur Bereitstellung eines Reaktionsansatzes zur Durchführung einer quantitativen Echtzeit-PCR sowie ein Verfahren zur Durchführung einer quantitativen Echtzeit-PCR und einen Kit.
Stand der Technik
Die Polymerasekettenreaktion (PCR) ist eine sehr sensitive Methode der Bioanalytik. Mithilfe des Enzyms DNA-Polymerase wird auf der Grundlage einer DNA-Sequenz als Vorlage DNA amplifiziert. Die in jedem Zyklus gebildeten Produkte dienen dabei als Vorlage für den jeweils nächsten Zyklus. Die zu vervielfältigende DNA wird dabei als template (Template-DNA) bezeichnet.
Weiterhin sind sogenannte Primer erforderlich, die auf den Einzelsträngen der DNA jeweils den Startpunkt der DNA-Synthese festlegen. Die DNA-Synthese wird durch die temperaturstabile DNA-Polymerase unter Verwendung von Desoxy-Nukleotiden katalysiert. Für jeden PCR-Zyklus wird die doppelsträngige DNA zunächst denaturiert ( melting ), bevor die Primer-Hybridisierung, also die Bindung der Primer an den komplementäre Sequenzabschnitt der
einzelsträngigen DNA (primer annealing) stattfinden kann. Anschließend lagert sich die DNA-Polymerase an und es kommt zur komplementäre Verlängerung der Primer in dem sogenannten Elongationsschritt ( extending ). Diese einzelnen Schritte werden durch Temperaturzyklen gesteuert.
Eine Ausführungsform der PCR ist die Echtzeit-PCR (qPCR), bei welcher der Reaktionsverlauf mittels Fluoreszenzsonden verfolgt werden kann. Die Echtzeit- PCR erlaubt dabei eine Quantifizierung der Ausgangsmenge der Template-DNA. In der Regel sind hierfür Referenzmessungen, die in parallelen Reaktionsansätzen mitgeführt werden, erforderlich. Neben quantitativen
Referenzmessungen werden standardmäßig auch qualitative Kontrollen mitgeführt, um falsch-positive oder falsch-negative Resultate ausschließen zu können.
Offenbarung der Erfindung Vorteile der Erfindung
Die Erfindung stellt ein Reaktionsgemisch zur Verfügung, das zur Bereitstellung eines Reaktionsansatzes für die Durchführung einer quantitativen Echtzeit-PCR vorgesehen ist. Mit diesem Reaktionsgemisch kann die Quantifizierung einer DNA-Sequenz, beispielsweise einer DNA-Sequenz eines Genabschnittes, erfolgen, wobei in den jeweiligen Reaktionsansatz bzw. in das Reaktionsgemisch bereits parallele Standardreaktionen integriert sind, so dass es nicht erforderlich ist, parallele Standard- und Kontrollreaktionen mitzuführen. Der besondere Vorteil dabei ist, dass die Quantifizierung und eine Qualitätskontrolle in ein und demselben Reaktionsansatz (PCR-Ansatz) gemessen werden können. Unter einem Reaktionsansatz ist in diesem Zusammenhang zu verstehen, dass die Reaktion in einem Reaktionsgefäß abläuft. Es ist also nicht erforderlich, dass Referenzmessungen parallel mitgeführt werden, wodurch erhebliche
Einsparungen bei dem Aufwand für die PCR-Ansätze möglich sind. Dies kann beispielsweise insbesondere bei Point-of-Care (PoC)-Anwendungen erhebliche Vorteile bieten, da bei solchen Anwendungen in der Regel Untersuchungen direkt für einen Patienten ausgeführt werden. Es ist dafür in der Regel bei herkömmlichen Verfahren erforderlich, für jeden Patienten entsprechende Referenzmessungen anzusetzen und parallel mitzuführen. Dies entfällt bei der Verwendung des Reaktionsgemisches der vorliegenden Erfindung. Das
Reaktionsgemisch der vorliegenden Erfindung und das damit durchführbare Verfahren sind daher besonders in der Medizinaldiagnostik mit Vorteil einsetzbar.
Das Reaktionsgemisch der vorliegenden Erfindung umfasst wenigstens eine Ziel DNA, die zumindest in Teilen der zu quantifizierenden DNA-Sequenz entspricht. Im Folgenden wird diese Ziel-DNA auch als Quanticon bezeichnet. Weiterhin enthält das Reaktionsgemisch wenigstens eine Referenz-DNA, die eine definierte, artifizielle Sequenz aufweist, und die in definierter Menge in dem Reaktionsgemisch vorliegt. Diese Referenz-DNA wird im Folgenden auch als Articon bezeichnet. Weiterhin sind wenigstens zwei verschiedene
Fluoreszenzsonden mit unterschiedlicher Sequenz vorgesehen, die bei unterschiedlichen Wellenlängen ein Signal generieren. Darüber hinaus sind Primer, Desoxy- Nukleotide und eine hitzestabile DNA-Polymerase enthalten. Bei dem Primern handelt es sich, je nach Anwendung, um ein oder mehrere
Primerpaare. Die Ziel-DNA und die Referenz-DNA weisen die gleichen Primer- Bindungsstellen (Primer-Hybridisierungsstellen) auf. Weiterhin sind
unterschiedliche Sonden-Bindungsstellen auf der Ziel-DNA und der Referenz- DNA vorgesehen, wobei die Sonden-Bindungsstellen außerhalb der Primer- Bindungsstellen im jeweiligen Amplikon liegen. Der Begriff Amplikon bezeichnet hierbei allgemein die DNA, die vervielfältigt werden soll. Wenigstens eine der Fluoreszenzsonden ist zur Hybridisierung bzw. Bindung mit einem Abschnitt der Ziel-DNA außerhalb der Primer-Bindungsstellen im Amplikon vorgesehen.
Wenigstens eine der Fluoreszenzsonden ist zur Hybridisierung bzw. Bindung mit einem Abschnitt der Referenz-DNA außerhalb der Primer-Bindungsstellen im Amplikon vorgesehen. Eine der Fluoreszenzsonden bindet also an die Ziel-DNA und die andere Fluoreszenzsonde bindet an die Referenz-DNA. Bei den
Fluoreszenzsonden handelt es sich vorzugsweise um einzelsträngige DNA- Sequenzabschnitte, die jeweils an wenigstens ein Reporter- Farbstoffmolekül und an wenigstens ein Quencher-Molekül gekoppelt sind. Das Funktionsprinzip derartiger, an sich bekannter Fluoreszenzsonden basiert darauf, dass das Fluoreszenzsignal bei intakter Fluoreszenzsonde bzw. bei intaktem DNA-Molekül der Fluoreszenzsonde durch die räumliche Nähe des Reporter- Farbstoffmoleküls und des Quencher-Moleküls ausgelöscht ist. Während der PCR-Reaktion lagern sich die Fluoreszenzsonden an die jeweils komplementären Abschnitte der Template-DNA (außerhalb der Primer- Bindungsstellen) an. Während der Amplifizierung wandert die DNA-Polymerase an dem zu kopierenden Strang der Template-DNA entlang und stößt dabei zwangsläufig auf die angelagerte
Fluoreszenzsonde. Durch eine 5‘-3‘-Exonuklease-Aktivität der DNA-Polymerase werden die Fluoreszenzsonden geschnitten, so dass die räumliche Nähe der Reporter- Farbstoffmoleküle und der Quencher- Farbstoffmoleküle aufgehoben wird, wodurch ein Fluoreszenzsignal entsteht. Dieses messbare Fluoreszenzsignal lässt daher auf die erfolgte Amplifikation rückschließen. Durch die Verwendung von zwei verschiedenen Fluoreszenzsonden, von denen die eine mit der Ziel-DNA oder die andere mit der Referenz-DNA wechselwirken, kann daher in einem Reaktionsansatz sowohl die Amplifikation auf der Basis der Ziel-DNA als auch die Amplifikation auf der Basis der Referenz-DNA durch die unterschiedlichen Fluoreszenzsignale verfolgt werden. Zweckmäßigerweise werden die Fluorophore der Sonden dabei so gewählt, dass die Farben bzw. Fluoreszenzsignale mittels einer Detektoreinrichtung und einem geeigneten Filterset voneinander unterscheidbar sind.
Die definierte, artifizielle Sequenz der Referenz-DNA ist zweckmäßigerweise ungleich (orthogonal), d.h. also nicht homolog, zu der Sequenz der Ziel-DNA, wobei der GC-Gehalt, also der Gesamtanteil an Guanin (G) und Cytosin (C) in der Sequenz, unabhängig von deren Positionen in der Sequenz selbst, vorzugsweise möglichst identisch mit dem GC-Gehalt der Ziel-DNA ist. Unter „möglichst identisch“ ist hierbei zu verstehen, dass eine Abweichung des prozentualen GC-Gehalts der Ziel-DNA und der Referenz-DNA von
beispielsweise bis zu 15%, vorzugsweise von bis zu 10%, vorliegen kann.
Weiterhin ist es bevorzugt, dass die Basenpaarlänge der Ziel-DNA-Sequenz und der Referenz-DNA-Sequenz möglichst gleich ist, wobei Abweichungen von beispielsweise bis zu 15%, vorzugsweise von bis zu 10%, akzeptabel sein können.
Das dem beschriebenen Reaktionsgemisch zugrundeliegende Konzept für die Durchführung einer quantitativen Echtzeit-PCR liegt darin, dass eine artifizielle Referenz-DNA in definierter Zusammensetzung und Menge dem
Reaktionsansatz beigegeben wird. Die Referenz-DNA erlaubt eine interne Kalibrierung und kann darüber hinaus die Aufgaben von Positiv- und Negativ- Kontrollen erfüllen. Dabei wird im Prinzip eine Multi-Template-PCR durchgeführt, wobei in der Amplifikationsreaktion parallel mehrere verschiedene, spezifische Amplifikate entstehen. Es sind dabei mindestens zwei Templates, also die Ziel- DNA und die Referenz-DNA vorgesehen. Die Amplifikation der unterschiedlichen Templates erfolgt dabei im Prinzip mit nur einem Primerpaar, das mit der Ziel- DNA und der Referenz-DNA hybridisiert. Durch die Verwendung von
verschiedenen Sonden, wobei eine Sonde für die Ziel-DNA und eine Sonde für die Referenz-DNA spezifisch ist (oder gegebenenfalls mehrere Sonden), können unterschiedliche Fluoreszenzsignale bzw. Fluoreszenzfarben detektiert werden, wobei aus den Verhältnissen der verschiedenen Fluoreszenzsignale zueinander das Testergebnis erhalten werden kann.
Ein PCR-Prozess, der mit dem beschriebenen Reaktionsgemisch durchgeführt wird, eignet sich aufgrund der integrierten Referenzen und Kontrollen in besonderer Weise für eine Automatisierung und eine Miniaturisierung, insbesondere im Rahmen einer mikrofluidischen Anwendung. Hierbei kann es besonders vorteilhaft sein, wenn die verschiedenen Komponenten des
Reaktionsgemisches in lyophilisierter Form bereitgestellt werden. So können insbesondere die Ziel-DNA und/oder die Referenz-DNA und/oder die Primer und/oder die Desoxy-Nukleotide und/oder die DNA-Polymerase in lyophilisierter Form bereitgestellt und vorgelegt werden. Dies kann beispielsweise in Form von einem oder mehreren sogenannten Lyobeads realisiert werden. Unter einem Lyobead ist im Allgemeinen ein Lyophilisat zu verstehen, das nach der
Herstellung, nach der die Substanzen in der Regel als Pulver vorliegen, in eine sphärische Form gepresst ist. So können beispielsweise die für den PCR-Ansatz erforderlichen Komponenten in lyophilisierter Form bereitgestellt werden, insbesondere die DNA-Polymerase, die Desoxy-Nukleotide, die Ziel-DNA und die Referenz-DNA und die Reaktionspufferkomponenten und gegebenenfalls auch die Primer und/oder die Sonden. Auf diese Weise kann in sehr
anwenderfreundlicher Weise durch Zugabe der zu quantifizierenden Probe und gegebenenfalls von weiteren erforderlichen Komponenten der PCR-Prozess direkt gestartet werden. Die Bereitstellung in lyophilisierter Form ist insbesondere für automatisierte Anwendungen sehr vorteilhaft.
Die Bereitstellung des Reaktionsgemisches oder zumindest von Teilen des Reaktionsgemisches als Lyobead hat weiterhin den Vorteil, dass durch die Integration von Standards und/oder Kontrollen in einem Reaktionsansatz der Herstellungsaufwand und auch der Entwicklungsaufwand für die Lyobeads erheblich reduziert werden kann. Durch die Verringerung der Anzahl der erforderlichen Reaktionsansätze ist auch die Integration in ein mikrofluidisches System besonders vorteilhaft, da weniger Reaktionskammern als bei herkömmlichen PCR-Prozessen erforderlich sind, und die mikrofluidische Plattform nicht um weitere Kammern erweitert werden muss. Weiterhin kann die Laufzeit der Echtzeit-PCR verkürzt werden, da das der Erfindung
zugrundeliegende Konzept es ermöglicht, dass die Reaktionsbedingungen durch vordefinierte Mengen der Templates in einen besonders effizienten bzw. idealen Reaktionsbereich gebracht werden, so dass immer Fluroeszenzsignale erwartet werden können.
Ein weiterer besonderer Vorteil des hier beschriebenen PCR-Prozesses ist, dass durch die Integration von Standards und/oder Kontrollen in einem
Reaktionsansatz die Bedingungen für die Standards, Kontrollen und die eigentliche Probe mit der zu quantifizierenden DNA identisch sind. Wenn beispielsweise eine Luftblase in dem Reaktionsansatz vorliegt, was in seltenen Fällen beispielsweise in mikrofluidischen Systemen der Fall sein kann, so sind die damit verbundenen Auswirkungen auf die Reaktionseffizienz für alle
Templates identisch, also beispielsweise für die Qualitätskontrolle, die
Kalibrierung und für die eigentliche Probenreaktion, so dass das gesamte Experiment in jedem Fall vergleich- und auswertbar ist.
Herkömmlicherweise wird im Rahmen einer quantitativen Echtzeit-PCR oft eine Standardgerade erstellt, wobei hierfür oftmals mindestens drei unterschiedliche Konzentrationen für die Standardgerade vorausgesetzt werden, die im Bereich der zu erwartenden Probenkonzentration liegen. Aus statistischen Gründen werden oftmals mehr Konzentrationen für die Standardreaktionen gewählt und diese Standardreaktionen zudem in Mehrfachausführung prozessiert. Bei dem vorliegend beschriebenen Konzept für die Echtzeit-PCR erfolgt die Kalibrierung mithilfe eines Mehrsignalkonzeptes der unterschiedlichen Fluoreszenzsonden und deren Verhältnis zueinander, weshalb nur eine Reaktion benötigt wird und dennoch eine Quantifizierung möglich ist. Dies hat erhebliche Vorteile im Hinblick auf den hierfür erforderlichen Arbeits- und Prozessaufwand sowie auch im Hinblick auf eine vorteilhafte Minimierung von kostspieligen Chemikalien und den Probenbedarf bzw. die erforderliche geringe Probenmenge.
In einer bevorzugten Ausgestaltung des Reaktionsgemisches kann die Menge der Referenz-DNA in einer Konzentration vorliegen, die einer Nachweisgrenze für den zu quantifizierende DNA-Abschnitt entspricht. Weiterhin kann es je nach Anwendung vorgesehen sein, dass die Ziel-DNA und die Referenz-DNA in einem Verhältnis von 1:1 und darüber hinaus in definierten Mengen vorliegen.
Die Erfindung umfasst weiterhin ein Verfahren zur Durchführung einer quantitativen Echtzeit-PCR, wobei bei diesem Verfahren wenigstens ein
Reaktionsgemisch, wie es oben beschrieben ist, verwendet wird. Zu diesem Reaktionsgemisch wird in der Regel noch die eigentliche Probe mit dem
Nukleinsäurematerial, das den zu quantifizierenden DNA-Abschnitt
(gegebenenfalls) umfasst, hinzugegeben. Mit diesem vervollständigten
Reaktionsansatz wird der PCR-Prozess gewissermaßen als Duplexreaktion durchgeführt, wobei in an sich bekannter Weise die PCR-Zyklen durch Variation der Temperatur in einem an sich bekannten thermocycling- Prozess durchgeführt werden. Dabei wird zum einen die Ziel-DNA und der zu quantifizierende DNA- Abschnitt, sofern in der Probe vorhanden, als auch die Referenz-DNA amplifiziert. Durch Erfassung und Auswertung der Fluoreszenzsignale der verschiedenen Fluoreszenzsonden, die jeweils spezifisch für die Ziel-DNA (und gleichzeitig für den zu quantifizierenden DNA-Abschnitt) und die Referenz-DNA sind, kann die Amplifikation der Ziel-DNA und gleichzeitig der eigentlichen Probe mit dem zu quantifizierenden DNA-Abschnitt als auch die Amplifikation der Referenz-DNA erfasst und unterscheidbar nachverfolgt werden. Aus dem Verhältnis dieser Signale zueinander kann ein Testergebnis und insbesondere ein quantitatives Testergebnis ermittelt werden.
In einer besonders bevorzugten Ausgestaltung des Verfahrens wird das
Verfahren in einem PCR-Array mit einer Mehrzahl von Arraygefäßen
durchgeführt. Dies kann mit besonderem Vorteil in mikrofluidischen
Anwendungen erfolgen, die insbesondere auch einer Automatisierung zugänglich sind. Hierbei kann jedes Arraygefäß des PCR-Arrays mit unterschiedlichen Reaktionsgemischen bestückt werden, so dass ein maximaler Multiplexgrad möglich ist. Die Bestückung kann beispielsweise durch ein Bespotten jedes Arraygefäßes mit einem anderen Reaktionsgemisch erfolgen. Hierdurch ist es möglich, dass insbesondere in einem mikrofluidischen PCR-Array die
Probenlösung mit dem zu quantifizierenden DNA-Abschnitt bzw. dem zu untersuchenden Nukleinsäurematerial beispielsweise als Ganzes über den Array gegeben werden kann. Auf diese Weise gelangt die Probenlösung in jedes einzelne Arraygefäß und bildet mit dem jeweils unterschiedlichen
Reaktionsgemisch einen jeweiligen Reaktionsansatz. Der besondere Vorteil hierbei ist, dass die einzelnen Reaktionskammern nicht einzeln befüllt und angesteuert werden müssen. Bei herkömmlichen Verfahren besteht das
Problem, dass bei einem PCR-Array die Arraygefäße, die für die
Standardreaktionen vorgesehen sind, nicht mit Probenmaterial beladen werden dürfen. Insofern ist es bei herkömmlichen PCR-Arrays in der Regel erforderlich, dass die einzelnen Reaktionskammern einzeln befüllt und angesteuert werden müssen, wobei die Reaktionsgefäße für die Standardreaktionen anders befüllt werden als die Reaktionskammern, die für die PCR-Prozesse mit der
eigentlichen Probe vorgesehen sind. Der PCR-Array, mit dem ein PCR-Prozess gemäß dem vorliegend beschriebenen Konzept durchgeführt wird, erlaubt hingegen zum einen eine wesentlich größere Anzahl von PCR-Ansätzen mit der zu messenden Probe in einem Array, weil für die Standardreaktionen keine separaten Reaktionsansätze bereitgestellt werden müssen. Zum anderen erlaubt das Konzept der vorliegenden Anmeldung darüber hinaus, wie oben
beschrieben, dass der gesamte Array als Ganzes mit der Probelösung befüllt wird.
Ein weiterer besonderer Vorteil des vorliegend beschriebenen Konzeptes für eine Echtzeit-PCR ist, dass das Reaktionssystem nicht für jede Lichtquelle kalibriert werden muss, da die Testergebnisse aus dem Verhältnis der Signale, das auf den konservierten Verhältnissen bei den einzelnen Amplifikationsabläufen beruht, gefällt wird. Lichtquellen und optische Detektoren sind oftmals bei verschiedenen Gerätetypen unterschiedlich. Daher sind herkömmlicherweise Kalibrierungsmessungen für jeden Gerätetyp erforderlich. Selbst in einem Gerät, bei dem zwei gleiche LED-Lichtquellen verbaut sind, müssen
herkömmlicherweise beide Lichtquellen kalibriert werden, damit diese dieselben absoluten Zahlen, welche für die Auswertung über Standardgeraden erforderlich sind, liefern. Bei dem Konzept für eine Echtzeit-PCR gemäß der vorliegenden Erfindung entfallen diese aufwendigen Kalibrierungsmessungen, da mit relativen Verhältnissen innerhalb eines Ansatzes gearbeitet wird.
Bei medizinischen Anwendungen und insbesondere in der medizinischen Diagnostik sind die Probenmengen, die von dem Patienten gewonnen werden, oft klein. Weiterhin sind Analysesysteme, die in Po/nt-of-Care-Anwendungen eingesetzt werden, für einen kleinen Platzbedarf vorgesehen und sollten einen möglichst hohen Automatisierungsgrad aufweisen, um den Bedienungsaufwand zu reduzieren. Insofern eignen sich insbesondere mikrofluidische Realisierungen des vorliegend beschriebenen PCR-Ansatzes in besonderer Weise für diese Anwendungen, wobei eine Automatisierung, eine Miniaturisierung und eine Parallelisierung möglich sind, was zum einen den Aufwand bei der Anwendung verringert und auch das Fehlerpotenzial bei Fehlbedienungen minimiert.
Weiterhin können kleine Probenmengen in kleine Volumina überführt werden, so dass die Reaktionskonzentration größer wird. Bei herkömmlichen Verfahren ist eine Parallelisierung mit Herausforderungen an das Handling verbunden, da in der Regel die Verteilung von Reaktionsgemischen und die Vorlagerung und Aufbereitung der erforderlichen Chemikalien durch die Miniaturisierung schwierig ist. Die Echtzeit-PCR gemäß dem vorliegend beschriebenen Konzept minimiert den Aufwand bei dem Handling des PCR- Prozesses, da zum einen die Anzahl der Reaktionsansätze auf im Wesentlichen einen Ansatz reduziert wird. Hierbei können die erforderlichen Reagenzien ohne weiteres vorgelagert werden, beispielsweise in einem Lab-on-Chip-System. Durch die Möglichkeit der
Lyophilisierung können die Reagenzien beispielsweise auch bei Raumtemperatur und auf kleinstem Raum bereitgestellt werden, beispielsweise in Form von Lyobeads.
In einer besonders bevorzugten Ausgestaltung des Verfahrens kann das
Verfahren für einen verschachtelten PCR-Prozess genutzt werden. Ein verschachtelter PCR-Prozess umfasst in an sich bekannter Weise eine
Präamplifikation und wenigstens eine nachgeschaltete Nachweisreaktion. Hierbei kann das vorliegend beschriebene Konzept unter Verwendung einer Ziel-DNA und einer Referenz-DNA in einem Ansatz für eine Abschätzung der PCR- Produktmenge der Präamplifikation genutzt werden. Hierbei können die Ziel-DNA und die Referenz-DNA so entworfen werden, dass ein erstes Primerpaar für die Präamplifikation und wenigstens ein zweites Primerpaar für die
Nachweisreaktion(en) eingesetzt werden. Die Ziel-DNA und die Referenz-DNA weisen jeweils komplementäre Sequenzabschnitte zu den Primersequenzen auf (Primer-Bindungsstellen), wobei die komplementären Sequenzabschnitte für das zweite Primerpaar (Primer-Bindungsstellen für das Primerpaar der Nachweisreaktion(en)) innerhalb der komplementären Sequenzabschnitte für das erste Primerpaar (Primer-Bindungsstellen für das Primerpaar der
Präamplifikation) liegen. Das heißt, die Primer-Bindungsstellen für die einzelnen Primerpaare sind auf der Ziel-DNA und der Referenz-DNA gewissermaßen ineinander verschachtelt.
Der verschachtelte PCR- Prozess kann insbesondere für einen
Punktmutationsnachweis eingesetzt werden. Hierbei kann nach der
Präamplifikation, deren PCR-Produktmenge gemäß dem vorliegend
beschriebenen Konzept bestimmt wird, die Nachweisreaktion unter Verwendung eines mutationssensitiven Primers und/oder einer mutationssensitiven
Fluoreszenzsonde durchgeführt werden.
Der verschachtelte PCR-Prozess kann ein Multiplex-Prozess sein, bei dem wenigstens zwei bestimmte Genabschnitte in einem Genom nachgewiesen werden sollen. Hierbei kann für eine Quantifizierung der Präamplifikation eine Kontrollreaktion durchgeführt werden, bei der parallel ein Kontroll-Exon aus dem Genom amplifiziert wird. Die Ziel-DNA und die Referenz-DNA sind in diesem Fall an das Kontroll-Exon angepasst, wobei aus der Quantifizierung der Amplifikation des Kontroll-Exons gemäß dem vorliegend beschriebenen Konzept auf die Mengen bei der Amplifikation der nachzuweisenden Genabschnitte während der Präamplifikation rückgeschlossen wird.
Insgesamt kann das vorliegend beschriebene Konzept für einen PCR-Prozess nicht nur quantitative Standardgeraden und Qualitätsreaktionen integrieren, sondern auch Referenz- und Schwellwertmessungen, welche z. B. bei
Punktmutationsassays in der Onkologie benötigt werden. Obwohl pro zu untersuchendem DNA-Abschnitt zwei Farbkanäle bei der Detektion benötigt werden, erlaubt das Konzept ein Multiplexing und es können mehrere
verschiedene DNA-Abschnitte (Targets) in einem Ansatz adressiert werden. Insbesondere im Rahmen einer verschachtelten PCR mit Präamplifikation und einer nachgeschalteten qualitativen Messung, beispielsweise einer Analyse einer Punktmutation, kann das Verfahren so angewendet werden, dass die
Ausgangsmenge für die zweite Reaktion durch eine Quantifizierung der
Präamplifikation abgeschätzt wird. Dabei können die beiden PCR-Prozesse, also die Präamplifikation und die nachgeschaltete Nachweisreaktion, in einem mikrofluidischen System vollautomatisch miteinander verknüpft werden, ohne dass in einem Zwischenschritt separat die DNA- Konzentration gemessen werden müsste oder dass bei der Präamplifikation entstandene PCR-Produkte aufgereinigt werden müssten. Der verschachtelte PCR-Prozess kann
beispielsweise so ausgestaltet werden, dass nach der Abschätzung der PCR- Produktmenge aus der Präamplifikation eine optimale DNA- Konzentration für die nachfolgende(n) Nachweisreaktion(en) durch Verdünnung eingestellt wird. Dies kann beispielsweise in-situ, auch in automatisierter Weise, durchgeführt werden.
Die Erfindung umfasst schließlich einen Kit zur Durchführung einer quantitativen Echtzeit-PCR. Der Kit umfasst wenigstens eine Ziel-DNA, die zumindest in Teilen der zu quantifizierenden DNA-Sequenz entspricht. Weiterhin umfasst der Kit wenigstens eine Referenz-DNA mit definierter, artifizieller Sequenz und in definierter Menge. Weiterhin sind wenigstens zwei verschiedene
Fluoreszenzsonden mit unterschiedlicher Sequenz vorhanden, die bei unterschiedlichen Wellenlängen ein Signal generieren. Gegebenenfalls können Primer und/oder Desoxy-Nukleotide und/oder eine DNA-Polymerase und/oder Pufferkomponenten vorgesehen sein. Die Ziel-DNA und die Referenz-DNA weisen die gleichen Primer-Bindungsstellen, aber unterschiedliche Sonden- Bindungsstellen auf, wobei die Sonden-Bindungsstellen außerhalb der Primer- Bindungsstellen im jeweiligen Amplikon liegen. Wenigstens eine der
Fluoreszenzsonden ist zur Hybridisierung (Bindung) mit einem Abschnitt der Ziel- DNA außerhalb der Primer-Bindungsstellen im Amplikon und wenigstens eine der Fluoreszenzsonden ist zur Hybridisierung (Bindung) mit einem Abschnitt der Referenz-DNA außerhalb der Primer-Bindungsstellen im Amplikon vorgesehen. Die Bestandteile des Kits können insbesondere in lyophilisierter Form
bereitgestellt werden, z.B. in Form von Lyobeads. Bezüglich weiterer Merkmale dieses Kits wird auf die obige Beschreibung verweisen.
Weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der
nachfolgenden Beschreibung von Ausführungsbeispielen. Hierbei können die einzelnen Merkmale jeweils für sich oder in Kombination miteinander verwirklicht werden. In den Figuren zeigen:
Fig. 1 schematische Darstellung des Designs der Ziel-DNA und der Referenz DNA zur Illustrierung des Grundprinzips des Konzeptes zur
Durchführung einer quantitativen Echtzeit-PCR;
Fig. 2 schematische Darstellung der für die quantitative Echtzeit-PCR
verwendeten Template-DNAs und schematische Darstellung von möglichen Versuchsergebnissen bei der Quantifizierung eines bestimmten DNA-Abschnitts in einer Probe;
Fig. 3 schematische Darstellung der für eine quantitative Echtzeit-PCR
verwendeten DNA-Templates (Fig. 3A) und schematische Darstellung von möglichen Versuchsergebnissen (Fig. 3B) bei Anwendung des Konzeptes im Rahmen einer quantitativen verschachtelten PCR;
Fig. 4 schematische Darstellung von möglichen Designs für eine Referenz DNA im Rahmen eines Punktmutationsassays;
Fig. 5 schematische Darstellung der verwendeten Template-DNAs zur
Erläuterung einer Multiplexausführung einer verschachtelten PCR und
Fig. 6 schematische Darstellung der Implementierung der quantitativen
Echtzeit-PCR in einem mikrofluidischen PCR-Array.
Beschreibung von Ausführungsbeispielen
Anhand von Fig· 1 wird das Grundprinzip des Designs der verwendeten
Template-DNAs, also der Ziel-DNA 11 und der Referenz-DNA 12 erläutert. Als Grundlage für den PCR- Reaktionsansatz kann ein klassisches TaqMan®-System eingesetzt werden, wobei zwei verschiedene Fluoreszenzsonden, wie eingangs erläutert, verwendet werden. Dabei entspricht die Ziel-DNA der eigentlich zu analysierenden bzw. zu quantifizierenden DNA-Sequenz, beispielsweise der DNA-Sequenz eines Genabschnitts. Die Ziel-DNA 11 wird mit einer artifiziellen Referenz-DNA, die eine definierte Sequenz aufweist und die in definierter Menge eingesetzt wird, ergänzt. Die Ziel-DNA 11 und die Referenz-DNA 12 besitzen dieselben Primer-Bindungsstellen, also jeweils eine Bindungsstelle 13 für den Forward- Primer und jeweils eine Bindungsstelle 14 für den Reverse- Primer. In der restlichen Basenpaarsequenz 15, 16 unterscheiden sich diese Template- DNAs 11, 12. Insbesondere weisen sie unterschiedliche Bindungsstellen 17, 18 für die verwendeten Sonden auf. Die beiden Template-DNAs 11 und 12 werden auch als Quanticon 11 für das zu quantifizierende Amplikon und als Articon 12 für das artifizielle Amplikon bezeichnet. Die folgende Tabelle fasst das Design des Quanticon (Ziel-DNA) 11 und des Articon (Referenz-DNA) 12 zusammen:
Die Fluorophore der Fluoreszenzsonden sind so gewählt, dass die beiden Farben mittels Detektor (Filterset) voneinander unterscheidbar sind. Die orthogonale Sequenz 16 der Referenz-DNA 12 ist zweckmäßiger ungleich zur Target-Sequenz 15 der Ziel-DNA 11. Der GC-Gehalt sollte möglichst identisch mit dem GC-Gehalt der Target-Sequenz 15 der Ziel-DNA sein. Auch die
Basenpaarlänge von Quanticon, also Ziel-DNA 11, und Articon, also Referenz- DNA 12, sollte gleichlang sein. Dadurch sind die Schmelztemperaturen der beiden Amplikons 11, 12 sehr ähnlich, so dass bei einer effizienten PCR im Prinzip die gleichen Mengen an Amplifikat entstehen. Mit diesen Template-DNAs wird eine quantitative Echtzeit-PCR durchgeführt, wobei Quanticon 11 und Articon 12 als Quasi-Duplexreaktion im gleichen Reaktionsgefäß amplifiziert werden. Währenddessen werden beide Sonden aufgezeichnet, beispielsweise nach jedem PCR-Zyklus oder kontinuierlich. Das Articon 12 kann dabei in einer vordefinierten Menge im Bereich oder über der Nachweisgrenze vorgelegt werden und muss bei einer erfolgreichen PCR als Signale der Sonde B detektiert werden. Das Articon 12 dient in diesem Fall als Reaktionskontrolle. Die
Amplifikation des Quanticons 11 und des gegebenenfalls zusätzlich im Reaktionsansatz vorhandenen zu quantifizierenden Genabschnitts (Target) ist als Signal von Sonde A detektierbar. Die Signale von Sonde A und B stehen nun in definierten Verhältnissen. Ist die gleiche Startmenge von Articon 12 und Quanticon 11 vorhanden, so sind die beiden Amplifikationskurven kongruent. Ist mehr Quanticon 11 vorhanden, dann wird dieses früher detektiert und die Kurve des Articons 12 folgt abhängig von dessen Konzentration. Dies lässt sich durch die Reaktionseffizienz und aus der fest definierten Menge des Articons 12 berechnen. Die vorgelegte Menge Articon 12 ist dabei ein absoluter
Referenzpunkt, dessen Menge bekannt ist. Die Effizienz der Reaktion kann mittels der Kurvenform der exponentiellen Phasen ermittelt werden. Dadurch kann mit dem absoluten Referenzpunkt die unbekannte Startmenge des
Quanticons 11 berechnet werden.
Fig. 2 zeigt die Implementation des Reaktionssystems für den Fall, dass das Probenmaterial (Sample) als Genom vorliegt. Dies kann beispielsweise zur Anwendung kommen, wenn bestimmte Genabschnitte aus einem Lysat nachgewiesen werden sollen. Vergleichbar mit dem Prinzip aus Fig. 1 wird hier ein Quanticon 11 (Q) und ein Articon 12 (A) eingesetzt. Zusätzlich befindet sich im Reaktionsansatz der zu amplifizierende Genabschnitt 20 (S) als Zelllysat mit genetischem Material, das von dem Genom der Zelle(n) gebildet wird. In diesem Fall werden das Quanticon 11 und das Articon 12 in einer vordefinierten Menge in einem Verhältnis von 1:1 vorgelegt. Die gewählte Menge kann beispielsweise in der Nähe oberhalb der Nachweisgrenze liegen. Eine andere Möglichkeit ist, die Menge an einen für die PCR-Reaktion ideal funktionalen Bereich
anzupassen, so dass die PCR besonders effizient abläuft. Im Allgemeinen hat jede quantitative Echtzeit- PCR (qPCR) Grenzen, innerhalb derer die Reaktion effizient abläuft. Dabei stehen die detektierten Ci-Werte, die den Anfang des exponentiellen Wachstums einer Kurve beschreiben, in einem linearen Verhältnis zur eingesetzten, logarithmierten Startmenge. Wenn die eingesetzte Menge des Quanticons 11 und des Articons 12 in diesem Bereich gewählt wird, sollte bei jedem erfolgreichen PCR-Prozess ein Signal detektiert werden. Das Signal des Articons 12 ist das Signal, welches in der zeitlichen Reihenfolge als Letztes gemessen werden muss. Fehlt dieses, ist die Reaktionskontrolle negativ. Wird zeitgleich mit dem Signal für das Articon 12 das Signal des Quanticons 11 detektiert, bedeutet dies, dass in der Reaktionsmischung nur Quanticon 11 und Articon 12 vorhanden war und keine Probe 20. Dieser Fall ist in dem Diagramm A der Fig. 2 dargestellt und dient als Nachweiskontrolle für die prinzipielle Funktion des PCR-Ansatzes. Hierbei repräsentieren die Linien 11 und 12 die jeweiligen Fluoreszenzsignale des Quanticons 11 (Fluorophor A) und des Articons 12 (Fluorophor B). Wenn in dem Genom bzw. in der Probe 20 der gleiche DNA-Abschnitt wie im Quanticon 11 vorhanden war, so wird dieser Abschnitt aus der Probe 20 mit hochamplifiziert. Dies führt dazu, dass das Signal des Quanticons 11 (Diagramm B in Fig. 2) früher detektiert wird, wobei sich das detektierte Signal aus der Amplifizierung des Quanticons 11 und der Probe 20 zusammensetzt. Wie im Prinzip anhand der Fig. 1 bereits erläutert, kann nun die Startmenge des zu untersuchenden DNA-Abschnitts aus der Probe 20 ( Sample ) berechnet werden. Die vordefinierten Mengen von Articon 12 und Quanticon 11 bieten dabei nicht nur den absoluten Referenzpunkt zur Berechnung der
Quantifizierung, sondern gewährleisten auch Signale und dienen als Kontrolle.
In einer weiteren Ausgestaltung des PCR-Prozess kann der Prozess dynamisch durchgeführt werden, indem das Signal des Quanticons 11 ein Abbruchkriterium für die Reaktion darstellt, so dass nach dem Auftreten des Signals des
Quanticons 11 der PCR-Prozess beendet werden kann. Da die Menge des Quanticons 11 in einen effizienten Bereich für den PCR-Prozess transferiert werden kann, ist eine Detektion etwa in der zeitlichen Mitte der geplanten Prozessdauer, also bei mittleren Zyklenzahlen, möglich. Bei einer positiven Probe, das heißt der gesuchte DNA-Abschnitt in der Probe 20 ist vorhanden, liegt das Signal des Quanticons 11 (zusammen mit dem Signal der Probe 20) vor dem Signal des Articons 12, so dass sich die Prozesszeit zur Messung verkürzen kann. In diesem Fall ist nach dem Abbruch der Reaktion lediglich eine qualitative Aussage möglich.
Fig. 3A und Fig. 3B illustrieren das beschriebene Konzept im Rahmen einer qualitativen verschachtelten PCR ( nested PCR). Eine solche PCR-Methode kann z. B. zum Nachweis von Mutationen eingesetzt werden. Dafür wird aus der genomischen DNA 30 von Zellen die Zielregion, in der die Mutation liegt, hochkopiert. Anschließend wird das Verhältnis von Wildtyp zu Mutation gemessen. Hierfür wird der eigentlichen Nachweisreaktion eine Präamplifikation vorangestellt, um sicherzugehen, dass genügend Material für einen Nachweis vorhanden ist. Dies ist insbesondere dann von großer Bedeutung, wenn wenig Zellmaterial vorhanden ist, wie z. B. bei einer Flüssigbiopsie mit zirkulierenden Tumorzellen. Wie in Fig. 3A illustriert, erfolgt die Implementierung des vorliegend beschriebenen Konzeptes in ein solches System so, dass zunächst der Lokus der Mutation 35 (Target-DNA) in einem genügend großen Abschnitt mit einem definierten Primerpaar hochkopiert wird. Auf der genomischen DNA der Probe 30 sind für dieses erste Primerpaar entsprechende Bindungsstellen 33, 34 für einen Forward- Primer und einen Reverse- Primer vorhanden. Zur Kontrolle,
Überwachung und Quantifizierung des Prozesses wird eine Sonden- Bindungsstelle 37 für eine erste Fluoreszenzsonde A in unmittelbarer Nähe der Primer-Bindungsstelle 33 gewählt. Kongruent zu diesem Amplikon in der Probe 30 wird ein Quanticon 21, also eine Ziel-DNA 21 entworfen, die entsprechende Primer-Bindungsstellen 23 und 24 und eine entsprechende Sonden- Bindungsstelle 27 für die Fluoreszenzsonde A aufweist. Weiterhin wird ein Articon 22 (Referenz-DNA) mit den gleichen Primer-Bindungsstellen 23, 24 und einer abweichenden Sonden-Bindungsstelle 28 für eine Fluoreszenzsonde B entworfen. Diese Komponenten 30, 21, 22 stellen die Basis für die
Präamplifikation bereit, die gemäß des anhand von Fig. 2 erläuterten Prinzips quantifizierbar ist. Darüber hinaus sind für die nachfolgende Nachweisreaktion 102 weitere Primer-Bindungsstellen 43, 44 für ein weiteres Primerpaar mit einem zweiten Forward- Primer und einem zweiten Reverse- Primer vorgesehen, wobei sich bei dem genomischen Genabschnitt 30 die Bindungsstelle 43 für den zweiten Forward- Primer an die Bindungsstelle 37 für die Fluoreszenzsonde A anschließt. Die Bindungsstelle 44 für den zweiten Reverse- Primer befindet sich stromabwärts der eigentlichen Target-DNA 35, die den nachzuweisenden Genabschnitt darstellt. Auf der Referenz-DNA 22 (Articon für die
Präamplifikation) befinden sich entsprechende Primer-Bindungsstellen 43, 44.
Auf der Ziel-DNA 21 (Quanticon für die Präamplifikation) sind an den Positionen 143, 144, die den Primer-Bindungsstellen 43, 44 der Articon-Sequenz 22 entsprechen, abweichende, also orthogonale Sequenzen, vorgesehen. Die Sequenz zwischen den Sequenzen 143, 144 auf der Quanticon-Sequenz 21 entspricht der Target-DNA-Sequenz 35 des zu quantifizierenden DNA-Abschnitts der Probe 30. Nach der Präamplifikation 100, die nach Zugabe des ersten Primerpaares erfolgt, ist als PCR-Produkt der amplifizierte, zu quantifizierende Genabschnitt 30‘ (amplifizierte Probe) vorhanden. Weiterhin ist das amplifizierte Articon 22‘ vorhanden. Das ebenfalls amplifizierte Quanticon 21 entspricht von der Sequenz her im Wesentlichen der amplifizierten Probe 30‘. Innerhalb der Primer- Bindungsstellen 43, 44 für das zweite Primerpaar der nachfolgenden
Nachweisreaktion 102 befinden sich im Anschluss an die Primer-Bindungsstelle 43 für den Forward- Primer eine Bindungsstelle 47 für eine weitere
Fluoreszenzsonde A‘, die in der nachfolgenden Nachweisreaktion 102 eingesetzt wird. Das Articon 22 bzw. das amplifizierte Articon 22‘ weist in entsprechender Weise nach der Primer-Bindungsstelle 43 eine andere Sonden-Bindungsstelle 48 für eine weitere Fluoreszenzsonde B‘ auf, ebenfalls für die nachfolgende
Nachweisreaktion 102. Auf dem Articon 22 bzw. dem amplifizierten Articon 22‘ schließt sich eine orthogonale Sequenz 26 an, die orthogonal zu der Zielsequenz 35 der zu untersuchenden Probe 30 ist. Es schließen sich die Bindungsstelle 44 für den Reverse- Primer der nachfolgenden Nachweisreaktion 102 und die Bindungsstelle 24 für den Reverse- Primer aus der Präamplifikation an. Der GC- Gehalt und die Länge der Basenpaarsequenzen zwischen Articon 22 und dem entsprechenden Abschnitt in der Probe 30 und dem Quanticon 21 sollten sich in etwa entsprechen, wie oben bereits ausgeführt.
Die Quantifizierung der Präamplifikation 100 erfolgt im Prinzip wie bereits anhand von Fig. 2 erläutert und ist im oberen Teil von Fig. 3B illustriert. Hierbei sind jeweils die Signale der Sonden A und B dargestellt. Diagramm A zeigt den Fall, dass das Signal des Quanticons 21 (Sonde A) und das Signal des Articons 22 (Sonde B) Übereinanderliegen. In diesem Fall ist kein nachzuweisender DNA- Abschnitt in der Probe 30 vorhanden. Diagramm B zeigt den Fall, dass das Signal des amplifizierten Quanticons 21 zusammen mit dem amplifizierten Genabschnitt aus der Probe 30 zeitlich vor dem Signal des amplifizierten
Articons 22 auftritt. In diesem Fall ist der gesuchte Genabschnitt in der Probe 30 vorhanden. Wenn keine Probe ( Sample ) detektiert werden kann (Diagramm A), kann der Gesamtablauf gestoppt und die Ausgabe erfolgen, dass kein Nachweis stattfand (negatives Testergebnis). Wird gemäß Diagramm B Probe detektiert, kann der PCR-Prozess so lange weitergeführt werden, bis das Articon 22 detektiert wird. Dann kann gegebenenfalls der Prozess abgebrochen werden. Alternativ kann auch eine vordefinierte Anzahl an PCR-Zyklen abgearbeitet werden. Aus der Amplifikationskurve der Probe 30 zusammen mit dem
Quanticon 21 kann die Effizienz berechnet werden. Mittels des vordefinierten Articons 22 kann die Endkonzentration sowie die Startkonzentration aller Amplifikate berechnet werden. Auf dieser Basis kann der Ansatz so verdünnt werden und mit einem neuen Mastermix angesetzt werden (Schritt 101), dass der Ansatz den idealen Eingangskonzentrationen für den oder die nachfolgenden Nachweisassays (Schritt 102) entspricht. Die Verdünnung kann händisch erfolgen, beispielsweise wenn die Reaktionen in einem Bulksystem,
beispielsweise einem klassischen qPCR-Cycler, stattfinden. In bevorzugter Weise wird der Prozess in einem vollautomatisierten Fluidhandler ausgeführt, wobei sich mikrofluidische Systeme besonders eignen. Hier kann das Verdünnen und Verteilen von Flüssigkeiten mithilfe von mikrofluidischen Pump- und
Aliquotiersystemen erfolgen.
Für die eigentliche Nachweisreaktion 102, beispielsweise für einen
Punktmutationsnachweis, wird der Reaktionsansatz mit den hierfür erforderlichen Primern (zweites Primerpaar) amplifiziert und der Signalverlauf der Sonde A‘ (Kurve 470) und der Sonde B‘ (Kurve 480) beobachtet und ausgewertet. Das Articon 22‘ befindet sich gemäß dem Reaktionskonzept in der Unterzahl, das heißt, es ist weniger Startmaterial des Articons 22‘ vorhanden als Startmaterial der Probe 30‘. Dies liegt daran, dass bei der Präamplifikation 100 mehr Proben- Amplikon, bestehend aus der amplifizierten Probe 30‘ und dem amplifizierten Quanticon 21 entsteht. Daher ist ein dynamischer Abbruch der PCR nach unmittelbarer Detektion von großem Vorteil, denn das Articon 22‘ und die Probe 30‘ in der exponentiellen Phase machen das Abschätzen der Amplikonmengen genauer als bei einer Detektion in der Sättigungsphase. Da nun wieder das Articon 22‘ in definierten Mengen vorliegt und die Probe 30‘ als neues Quanticon wirkt, kann auch die zweite qPCR, also die Nachweisreaktion 102, vollständig quantifiziert werden. Die Anzahl der Kopien von Beginn bis zum Ende des Prozesses ist somit bekannt. Das amplifizierte Quanticon 21 der ersten Reaktion (Präamplifikation 100) fällt bei der zweiten Reaktion (Nachweisreaktion 102) außer Betracht, da die entsprechenden Positionen 143, 144 zu den Primer- Bindungsstellen 43, 44 auf der Ziel-DNA-Sequenz 21 der Präamplifikation orthogonal, also abweichend gewählt wurden. Für die Nachweisreaktion 102 kann in dessen Mastermix zusätzlich ein weiteres Articon beigemischt werden. Hierbei wird anstelle des Articons aus der ersten
Voramplifikation ein neues Articon für die zweite Nachweisreaktion zugegeben.
Dies ist sinnvoll, da die erste Reaktionsmischung in der Regel verdünnt wird und somit das Articon (nicht aber die vermehrte eigentliche Probe) nachgewiesen wird. Daher wird nach dem Verdünnen nochmals eine definierte Menge Articon für eine genauere Bestimmung beigegeben. Dieses weitere Articon kann beispielsweise in einem für die Nachweisreaktion benötigten (zweiten) Lyobead vorgelagert werden. Dies ist insbesondere von Vorteil, um das Verhältnis von Wild- und Mutationstyp bei einem Punktmutationsnachweis zu bestimmen. Es wird auch ein weiteres Quanticon eingesetzt, das die gleichen Primer-Bindungssequenzen aufweist. Das Amplifikat der ersten Reaktion 100 muss dann so verdünnt werden, dass diese der Konzentration des vorgelegten, zweiten Quanticons entspricht.
In Fig. 4 sind Ausführungsformen für ein mögliches Design der Articons
(Referenz-DNA) 52, 62 für einen Punktmutationsnachweis gezeigt. Diese
Articons 52, 62 sind für die Anwendung einer verschachtelten PCR im Rahmen eines Punktmutationsassays vorgesehen. Generell werden bei
Punktmutationsnachweisen zwei allgemeine PCR-Nachweisstrategien
eingesetzt. Hierbei werden entweder mutationssensitive Primer (a) oder
mutationssensitive Sonden oder Blocker (b) gewählt. Im Verfahren (a) wird der Primer so entworfen, dass dieser nur binden kann, wenn die Mutation vorhanden ist. Beispiele hierfür sind sogenannte ARMS ( Amplification Refractory Mutation System)- Systeme. In dem Verfahren (b) wird eine mutationssensitive Sonde oder Blocker verwendet, die bzw. der nur bindet, wenn die Mutation vorhanden ist (z.B. PNA-CLAMP-Systeme - Peptide nucleic acid (PNA)-mediated PCR
clamping; H. 0rum et al., Nucleic Acids Res. 21:5332-5336, 1993). Da jedoch diese Bindungen nicht zu 100% effizient sind, wird ein Referenzsignal zum
Wildtyp mit gemessen. Daher ist es für die Implementierung des
erfindungsgemäßen Konzeptes für einen solchen Nachweis sinnvoll, ein zweites Quanticon einzubinden. Für die Implementierung wird für das Articon 52, 62 die Mutation 301 in die orthogonalen Sequenzen eingebaut. Die Bindungsstelle der Mutation sollte somit eingeschlossen werden. In der Version 62 mit einem
mutationssensitiven Primer umfasst das Articon 62 daher folgende Abschnitte: Bindungsstelle 23 für den ersten Forward- Primer, Bindungsstelle 28 für die Sonde B, Bindungsstelle 63 für einen mutationsspezifischen Primer, der den Forward- Primer des zweiten Primerpaares für die Nachweisreaktion 102 darstellt, eine orthogonale Sequenz 26, eine Bindestelle 44 für den Re verse- Primer der Nachweisreaktion 102 und eine Bindungsstelle 24 für den Re verse- Primer der Präamplifikation. Für ein Nachweissystem mit einem mutationssensitiven Blocker oder einer mutationssensitiven Sonde wird das Articon 52 so entworfen, dass die Bindungsstelle für diese Sonde oder den Blocker die Mutationsstelle 301 an exakt derselben Stelle wie im Mutationstyp umfasst. Im Übrigen entspricht das Articon 52 dem Articon 62 bzw. dem Articon 22. Mit einem solchen Konstrukt kann nun in der Reaktion ein Signal für eine Reaktion mit 100% Wildtyp (zweites Quanticon) und ein Signal für 100% Mutation (Articon 52 oder 62) gemessen werden und mit der Probe abgeglichen werden. Dies ist alles innerhalb eines Reaktionsansatzes möglich, wodurch eine extreme Vereinfachung einer
Vollautomatisierung beispielsweise in einer Point-of-Care- Anwendung möglich ist. Besonders vorteilhaft ist es hierbei, wenn die entsprechenden Mastermixe als Lyophilisate vorgelegt werden.
In Fig. 5 ist eine Multiplexausführung einer verschachtelten PCR gezeigt, wobei zwei Nachweisreaktionen in einem Ansatz durchgeführt werden können. Bei dieser Ausführung wird von einem Lysat aus wenigen Zellen, beispielsweise 10 bis 1000 Zellen, ausgegangen. In diesem Lysat können sich beispielsweise Zellen aus einer Anreicherung befinden, beispielsweise aus einer Anreicherung von zirkulierenden Tumorzellen oder aus einer Anreicherung von Immunzellen, beispielsweise spezifischen T-Zellen, aus einer Körperflüssigkeit, wie Blut, Urin, Spinalfluid oder Anderem. Diese Zellen werden in einem kleinen Volumen lysiert und stellen die Probe für die Durchführung des Verfahrens bereit. In diesem Zelllysat sollen zwei Genabschnitte 70, 80 nachgewiesen werden, also beispielsweise ein Exon A (Genabschnitt 70) und ein Exon B (Genabschnitt 80). Zunächst werden die Genabschnitte 70, 80 amplifiziert (Präamplifikation), so dass in dem nachgeschalteten Schritt in ein oder mehreren Nachweisreaktionen Anomalien auf diesen Genabschnitten wie Mutationen oder funktionstypische Gensequenzen, beispielsweise die genetische Codierung eines Antigen- Epitops, nachgewiesen werden können. In dem ersten Schritt der Präamplifikation werden aus dem genetischen Material der lysierten Zellen zuerst die zwei Zielexone, also die Genabschnite 70 und 80, amplifiziert. Zusätzlich wird eine Probenkontrolle gefahren. Für die Probenkontrolle wird ein Kontroll-Exon C als Genabschnit 90 amplifiziert. Hierbei kann es sich beispielsweise um ein Exon des gesuchten Gens handeln, auf welchem die Anomalie nicht vorliegt. Wird dieses amplifiziert, gilt die Reaktion als erfolgreich und als Nachweis, dass das Probenmaterial, also genetisches Material, in der Probe vorhanden war. Zum Nachweis und zur Quantifizierung der Amplifikation des Kontroll-Exons 90 werden in
entsprechender Weise wie bereits beschrieben eine Ziel-DNA (Quanticon) 21 und eine Referenz-DNA (Articon) 22 eingesetzt, die gemäß den oben
beschriebenen Prinzipien von ihrer Struktur und ihren Komponenten her an das Kontroll-Exon 90 angepasst sind. Besitzen die Amplikone 70, 80 und 90 alle in etwa die gleiche Länge und den gleichen GC-Gehalt, dann sollten in dem
Reaktionsansatz in einer Triplex-Reaktion etwa gleich viele Kopien für jedes Template entstehen. Sofern Abweichungen bei der Länge und bei dem GC- Gehalt vorhanden sind, stellen sich konservierte Verhältnisse der amplifizierten Amplikone ein, wobei die Verhältnisse zusätzlich durch die DNA- Struktur und epigenetische Modifikationen beeinflusst werden können. Das heißt, auch wenn die Reaktion bei der Amplifikation eines der Exons möglicherweise weniger effizient ist, sind die Verhältnisse der entstandenen Amplikon- Kopien dennoch konstant. Dies erlaubt, nur ein Amplikon, nämlich das Kontroll-Exon C, im
Hinblick auf eine Quantifizierung zu messen, woraus die Amplikonanzahl für alle Exons bestimmt werden kann. Es ist also kein aufwendiges Dreisondendesign erforderlich, sondern im Allgemeinen ist es ausreichend, nur ein
Zweisondensystem für die Quantifizierung des Kontroll-Exons C (Genabschnit 90) einzusetzen. Somit wird zunächst die Präamplifikation durch das Kontroll- Exon 90 quantifiziert, so dass die Amplifikate für die nachfolgende
Nachweisreaktion wie oben beschrieben abgeschätzt und für optimale
Reaktionsbedingungen in der Nachweisreaktion gegebenenfalls in-situ verteilt und verdünnt werden können. Nach dem Verteilen und Verdünnen wird ein neuer Mastermix zugesetzt, der für den spezifischen Assay der Nachweisreaktion vorgesehen ist und der gemäß den Ausführungen zu Fig. 2 ebenfalls quantifiziert werden kann.
Das Design für die einzelnen Amplikone sieht bevorzugt folgendermaßen aus: Exon A (Genabschnit 70) besitzt an der Peripherie des Amplikons die Bindungsstellen 71, 72 für die Primer der Präamplifikation. Exon B (Genabschnitt 80) und das Kontroll-Exon C (Genabschnitt 90) besitzen entsprechende Primer- Bindungsstellen 81, 82 bzw. 91, 92, aber mit anderen Sequenzen. Bei den in der nachfolgenden Nachweisreaktion zu untersuchenden Exons A und B folgt jeweils die Bindungsstelle für die Primer der zweiten Reaktion (Nachweisreaktion) 73, 74 bzw. 83, 84 auf den Genabschnitten 70 bzw. 80. Ist eine Sonde für die
Nachweisreaktion vorgesehen, ist deren Bindungsstelle in dieser Sequenz inkludiert. Das Kontroll-Exon C (Genabschnitt 90) weist nach der Primer- Bindungsstelle 91 die Bindungsstelle 97 für eine Fluoreszenzsonde A auf.
Entsprechend wie anhand von Fig. 2 erläutert, werden zur Quantifizierung des Kontroll- Exons C (Genabschnitt 90) ein Quanticon bzw. eine Ziel-DNA 21 und ein Articon bzw. eine Referenz-DNA 22 ergänzt, die mit den gleichen Primer- Bindungsstellen 91, 92 wie das Kontroll-Exon C (Genabschnitt 90) versehen sind. Die Ziel-DNA 21 weist darüber hinaus die gleiche Bindungsstelle 97 für die Sonde A auf. Die Referenz-DNA 22 weist ebenfalls eine Sonden-Bindungsstelle 98 auf, aber mit anderer Sequenz zur Bindung einer Fluoreszenzsonde B. Aus den mit diesem Reaktionsansatz zu generierenden Signalen wird auf die entstandenen Kopien Nc sowie auf die Ausgangsmenge No zurückgeschlossen. Aus den konservierten Verhältnissen werden die Mengen der Exone A und B (Genabschnitte 70 und 80) berechnet. Die Verhältnisse können dabei im
Rahmen der Assayentwicklung herausgefahren werden. Die Verhältnisse sind spezifisch für den jeweiligen Assay. Die Verhältnisse sind intrinsisch konstant, müssen aber für jede Anwendung gemessen, d.h. parametrisiert werden. Gemäß dem anhand der Fig. 2 erläuterten Verfahren können die Mastermixe der nachfolgenden zwei separaten und parallel prozessierbaren spezifischen Nachweise für das Exon A und für das Exon B jeweils ein Quanticon und ein Articon aufweisen, welche die gleichen Primer-Bindungsstellen wie das jeweilige Ziel- Exon A bzw. B aufweisen. Zum Nachweis von Punktmutationen kann wie anhand von Fig. 4 erläutert, das Quanticon die Wildtypsequenz und das Articon die Mutantensequenz aufweisen. In dem mittleren Teil der Darstellung in Fig. 5 ist der gesamte Reaktionsablauf schematisch dargestellt. Zunächst erfolgt die Präamplifikation 200, wobei Exon A, Exon B, Kontroll-Exon C und das Quanticon und das Articon als Templates in dem Ansatz vorhanden sind. Nach der
Durchführung der Amplifikationsreaktionen wird das Quantifizierungsergebnis 210 erhalten (No Kontroll-Exon C, Nc Kontroll-Exon C, daraus errechenbar Nc, No Exon A; Nc, No Exon B). Um optimale Startbedingungen für die nachfolgende Nachweisreaktion für das Exon A und das Exon B zu erreichen, werden im Schritt 220 durch Verteilen und gegebenenfalls Verdünnen der Ansätze die optimalen Konzentrationen von Exon A (Ns, 2 Exon A) und Exon B (Ns, 2 Exon B) eingestellt. Anschließend wird durch Zugabe der Mastermixe für die jeweiligen Nachweisreaktionen im Schritt 230 beispielsweise der jeweils spezifische Mutationsnachweis durchführt, wobei hierfür neben dem Exon A bzw. dem Exon B jeweils ein entsprechend entworfenes Quanticon A und Articon A bzw.
Quanticon B und Articon B zugesetzt werden, wie im unteren Teil der Fig. 5 illustriert ist.
Fig. 6 illustriert die Implementierung des beschriebenen PCR-Konzeptes in einem mikrofluidischen qPCR-Array 500. Der Array 500 ist beispielsweise in einen Chip aus strukturiertem Silizium integriert, wobei sich der Array 500 in einer mikrofluidischen Kammer befindet, die mit einem Zufluss 501 und einem Abfluss 502 versehen ist. In einer möglichen Ausführung können einzelne Reaktionsgefäße des Arrays 500 global angesteuert bzw. mit Flüssigkeiten versetzt werden. Beispielsweise kann eine voramplifizierte Probe über das Array 500 gespült werden, so dass sich die einzelnen Reaktionsgefäße des Arrays 500 befüllen. Durch eine Versiegelung kann die Kommunikation via Diffusion zwischen den einzelnen Reaktionsgefäßen in einem zweiten fluidischen Schritt verhindert werden. Ist nun jedes Reaktionsgefäß des Arrays 500 beispielsweise mit einem lyophilisierten Mastermix und/oder mit den Primern und den
Sondensequenzen vorgespottet, ist durch das Verfahren mit einem n x m Array ein maximaler n x m Multiplexing-Grad einschließlich einer Quantifizierung und Qualitätskontrolle möglich. Die Reaktionsansätze gemäß dem
erfindungsgemäßen Konzept können vorzugsweise auf der Basis von TaqMan®- Systemen entwickelt werden. Die Synthese der einzelnen Template-DNAs, insbesondere der Quanticons und der Articons, kann mit üblicher
Nukleinsäuresynthese erfolgen. Vorzugsweise können die Mastermixe einschließlich der Template-DNAs als Lyophilisate vorgelagert werden. Für eine Automatisierung der Prozesse sind insbesondere mikrooptofluidische Systeme geeignet.

Claims

Ansprüche
1. Reaktionsgemisch zur Bereitstellung eines Reaktionsansatzes für die
Durchführung einer quantitativen Echtzeit-PCR zur Quantifizierung
wenigstens eines DNA-Abschnitts (20; 30; 90), dadurch gekennzeichnet, dass das Reaktionsgemisch
wenigstens eine Ziel-DNA (11; 21), die zumindest in Teilen dem zu quantifizierenden DNA-Abschnitt (20; 30; 90) entspricht, und wenigstens eine Referenz-DNA (12; 22) mit definierter Sequenz und in definierter Menge und
wenigstens zwei verschiedene Fluoreszenzsonden mit unterschiedlicher Sequenz, die bei unterschiedlichen Wellenlängen ein Signal generieren, und
Primer und Desoxy- Nukleotide und DNA-Polymerase enthält, und wobei die Ziel-DNA (11; 21) und die Referenz-DNA (12; 22) die gleichen Primer-Bindungsstellen (13, 14; 23, 24) und unterschiedliche Sonden-Bindungsstellen (17, 18; 27, 28) aufweisen und wobei wenigstens eine der Fluoreszenzsonden zur Bindung mit einem Abschnitt (17; 27) der Ziel-DNA außerhalb der Primer-Bindungsstellen (13, 14; 23, 24) und wenigstens eine der Fluoreszenzsonden zur Bindung mit einem Abschnitt (18; 28) der Referenz-DNA außerhalb der Primer-Bindungsstellen (13, 14; 23, 24) vorgesehen sind.
2. Reaktionsgemisch nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der GC- Gehalt der Ziel-DNA (11; 21) und der GC-Gehalt der Referenz-DNA (12; 22) mit einer Abweichung von bis zu 15% identisch sind.
3. Reaktionsgemisch nach Anspruch 1 oder Anspruch 23, dadurch
gekennzeichnet, dass die Basenpaarlänge der Ziel-DNA (11; 21) und der Referenz-DNA (12; 22) mit einer Abweichung von bis zu 15% identisch sind.
4. Reaktionsgemisch nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Ziel-DNA (11; 21) und/oder die Referenz-DNA (12; 22) und/oder die Primer und/oder die Desoxy- Nukleotide und/oder die DNA- Polymerase in lyophilisierter Form bereitgestellt werden.
5. Reaktionsgemisch nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Menge der Referenz-DNA (12; 22) in einer Konzentration vorliegt, die einer Nachweisgrenze für den zu quantifizierenden DNA-Abschnitt (20; 30; 90) entspricht.
6. Reaktionsgemisch nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren zum Nachweis und gegebenenfalls zur Quantifizierung eines DNA-Abschnittes (20) aus einem Genom vorgesehen ist, wobei in dem Reaktionsansatz die Ziel-DNA (11) und die Referenz-DNA (12) in einem Verhältnis von 1:1 in definierten Mengen enthalten sind.
7. Verfahren zur Durchführung einer quantitativen Echtzeit-PCR, dadurch
gekennzeichnet, dass ein PCR-Prozess unter Verwendung wenigstens ein Reaktionsgemisch gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 durchgeführt wird und wobei eine Probe mit dem zu quantifizierenden DNA-Abschnitt (20) zugegeben wird und wobei die Fluoreszenzsignale der wenigstens zwei Fluoreszenzsonden erfasst werden.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass ein Testergebnis aus dem Verhältnis der Signale der Fluoreszenzsonden ermittelt wird.
9. Verfahren nach Anspruch 7 oder Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren in einem PCR-Array (500) mit einer Mehrzahl von
Arraygefäßen durchgeführt wird.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren für einen verschachtelten PCR-Prozess mit einer
Präamplifikation (100) und wenigstens einer nachgeschalteten
Nachweisreaktion (102) verwendet wird, wobei die PCR-Produktmenge der Präamplifikation (100) durch die Quantifizierung abgeschätzt wird.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass ein erstes
Primerpaar für die Präamplifikation (100) und wenigstens ein zweites
Primerpaar für die Nachweisreaktion (102) verwendet werden, wobei die Ziel- DNA (21) und die Referenz-DNA (22) jeweils komplementäre
Sequenzabschnitte (23, 24, 43, 44) zu den Primersequenzen aufweisen und wobei die komplementären Sequenzabschnitte (43, 44) zu dem zweiten Primerpaar innerhalb des Abschnitts zwischen den komplementären
Sequenzabschnitten (23, 24) zu dem ersten Primerpaar liegen.
12. Verfahren nach Anspruch 10 oder Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass der verschachtelte PCR- Prozess für einen Punktmutationsnachweis eingesetzt wird, wobei für die Nachweisreaktion ein mutationssensitiver Primer und/oder eine mutationssensitive Fluoreszenzsonde verwendet werden.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass der verschachtelte PCR-Prozess ein Multiplex-Prozess zum Nachweis von wenigstens zwei bestimmten Genabschnitten (70, 80) in einem Genom ist, wobei für eine Quantifizierung der Präamplifikation eine Kontrollreaktion durchgeführt wird, bei der ein Kontroll-Exon (90) aus dem Genom amplifiziert wird, und wobei die Ziel-DNA (21) und die Referenz-DNA (22) in Anpassung an das Kontroll-Exon (90) entworfen sind, wobei aus der Quantifizierung der Amplifikation des Kontroll-Exons (90) auf die Mengen bei der Amplifikation der nachzuweisenden Genabschnitte (70, 80) während der Präamplifikation rückgeschlossen wird.
14. Kit zur Durchführung einer quantitativen Echtzeit-PCR zur Quantifizierung wenigstens eines DNA-Abschnittes, dadurch gekennzeichnet, dass der Kit wenigstens eine Ziel-DNA (11; 21), die zumindest in Teilen dem zu quantifizierenden DNA-Abschnitt entspricht, und wenigstens eine Referenz-DNA (12; 22) mit definierter Sequenz und in definierter Menge und
wenigstens zwei verschiedene Fluoreszenzsonden mit unterschiedlicher Sequenz, die bei unterschiedlichen Wellenlängen ein Signal generieren, und
gegebenenfalls Primer und/oder Desoxy- Nukleotide und/oder DNA-Polymerase und/oder Pufferkomponenten
enthält, und wobei die Ziel-DNA (11; 21) und die Referenz-DNA (12; 22) die gleichen Primer-Bindungsstellen (13, 14; 23, 24) und unterschiedliche Sonden-Bindungsstellen (17, 18; 27, 28) aufweisen und wobei wenigstens eine der Fluoreszenzsonden zur Bindung mit einem Abschnitt der Ziel-DNA außerhalb der Primer-Bindungsstellen (13, 14; 23, 24) und wenigstens eine der Fluoreszenzsonden zur Bindung mit einem Abschnitt der Referenz-DNA außerhalb der Primer-Bindungsstellen (13, 14; 23, 24) vorgesehen sind.
15. Kit nach Anspruch 14, weiter umfassend wenigstens eines der Merkmale gemäß einem der Ansprüche 2 bis 6.
EP19734358.5A 2018-08-03 2019-06-26 Reaktionsgemisch, verfahren und kit zur durchführung einer quantitativen echtzeit-pcr Pending EP3830294A1 (de)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE102018213027.2A DE102018213027A1 (de) 2018-08-03 2018-08-03 Reaktionsgemisch, Verfahren und Kit zur Durchführung einer quantitativen Echtzeit-PCR
PCT/EP2019/066957 WO2020025222A1 (de) 2018-08-03 2019-06-26 Reaktionsgemisch, verfahren und kit zur durchführung einer quantitativen echtzeit-pcr

Publications (1)

Publication Number Publication Date
EP3830294A1 true EP3830294A1 (de) 2021-06-09

Family

ID=67107434

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EP19734358.5A Pending EP3830294A1 (de) 2018-08-03 2019-06-26 Reaktionsgemisch, verfahren und kit zur durchführung einer quantitativen echtzeit-pcr

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20210310047A1 (de)
EP (1) EP3830294A1 (de)
CN (1) CN112513291A (de)
DE (1) DE102018213027A1 (de)
WO (1) WO2020025222A1 (de)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11965217B2 (en) * 2020-07-21 2024-04-23 Delta Electronics, Inc. Method and kit for detecting Mycobacterium tuberculosis
CN114457187B (zh) * 2022-03-10 2023-06-20 浙江农林大学 梅花实时荧光定量pcr分析中内参基因的筛选方法和应用

Family Cites Families (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5219727A (en) * 1989-08-21 1993-06-15 Hoffmann-Laroche Inc. Quantitation of nucleic acids using the polymerase chain reaction
EP0533854A4 (en) * 1990-12-20 1994-06-08 Hoffmann La Roche Pcr primers for detection of legionella species and methods for controlling visual intensity in hybridization assays
US5422242A (en) * 1991-08-15 1995-06-06 Hoffmann-La Roche Inc. Mycobacterium primers and probes
CA2159044A1 (en) * 1994-09-26 1996-03-27 Falko-Guenter Falkner Method of quantitating nucleic acids
US6312929B1 (en) * 2000-12-22 2001-11-06 Cepheid Compositions and methods enabling a totally internally controlled amplification reaction
CN100523216C (zh) * 2001-03-02 2009-08-05 匹兹堡大学 Pcr方法
EP1493822A1 (de) * 2003-07-02 2005-01-05 Labor Becker, Olgemoeller & Kollegen GbR Detektionsverfahren für Nucleinsäuren mit interner Amplifikationskontrolle
US7981606B2 (en) * 2005-12-21 2011-07-19 Roche Molecular Systems, Inc. Control for nucleic acid testing
US20110039303A1 (en) * 2007-02-05 2011-02-17 Stevan Bogdan Jovanovich Microfluidic and nanofluidic devices, systems, and applications
WO2008118998A2 (en) * 2007-03-27 2008-10-02 Primera Biosystems Inc. Method for multiplex detection and quantitation of nucleic acids
US20110003309A1 (en) * 2008-03-20 2011-01-06 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Non-Competitive Internal Controls for Use in Nucleic Acid Tests
EP2633073B1 (de) * 2010-10-29 2017-04-26 Asuragen, Inc. Mpcr verfahren zur analyse von wiederholungssequenzen
CA2837486C (en) * 2011-05-27 2020-10-27 Genapsys, Inc. Systems and methods for nucleic acid sequencing
CA2849023C (en) * 2011-09-15 2022-07-19 David A. Shafer Probe:antiprobe compositions for high specificity dna or rna detection
SG10201507700VA (en) * 2012-05-08 2015-10-29 Adaptive Biotechnologies Corp Compositions and method for measuring and calibrating amplification bias in multiplexed pcr reactions
AU2013266341B2 (en) * 2012-05-22 2019-01-03 The Johns Hopkins University A quantitative multiplex methylation specific PCR method- cMethDNA, reagents, and its use
US10150996B2 (en) * 2012-10-19 2018-12-11 Adaptive Biotechnologies Corp. Quantification of adaptive immune cell genomes in a complex mixture of cells
WO2014127484A1 (en) * 2013-02-21 2014-08-28 British Columbia Cancer Agency Branch Spike-in control nucleic acids for sample tracking
EP2971154A4 (de) * 2013-03-14 2017-03-01 Ibis Biosciences, Inc. Nukleinsäurekontrollpanels
US9528161B2 (en) * 2014-02-12 2016-12-27 The University Of Toledo Materials and methods for quality-controlled two-color RT-QPCR diagnostic testing of formalin fixed embedded and/or fresh-frozen samples
JP6778374B2 (ja) * 2014-10-17 2020-11-04 国立大学法人 東京医科歯科大学 新規な陽性コントロール核酸を利用した、被検試料中の標的核酸の検出・定量法
EP3234198B1 (de) * 2014-12-18 2024-04-03 Life Technologies Corporation Kalibrierpanel und verfahren zum entwurf davon
US20170283888A1 (en) * 2015-12-21 2017-10-05 Roche Molecular Systems, Inc. Use of rnase h for the selective amplification of viral dna
US9976181B2 (en) * 2016-03-25 2018-05-22 Karius, Inc. Synthetic nucleic acid spike-ins
US10930370B2 (en) * 2017-03-03 2021-02-23 Microsoft Technology Licensing, Llc Polynucleotide sequencer tuned to artificial polynucleotides
CA3071855C (en) * 2017-08-04 2021-09-14 Billiontoone, Inc. Target-associated molecules for characterization associated with biological targets
CN111527044A (zh) * 2017-10-26 2020-08-11 阿尔缇玛基因组学公司 用于序列判定的方法和系统
DK3735470T3 (da) * 2018-01-05 2024-02-26 Billiontoone Inc Kvalitetskontroltemplates til sikring af validiteten af sekventeringsbaserede analyser

Also Published As

Publication number Publication date
CN112513291A (zh) 2021-03-16
DE102018213027A1 (de) 2020-02-06
US20210310047A1 (en) 2021-10-07
WO2020025222A1 (de) 2020-02-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE60023056T2 (de) Verfahren zur Quantifizierung eines Analyten
DE69824004T2 (de) Verfahren zur quantitativen bestimmung der genexpression mit hilfe der multiplexen competitiven reversen-transkriptase polymerase kettenreaktion
DE60129869T2 (de) Methode zur Quantifizierung von Nukleinsäuren in Echtzeit mittels Effizienzkorrektur
DE60213730T2 (de) Echtzeit-Quantifizierung mit internen Standards
DE60035459T2 (de) Automatisierte Echtzeit-Analyse von Nukleinsäureamplifikation
DE69736637T2 (de) Multiplex amplifikation kurzer tandem repeat loci
DE10045521A1 (de) Nukleinsäureamplifikationen
DE10150121A1 (de) Echtzeitdetektion von DNA-Amplifikationsprodukten
Foster et al. Development of a fast PCR protocol enabling rapid generation of AmpFℓSTR® Identifiler® profiles for genotyping of human DNA
EP3830292A1 (de) Verfahren zur durchführung einer echtzeit-pcr
EP3830294A1 (de) Reaktionsgemisch, verfahren und kit zur durchführung einer quantitativen echtzeit-pcr
DE69114325T2 (de) Quantitative DNS-Polymerasebestimmung und Testkit dafür.
Bizouarn Clinical applications using digital PCR
DE102021005845B4 (de) Verfahren und System zur Durchführung einer kumulativen Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion
WO2015144345A1 (de) Mikrofluidische vorrichtung und verfahren zum analysieren einer probe biologischen materials
DE102006028101B4 (de) Verfahren zur Analyse von amplifizierten Nukleinsäuren
DE102007013099A1 (de) Verfahren und Testkit zum schnellen Nachweis spezifischer Nukleinsäuresequenzen, insbesondere zum Nachweis von Mutationen oder SNP's
Beaufils et al. Analysis of T-cell receptor-γ gene rearrangements using heteroduplex analysis by high-resolution microcapillary electrophoresis
DE102014205728B3 (de) Chiplabor-Kartusche für ein mikrofluidisches System zum Analysieren einer Probe biologischen Materials, mikrofluidisches System zum Analysieren einer Probe biologischen Materials sowie Verfahren und Vorrichtung zum Analysieren einer Probe biologischen Materials
WO1997021832A1 (de) Verfahren zur bestimmung von nukleinsäuremolekülen in niedriger konzentration
DE102005051816A1 (de) Verfahren zur relativen Bestimmung der Kopienzahl einer vorbestimmten Sequenz in einer biologischen Probe
DE102005029810B4 (de) Verfahren zum Nachweis von Nukleotidsequenzen, Verwendung des Verfahrens und Testbesteck
DE60311263T2 (de) Verfahren zur bestimmung der kopienzahl einer nukleotidsequenz
WO2024083474A1 (de) Kombinierte zellspezifische markierung und anreicherung von biomarkern
DE112018008028B4 (de) Verfahren zur mehrfachanalyse von amplikon unter verwendung der fluoreszenzbasierten mehrfachschmelzanalyse

Legal Events

Date Code Title Description
STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: UNKNOWN

STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: THE INTERNATIONAL PUBLICATION HAS BEEN MADE

STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: THE INTERNATIONAL PUBLICATION HAS BEEN MADE

PUAI Public reference made under article 153(3) epc to a published international application that has entered the european phase

Free format text: ORIGINAL CODE: 0009012

STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: REQUEST FOR EXAMINATION WAS MADE

17P Request for examination filed

Effective date: 20210303

AK Designated contracting states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AL AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LI LT LU LV MC MK MT NL NO PL PT RO RS SE SI SK SM TR

DAV Request for validation of the european patent (deleted)
DAX Request for extension of the european patent (deleted)
STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: EXAMINATION IS IN PROGRESS

17Q First examination report despatched

Effective date: 20230208