In
der molekularen Diagnostik gewinnen Verfahren zum Quantifizieren
von Sequenzen, insbesondere zur quantitativen Bestimmung der Kopienzahl
von Nukleinsäuresequenzen
pro Zelle, eine immer bedeutendere Rolle. Da eine Vielzahl von zum
Teil schweren Erkrankungen durch Abweichungen von der normalen Kopienzahl
von Nukleinsäuresequenzen
im Genom verursacht werden, lassen sich durch eine Bestimmung der
Kopienzahl bestimmter Chromosomen oder bestimmter Genabschnitte
entsprechende Krankheiten schon im Frühstadium der Entwicklung zuverlässig diagnostizieren.
Beispiele
für zum
Teil schwere Anomalien, welche auf eine erhöhte Kopienzahl ganzer Chromosomen zurückzuführen sind,
sind die Trisomie 18 (Edward's
Syndrom), Trisomie 13 (Pätau-Syndrom)
sowie Trisomie 21 (Down-Syndrom). Bei jeder dieser Krankheiten beträgt die Kopienzahl
des entsprechenden Chromosoms 18, 13 bzw. 21 pro Zelle drei, wohingegen
gesunde Individuen lediglich zwei Kopien der vorgenannten Chromosomen
pro Zelle aufweisen. In allen drei Fällen führt die Erhöhung der Kopienzahl des betreffenden
Chromosoms zu schwersten Entwicklungsstörungen. Während Träger der Trisomie 21 in ihrer
Entwicklung drastisch gehemmt sind und teilweise schwere Fehlbildungen
aufweisen, versterben die Träger
der Trisomie 18 und Trisomie 13 meistens innerhalb des ersten Lebensjahres.
Neben
Krankheiten, welche auf eine erhöhte
Kopienzahl ganzer Chromosomen zurückzuführen sind, ist auch eine Vielzahl
von Erkrankungen bekannt, welche auf einer veränderte Kopienzahl von Genen
oder Genabschnitten beruhen.
Ursache
für die
Huntington-Krankheit, einer progressiv verlaufenden neurodegenerativen
Erkrankung gekennzeichnet durch abnormale, unwillkürliche Bewegungen
bei zunehmendem Verfall der geistigen und körperlichen Fähigkeiten,
soll die Hintereinanderschaltung von mehr als 37 Kopien eines bestimmten
Motivs (CAG) sein, wobei die Prädisposition
zur Krankheitsausbildung mit der Anzahl der Wiederholungen dieses
Motivs im Genom zunimmt. Weitere Beispiele für instabile Trinukleotidsequenzen
beim Menschen sind das Kennedy-Syndrom und die spinocerebrale Ataxie-1.
Zudem
ist bekannt, dass sich bestimmte Protoonkogene durch Genamplifikation
im Genom vervielfältigen
können.
Derartige Amplifikationen sind in dem Chromosomensatz oftmals als
so genannte "double
minutes" (D.M.)
oder als "homogeneously
staining regions" (HSR)
zu erkennen. Aufgrund der enormen Erhöhung der Gen-Kopienzahl kann
das zugehörige
Protein in den Zellen in sehr großen Mengen produziert werden,
was eine verstärkte
Aktivierung der Zellproliferation – ohne Veränderung des Einzelgens an sich – ermöglicht.
Insbesondere das myc-Protoonkogen soll von der Amplifikation besonders
oft betroffen sein.
Aufgrund
des Bedarfs an Verfahren zur Quantifizierung von Sequenzkopien in
einer biologischen Probe wurde in der Vergangenheit eine Vielzahl
entsprechender Verfahren vorgeschlagen.
Eines
der grundlegenden Quantifizierungsverfahren, welches zumindest eine
Aussage über
die An- oder Abwesenheit von Nukleinsäuresequenzen und abhängig von
der Verfahrensführung
auch einen bedingten Rückschluss
auf die Kopienzahl der betreffenden Nukleinsäuresequenzen pro Zelle erlaubt,
ist das so genannte FISH-Verfahren (fluorescence in situ hybridization).
Bei diesem Verfahren wird die zu untersuchende biologische Probe
nach entsprechender Vorbehandlung, d.h. Denaturierung mit Formamid
sowie Vorhybridisierung, mit einer oder mehreren verschiedenen Sonden,
welche zuvor mit jeweils unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen
markiert wurden, unter Bedingungen inkubiert, welche eine Hybridisierung
der Sonden mit dazu homologen Sequenzen in der biologischen Probe
ermöglichen.
Nach der Hybridisierung werden die Proben gewaschen, wobei unspezifische
Hybridisierungssignale eliminiert werden. Abschließend werden
die Fluoreszenzsignale des Präparats
mit einem Fluoreszenzmikroskop ausgewertet. Jedes vorhandene Fluoreszenzsignal
weist auf die Anwesenheit der der mit dem entsprechenden Fluoreszenzmarker
versehenen Sonde entsprechenden Sequenz hin. Die Intensität der Fluoreszenz
kann einen bedingten Rückschluss
auf die Anzahl der Sequenzkopien in der biologischen Probe zulassen.
Wird hingegen bei der Wellenlänge
einer der eingesetzten fluoreszenzmarkierten Sonden kein Signal oder
nur ein unterhalb eines definierten Schwellenwerts liegendes Signal
erhalten, kann auf die Abwesenheit der zu der entsprechenden Sonde
korrespondierenden Sequenz in der biologischen Probe geschlossen
werden. Allerdings kann die Abwesenheit eines entsprechenden Fluoreszenzsignals
auch darin begründet
liegen, dass in der entsprechenden Bindungsstelle der nachzuweisenden
Sequenz eine Mutation und/oder Mikrodeletion stattgefunden hat,
weswegen die Sonde unter den gewählten
Hybridisierungsbedingungen nicht mehr an die vorbestimmte Sequenz
bindet. Ein weiterer Nachteil des vorgenannten Verfahrens liegt
darin, dass eine unerwünschte
und zu falschen Ergebnissen führende Kreuzhybridisierung
niemals vollständig
ausgeschlossen werden kann. Zudem ist dieses Verfahren vergleichsweise
teuer, zum einen weil zwingend Fluoreszenzfarbstoffe eingesetzt
werden müssen,
und zum anderen, weil es aufwändige
Apparaturen, wie Fluoreszenzmikroskope, benötigt. Schließlich hängt die
Aussagekraft dieses Verfahrens in ganz erheblichem Maße von der
Qualität
der eingesetzten Sonden ab; zuverlässige Ergebnisse werden nur
erhalten, wenn die Sonden mit einer Effektivität von mehr als 90% an die dazu
korrespondierenden Bindungsstellen hybridisieren, so dass nur noch
10% der Zielsequenzen unhybridisiert vorliegen und demzufolge nicht
mehr amplifiziert werden. Daraus folgt, dass eine falsche Wahl der
Sonden, aber auch inadäquate
Hybridisierungsbedingungen zu einem falschen Ergebnis führen. Ein
weiterer Nachteil dieses Verfahrens liegt darin, dass eine Mindestmenge
an biologischer Probe eingesetzt werden muss, um überhaupt
ein auswertbares Fluoreszenzsignal zu erhalten. Zudem darf die Sequenz
eine minimale Länge
nicht unterschreiten. Weiterhin ist es für ein valides Ergebnis notwendig,
eine Vielzahl von Zellen zu analysieren, die einer Hybridisierung
zugänglich
waren. Aus diesem Grund ist die FISH-Analyse für die Einzelzelldiagnostik
nicht adäquat.
Darüber
hinaus ist eine automatisierte Auswertung durch den Pathologen kaum
möglich.
Ein
anderes fluoreszenzbasierendes Verfahren ist die CGH-Analyse (comparative
genomic hybridization). Bei diesem Verfahren wird die Nukleinsäure der
zu analysierenden Probe komplett mit einem Farbstoff 1 markiert.
Die gleiche Menge an Nukleinsäuren
einer Referenzprobe wird mit einem Farbstoff 2 markiert. Beide Reaktionsansätze werden
gemeinsam auf einem gespreiteten Metaphasechromosomensatz hybridisiert, wobei
die in beiden Reaktionsansätzen
enthaltenen Sequenzen um die Bindungsstellen an den gespreiteten Chromosomen
kompetieren. Im Wesentlichen wird sich an allen Hybridisierungsstellen
ein Verhältnis
von Farbstoff 1 zu Farbstoff 2 von 1:1 einstellen. Enthält die zu
analysierende Probe amplifizierte Bereiche (mehr als die gewöhnliche
Kopienzahl der Referenz), so wird der Farbstoff 1 an dieser Hybridisierungsstelle überwiegen.
Im Falle einer Deletion in der zu untersuchenden Probe wird man
nur den Farbstoff 2 an dieser Hybridisierungsstelle detektieren.
Die Referenzmessung erlaubt eine relative Aussage über die
Häufigkeit
von Sequenzen in der zu analysierenden Probe. Allerdings ist auch
dieses Verfahren, da absolute Fluoreszenzintensitäten gemessen
werden müssen,
aufwändig
und teuer. Zudem erfordert auch dieses den Einsatz einer bestimmten,
vergleichsweise hohen Ausgangsmenge.
Eine
spezielle Variante ist die Array-CGH, in der nicht auf Chromosomen,
sondern auf immobilisierte Sequenzen, deren physikalische Adresse
im Genom bekannt ist, hybridisiert wird.
Ein
weiteres bekanntes Verfahren zur Quantifizierung von Nukleinsäuresequenzen
ist die Real-Time-PCR-Methode, bei der eine PCR (polymerase chain
reaction bzw. Polymerasekettenreaktion) mit fluoreszenzmarkierten
Primern durchgeführt
wird und die Zunahme des Fluoreszenzsignals in Abhängigkeit
von der Zyklenzahl beobachtet wird. Der Schwellenwert-PCR-Zyklus (auch
Threshold-Cycle) wird dem Reaktionszeitpunkt zuge ordnet, bei dem
sich das Fluoreszenzsignal signifikant von der Hintergrundfluoreszenz
abhebt und die PCR-Produktbildung exponentiell verläuft. Dieser
korreliert mit der Anfangskopienzahl der zu vermehrenden DNA-Sequenz.
Auf diese Weise lassen sich DNA-Proben anhand des Vergleichs mit
einer DNA-Verdünnungsreihe
relativ quantifizieren. Ein Nachteil dieses Verfahrens liegt jedoch
darin, dass die Menge an Ausgangsmaterial nicht beliebig verkleinert
werden kann, da mit wenigen Startmolekülen, beispielsweise 10 bis 100
Kopien, als Ausgangsmaterial der stochastische Fehler aufgrund der
exponentiellen Amplifikation sehr groß wird, was keine quantitative
Aussagen mehr zulässt.
Des weiteren erfordert auch dieses Verfahren aufwändige und
teure Apparaturen zur Messung der Fluoreszenzintensität.
Ein
neueres Verfahren zur quantitativen Bestimmung einer Nukleinsäuresequenz
ist die QF-PCR (quantitative fluorescence PCR), bei der in einem
PCR-Ansatz parallel mehrere PCR's
unter Einsatz unterschiedlich fluoreszenzmarkierter Primer durchgeführt werden
und die fluoreszenzmarkierten PCR-Produkte anschließend mit
einem automatischen DNA-Scanner laserdensitometrisch analysiert
werden. Um einen aussagenkräftigen
quantitativen Vergleich zwischen zwei nebeneinander amplifizierten
PCR-Produkten treffen
zu können,
müssen
die beiden PCR-Teilreaktionen mit gleicher Effizienz ablaufen und
die Fluoreszenzintensitäten
der Reaktionsprodukte zum Zeitpunkt der exponentiellen Produktamplifikation
quantitativ analysiert werden. Auch andere auf optisch aktiv markierten
Sonden basierende Verfahren, bspw. solche unter Einsatz von infrarotmarkierten
Sonden, lösen
das Problem nicht.
Ein
auf der QF-PCR-Methodik basierendes Verfahren zur Feststellung möglicher
numerischer Aberrationen der Chromosomen 21, 18, 13, X und Y in
Fruchtwasserproben ist von Lucchini et al. in Wissenschaftliche
In formationen, September 2004 beschrieben worden. Dieses Verfahren
basiert auf der in-vitro-PCR-Amplifikation von repetitiven und polymorphen
STR (short tandem repeats)-Sequenzen mit fluoreszenzmarkierten Primern.
Nach Abschluss der PCR werden die amplifizierten PCR-Produkte mittels
Kapillarelektrophorese quantifiziert. Werden bei diesen Verfahren
chromosomenspezifische STR-Systeme eingesetzt, so lassen sich aus
der Anzahl der erhalten unterschiedlichen PCR-Produkte Rückschlüsse auf
die Kopienzahl des entsprechenden Chromosoms schließen. Werden
beispielsweise bei der Reaktion mit einem chromosomspezifischen STR-System
bei der Kapillarelektrophorese drei Peaks erhalten, wobei die Peakhöhen untereinander
1:1:1 betragen, so enthält
das untersuchte Individuum drei verschiedene Allele des entsprechenden
Chromosoms (triallelische Trisomie). Werden hingegen bei dem Verfahren
zwei Peaks erhalten, wobei das Verhältnis der Peaks untereinander
2:1 beträgt,
so weist das untersuchte Individuum pro Zelle zwei gleiche Allele
des Chromosoms sowie ein anderes Allel des Chromosoms (diallelische
Trisomie) auf. Im Falle, dass nur zwei Peaks mit identischer Peakhöhe erhalten
werden, weist das Individuum zwei Allele auf, so dass keine Trisomie
vorliegt (heterozygoter Fall). Allerdings lässt dieses Verfahren in dem
Fall, dass lediglich ein Peak erhalten wird, keine Aussage über die
An- oder Abwesenheit einer Trisomie zu, da dieses Ergebnis sowohl
im Falle einer monoallelischen Trisomie als auch im Falle einer
monoallelischen Disomie erhalten wird. Ein auf dieser Technologie
beruhendes Verfahren zum Nachweis von Trisomie 13 wird auch in der
DE 101 02 687 A1 offenbart.
Um auch zwischen einer monoallelischen Disomie und einer monoallelischen
Trisomie unterscheiden zu können,
wird bei diesem Verfahren vorgeschlagen, mit der PCR drei verschiedene,
für das
Chromosom 13 spezifische STR-DNA-Bereiche zu amplifizieren. Allerdings
weist auch dieses Verfahren den Nachteil auf, dass fluoreszenzmarkierte
Primer eingesetzt werden müssen.
Zudem erfordert es den Einsatz einer Mindestmenge an DNA, da andernfalls
der stochasti sche Fehler aufgrund der exponentiellen Amplifikation
sehr groß wird
und keine quantitative Aussage für
die diallelische Trisomie mehr möglich
ist. Ein weiterer Nachteil des vorgenannten Verfahrens liegt schließlich darin,
dass dieses nur in einem engen PCR-Fenster mit einiger Zuverlässigkeit funktioniert,
da nur in diesem Fenster die Peakhöhen proportional zum Verhältnis des
Ausgangsmaterials sind. Des weiteren weist auch dieses Verfahren
den Nachteil auf, dass die absolute Fluoreszenzintensität bestimmt werden
muss.
In
der WO 2004/027089 wird ein Verfahren zur Amplifikation genetischer
Informationen aus genetischem Material umfassend mehrere voneinander
abgrenzbare Teilmengen genetischen Materials mittels PCR und zur
Bestimmung der Kopienzahl verschiedener Chromosomen pro Zelle offenbart,
wobei in der PCR mit fluoreszenzmarkierten Primern für jedes
zu bestimmende Chromosom spezifische Zielsequenzen mit vorbestimmter
Länge amplifiziert
werden. Um eine Aussage über
die Kopienzahl der zu detektierenden Chromosomen zu erhalten, wird
die Fluoreszenzintensität
der für
die jeweiligen Chromosomen erhaltenen PCR-Produkte bestimmt und
werden die für
die Zielsequenzen jedes Chromosoms erhaltenen Intensitäten miteinander
verglichen. Wenn bspw. die mit den für das Chromosom 21 spezifischen
PCR-Produkten erhaltene Intensität gleich
oder zumindest annähernd
gleich wie die mit den für
das Chromosom 1 spezifischen PCR-Produkten erhaltene
Intensität
ist, wird die Aussage getroffen, dass die beiden vorgenannten Chromosomen
in der biologischen Probe in gleicher Kopienzahl vorliegen. Auch
dieses Verfahren setzt daher zwingend den Einsatz fluoreszenzmarkierter
Primer voraus und benötigt
zur Auswertung die quantitative Erfassung der Fluoreszenzintensitäten der
einzelnen erhaltenen Amplifikationsprodukte. Auch dieses Verfahren
funktioniert daher nur in einem engen PCR-Fenster mit einiger Zuverlässigkeit,
da nur in diesem Fenster die Peakhöhen proportional zum Verhältnis des
Ausgangsmaterials sind.
Alle
vorgenannten Verfahren basieren auf dem Einsatz von fluoreszenzmarkierten
Primern und erfordern teure Apparaturen zur Bestimmung der Fluoreszenzintensität. Zudem
erfordern diese den Einsatz einer Mindestmenge an Ausgangsmaterial
um zumindest einigermaßen
zuverlässige
Ergebnisse zu erhalten.
Aufgabe
der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur relativen quantitativen
Bestimmung der Anzahl einer vorbestimmten Sequenz in einer biologischen
Probe, insbesondere zur relativen quantitativen Bestimmung der Anzahl
einer vorbestimmten Sequenz und von dazu homologen Sequenzen, beispielsweise
der relativen Anzahl von Allelen in einer biologischen Probe, bereitzustellen,
welches einfach und kostengünstig durchführbar ist,
welches auch und gerade bei einer geringen Anzahl an in der zu untersuchenden
biologischen Probe vorhandenen vorbestimmten Sequenzen zuverlässige Ergebnisse
liefert und welches insbesondere mit geringen Mengen an Ausgangsmaterial
durchführbar
ist.
Erfindungsgemäß wird diese
Aufgabe durch ein Verfahren zur relativen quantitativen Bestimmung
der Anzahl wenigstens einer vorbestimmten Sequenz und ggf. dazu
homologer Sequenzen in einer biologischen Probe, insbesondere zur
Bestimmung der relativen Anzahl an Kopien von Allelen, gelöst, welches
die folgenden Schritte umfasst:
- a) Bereitstellen
einer vorzugsweise definierten Menge einer biologischen Probe mit
zu bestimmender Kopienzahl an der wenigstens einen vorbestimmten
Sequenz,
- b) Durchführen
von einer, zwei oder mehr verschiedenen Amplifikationsreaktionen,
wobei die wenigstens eine Amplifikationsreaktion daran angepasst
ist, eine oder wenigstens zwei zueinander homologe und/oder nicht
homologe Sequenzen, die von der vorbestimmten Sequenz umfasst sind,
zu amplifizieren,
- c) Bestimmen der Anzahl der erhaltenen unterschiedlichen Amplifikationsprodukte
für jede
der wenigstens einen Amplifikationsreaktion von Schritt b),
- d) Durchführen
wenigstens einer Amplifikationsreaktion mit einer Referenzprobe
vorzugsweise mit einer bekannten Menge an der vorbestimmten Sequenz
unter denselben Reaktionsbedingungen wie der in Schritt b) eingesetzten
wenigstens einen Amplifikationsreaktion,
- e) Bestimmen der Anzahl der erhaltenen unterschiedlichen Amplifikationsprodukte
für jede
der wenigstens einen Amplifikationsreaktion von Schritt d) und
- f) Vergleichen der Anzahl der bei der wenigstens einen mit der
biologischen Probe durchgeführten
Amplifikationsreaktion erhaltenen unterschiedlichen Amplifikationsprodukte
von Schritt c) mit der Anzahl an mit der Referenzprobe erhaltenen
unterschiedlichen Amplifikationsprodukten gemäß Schritt e), wobei
- g) die Bedingungen der Amplifikationsreaktionen und die Menge
der eingesetzten biologischen Probe sowie Referenzprobe derart eingestellt
werden, dass in der wenigstens einen Amplifikationsreaktion gemäß Schritt
b) und in der wenigstens einen Amplifikationsreaktion gemäß Schritt
d) 0 bis 90% der theoretisch möglichen
Anzahl an unterschiedlichen Amplifikationsprodukten erhalten wird.
Unter
homologen Sequenzen im Sinne der vorliegenden Erfindung werden Sequenzen
verstanden, welche untereinander eine Ähnlichkeit bezüglich deren
Nukleotidsequenz von wenigstens 70%, bevorzugt wenigstens 80%, besonders
bevorzugt wenigstens 90% und ganz besonders bevorzugt wenigstens
95% aufweisen, wohingegen nicht homologe Sequenzen solche sind,
welche untereinander eine entsprechend geringere Sequenzähnlichkeit
aufweisen. Zudem bedeutet relative quantitative Bestimmung der Anzahl
einer vorbestimmten Sequenz in einer biologischen Probe im Sinne
der vorliegenden Erfindung die Bestimmung, ob eine biologische Probe
weniger, gleich viel oder mehr Kopien der vorbestimmten Sequenz
enthält
als eine Referenzprobe.
Im
Unterschied zu den Verfahren nach dem Stand der Technik wird bei
dem erfindungsgemäßen Verfahren
nicht, wie beispielsweise bei der quantitativen PCR und QF-PCR,
die absolute Fluoreszenzintensität von
PCR-Produkten bestimmt
sowie wie im Falle der CGH mit der Fluoreszenzintensität einer
Kontroll- bzw. Referenzprobe verglichen, sondern lediglich die Anzahl
der erhaltenen unterschiedlichen PCR-Produkte bestimmt und diese
mit der mit einer Referenzprobe erhaltenen Anzahl an unterschiedlichen
PCR-Produkten verglichen. Insofern müssen in dem erfindungsgemäßen Verfahren
keine fluoreszenzmarkierten Primer eingesetzt werden. Sofern diese
zur Detektion der Anzahl an erhaltenen verschiedenen PCR-Produkten dennoch eingesetzt
werden, muss nicht aufwendig die Fluoreszenzintensität der erhaltenen
fluoreszenzmarkierten PCR-Produkte bestimmt werden, sondern lediglich
evaluiert werden, ob eine ggf. über
einem definierten Schwellenwert (bspw. Faktor 10 oder 100) liegende
Fluoreszenz bei einer den eingesetzten Fluoreszenzfarbstoffen entsprechenden
Wellenlänge
vorhanden ist oder nicht. Daher ist das erfindungsgemäße Verfahren ohne
kostenaufwändige
Apparaturen zur quantitativen Detektion von Fluoreszenz einfach
und kostengünstig durchzuführen.
Grundsätzlich ist
das erfindungsgemäße Verfahren
zur relativen quantitativen Bestimmung der Anzahl einer vorbestimmten
Sequenz in einer biologischen Probe unabhängig von der Art der vorbestimmten
Sequenz geeignet. Vorzugsweise ist die vorbestimmte Sequenz ein
Chromosom, ein Gen oder ein Genabschnitt. Unter definierter Menge
einer biologischen Probe wird im Sinne der vorliegenden Erfindung
verstanden, dass die biologische Probe in einer bestimmten Volumenmenge
bereitgestellt wird oder die bereitgestellte biologische Probe eine
bestimmte Zellenzahl oder eine bestimmte Menge an DNA enthält.
Auch
bezüglich
der Art der wenigstens einen Amplifikationsreaktion ist das erfindungsgemäße Verfahren
nicht limitiert, vielmehr können
alle denkbaren Amplifikationsreaktionen, mit denen Sequenzvarianten nachgewiesen
werden können,
eingesetzt werden. Dennoch hat es sich als vorteilhaft erwiesen,
als wenigstens eine Amplifikationsreaktion eine PCR durchzuführen, da
eine PCR einfach und vergleichsweise schnell und mit geringem technischen
Aufwand durchzuführen
ist und durch die Auswahl geeigneter Primerpaare beliebige Nukleinsäuresequenzen
aus der biologischen Probe amplifiziert werden können.
Das
Prinzip des erfindungsgemäßen Verfahrens
beruht auf dem Vergleich der in der wenigstens einen Amplifikationsreaktion
gemäß Schritt
b) für
die biologische Probe erhaltenen Anzahl an unterschiedlichen Amplifikationsprodukten
mit der Anzahl von für
eine Referenzprobe mit wenigstens einer unter den gleichen Bedingungen
wie in Schritt b) durchgeführten
Amplifikationsreaktion erhaltenen unterschiedlichen Amplifikationsprodukten.
Aus dem Vergleich der Anzahlen der erhaltenen unterschiedlichen
Amplifikationsprodukte kann die Aussage getroffen werden, ob die
zu un tersuchende biologische Probe gleich viel, mehr oder weniger
Kopien als die Referenzprobe enthält.
Vorzugsweise
weist die Referenzprobe bezüglich
der vorbestimmten Sequenz einen bekannten Genotyp auf. Darunter
wird im Sinne der vorliegenden Erfindung verstanden, dass bekannt
ist, ob es sich bei dem Individuum, aus dem die Referenzprobe entnommen
wurde, um ein bezüglich
der vorbestimmten Sequenz, bspw. einem Chromosom, um ein gesundes
oder krankes Individuum handelt. Es muss jedoch bei dieser Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung nicht bekannt sein, wie hoch konkret
die Kopienzahl der vorbestimmten Sequenz in dem Individuum ist;
vielmehr reicht aus, dass bekannt ist, ob die Referenzprobe bspw.,
wenn die vorbestimmte Sequenz das Chromosom 21 ist, 2 Kopien des
Chromosoms 21 (gesundes Individuum) oder mehr oder weniger als 2
Kopien des Chromosoms 21 (krankes Individuum) aufweist. Durch Vergleich
der Anzahl der mit der wenigstens einen PCR gemäß Schritt b) erhaltenen unterschiedlichen
PCR-Produkte mit der entsprechenden Anzahl von mit der wenigstens
einen PCR gemäß Schritt
d) erhaltenen unterschiedlichen PCR-Produkten lässt sich so zuverlässig darauf
schließen,
ob das Individuum, aus dem die biologische Probe entnommen wurde,
hinsichtlich der vorbestimmten Sequenz gesund (es werden mit der
biologischen Probe gleich viele verschiedene PCR-Produkte wie für die Referenzprobe
erhalten) oder krank ist. Dies sei am folgenden Beispiel erläutert:
Soll
beispielsweise mit dem erfindungsgemäßen Verfahren bestimmt werden,
ob bei einem Individuum eine Chromosom 21-Aberration vorliegt, können als
Referenzprobe eine oder mehrere Zellen eines gesunden Individuums
(mit 2 Kopien des Chromosoms 21) eingesetzt werden. Werden mit der
zu untersuchenden biologischen Probe – bei Einsatz gleich vieler
Zellen wie in der Referenzprobe – weniger sich voneinander
unterschei dende Amplifikationsprodukte erhalten als mit der Referenzprobe,
weist das untersuchte Individuum weniger als zwei Chromosomen auf.
Werden hingegen mit der biologischen Probe mehr unterschiedliche
Amplifikationsprodukte als mit der Referenzprobe erhalten, liegt
die Kopienzahl an Chromosom 21 pro Zelle bei 3 (Trisomie 21) oder
höher.
Werden jedoch mit der biologischen Probe und der Referenzprobe jeweils
die gleiche Anzahl an unterschiedlichen Amplifikationsprodukten
erhalten, ist das zu untersuchende Individuum bezüglich der
Kopienzahl an Chromosom 21 gesund.
Anstelle
einer Referenzprobe eines gesunden Individuums kann auch die eines
kranken Individuums, beispielsweise einem Träger der Trisomie 21, eingesetzt
werden. Bezogen auf das vorgenannte Beispiel ist in diesem Fall
nicht bekannt, welche exakte Anzahl an Chromosom 21 das Individuum,
aus dem die Referenzprobe entnommen wurde, aufweist, sondern nur,
dass die Referenzprobe weniger oder mehr als zwei Chromosomen 21
pro Zelle enthält.
In diesem Fall lässt
sich, vorausgesetzt die Anzahl der in der biologischen Probe enthaltenen
Zellen relativ zu der in der Referenzprobe enthaltenen Anzahl an
Zellen ist bekannt, aus dem Vergleich der mit der biologischen Probe
und mit der Referenzprobe jeweils erhaltenen Anzahl an unterschiedlichen
PCR-Produkten schließen,
ob das Individuum, aus dem die biologische Probe entnommen wurde,
die gleiche oder eine andere Kopienzahl an Chromosom 21 pro Zelle
als der Träger
der Referenzprobe aufweist.
Allerdings
ist es bevorzugt, dass die Referenzprobe eine bekannte Kopienzahl
der vorbestimmten Sequenz aufweist.
Da
erfindungsgemäß genau
eine Referenzprobe eingesetzt wird, ist das erfindungsgemäße Verfahren schnell
und einfach durchzuführen.
In
Weiterbildung des Erfindungsgedankens wird vorgeschlagen, in der
wenigstens einen Amplifikationsreaktion gemäß Schritt b) und in der wenigstens
einen Amplifikationsreaktion gemäß Schritt
d), welche daran angepasst sind, eine oder wenigstens zwei zueinander
homologe und/oder nicht homologe Sequenzen, die von der vorbestimmten
Sequenz umfasst sind, zu amplifizieren, jeweils eine derart geringe
Menge an biologischem Ausgangsmaterial einzusetzen, oder die Amplifikationsbedingungen
derart einzustellen, dass bei der Durchführung der PCR's ein "allelic dropout" auftritt. Unter
einem "allelic dropout" versteht der Fachmann den
Verlust eines allelischen DNA-Fragmentes nach einer PCR-Amplifikation,
verursacht durch zu geringe Mengen an DNA-Ausgangsmaterial. In einem
heterogenen DNA-Gemisch, wie beispielsweise einer Probe chromosomaler
DNA, sind bestimmte Allele unterschiedlich häufig vertreten. Da die PCR
exponentiell amplifiziert, kann diese Ungleichverteilung so sehr
verstärkt
werden, dass das geringer konzentrierte Allel im Verhältnis zu
dem höher
konzentrierten Allel so gering vertreten ist, dass es nicht mehr
detektiert werden kann. Um einen "allelic dropout" zu vermeiden, wird z.B. bei forensischen
Untersuchungen immer eine gewisse, im Nanogrammbereich liegende
Ausgangsmenge an DNA-Material eingesetzt, um überhaupt zuverlässige Ergebnisse
zu erhalten. Im Unterschied dazu ist es bei dem erfindungsgemäßen Verfahren
gerade erwünscht,
unterhalb einer solchen Mindestmenge an Ausgangsmaterial zu arbeiten.
Besonders
gute Ergebnisse werden gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform
erhalten, wenn für
die wenigstens eine Amplifikationsreaktion eine biologische Probe
eingesetzt wird, welche weniger als 100 pg DNA, beispielsweise chromosomale
DNA, enthält.
Insbesondere bevorzugt werden in der wenigstens einen Amplifikationsreaktion
weniger als 50 pg DNA, besonders bevorzugt weniger als 10 pg DNA
und ganz beson ders bevorzugt weniger als 5 pg DNA als Ausgangsmaterial
eingesetzt, wobei grundsätzlich
gilt, dass je weniger Basenpaare die Nukleinsäure in der biologischen Probe
enthält,
desto weniger DNA eingesetzt werden kann und sollte. Umgerechnet
in Zellen entsprechen die vorgenannten DNA-Mengen dem Einsatz von weniger als 100
Zellen, bevorzugt weniger als 10 Zellen und besonders bevorzugt
weniger als 5 Zellen in der wenigstens einen Amplifikationsreaktion.
Insbesondere auch bei Einsatz einer einzelnen Zelle als biologisches
Ausgangsmaterial, bspw. einem Polkörper nach der ersten Reifeteilung,
werden gute Ergebnisse erhalten.
Es
ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung auch möglich, in der wenigstens einen
Amplifikationsreaktion gemäß Schritt
b) und d) RNA als Vorlage einzusetzen. Bei dieser Ausführungsform
muss zunächst
die RNA mit reverser Transkriptase in cDNA überführt werden, bevor die Amplifikationsreaktion
durchgeführt
wird. Abgesehen davon wird das Verfahren wie zuvor beschrieben ausgeführt. Mit
dieser Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung können
Rückschlüsse auf
Unterschiede in der Genexpression zwischen einer zu untersuchenden
biologischen Probe und einer Referenzprobe erhalten werden, die
auf DNA-Ebene allein nicht erfasst werden können.
Im
Unterschied zu den beispielsweise in der Forensik eingesetzten Verfahren
basiert das erfindungsgemäße Verfahren
auf einem statistischen Ansatz, bei dem es gar nicht erwünscht ist,
dass in der wenigstens einen Amplifikationsreaktion die eine oder
jede der wenigstens zwei zueinander homologen bzw. nicht homologen
Sequenzen tatsächlich
amplifiziert werden. Vielmehr soll gerade durch die Einstellung
der Parameter der Amplifikationsreaktion, nämlich den Einsatz einer sehr
geringen DNA-Menge als Ausgangsmaterial und/oder durch Wahl einer
entsprechend kleinen Zyklenzahl und/oder durch die Temperaturführung bei
der Amplifikations reaktion und/oder durch eine gezielte Kontamination
des Amplifikationsansatzes mit die Amplifikationsreaktion störenden Kontaminanten
und/oder durch Wahl sehr stringenter Hybridisierungsbedingungen
der eingesetzten Primer zu den Primerbindungsstellen, erreicht werden,
dass nur ein bestimmter Prozentsatz, nämlich 0 bis 90% der wenigstens
einen zueinander homologen oder nicht homologen Sequenzen, tatsächlich amplifiziert
wird. Indem sowohl die zu untersuchende biologische Probe als auch
die Referenzprobe einer Amplifikationsreaktion mit jeweils denselben
Amplifikationsbedingungen unterzogen wird, werden die Ausfälle einzelner
theoretisch möglicher
Amplifikationsprodukte nivelliert, so dass zuverlässig auf
die relative Kopienzahl der vorbestimmten Sequenz in der zu untersuchenden
biologischen Probe verglichen mit der Referenzprobe geschlossen
werden kann.
In
Weiterbildung des Erfindungsgedankens wird vorgeschlagen, die Bedingungen
der Amplifikationsreaktionen und die Menge der eingesetzten biologischen
Probe sowie der Referenzprobe derart einzustellen, dass in der wenigstens
einen Amplifikationsreaktion gemäß Schritt
b) und in der wenigstens einen Amplifikationsreaktion gemäß Schritt
d) 20 bis 80%, bevorzugt 30 bis 70%, besonders bevorzugt 40 bis
60% und ganz besonders bevorzugt etwa 50% der theoretisch möglichen
Anzahl an unterschiedlichen Amplifikationsprodukten erhalten wird.
Um
die vorgenannten Werte zu erreichen ist es insbesondere in dem Fall,
dass die DNA-Konzentration der biologischen Probe und/oder der Referenzprobe
nicht bekannt ist, vorteilhaft, in Schritt a) eine Verdünnungsreihe
der biologischen Probe bereitzustellen und mit jeder Verdünnungsstufe
der Verdünnungsreihe
in Schritt b) wenigstens eine, besonders bevorzugt genau eine, PCR
durchzuführen
und/oder in Schritt d) eine Verdünnungsreihe
der Referenzprobe bereitzustellen und mit jeder Verdün nungsstufe
der Verdünnungsreihe wenigstens
eine, besonders bevorzugt genau eine, PCR durchzuführen. So
kann durch Bestimmung der Anzahl an für jede Verdünnungsstufe erhaltenen unterschiedlichen
Amplifikationsprodukten sowohl für
die biologische Probe als auch die Referenzprobe eindeutig festgestellt
werden, ab welcher Verdünnungsstufe
bei der Amplifikationsreaktion gemäß Schritt b) bzw. Schritt d)
weniger als 90% der theoretisch möglichen Anzahl an unterschiedlichen
Amplifikationsprodukten erhalten werden. Bei der anschließenden Auswertung
der Anzahl der erhaltenen unterschiedlichen Amplifikationsprodukte
für die
biologische Probe und/oder für
die Referenzprobe gemäß Schritt
f) werden dann vorzugsweise nur diejenigen Verdünnungsstufen berücksichtigt,
bei denen 0 bis 90% der theoretisch möglichen Anzahl an unterschiedlichen
Amplifikationsprodukten erhalten wurden. Auch wenn die DNA-Konzentration
bspw. der Referenzprobe bekannt ist, nicht aber die DNA-Konzentration
der biologischen Probe werden vorzugsweise sowohl für die Referenzprobe
als auch die biologische Probe jeweils eine Verdünnungsreihe erstellt, wobei
die Verdünnungsfaktoren
für die
einzelnen Verdünnungsstufen für die Referenzprobe
und die biologische Probe gleich hoch gewählt werden.
Wenn
die DNA-Konzentration sowohl der biologischen Probe als auch der
Referenzprobe bekannt sind, ist eine Verdünnungsreihe nicht zwingend
erforderlich, da die bekannte DNA-Konzentration dann gezielt soweit
verdünnt
werden kann, dass unter den gewählten
PCR-Bedingungen weniger als 90% der theoretisch möglichen
Anzahl an unterschiedlichen Amplifikationsprodukten erhalten werden.
Wenn die bekannte DNA-Konzentration sowohl der biologischen Probe
als auch der Referenzprobe hingegen bereits so gering ist, dass
unter den gewählten
PCR-Bedingungen weniger als 90% der theoretisch möglichen
Anzahl an unterschiedlichen Amplifikationsprodukten erhalten werden,
kann auf eine Verdünnung
verzichtet werden. Dennoch ist es in beiden vorgenannten Fällen bevorzugt
eine Ver dünnungsreihe
durchzuführen,
um sicher sein zu können,
in einem Bereich gearbeitet zu haben, in dem bei der Amplifikationsreaktion
weniger als 90% der theoretisch möglichen Anzahl an unterschiedlichen
Amplifikationsprodukten erhalten werden.
Dies
sei an einem Gedankenbeispiel erläutert: Es liegt eine Referenzprobe
mit bekannten Genotyp vor, wobei die Referenzprobe 96 Zellen umfasst.
Es ist nicht sicher bekannt, ob mit dieser Zellzahl bei der durchgeführten PCR
weniger als 90% der theoretisch möglichen Anzahl an unterschiedlichen
Amplifikationsprodukten erhalten werden oder nicht. Daher wird eine
Verdünnungsreihe
erstellt, wobei der Verdünnungsfaktor
zwischen den einzelnen Verdünnungsstufen
2 beträgt,
mithin die einzelnen Verdünnungsstufen
96 Zellen (Verdünnungsstufe
0), 48 Zellen (Verdünnungsstufe
1), 24 Zellen (Verdünnungsstufe
2), 12 Zellen (Verdünnungsstufe
3), 6 Zellen (Verdünnungsstufe
4), 3 Zellen (Verdünnungsstufe
5) und 1,5 Zellen (Verdünnungsstufe
6) enthalten. Mit jeder Verdünnungsstufe
wird nunmehr wenigstens eine PCR, bevorzugt mit mindestens 10 Primerpaaren,
unter jeweils exakt den gleichen Amplifikationsbedingungen durchgeführt und
anschließend
die Anzahl der erhaltenen unterschiedlichen Amplifikationsprodukte
bestimmt, wobei das in der 1 wiedergegebene
Ergebnis erhalten wurde.
Aus
dem in der 1 gezeigten Ergebnis ist ersichtlich,
dass unter den gewählten
PCR-Bedingungen bei Einsatz von 20 Zellen oder weniger in der PCR
weniger als 90% der theoretisch möglichen Anzahl an unterschiedlichen
Amplifikationsprodukten erhalten werden. Zudem kann durch die Steigung
der durch die Kurve gelegten Regressionsgerade relativ genau berechnet
werden, bei wie vielen Zellen in der Ausgangsprobe unter den gewählten Amplifikationsbedingungen
eine vorbestimmte Anzahl der theoretisch möglichen Anzahl an unterschiedlichen
Amplifikationsprodukten, bspw. 50% der theoretisch möglichen
Anzahl an unterschiedlichen Amplifikationsprodukten, erhalten wird.
Vorzugsweise
wird in Schritt b) und/oder in Schritt d) mit der biologischen Probe
bzw. mit der Referenzprobe genau eine PCR durchgeführt. Dabei
bezieht sich die Angabe "eine" PCR lediglich darauf,
dass nicht zwei oder mehr verschiedene Amplifikationsreaktionen,
welche dazu angepasst sind, eine oder wenigstens zwei zueinander
homologe und/oder nicht homologe Sequenzen, die von der vorbestimmten
Sequenz umfasst sind, zu amplifizieren, wobei sich die zwei oder
mehr verschiedenen Amplifikationsreaktionen beispielsweise durch
die Wahl der eingesetzten Primerpaare unterscheiden, durchgeführt werden.
Dies schließt
jedoch nicht aus, dass die in Schritt b) und/oder in Schritt d)
durchgeführte
genau eine PCR mit der biologischen Probe bzw. Referenzprobe anhand
von Teilmengen (Aliquots) mehrmals durchgeführt wird, um im Rahmen einer
Mehrfachbestimmung eine Absicherung des Ergebnisses zu erhalten.
Diese Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung ist besonders schnell und einfach durchzuführen.
Es
hat sich im Rahmen der vorliegenden Erfindung als vorteilhaft erwiesen,
sowohl für
die PCR in Schritt b) als auch die PCR in Schritt d) eine Mehrfachbestimmung
durchzuführen.
Durch die Mehrfachbestimmung der wenigstens einen PCR in Schritt
d) für
die Referenzprobe wird im Prinzip eine Häufigkeitsverteilung erhalten,
welche die Wahrscheinlichkeit für
den Erhalt jeder zwischen 0 und der theoretisch möglichen
Maximalzahl liegenden Anzahl an unterschiedlichen PCR-Produkten
angibt. Gleiches gilt für
die Mehrfachbestimmung der PCR mit der biologischen Probe. So kann
durch den Vergleich der Anzahl der bei der wenigstens einen mit
der biologischen Probe durchgeführten
Amplifikationsreaktion erhaltenen unterschiedlichen Amplifikationsprodukten
mit der Anzahl an mit der Referenzprobe erhaltenen unterschiedlichen
Amplifikationsprodukten eine besonders zuverlässige Aussage getroffen werden,
ob die biologische Probe gleich viel, mehr oder weniger Kopien der
vorbestimmten Sequenz enthält
als die Referenzprobe.
Unabhängig davon,
ob in Schritt b) und/oder in Schritt d) eine oder zwei oder mehr
verschiedene PCR's
durchgeführt
werden, können
die wenigstens eine PCR gemäß Schritt
b) sowie die wenigstens eine PCR gemäß Schritt d) parallel zueinander
durchgeführt.
Allerdings ist es bevorzugt, die beiden Proben zeitlich zueinander
versetzt zu amplifizieren, wobei besonders bevorzugt die Referenzprobe
zeitlich vor der biologischen Probe amplifiziert wird.
Sofern
bei den einzelnen PCR's
eine Mehrfachbestimmung durchgeführt
wird, werden vorzugsweise für
den Vergleich der Anzahl der mit den beiden Proben, nämlich der
biologischen Probe und der Referenzprobe, erhaltenen Anzahl an unterschiedlichen
Amplifikationsprodukten gemäß Schritt
f) des erfindungsgemäßen Verfahrens
die Mittelwerte der für
jede Probe bei der Mehrfachbestimmung erhaltenen Anzahl an unterschiedlichen
Amplifikationsprodukten miteinander verglichen. Bevorzugt wird hierbei
auch die Standardabweichung bestimmt, um eine Aussage über die
statistische Sicherheit des getroffenen Ergebnisses zu erhalten.
Ist beispielsweise die Standardabweichung bei der Mittelwertbildung
gering, so kann aus einer verschiedenen Anzahl an für die Amplifikationsreaktion
gemäß Schritt
b) erhaltenen unterschiedlichen Amplifikationsprodukten verglichen
mit der entsprechenden Anzahl für
die Referenzprobe besonders zuverlässig darauf geschlossen werden,
dass sich die Kopienzahl der vorbestimmten Sequenz in der biologischen
Probe von der der Referenzprobe unterscheidet.
Alternativ
zu der vorgenannten Ausführungsform
ist es selbstverständlich
auch möglich,
nur eine der Amplifikationsreaktionen gemäß den Schritten b) und d) einer
Mehrfachbestimmung zu unterziehen, wohingegen die andere der Amplifikationsreaktionen
nur einer einfachen Bestimmung unterzogen wird. Beispielsweise werden
auch gute Ergebnisse erhalten, wenn nur die für die Referenzprobe durchgeführte PCR
mehrfach bestimmt wird, während
die zu untersuchende biologische Probe einer einfachen Bestimmung
unterzogen wird. Allerdings ist es auch möglich, das erfin dungsgemäße Verfahren
derart durchzuführen,
dass sowohl für
die Amplifikationsreaktion der Referenzprobe als auch die entsprechende
Reaktion der biologischen Probe jeweils nur eine Einfachbestimmung
durchgeführt
wird.
Wenn
wenigstens für
eine der Amplifikationsreaktionen mit der biologischen Probe und/oder
der Referenzprobe eine Mehrfachbestimmung durchgeführt wird,
liegt die Anzahl der einzelnen Mehrfachbestimmungen pro Amplifikationsreaktion
vorzugsweise zwischen 2 und 1.000 mal, besonders bevorzugt zwischen
2 und 50 mal, ganz besonders bevorzugt zwischen 2 und 20 mal und
höchst
bevorzugt zwischen 5 und 10 mal. Je höher die Anzahl der für die Referenzprobe
und/oder biologische Probe durchgeführten Bestimmungen, desto höher die
statistische Sicherheit, desto höher
allerdings auch der experimentelle Aufwand.
Je
nach Anzahl der einzelnen Bestimmungen pro Amplifikationsreaktion
kann es notwendig sein, die biologische Probe und/oder die Referenzprobe
vor Durchführung
des erfindungsgemäßen Verfahrens
zu amplifizieren, um eine ausreichende Menge an Ausgangsmaterial
für die
einzelnen Amplifikationsreaktionen der Mehrfachbestimmung zu haben.
Vorzugsweise erfolgt in diesem Fall die Vermehrung des Ausgangsmaterials durch
eine unspezifische PCR der biologischen Probe und/oder der Referenzprobe.
Hervorzuheben
ist, dass das erfindungsgemäße Verfahren
nicht nur dazu geeignet ist, die relative Anzahl einer vorbestimmten
Sequenz, beispielsweise eines speziellen Gens oder Genoms, in einer
biologischen Probe zu bestimmen, sondern insbesondere auch zur relativen
Bestimmung der Anzahl einer vorbestimmten Sequenz sowie dazu homologer
Sequenzen, wobei es sich bei den homologen Sequenzen vorzugsweise
um Allele handelt. Bei der letztgenannten Ausführungsform der vorliegenden
Erfindung ist es notwendig, in der wenigstens einen Amplifikationsreaktion
gemäß Schritt
b) und der wenigstens einen Amplifikationsreaktion gemäß Schritt
d) eine allelspezifische Sequenz zu amplifizieren, worunter eine
Sequenz verstanden wird, welche zwischen zwei Allelen zwar hochgradig ähnlich bzw.
homolog, aber nicht identisch ist. Da in den Schritten c) und e)
die Anzahl der erhaltenen unterschiedlichen PCR-Produkte für die biologische
Probe und die Referenzprobe bestimmt werden und dadurch die Anzahl
der unterschiedlichen Allele das Ergebnis beeinflusst, kann durch
Vergleich der erhaltenen Anzahl an unterschiedlichen PCR-Produkten
für die
biologische Probe mit der entsprechenden Anzahl für die Referenzprobe
die Kopienzahl der einzelnen Allele relativ bestimmt werden, d.h.
es ist die Aussage möglich,
ob die biologische Probe weniger, gleich viel oder mehr Kopien des
Allels pro Zelle aufweist als die Referenzprobe. Daher wird die
wenigstens eine Amplifikationsreaktion in den Schritten b) und d)
vorzugsweise derart ausgelegt, dass die eine oder wenigstens zwei
zueinander homologen bzw. nicht homologen Sequenzen aus dem nicht-kodierenden
DNA-Bereich amplifiziert werden. Bekanntermaßen ist der nicht-kodierende DNA-Bereich
wesentlich polymorpher als der kodierende Bereich, so dass die Wahrscheinlichkeit,
dort allelspezifische Sequenzen zu amplifizieren, groß ist. In
Weiterbildung des Erfindungsgedankens wird zudem vorgeschlagen,
die wenigstens eine Amplifikationsreaktion dazu anzupassen, dass
eine oder wenigstens zwei zueinander homologe und/oder nicht homologe
hochpolymorphe Sequenzen amplifiziert werden.
Insbesondere
in den Fällen,
in denen die wenigstens eine Amplifikationsreaktion gemäß den Schritten b)
und d) dazu angepasst ist, eine oder wenigstens zwei zueinander
homologe und/oder nicht homologe Sequenzen zu amplifizieren, welche
aus der STR-Sequenzen, VNTR-Sequenzen, SNP-Sequenzen und beliebigen Kombinationen
hiervon bestehenden Gruppe ausgewählt sind, werden gute Ergebnisse
erhalten. STR- bzw. short tan dem repeat-Sequenzen sind hochpolymorphe
Sequenzen, welche aus lediglich zwei bis vier bp langen Wiederholungseinheiten
bestehen und zwischen den einzelnen Individuen eine hohe Variabilität aufweisen.
Im Unterschied dazu bestehen VNTR- bzw. variable number of tandem
repeat-Sequenzen
aus etwa 15 bis 30 bp Länge
aufgebauten repetitiven DNA-Abschnitten,
deren Gesamtlänge
durch die Anzahl der Wiederholungen dieser Grundeinheit bestimmt
sind. Auch VNTR-Sequenzen sind in der Regel hochpolymorph, d.h.
die Anzahl der jeweiligen Wiederholungseinheiten unterscheidet sich
zwischen den verschiedenen Individuen sehr stark. Bei SNP's (single nucleotide
polymorphism) handelt es sich um die einfachsten Polymorphismen,
bei denen sich die homologen Sequenzen nur durch eine Base unterscheiden.
Auch diese eignen sich hervorragend für die Durchführung des
erfindungsgemäßen Verfahrens.
Abgesehen davon sind jedoch auch alle anderen hochpolymorphen Sequenzen
als Marker für
das erfindungsgemäße Verfahren
geeignet.
Ferner
ist es bevorzugt, dass die wenigstens eine Amplifikationsreaktion
dazu angepasst ist, eine oder wenigstens zwei zueinander homologe
und/oder nicht homologe Sequenzen zu amplifizieren, welche im Genom
des Spenders jeweils pro Allel nur einmal vorkommen.
Vorzugsweise
ist die wenigstens eine Amplifikationsreaktion gemäß den Schritten
b) und d) dazu angepasst, zwischen 2 und 100 zueinander homologe
bzw. nicht homologe Sequenzen zu amplifizieren, wobei insbesondere
bei Anpassung zur Amplifikation von 2 bis 20 zueinander homologen
bzw. nicht homologen Sequenzen, besonders bevorzugt 3 bis 15 zueinander
homologen bzw. nicht homologen Sequenzen und ganz besonders bevorzugt
zwischen 5 und 12 zueinander homologen Sequenzen bzw. nicht homologen,
besonders gute Ergebnisse erhalten werden.
In
Weiterbildung des Erfindungsgedankens wird vorgeschlagen, die Anzahl
der Kopien der vorbestimmten Sequenz in der Referenzprobe und/oder
der biologischen Probe zwischen 20 und 1.000 zu wählen.
Ein
besonderer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt darin,
dass in Schritt c) und in Schritt e) bei der Bestimmung der Anzahl
an unterschiedlichen PCR-Produkten pro Amplifikationsansatz jeweils
zwei Informationen pro Amplifikationsansatz berücksichtigt werden, nämlich zum
einen die An- bzw. Abwesenheit eines entsprechenden PCR-Produktes sowie zum
anderen die Information über
einen zweiten, die einzelnen PCR-Produkte voneinander unterscheidenden
Parameter, beispielsweise die Länge
oder Sequenz der PCR-Produkte, weswegen selbst bei einer Einfachbestimmung
der wenigstens einen Amplifikationsreaktion gemäß Schritt b) als auch der wenigstens
einen Amplifikationsreaktion gemäß Schritt
d) zuverlässige
Ergebnisse über
die relative Anzahl an Sequenzkopien in der biologischen Probe mit
Bezug zu der Referenzprobe möglich
sind. Zur Bestimmung der An- bzw. Abwesenheit von Amplifikationsprodukten
können
alle dem Fachmann zu diesem Zweck bekannten Verfahren eingesetzt
werde, wobei lediglich beispielsweise Gelelektrophorese, gängige Hybridisierungstechniken,
beispielsweise auf einem DNA-Array,
genannt seien. Dabei kann es in Abhängigkeit von dem eingesetzten
Detektionsverfahren zweckmäßig sein,
Schwellenwerte zu definieren, oberhalb derer die Anwesenheit eines
PCR-Produktes und unterhalb derer die Abwesenheit eines PCR-Produktes
angenommen wird. Die Art des zweiten, die einzelnen PCR-Produkte
voneinander unterscheidenden Parameters ist im Wesentlichen von
der Art der einen bzw. wenigstens zwei zu amplifizierenden, zueinander homologen
bzw. nicht homologen Sequenzen abhängig. Werden beispielsweise
die PCR-Primer in der wenigstens einen Amplifikationsreaktion so
gewählt,
dass STR-Abschnitte und/oder VNTR-Abschnitte als zueinander homologe
und/oder nicht ho mologe Sequenzen amplifiziert werden, wird als
zweiter Parameter bzw. Unterscheidungsmerkmal der einzelnen PCR-Produkte
vorzugsweise die Länge
der einzelnen PCR-Produkte gewählt,
so dass die Bestimmung der Anzahl der erhaltenen unterschiedlichen
Amplifikationsprodukte gemäß den Schritten
c) und e) die Prüfung
auf An- bzw. Abwesenheit von PCR-Produkten
sowie die Bestimmung der Länge
der einzelnen PCR-Produkte umfasst, wobei die Anzahl der erhaltenen
unterschiedlichen Amplifikationsprodukte der Anzahl der erhaltenen
Amplifikationsprodukte mit sich unterscheidender Länge entspricht.
Ein geeignetes Verfahren hierfür
ist beispielsweise die Kapillarelektrophorese.
Werden
hingegen bei der wenigstens einen Amplifikationsreaktion PCR-Primer eingesetzt,
welche daran angepasst sind, eine oder wenigstens zwei zueinander
homologe und/oder nicht homologe SNP-Sequenzen zu amplifizieren,
so ist das zweite Unterscheidungsmerkmal bzw. der zweite Parameter
vorzugsweise die Bestimmung der sich unterscheidenden Sequenz, die
bei SNP-Abschnitten üblicherweise
auf ein Nukleotid beschränkt
ist. Auch hierzu können
alle dem Fachmann zu diesem Zweck bekannten Verfahren herangezogen werden,
wobei lediglich beispielsweise DNA-Sequenzierung oder bekannte Hybridisierungsverfahren
genannt seien.
Gemäß einer
weiteren bevorzugten Ausführungsform
betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur relativen quantitativen
Bestimmung der Anzahl wenigstens einer vorbestimmten Nukleinsäuresequenz
und dazu homologer Sequenzen in einer biologischen Probe, umfassend
die Schritte:
- a) Bereitstellen einer biologischen
Probe mit zu bestimmender Kopienzahl an der wenigstens einen vorbestimmten
Sequenz, wobei die biologische Probe zwischen 1 und 100 Zellen und/oder
zwischen 1 pg und 100 pg chromosomale DNA umfasst,
- b) Durchführen
wenigstens einer PCR, wobei die wenigstens eine PCR daran angepasst
ist, eine oder wenigstens zwei zueinander homologe und/oder nicht
homologe Sequenzen, die von der vorbestimmten Sequenz umfasst und
aus der aus STR-Abschnitten, VNTR-Abschnitten, SNP-Abschnitten und beliebigen Kombinationen
hiervon bestehenden Gruppe ausgewählt sind, zu amplifizieren,
- c) Bestimmen der in der wenigstens einen PCR erhaltenen Anzahl
an unterschiedlichen Amplifikationsprodukten,
- d) Durchführen
wenigstens einer PCR mit einer Referenzprobe vorzugsweise mit einer
bekannten Menge an der vorbestimmten Sequenz unter denselben Reaktionsbedingungen
wie der in Schritt b) eingesetzten wenigstens einen PCR,
- e) Bestimmen der in der wenigstens einen PCR gemäß Schritt
d) erhaltenen Anzahl an unterschiedlichen PCR-Produkten und
- f) Vergleichen der Anzahl der bei der mit der biologischen Probe
durchgeführten
wenigstens einen PCR erhaltenen unterschiedlichen PCR-Produkte von
Schritt c) mit der Anzahl an mit der Referenzprobe erhaltenen unterschiedlichen
PCR-Produkten gemäß Schritt
e), wobei
- g) die Bedingungen der PCR's
und die Menge der eingesetzten biologischen Probe sowie der Referenzprobe
derart eingestellt werden, dass in der wenigstens einen PCR gemäß Schritt
b) und in der wenigstens einen PCR gemäß Schritt d) 0 bis 90% der
theoretisch möglichen
Anzahl an unterschiedlichen Amplifikationsprodukten erhalten werden.
Es
hat sich bei der Durchführung
des erfindungsgemäßen Verfahrens
als zweckmäßig erwiesen,
parallel zu der wenigstens einen Amplifikationsreaktion gemäß Schritt
b) bzw. d) eine Amplifikationsreaktion unter den gleichen Bedingungen
mit einer Kontrollprobe durchzuführen,
wobei die Kontrollprobe vorzugsweise zu einer bekannten Anzahl an
unterschiedlichen Amplifikationsprodukten führt. So kann auf einfache Weise
festgestellt werden, ob die wenigstens eine Amplifikationsreaktion
gemäß Schritt
b) und/oder Schritt d) ordnungsgemäß abgelaufen ist, oder möglicherweise
durch einen Defekt an dem Thermocycler gar nicht oder nur unzureichend
stattgefunden hat.
Ein
weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Kit zur relativen
quantitativen Bestimmung der Anzahl einer vorbestimmten Sequenz
und gegebenenfalls dazu homologer Sequenzen in einer biologischen
Probe, welches insbesondere zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens
geeignet ist. Erfindungsgemäß umfasst
dieses Kit:
- a) wenigstens zwei Primerpaare,
welche dazu angepasst sind, in wenigstens einer PCR eine oder wenigstens
zwei zueinander homologe und/oder nicht homologe Sequenzen, die
von der vorbestimmten Sequenz umfasst sind, zu amplifizieren,
- b) eine Referenzprobe mit einer bezüglich der vorbestimmten Sequenz
bekannten Kopienzahl und/oder das Ergebnis wenigstens einer, unter
den gleichen wie in dem Protokoll gemäß d) vorgeschrieben, durchgeführten Amplifikationsreaktion,
wobei die Kopienzahl so gewählt
war, dass das Amplifikationsprodukt mit einer Wahrscheinlichkeit
von weniger als 90% entstand,
- c) ggf. PCR-Puffer und
- d) ein Protokoll für
die Durchführung
der wenigstens einen PCR mit der biologischen Probe und ggf. einer Referenzprobe.
Unter
Ergebnis wenigstens einer, unter den gleichen wie in dem Protokoll
gemäß d) vorgeschrieben, durchgeführten Amplifikationsreaktion
für eine
Referenzprobe werden die Anzahl der mit der wenigstens einen Amplifika tionsreaktion,
welche daran angepasst ist, eine oder wenigstens zwei zueinander
homologe und/oder nicht homologe Sequenzen, die von der vorbestimmten
Sequenz umfasst sind, zu amplifizieren, erhaltenen unterschiedlichen
Amplifikationsprodukte verstanden.
Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform
des Kits gemäß der vorliegenden
Erfindung sind die wenigstens zwei Primerpaare daran angepasst,
in der wenigstens einen PCR eine oder wenigstens zwei zueinander
homologe und/oder nicht homologe Sequenzen zu amplifizieren. Insbesondere
wenn die zueinander homologen und/oder nicht homologen Sequenzen
hochgradig polymorph sind, werden gute Ergebnisse erhalten. Besonders
bevorzugt sind die wenigstens zwei Primerpaare dazu angepasst, aus
der aus STR-Sequenzen, VNTR-Sequenzen, SNP-Sequenzen und beliebigen
Kombinationen hiervon bestehenden Gruppe ausgewählte zueinander homologe und/oder
nicht homologe Sequenzen zu amplifizieren.
In
Weiterbildung des Erfindungsgedankens wird vorgeschlagen, dass die
wenigstens zwei Primerpaare und/oder das Protokoll derart angepasst
sind, dass in der PCR 2 bis 100, besonders bevorzugt 2 bis 20, ganz
besonders bevorzugt 3 bis 15 und höchst bevorzugt 5 bis 12 zueinander
homologe bzw. nicht homologe Sequenzen amplifiziert werden.
Zudem
hat es sich als vorteilhaft erwiesen, die wenigstens zwei Primerpaare
gemäß a) und/oder
das Protokoll gemäß d) daran
anzupassen, dass die relative Häufigkeit
für eine
positive Amplifikationsreaktion der wenigstens einen PCR für jede der
einen oder wenigstens zwei zueinander homologen bzw. nicht homologen Sequenzen
zwischen 0 und 90%, bevorzugt zwischen 20 und 80%, besonders bevorzugt
zwischen 30 und 70%, ganz besonders bevorzugt zwischen 40 und 60%
und höchst
bevorzugt etwa 50% beträgt.
Desweiteren
ist es bevorzugt, dass das Kit das Ergebnis wenigstens einer, unter
den gleichen wie in dem Protokoll gemäß d) vorgeschrieben, durchgeführten Amplifikationsreaktion
enthält,
wobei die Kopienzahl der Referenzprobe so gewählt ist, dass die relative
Häufigkeit
für eine
positive Amplifikationsreaktion der wenigstens einen Amplifikationsreaktion
für die
eine oder jede der wenigstens zwei zueinander homologen Sequenzen
zwischen 20 und 80%, bevorzugt zwischen 30 und 70%, besonders bevorzugt
zwischen 40 und 60% und ganz besonders bevorzugt etwa 50% beträgt.
