WO2007068305A1 - Verfahren zur bestimmung des genotyps aus einer biologischen probe enthaltend nukleinsäuren unterschiedlicher individuen - Google Patents

Verfahren zur bestimmung des genotyps aus einer biologischen probe enthaltend nukleinsäuren unterschiedlicher individuen Download PDF

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biological sample
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homologous
amplification
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Christoph Gauer
Wolfgang Mann
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Advalytix Ag
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification

Definitions

  • the present invention relates to a method for determining the genotype of one or more individuals from a biological sample containing nucleic acids of different individuals, in particular a method for determining the copy number of a predetermined sequence, and a kit for determining the genotype of one or more individuals from a biological Sample containing nucleic acids from different individuals.
  • Method of determining the genotype of individuals from a biological sample i. For example, the detection of the presence or absence of predetermined sequences, such as individual genes or gene segments, or the determination of the quantity of specific nucleic acids are used in many technical fields. For example, applications in forensics, genetic engineering, e.g. in the context of cloning, or medical diagnostics known.
  • One technique often used in forensics, forensics, or paternity and relationship research to characterize the genotype of one or more individuals is to create a genetic fingerprint.
  • two methods are currently used to generate a genetic fingerprint, namely, the RFLP technique (restriction fragment length polymorphism technique) and the VNTR typification (variable numbers oftandem repeats). Typing).
  • RFLP technique restriction fragment length polymorphism technique
  • VNTR typification variable numbers oftandem repeats.
  • typing DNA is first isolated from biological trace material which contains, for example, blood, saliva, hair with roots, sperm or vaginal secretions. After isolation of the DNA from the biological sample, the RFLP method hydrolyzes the DNA into a variety of lengths of DNA using restriction enzymes, before the individual DNA fragments are separated on an agarose gel lengthwise.
  • the individual DNA fragments are transferred from the agarose gel onto a nylon membrane using the known Southern ⁇ / ot method and fixed on the membrane.
  • the nylon membrane is hybridized with specific fluorescently labeled probes to detect specific DNA fragments.
  • the hybridized with the specific probes DNA fragments are visualized, for example, by enzyme reaction to obtain a genetic fingerprint called band pattern. For example, conclusions about the genotype of the individual can be drawn from the relative position of the individual bands by comparison with the corresponding pattern of a reference sample.
  • the RFLP method provides meaningful values only if the initial biological sample contains only DNA of an individual.
  • VNTR typing selected DNA regions from the noncoding region of the genome are first amplified by PCR [polymerase chain reaction] before the amplified DNA fragments are separated, for example on a polyacrylamide gel lengthwise and then visualized. From the length pattern thus obtained, by comparison with the band pattern obtained with a corresponding reference sample, the identity or non-identity of the donor of the reference sample with the individual whose nucleic acid is present in the biological sample can be inferred with a certain probability.
  • a disadvantage of this method is that it is relatively time-consuming, in particular due to the separation of the D NA fragments on a polyacrylamide gel. In addition, this only provides meaningful results if in the examined biological sample only DNA of an individual is included. However, if the initial biological sample contains nucleic acids from different individuals, the VNTR typing as well as the RFLP technique fails.
  • Methods for characterizing the genotype of an individual, in particular for quantifying sequences, for example for quantitative determination of the copy number of nucleic acid sequences are also becoming increasingly important in molecular diagnostics. Since a variety of sometimes severe diseases caused by deviations from the normal copy number of nucleic acid sequences in the genome, can be reliably diagnosed by determining the copy number of certain chromosomes or certain gene sections diseases early in development.
  • trisomy 18 Error's syndrome
  • trisomy 13 Patau syndrome
  • trisomy 21 Down syndrome
  • the copy number of the corresponding chromosome is 18, 13 and 21 per cell, respectively healthy individuals have only two copies of the aforementioned chromosomes per cell.
  • increasing the copy number of the chromosome in question leads to the most severe developmental disorders. While carriers of trisomy 21 are drastically inhibited in their development and sometimes have severe malformations, carriers of trisomy 18 and trisomy 13 usually die within the first year of life.
  • Huntington's disease a progressive neurodegenerative disease characterized by abnormal, involuntary movements with increasing decay of mental and physical abilities, may be mentioned in this context.
  • FISH fluorescence in situ hyb ⁇ dization
  • Any fluorescence signal present indicates the presence of the sequence corresponding to the probe provided with the corresponding fluorescent label, with the intensity of the fluorescence being able to make a conditional inference to the number of sequence copies in the biological sample.
  • a disadvantage of the aforementioned method is that unwanted cross-hybridization leading to incorrect results can never be completely ruled out.
  • this method is relatively expensive, on the one hand because it is imperative to use fluorescent dyes and, on the other hand, because it requires expensive equipment, such as fluorescence microscopes.
  • this method depends to a very considerable extent on the quality of the probes used; Reliable results are only obtained if the probes hybridize with an effectiveness of more than 90% to the corresponding binding sites, so that only 10% of the target sequences are unhybridized and therefore no longer detectable. Finally, when a biological sample containing nucleic acids from different individuals is used, this method does not provide meaningful results.
  • CGH analysis comparative genomic hyb ⁇ dization
  • the nucleic acid of the sample to be analyzed is completely labeled with a dye 1.
  • the same amount of nucleic acid of a reference sample is labeled with a dye 2.
  • Both reactions are hybridized together on a sprouted metaphase chromosome set, wherein Compete the sequences contained in both reactions around the binding sites on the spread chromosomes.
  • a ratio of dye 1 to dye 2 of 1: 1 will be established at all hybridization sites. If the sample to be analyzed contains more copies of a range (more than the usual copy number of the reference), then Dye 1 will predominate at this hybridization site.
  • Another known method for quantifying nucleic acid sequences is the real-time PCR method, in which, for example, a PCR is carried out with fluorescence-labeled primers and the increase in the fluorescence signal is observed as a function of the number of cycles.
  • the threshold PCR cycle (also known as the threshold cycle) is assigned to the reaction time at which the fluorescence signal is significantly different from the background fluorescence and the PCR product formation proceeds exponentially. This correlates with the initial copy number of the DNA sequence to be amplified. In this way, DNA samples can be relatively quantified by comparison with a series of DNA dilutions.
  • the object of the present invention is therefore to provide a method for determining the genotype of one or more individuals from a biological sample which contains nucleic acids of different individuals, which in particular for determining the copy number of a predetermined sequence and homologous sequences, for example the absolute or relative number of alleles in a biological sample, which is also simple and inexpensive to carry out and especially with low amounts of starting material, such as those contained in a forensic sample, provides reliable results.
  • this object is achieved by a method for determining the genotype of one or more individuals from a biological sample which contains nucleic acids of different individuals, in particular a method for determining the copy number of a predetermined sequence, comprising the steps:
  • step a) of the method according to the invention can be carried out in any manner known to the person skilled in the art for this purpose.
  • at least two subsets may be taken from the biological sample, which are subsequently diluted with a mutually different dilution factor. It is equally possible to take two aliquots of the sample and concentrate one sample, whereas the other aliquot is either left undiluted or diluted. Any other method which provides at least two subsets of the biological sample, each with a different concentration of the biological sample, can be used in step a).
  • the method according to the invention comprises, for example, the following steps:
  • step b) a) providing a subset of the biological sample, b) carrying out at least one amplification reaction with the subset of the biological sample, wherein the at least one amplification reaction is adapted to one or at least two zuein- to amplify other homologous and / or non-homologous sequences encompassed by at least one of the nucleic acids contained in the biological sample, c) determining the number of different amplification products obtained for each of the at least one amplification reaction of step b), d) Providing a further subset of the biological sample, diluting the further subset of the biological sample and performing at least one amplification reaction under the same conditions as in step b) with the diluted sample, e) determining the number of different amplification products obtained for each of the at least one amplification reaction from step d), f) comparing the number of different amplification products determined in step c) with the number of different amplification products determined in step e), g) if the number determined in
  • the determination of the genotype of one or more individuals in the context of the present invention means the characterization of at least one predetermined sequence of an individual with regard to presence or absence, copy number or nucleic acid sequence, ie in particular the determination of the absolute or relative number of a predetermined sequence, for example of a genome, a gene or gene segment, and / or the determination of the presence or absence of a predetermined sequence.
  • the term different individual within the meaning of the present invention includes not only - in the case of humans - different persons, but in particular also different cell types of a person, which differ from one another with regard to their genotype.
  • examples of this are genetic mosaics or chimeras, ie cells of different genotype of a person, which are formed by mixing or exchange of different genotypes (chimera) or arise in an individual (genetic mosaic).
  • An example of a genetic mosaic is cancer cells that are caused by LOH ("loss of heterozygosity").
  • homologous sequence in the context of the present invention denotes sequences which have similarity with respect to their nucleotide sequence of at least 70%, preferably at least 80%, more preferably at least 90% and most preferably at least 95%, whereas non-homologous sequences are those which have a correspondingly lower sequence similarity with each other.
  • relative quantitative determination of the number of a predetermined sequence in a biological sample in the sense of the present invention means determining whether a biological sample contains fewer, equal to or more copies of a predetermined sequence than a reference sample and absolute quantitative determination of the number of a predetermined sequence in FIG a sample determining which concrete number of copies of the predetermined sequence are contained in the biological sample.
  • the method according to the invention is suitable not only for biological samples which contain the DNA of an individual but also, in particular, for biological samples which contain nucleic acids from contain at least two different individuals.
  • this is achieved by first carrying out at least one amplification reaction with a subset of the undiluted biological sample, which is adapted to one or at least two homologous and / or non-homologous sequences from at least one of the nucleic acids contained in the biological sample are compared to amplify and the number of different amplification products obtained with the at least one amplification reaction is compared with the number of obtained amplification products of at least one performed under the same conditions amplification reaction with such a diluted subset of the biological sample that in the amplification reaction for the diluted Subset of less amplification products than with the undiluted partial quantity of the biological sample.
  • the principle of the method according to the invention is therefore based on diluting a subset of the biological sample containing nucleic acids of different individuals until at least a part of the theoretically possible amplification products is no longer obtained, wherein the "failing" amplification products usually those of the in the biological sample in the lowest concentration will be present.
  • a heterogeneous DNA mixture such as a sample containing nucleic acids of different individuals, wherein the nucleic acids of the individual individuals in the biological sample are present in different amounts, the sequences of the nucleic acids of the individual individuals are present in different copy numbers.
  • the dilution is so high that with the diluted sample less amplification products are obtained than with the undiluted sample, the individual amplification products are assigned to the individual individuals, of which nucleic acid is contained in the biological starting sample.
  • the amplification products obtained with both the undiluted and the diluted sample are to be assigned to the individual, of which a higher amount of nucleic acid is contained in the biological sample
  • the amplification products obtained with the undiluted biological sample can be combined with the diluted biological sample are no longer obtained, are assigned to the individual, of which there is a smaller amount of DNA in the biological sample.
  • both the victim and the perpetrator are heterozygous with respect to chromosome 18, the theoretically maximum possible number of amplification products for those with a subset of the called amplification reaction in four amplification products, whereby two amplification products for the two alleles of the victim and two amplification products for the two alleles of the offender are obtained. If a subset of the biological sample is now successively diluted, the case occurs that, from a certain dilution factor, in which the concentration of the nucleic acid of the offender in the diluted biological sample falls below a certain minimum concentration, that only the amplification products for the victim's DNA are obtained but not the amplification products for the offender's DNA.
  • the amplification products obtained with the thus diluted partial amount of the biological sample which have, for example, a length of 120 and 130 bp, can be assigned to the individual of whom a larger amount of DNA is contained in the biological sample.
  • those amplification products which were obtained with the amplification reaction carried out on the undiluted subset of the biological sample but not with the amplification reaction carried out on the diluted subset of the biological sample which for example have a length of 125 and 135 bp, belong to the individual. of which a smaller amount of DNA is contained in the biological sample.
  • the individual amplification products can be compared with the amplification products obtained with a PCR performed on a reference sample containing cells of the victim, so that it can be precisely assigned which of the two DNA samples originates from the victim. If, for example, two PCR products with a length of 120 and 130 bp are obtained with the victim's reference sample, it can be inferred from the above-mentioned experiment with a certain probability that in the biology found at the crime scene. see sample DNA of at least two different individuals, with at least one DNA derived from the victim.
  • the experiment allows us to conclude that the DNA present in higher concentrations in the biological sample is attributable to the victim and that the DNA which in the amplification reaction gives two amplification products with a length of 125 and 135 bp is not the victim but attributable to the offender or a third party not involved in the act. Thereafter, the amplification products obtained for the perpetrator or the uninvolved third party can then be further analyzed in a targeted manner in order to conclude, for example by comparison with the data stored in a database, the identity of the offender.
  • a further advantage of the method according to the invention is that it is possible to dispense with a determination of the absolute fluorescence intensity of PCR products, as is absolutely necessary with the methods known in the prior art. Rather, in the process according to the invention, only the numbers of the different amplification products obtained with at least one amplification reaction are determined and compared with each other. In this respect, fluorescence-labeled primers do not necessarily have to be used in the method according to the invention.
  • the inventive method is simple and inexpensive to perform without costly equipment for the qualitative detection of fluorescence.
  • the method according to the invention is suitable for determining the genotype of one or more individuals from a biological sample containing nucleic acids of different individuals, regardless of the specific number of different individuals.
  • the biological sample contains nucleic acids from at least two but less than 10 different individuals. More preferably, the biological sample contains nucleic acids of at least two, but less than five, most preferably of two or three, and most preferably of exactly two different individuals.
  • the present invention is also not limited with regard to the differences in quantity or concentration of the individual nucleic acids with one another.
  • concentration difference between the nucleic acids contained by the individual individuals in the biological sample is between 1: 1000 and 1: 1, more preferably between 1: 500 and 1: 5, and most preferably between 1: 100 and 1:10.
  • the method according to the invention is particularly suitable for forensic examinations, for example in connection with crime investigation.
  • the method of the invention is not limited to this, but can be used for any type of biological sample containing nucleic acids from at least two different individuals.
  • Another particular application of the method according to the invention is, for example, the determination of the genotype of one or more individuals from a biological sample containing maternal, ie maternal, blood and fetal cells. Fetal cells come in maternal blood at a frequency of about 1: 1,000,000. Despite the relatively low number of fetal cells in the maternal blood, the method according to the invention makes it possible to draw conclusions quickly and simply regarding the genotype of the fetus.
  • an amplification reaction which is adapted to amplify, for example, 15 different amplification products from the mother's genome, is first carried out with a subset of the undiluted sample and then a dilution series is established with a further subset of the biological sample, the dilution factor between the individual dilution stages, for example, 1: 2. Subsequently, with each dilution step, an amplification reaction is carried out exactly under the same conditions as with the undiluted sample, and the number of different amplification products obtained is determined for each amplification reaction.
  • Those amplification products which were obtained with the subset of the undiluted biological sample, but not with the diluted subsets of the biological sample, can be assigned to the fetus, whereas the other amplification products, ie those diluted with both the undiluted biological sample and the diluted biological sample obtained from the mother.
  • the amplification products By characterizing the amplification products, it can be determined, for example, whether the fetus suffers from trisomy 21 or is healthy in this respect.
  • the particular advantage of the method according to the invention lies in the fact that this characterization can be carried out from a biological sample which contains both maternal blood and fetal cells without, as is necessary in the prior art, isolating the fetal cells from the maternal blood have to.
  • the method of the invention can be used to characterize LOH ("Lost of heterozygosity") resulting cancer cells from a mixed sample, for example, to typify them.
  • the biological sample contains, for example, a mixture of healthy cells and LOH-derived cancer cells.
  • the method according to the invention is not limited; Rather, all conceivable types of amplification reactions, with which sequence variants can be detected, can be used. Nevertheless, it has proven to be advantageous to carry out a PCR as at least one amplification reaction, since a PCR can be carried out simply, comparatively quickly and with little technical outlay, and any nucleic acid sequences from the biological sample can be amplified by selecting suitable primer pairs.
  • the method according to the invention is intended to determine the genotype of one or more individuals from a biological sample containing nucleic acids from different individuals, it is proposed in a further development of the inventive idea to adapt the at least one amplification reaction to one or at least two mutually homologous and / or non-homologous sequences non-coding DNA region to amplify. It is known that the non-coding DNA region is substantially more polymorphic than the coding DNA region, so that by amplifying sequences from the non-coding DNA region with a relatively high probability individual-specific sequences can be amplified. This is advantageous in both forensic composite samples and in characterizing the genotype of fetal cells from maternal blood containing fetal cells.
  • the at least one amplification reaction has proved to be advantageous to adapt the at least one amplification reaction to one or at least two mutually homologous and / or non-homologous highly polymorphic sequences to amplify.
  • the at least one amplification reaction is adapted to amplify one or at least mutually homologous and / or non-homologous sequences selected from the group consisting of STR sequences, VNTR sequences, SNP sequences and any combination thereof are, good results are obtained.
  • STR or short tandem repeat sequences are highly polymorphic sequences which consist of only two to four bp repeating units and have a high variability between the individual individuals.
  • VNTR variable number of tandem repeat sequences of about 15 to 30 bp in length constructed repetitive DNA sections, the total length of which are determined by the number of repetitions of this basic unit.
  • VNTR sequences are also usually highly polymorphic, ie the number of repeating units varies greatly between the different individuals.
  • SNPs single nucleotide polymorphism
  • SNPs single nucleotide polymorphism
  • SNPs single nucleotide polymorphism
  • the at least one amplification reaction is adapted to amplify one or at least two mutually homologous and / or non-homologous sequences which occur only once in the genome of the donor per each allele.
  • conclusions can be drawn on the individual alleles of an individual, so that, for example, the number of individual alleles of an individual in a biological sample comprising nucleic acids of different individuals can be determined.
  • the at least one amplification reaction is adapted to amplify between 1 and 100, preferably between 2 and 20 and more preferably between 5 and 15 mutually homologous and / or non-homologous sequences.
  • the experimental effort is not too big.
  • step b) or step d) of the method according to the invention a PCR adapted to amplify at least two mutually homologous and / or non-homologous sequences is performed, in which one of the number of at least two mutually homologous and / or or non-homologous sequences corresponding number of primer pairs, which are adapted to amplify the at least two mutually homologous and / or non-homologous sequences, is used.
  • An advantage of this embodiment is that in each case only one PCR is necessary for the amplification reaction carried out with the amplification reaction carried out with the undiluted subset of the biological sample and the amplification reaction carried out with the dilution step (s) of the subset of the biological sample, so that the method can be carried out quickly and without large pipetting - Can be carried out effort.
  • An example of a suitable procedure is a multiplex PCR, although any other amplification reaction in which the one or the at least two mutually homologous and / or non-homologous sequences to be amplified can be amplified simultaneously in one reaction can also be used.
  • step b) or step d) a PCR adapted for the amplification of at least homologous and / or non-homologous sequences is carried out, wherein in step a) one of the number of at least two mutually homologous and / or or non-homologous sequences corresponding number of subsets of the biological sample is provided, each subset containing the same amount of biological material, and in step b) or step d) with each of the subsets of a PCR, in each of which a primer pair is used is carried out, wherein the primer pairs used in the various PCRs are adapted to amplify the at least two mutually homologous and / or non-homologous sequences.
  • both embodiments are also conceivable, for example one in which part of the at least two mutually homologous and / or non-homologous sequences to be amplified in FIG a PCR using at least two primer pairs and the other part of the at least two mutually homologous and / or non-homologous sequences to be amplified, each in separate PCRs, wherein only one primer pair is used in each PCR amplified.
  • the presence or absence of amplification products must first be determined.
  • a second, preferably physically and / or chemically measurable parameter must be determined in order to be able to distinguish the individual amplification products from one another to determine the number of different amplification products obtained.
  • the type of the second parameter which distinguishes the individual PCR products, depends essentially on the nature of the one or at least two mutually homologous and / or non-homologous sequences to be amplified.
  • the second parameter is used or as a second distinguishing feature of the individual PCR products, preferably the length of the individual PCR products, so that the determination of the number of different amplification products obtained on the examination for presence or absence of PCR products and the determination of the length of the comprises individual PCR products, wherein the number of different amplification products obtained corresponds to the number of amplification products of differing length obtained.
  • a suitable method for this is, for example, capillary electrophoresis.
  • the second distinguishing feature or the second parameter is preferably the determination of differing sequence, which is usually restricted to one nucleotide in SNP segments.
  • step b) or step d) it has proven to be advantageous to set the parameters in the at least one amplification reaction according to step b) or step d) such that the relative frequency for a positive amplification reaction for the one or each of the at least two mutually homologous and / or non-homologous sequences are each at least substantially equal.
  • the sequence to be amplified of the nucleic acids of the different individuals contained in the biological sample if they are present in an equal amount, amplified with the same effectiveness, so that from the elimination of an amplification product from a certain dilution It can be reliably concluded that the elimination of the amplification product is due to the fact that the DNA of the corresponding individual in the biological sample is present in a correspondingly smaller amount than that of the other individuals, and the omission is not merely based on the fact that the effectiveness of the Amplification reaction for this amplification product was lower than that for another amplification product even with the same amount of DNA.
  • the binding affinity of the individual PCR primers to their primer binding sites and the other parameters of the PCR, in particular the number of cycles and the temperature control, such that the relative frequency for a positive amplification reaction of the at least one amplification reaction for each of the to be amplified mutually homologous and / or non-homologous sequences between 0.2 and less than 1, preferably between 0.4 and 0.6, and particularly preferably about 0.5.
  • the relative frequency for a positive amplification reaction for the mutually homologous and / or non-homologous sequences to be amplified were 1, it would only be possible to eliminate the amplification products for the nucleic acid present in the biological sample in a low DNA concentration from a relatively high dilution stage observe. Therefore, it is advantageous to set the relative frequency for a positive amplification of the at least one amplification reaction to a value below 1. On the other hand, to prevent the disappearance of the PCR products already observed in the undiluted sample, on the other hand, the relative frequency for a positive amplification reaction should not be too low.
  • the above values for the relative frequency to be set for a positive amplification reaction of the at least one amplification reaction for each of the sequences are not fixed sizes, but in particular depends on the number of used in the PCR start copies. The greater the number of starting copies, the lower the effectiveness of the at least one amplification reaction should be set in order to eliminate the amplification products for the nucleic acid present in low DNA concentration in the biological sample from a relatively low dilution stage. This dependence of the effectiveness to be set on the number of starting copies, ie the number of cells used or the number of copies used, is shown in FIG.
  • control sample in parallel with the at least one amplification reaction according to step b) or step d).
  • the control sample preferably leads to a known number of different amplification products.
  • the dilution factor to be selected for the subset of the biological sample depends, in particular, on the concentration of the nucleic acids in the biological sample and can easily be determined by one skilled in the art within the scope of experiments which are usual in the art. However, it has proven to be advantageous in principle to use the subset of the biological sample in a ratio of between 1: 1 and 1: 1000, preferably between 1: 1 and 1: 100, more preferably between 1: 1 and 1:10 and most preferably between 1: 1 and 1: 2.
  • the characterization of the amplification products it is possible to use all techniques known to the person skilled in the art which permit a conclusion as to the genotype of the corresponding individual.
  • the characterization of the amplification products may include determining the relative number of one or more alleles of a predetermined sequence.
  • any method known to the person skilled in the art for this purpose can be used. For example, this can be done by carrying out at least one amplification reaction under the same conditions as in step b) of the method according to the invention with a reference sample and the number of different amplification products obtained with this at least one amplification reaction with the reference sample with the number of only part of the Aliquots of amplification products obtained is compared.
  • the reference sample has a known genotype; For this, it is sufficient, for example, to know whether the individual from whom the reference sample was taken is a healthy or ill individual with regard to the predetermined sequence on which the allele to be determined is present. But just as well, the copy number of the predetermined sequence of the reference sample can be known.
  • the reference sample in the at least one amplification reaction is used an equal amount of DNA as in the at least one amplification reaction according to step b) of the method according to the invention. To ensure this, it may be necessary, for example, to determine the DNA concentration in the biological sample, possibly after a nonspecific PCR for the propagation of the material.
  • the relative number of alleles By reducing the number of only part of the Amounts obtained different amplification products, ie, for the individual, which is contained in the biological sample, the larger amount of DNA, with the corresponding number of different amplification products obtained for a reference sample with the same amplification reaction, the relative number of alleles a predetermined Sequence, provided that in the at least one amplification reaction corresponding primer pairs which are adapted to amplify the alleles encompassed by the predetermined sequence were used.
  • step b) it is also possible to carry out at least one amplification reaction under the same conditions as in step b) with a reference sample to characterize the amplification products and the number of different amplification products obtained with this at least one amplification reaction with the number of different obtained for all subsets Compare amplification products.
  • the inventive concept it is proposed to compare the number of different amplification products obtained for only a portion of the subsets and / or the number of different amplification products intended for all subsets of the biological sample with at least one frequency distribution for the characterization of the amplification products, the frequency distribution eg. by carrying out the same and the same reaction conditions separately as in step b).
  • at least one amplification reaction wherein in the at least one amplification reaction the same amount of starting material as in step a) was used with at least two different reference samples, the at least two different reference samples each having a known, mutually different copy number of the predetermined sequence, and then determining the number of different amplification products obtained per reference sample was / is obtained.
  • a particularly reliable determination of the relative or even absolute number of alleles of a predetermined sequence in each of the individuals of which nucleic acids are contained in the biological sample is possible.
  • multiple determination of the PCR can also be carried out with one or more dilution stages of the biological sample in order to determine, for example, the relative or absolute number of the predetermined sequence from the comparison of the average of the numbers of different amplification products obtained in the individual determinations to close in the biological sample. It is equally possible to carry out a multiple determination of the PCR with one or more dilution stages of the biological sample and to compare the mean value of the number of a specific, for example allele-specific amplification product obtained with the mean of the number of another specific, for example allele-specific amplification product obtained.
  • a five-fold determination of a PCR can be carried out for the dilution stages 1: 5 and 1:10 of a biological sample, wherein the primer pairs used in the PCR are adapted to amplify at least one allele-specific sequence. If, for example, 2 amplification products are obtained with the PCR for the allele-specific primer pair for one individual, the two amplification products appear equally frequently at the individual dilution stages, for example 0.5 times in each case at the dilution stage 1: 5 and 0 times on average at the dilution stage 1:10, a biallelic disomy can be concluded.
  • Amplification product 1 at the dilution stage 1: 10 for the first time is no longer obtained, whereas amplification product 2 already at the dilution level of 1: 5 is no longer obtained, this indicates a biallelic trisomy.
  • the number of multiple determinations is between 2 and 1,000, more preferably between 3 and 100, most preferably between 4 and 15, and most preferably between 5 and 10.
  • a further subject of the present invention is a kit for determining the genotype of one or more individuals from a biological sample which contains nucleic acids of different individuals, in particular for carrying out the aforementioned method comprising:
  • At least one primer pair which are adapted, in at least one PCR, one or at least two mutually homologous bi) a reference sample with a known genotype and preferably with a copy number known with respect to a predetermined sequence and / or b2) the result at least one amplification reaction with a reference sample performed under the same conditions as prescribed in the protocol according to d), the reaction conditions being such that the at least one amplification product was formed with a probability of between 20% and less than 100% , and / or b) at least one frequency distribution, which by separately carrying out the same and under the same reaction conditions as in the protocol d) prescribed at least one amplification reaction with at least two different reference samples, wherein the at least two different reference sample n each have a known, mutually different copy number of a predetermined sequence, and subsequent determination of the number of different amplification products obtained per reference sample was obtained, and c) optionally PCR buffer and d) a protocol for performing the at least one PCR in a) and, if appropriate
  • the kit contains a reference sample bi) with a known genotype, and preferably with one known with respect to a predetermined sequence Copy number.
  • the amplification products can be characterized by comparing the number of amplification products obtained for one of the subsamples of the biological sample with the number of amplification products in the process of the invention for the reference sample in the at least one amplification reaction obtained different amplification products on the relative copy number of the predetermined sequence in the nucleic acid contained in the biological sample of an individual are concluded.
  • At least two different subsets of different concentrations of at least two under the same conditions as the subsets of the biological sample to be examined are subjected to at least one amplification reaction, even the absolute copy number of the predetermined sequence in the nucleic acid of an individual contained in the biological sample may be subjected to at least one reference sample getting closed.
  • the kit of the invention can produce the result b 2) of at least one amplification reaction carried out under the same as prescribed in the protocol according to d), with the reaction conditions chosen were that the at least one amplification product was formed with a probability between 20% and less than 100%, and / or contain at least one frequency distribution b ⁇ ), which by separately carrying out the same and under the same reaction conditions as described in the protocol d ) prescribed at least one amplification reaction with at least two different Re. samples, wherein the at least two different reference samples each have a known, mutually different copy number of a have been matched sequence, and then determining the number of different amplification products obtained per reference sample was obtained.
  • the determination of the relative copy number of a predetermined sequence in the nucleic acid of an individual contained in the biological sample a corresponding comparison with the frequency distribution according to b ⁇ ) allows the determination of the absolute copy number of a predetermined sequence in the nucleic acid of an individual contained in the biological sample.
  • the at least one primer pair is adapted in the at least one PCR to one or at least two mutually homologous and / or non-homologous sequences from the non-coding DNA region, preferably highly polymorphic to each other homologous and / or non-homologous sequences, most preferably selected from the group consisting of STR sequences, VNTR sequences, SNP sequences, and any combinations thereof.
  • the at least one primer pair according to a) and / or the protocol according to d) of the kit according to the invention in the at least one PCR between 1 and 100, preferably between 2 and 20 and particularly preferably between 5 and 15 mutually homologous and / or non-homologous sequences to amplify.
  • the present invention is explained by means of these illustrative but non-limiting examples:
  • the genotype of fetal cells present in maternal blood is to be determined.
  • Fetal cells occur in maternal blood at a rate of about 1: 1,000,000. Fetal cells can be accumulated in maternal blood by various methods. For example, magnetic beads with specific antibodies can be used for fetal cells or cell sorters that recognize and separate the fetal cells using membrane proteins. In this way, the fetal cells in the maternal blood can be enriched to a ratio of 1: 1000.
  • a concentrated sample it is to be determined on the basis of such a concentrated sample whether the fetus is affected by a trisomy 21 or not.
  • a cell sorter experiment it is known from a cell sorter experiment that about 10,000 cells are found in the sample.
  • a dropout ie a non-amplification of the amplification products encompassed by the primer pairs used, occurs when two copies of the chromosome 21 less than 10 cells are used per cell in the PCR or less than 7 cells are used in the PCR for 3 copies of the chromosome 21 per cell.
  • a subset of a concentrated mixed sample containing fetal cells and maternal blood in a ratio of 1: 1000 was subjected to PCR with a primer pair, the primer pair being adapted to amplify one STR sequence of chromosome 21, respectively.
  • an amplification product for a healthy individual homozygous for chromosome 21, an amplification product, for a healthy, heterozygous individual for chromosome 21, two amplification products, for an individual with monoallelic trisomy, an amplification product, for an individual with biallelic trisomy, two amplification products and for one individual triallelic trisomy expected three amplification products.
  • the amplification products of length 132 bp and 144 bp are obtained to a dilution level of 1: 1000 and 1: 500, respectively, whereas the other two amplification products are obtained.
  • products with a length of 136 bp and 156 bp already at a dilution stage of 1: 5 or 1: 7 fail. It follows that the 136-bp and 156-bp alleles are attributable to the fetus as they fail at much lower dilutions than the two other alleles of 132-bp and 144-bp. This result can be verified by comparison with maternal tissue cells.
  • the 156 bp allele at a given dilution step has a significantly higher probability of dropouts, i. Failures of the expected amplification product show as the allele of length 136 bp. From this it can be concluded with a certain probability that the allele with the length 136 bp with two copies per cell and the allele with the length 156 bp occurs in one copy per cell. If both alleles occur with the same number of copies per cell, then the dropouts should also be equally frequent at the same dilution.
  • the above experiments allow statements about the relative number of alleles of an individual from a biological sample containing nucleic acids from two different individuals.
  • a biallelic trisomy 21 was diagnosed for the fetus.
  • the safety of the statements made in the above experiment could be increased if more than two primer pairs were used in the amplification reaction.
  • the 136 bp, 156 bp and 160 bp amplification products precipitate at a lower dilution level than the corresponding 132 bp and 144 bp amplification products. It follows that the first three amplification products are attributable to the fetal cells present in the biological sample in a smaller amount, whereas the latter two amplification products are attributable to the mother. Since three amplification products were obtained for the undiluted sample for the fetus, whereas only two amplification products were obtained for the mother, it can be said with a high probability that the fetus suffers from triallelic trisomy of chromosome 21.
  • a mixed forensic sample namely a biological sample seized at a crime scene for a violent crime containing nucleic acids from different individuals, is to be characterized.
  • an amplification reaction was carried out with different dilution stages of the biological sample, the following result being obtained:
  • nucleic acid from a third individual is still present in the biological sample, since then two individuals only have one allele would be present in the sample. This is very unlikely.
  • the nucleic acids of the two individuals can now be further characterized as described above.
  • a biological sample which besides maternal blood may also contain fetal cells, for example in the case of a pregnant woman, contains such fetal cells and, if present, is the ratio of maternal to fetal cells.
  • the determination of the relative cell number of fetal cells in maternal blood is not or, if at all, only poorly possible according to the method known from the prior art and PCR, since fetal cells in maternal blood are only at a frequency of 1 to 1 ml - Hon cells occur.
  • more than 1 ⁇ g of maternal blood must be used in the PCR in the methods known from the prior art in order to obtain an evaluable result at all.
  • a PCR with such high DNA output amounts no longer optimally, so that only an inaccurate result is obtained.
  • All I-1 Allele 1 from cell type I (fetal cells)
  • Allele II-2 Allele 2 from cell type II (maternal cells)
  • the fetal and / or maternal cells can now be further characterized as previously described.
  • the table shows that allele 1-2 was obtained at all dilution levels, whereas allele I-1 was only amplified to a 1:16 dilution level. This shows that there are more copies of the allele 1-2 than the allele I-1 in the biological sample. From this it can be concluded with a certain probability that the biological sample is a mixed sample containing both healthy I heterozygous cells and LOH-derived cancer cells that are homozygous for allele I only.
  • the biological sample contains two different cell types, one of which contains two alleles of the D85522 gene (the two lower bands in lane "N"), whereas the other cell type contains only one of the two alleles of the D85522 gene contains (the lower band in the track "T").
  • Bands are "conformational bands" that arise from alternatively folded sequences from each allele.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung des Genotyps eines oder mehrerer Individuen aus einer biologischen Probe, welche Nukleinsäuren unterschiedlicher Individuen enthält, insbesondere ein Verfahren zur Bestimmung der Kopienzahl einer vorbestimmten Sequenz, bei dem zunächst mit wenigstens zwei Teilmengen der biologischen Probe unterschiedlicher Konzentration jeweils wenigstens eine Amplifikationsreaktion durchgeführt wird, anschließend die Anzahl der für jede der wenigstens zwei Teilmengen erhaltenen unterschiedlichen Amplifikationsprodukte bestimmt und miteinander verglichen wird und schließlich die Amplifikationsprodukte, welche nur für eine bestimmte Teilmenge erhalten wurden und/ oder diejenigen Amplifikationsprodukte, die für alle Teilmengen erhalten wurden, charakterisiert werden. Desweiteren betrifft die vorliegende Erfindung ein Kit zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens.

Description

Verfahren zur Bestimmung des Genotyps aus einer biologischen Probe enthaltend Nukleinsäuren unterschiedlicher Individuen
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung des Genotyps einer oder mehrerer Individuen aus einer biologischen Probe, welche Nukleinsäuren unterschiedlicher Individuen enthält, insbesondere ein Verfahren zur Bestimmung der Kopienzahl einer vorbestimmten Sequenz, sowie ein Kit zur Bestimmung des Genotyps eines oder mehrerer Individuen aus einer biologischen Probe enthaltend Nukleinsäuren unterschiedlicher Individuen.
Verfahren zur Bestimmung des Genotyps von Individuen aus einer biologischen Probe, d.h. bspw. der Nachweis des Vorliegens bzw. der Abwesenheit vorbestimmter Sequenzen, wie beispielsweise einzelner Gene oder Genabschnitte, oder die Bestimmung der Quantität spezifischer Nukleinsäuren, werden in vielen technischen Gebieten eingesetzt. Lediglich beispielsweise seien Anwendungen in der Forensik, der Gentechnik, z.B. im Rahmen von Klonierungen, oder der medizinische Diagnostik bekannt.
Eine häufig in der Kriminalistik, Forensik oder bei Vaterschafts- und Verwandtschaftsermittlungen eingesetzte Technik zur Charakterisierung des Genotyps eines oder mehrerer Individuen ist die Erstellung eines genetischen Fingerabdrucks. Zur Erstellung eines genetischen Fingerabdrucks werden heute insbesondere zwei Verfahren herangezogen, nämlich zum einen die RFLP-Technik (Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus- Technik) sowie die VNTR-Typisierung (variable numbers oftandem repeats- Typisierung) . Bei beiden Verfahren wird zunächst aus biologischem Spurenmaterial, welches beispielsweise Blut, Speichel, Haare mit Wurzel, Sperma oder Vaginalsekret enthält, DNA isoliert. Nach der Isolierung der DNA aus der biologischen Probe wird bei dem RFLP- Verfahren die DNA mit Hilfe von Restriktionsenzymen in eine Vielzahl unterschiedlich langer DNA-Stücke hydrolysiert, bevor die einzelnen DNA-Fragmente auf einem Agarosegel ihrer Länge nach aufgetrennt werden. Anschließend werden die einzelnen DNA-Fragmente mit Hilfe der bekannten Southern ß/ot-Methode aus dem Agarosegel auf eine Nylonmembran transferiert und auf der Membran fixiert. Anschließend wird die Nylonmembran mit spezifischen, fluoreszenzmarkierten Sonden hybridisiert, um spezifische DNA- Fragmente nachzuweisen. Abschließend werden die mit den spezifischen Sonden hybridisierten DNA-Fragmente beispielsweise durch Enzymreaktion visualisiert, um ein genetischen Fingerabdruck genanntes Bandenmuster zu erhalten. Aus der relativen Lage der einzelnen Banden können bspw. durch Vergleich mit dem entsprechenden Muster einer Referenzprobe Rückschlüsse auf den Genotyp des Individuums gezogen werden. Allerdings werden zur Durchführung der RFLP-Technik sehr große Mengen an DNA benötigt, so dass dieses Verfahren heute nur noch bei Vaterschafts- oder Verwandtschaftsbestimmungen lebender Personen zum Einsatz kommt, da nur bei diesen Anwendungen ausreichend viel DNA zur Verfügung steht. Für forensische Verfahren, wie beispielsweise die Aufklärung von Gewaltverbrechen, bei denen oftmals nur sehr kleine Spuren von DNA zur Verfügung stehen, ist das RFLP- Verfahren jedoch nicht geeignet. Zudem liefert das RFLP- Verfahren nur dann aussagekräftige Werte, wenn die biologische Ausgangsprobe nur DNA eines Individuums enthält.
Bei der VNTR-Typisierung werden zunächst ausgewählte DNA-Bereiche aus dem nicht-kodierenden Bereich des Genoms durch PCR [polymerase chain reaction bzw. Polymerasekettenreaktion) vervielfältigt, bevor die amplifizierten DNA-Fragmente beispielsweise auf einem Polyacrylamid-Gel der Länge nach aufgetrennt und anschließend visualisiert werden. Aus dem so erhaltenen Längenmuster kann durch Vergleich mit dem mit einer entsprechenden Referenzprobe erhaltenen Bandenmuster mit einer gewissen Wahrscheinlichkeit auf die Identität bzw. Nicht-Identität des Spenders der Referenzprobe mit dem Individuum, dessen Nukleinsäure in der biologischen Probe vorhanden ist, geschlossen werden. Ein Nachteil dieses Verfahrens ist jedoch, dass dieses insbesondere aufgrund der Auftrennung der D NA- Fragmente auf einem Polyacrylamid-Gel relativ zeitaufwändig ist. Zudem liefert dieses nur dann aussagekräftige Ergebnisse, wenn in der untersuchten biologischen Probe nur DNA eines Individuums enthalten ist. Enthält die biologische Ausgangsprobe jedoch Nukleinsäuren verschiedener Individuen, versagt die VNTR-Typisierung ebenso wie die RFLP-Technik.
Auch in der molekularen Diagnostik gewinnen Verfahren zur Charakterisierung des Genotyps eines Individuums, insbesondere zum Quantifizieren von Sequenzen, bspw. zur quantitativen Bestimmung der Kopienzahl von Nukleinsäuresequenzen, eine immer bedeutendere Rolle. Da eine Vielzahl von zum Teil schweren Erkrankungen durch Abweichungen von der normalen Kopienzahl von Nukleinsäuresequenzen im Genom verursacht werden, lassen sich durch eine Bestimmung der Kopienzahl bestimmter Chromosomen oder bestimmter Genabschnitte entsprechende Krankheiten schon im Frühstadium der Entwicklung zuverlässig diagnostizieren.
Beispiele für zum Teil schwere Anomalien, welche auf eine erhöhte Kopienzahl ganzer Chromosomen zurückzuführen sind, sind die Trisomie 18 (Edward's Syndrom), Trisomie 13 (Patau- Syndrom) sowie Trisomie 21 (Down- Syndrom). Bei jeder dieser Krankheiten beträgt die Kopienzahl des entsprechenden Chromosoms 18, 13 bzw. 21 pro Zelle drei, wohingegen gesunde Individuen lediglich zwei Kopien der vorgenannten Chromosomen pro Zelle aufweisen. In allen drei Fällen führt die Erhöhung der Kopienzahl des betreffenden Chromosoms zu schwersten Entwicklungsstörungen. Während Träger der Trisomie 21 in ihrer Entwicklung drastisch gehemmt sind und teilweise schwere Fehlbildungen aufweisen, versterben die Träger der Trisomie 18 und Trisomie 13 meistens innerhalb des ersten Lebensjahres.
Neben Krankheiten, welche auf eine erhöhte Kopienzahl ganzer Chromosomen zurückzuführen sind, ist auch eine Vielzahl von Erkrankungen bekannt, welche auf einer veränderte Kopienzahl von Genen oder Genabschnitten beruhen. Lediglich beispielsweise sei in diesem Zusammenhang die Huntington-Krankheit, eine progressiv verlaufende neurodegenerative Erkrankung gekennzeichnet durch abnormale, unwillkürliche Bewegungen bei zunehmendem Verfall der geistigen und körperlichen Fähigkeiten, genannt.
Aufgrund des Bedarfs an Verfahren zur Quantifizierung von Sequenzkopien in einer biologischen Probe wurde in der Vergangenheit eine Vielzahl entsprechender Verfahren vorgeschlagen.
Eines der grundlegenden Quantifizierungsverfahren, welches zumindest eine Aussage über die An- oder Abwesenheit von Nukleinsäuresequenzen und abhängig von der Verfahrensführung auch einen bedingten Rück- schluss auf die Kopienzahl der betreffenden Nukleinsäuresequenzen pro Zelle erlaubt, ist das so genannte FISH-Verfahren {fluorescence in situ hybήdization). Bei diesem Verfahren wird die zu untersuchende biologische Probe nach entsprechender Vorbehandlung mit einer oder mehreren verschiedenen Sonden, welche zuvor mit jeweils unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen markiert wurden, unter Bedingungen inkubiert, welche eine Hybridisierung der Sonden mit dazu homologen Sequenzen in der biologischen Probe ermöglichen. Nach der Hybridisierung werden die Proben gewaschen, wobei unspezifische Hybridisierungssignale eliminiert werden. Abschließend werden die Fluoreszenzsignale des Präparats mit einem Fluoreszenzmikroskop ausgewertet. Jedes vorhandene Fluoreszenzsignal weist auf die Anwesenheit der der mit dem entsprechenden Fluo- reszenzmarker versehenen Sonde entsprechenden Sequenz hin, wobei die Intensität der Fluoreszenz einen bedingten Rückschluss auf die Anzahl der Sequenzkopien in der biologischen Probe zulassen kann. Ein Nachteil des vorgenannten Verfahrens liegt darin, dass eine unerwünschte und zu falschen Ergebnissen führende Kreuzhybridisierung niemals vollständig ausgeschlossen werden kann. Zudem ist dieses Verfahren vergleichsweise teuer, zum einen weil zwingend Fluoreszenzfarbstoffe eingesetzt werden müssen, und zum anderen, weil es aufwändige Apparaturen, wie Fluoreszenzmikroskope, benötigt. Ferner hängt die Aussagekraft dieses Verfahrens in ganz erheblichem Maße von der Qualität der eingesetzten Sonden ab; zuverlässige Ergebnisse werden nur erhalten, wenn die Sonden mit einer Effektivität von mehr als 90 % an die dazu korrespondierenden Bindungsstellen hybridisieren, so dass nur noch 10% der Zielsequenzen un- hybridisiert vorliegen und demzufolge nicht mehr detektiert werden. Schließlich liefert dieses Verfahren, wenn eine biologische Probe eingesetzt wird, welche Nukleinsäuren von verschiedenen Individuen enthält, keine aussagekräftigen Ergebnisse.
Ein anderes fluoreszenzbasierendes Verfahren ist die CGH-Analyse (com- parative genomic hybήdization). Bei diesem Verfahren wird die Nukleinsäure der zu analysierenden Probe komplett mit einem Farbstoff 1 markiert. Die gleiche Menge an Nukleinsäuren einer Referenzprobe wird mit einem Farbstoff 2 markiert. Beide Reaktionsansätze werden gemeinsam auf einem gespreiteten Metaphasechromosomensatz hybridisiert, wobei die in beiden Reaktionsansätzen enthaltenen Sequenzen um die Bindungsstellen an den gespreiteten Chromosomen kompetieren. Im Wesentlichen wird sich an allen Hybridisierungsstellen ein Verhältnis von Farbstoff 1 zu Farbstoff 2 von 1: 1 einstellen. Enthält die zu analysierende Probe mehr Kopien eines Bereiches (mehr als die gewöhnliche Kopienzahl der Referenz), so wird der Farbstoff 1 an dieser Hybridisierungsstelle überwiegen. Im Falle einer DeIe tion in der zu untersuchenden Probe wird man nur den Farbstoff 2 an dieser Hybridisierungsstelle detektieren. Die Referenzmessung erlaubt eine relative Aussage über die Häufigkeit von Sequenzen in der zu analysierenden Probe. Das Verfahren ist aufwendig und teuer, da die benötigten technischen Geräte sehr genau eingestellt und/ oder kalibriert werden müssen; es werden zwei Farben zur unterschiedlichen Markierung benötigt und die Standardisierung dieser Experimente ist zeitaufwendig und schwierig. Zudem liefert dieses Verfahren, wenn eine biologische Probe eingesetzt wird, welche Nukleinsäuren von verschiedenen Individuen enthält, keine auswertbaren Ergebnisse.
Ein weiteres bekanntes Verfahren zur Quantifizierung von Nukleinsäure- sequenzen ist die Real-Time-PCR-Methode, bei der bspw. eine PCR mit fluoreszenzmarkierten Primern durchgeführt wird und die Zunahme des Fluoreszenzsignals in Abhängigkeit von der Zyklenzahl beobachtet wird. Der Schwellenwert-PCR-Zyklus (auch Threshold-Cycle) wird dem Reaktionszeitpunkt zugeordnet, bei dem sich das Fluoreszenzsignal signifikant von der Hintergrundfluoreszenz abhebt und die PCR-Produktbildung exponen- tiell verläuft. Dieser korreliert mit der Anfangskopienzahl der zu vermehrenden DNA-Sequenz. Auf diese Weise lassen sich DNA-Proben anhand des Vergleichs mit einer DNA- Verdünnungsreihe relativ quantifizieren. Ein Nachteil dieses Verfahrens liegt jedoch darin, dass die Menge an Ausgangsmaterial nicht beliebig verkleinert werden kann, da mit wenigen Startmolekülen, beispielsweise 10 bis 100 Kopien, als Ausgangsmaterial der stochastische Fehler aufgrund der exponentiellen Amplifϊkation sehr groß wird, was keine quantitative Aussagen mehr zulässt. Des weiteren erfordert auch dieses Verfahren aufwändige und teure Apparaturen zur Messung der Fluoreszenzintensität. Schließlich versagt auch dieses Verfahren, wenn eine biologische Probe eingesetzt wird, welche Nukleinsäuren von verschiedenen Individuen enthält.
Alle vorgenannten Verfahren basieren auf dem Einsatz von Fluoreszenzfarbstoffen und erfordern teure Apparaturen zur Bestimmung der Fluoreszenzintensität. Zudem erfordern diese den Einsatz einer Mindestmenge an Ausgangsmaterial, um zumindest einigermaßen zuverlässige Ergebnisse zu erhalten. Zudem ist keines der vorgenannten Verfahren dazu geeignet, den Genotyp eines Individuums aus einer biologischen Probe zu bestimmen, welche Nukleinsäuren unterschiedlicher Individuen enthält.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein Verfahren zur Bestimmung des Genotyps eines oder mehrerer Individuen aus einer biologischen Probe, welche Nukleinsäuren unterschiedlicher Individuen enthält, bereitzustellen, welches insbesondere zur Bestimmung der Kopienzahl einer vorbestimmten Sequenz und von dazu homologen Sequenzen, beispielsweise der absoluten oder relativen Anzahl von Allelen in einer biologischen Probe, geeignet ist, welches zudem einfach sowie kostengünstig durchführbar ist und insbesondere auch mit geringen Mengen an Ausgangsmaterial, wie sie bspw. in einer forensischen Probe enthalten sind, zuverlässige Ergebnisse liefert.
Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe gelöst durch ein Verfahren zur Bestimmung des Genotyps eines oder mehrerer Individuen aus einer biologischen Probe, welche Nukleinsäuren unterschiedlicher Individuen enthält, insbesondere ein Verfahren zur Bestimmung der Kopienzahl einer vorbestimmten Sequenz, umfassend die Schritte:
a) Bereitstellen von wenigstens zwei Teilmengen der biologischen Probe mit jeweils unterschiedlicher Konzentration an der biologischen Probe, b) Durchführen von jeweils wenigstens einer Amplifikationsreaktion mit jeder der in Schritt a) bereitgestellten Teilmengen der biologischen Probe, wobei die wenigstens eine Amplifikationsreaktion daran angepasst ist, eine oder wenigstens zwei zueinander homologe und /oder nicht homologe Sequenzen, die von wenigstens einer der in der biologischen Probe enthaltenen Nukleinsäuren umfasst sind, zu amplifizieren, c) Bestimmen der für jede der wenigstens zwei Teilmengen mit der jeweils wenigstens einen Amplifikationsreaktion gemäß Schritt b) erhaltenen Anzahl an unterschiedlichen Amplifikationsprodukten und Vergleichen der erhaltenen Zahlen, d) wenn die in Schritt c) bestimmte Anzahl an erhaltenen unterschiedlichen Amplifikationsprodukten für jede der wenigstens zwei Teilmengen gleich ist: Bereitstellen wenigstens einer weiteren Teilmenge der biologischen Probe mit jeweils anderer Konzentration als die in Schritt a) bereitgestellten Teilmengen und Wiederholen der Schritte b) und c) und ggf. d) solange, bis in Schritt c) für wenigstens eine Teilmenge eine andere Anzahl an unterschiedlichen Amplifikationsprodukten erhalten wird als für die anderen Teilmengen, e) Charakterisierung der Amplifikationsprodukte, welche mit der wenigstens einen Teilmenge, für die in der wenigstens einen Amplifikationsreaktion eine andere Anzahl an unterschiedlichen Amplifikationsprodukten erhalten wurde als für die anderen Teilmengen, erhalten wurden und/ oder Charakterisierung der Amplifikationspro- dukte, welche sowohl für die wenigstens eine Teilmenge, für die in der wenigstens einen Amplifikationsreaktion eine andere Anzahl an unterschiedlichen Amplifikationsprodukten erhalten wurde als für die anderen Teilmengen, als auch für die anderen Teilmengen erhalten wurden.
Die Bereitstellung der wenigstens zwei Teilmengen der biologischen Probe mit jeweils unterschiedlicher Konzentration an der biologischen Probe gemäß Schritt a) des erfindungsgemäßen Verfahrens kann auf jede dem Fachmann zu diesem Zweck bekannte Weise erfolgen. Beispielsweise können der biologischen Probe zur Bereitstellen der wenigstens zwei Teilmengen beispielsweise wenigstens zwei Teilmengen entnommen werden, welche anschließend mit einem voneinander verschiedenen Verdünnungsfaktor verdünnt werden. Genauso gut ist es möglich, zwei Teilmengen der Probe zu entnehmen und eine Probe aufzukonzentrieren, wohingegen die andere Teilmenge entweder unverdünnt belassen wird oder verdünnt wird. Auch jede andere Methode, welche wenigstens zwei Teilmengen der biologischen Probe mit jeweils unterschiedlicher Konzentration an der biologischen Probe bereitstellt, kann in Schritt a) eingesetzt werden.
Für den zuerst skizzierten Fall, dass in Schritt a) wenigstens zwei Teilmengen entnommen werden, welche anschließend mit einem voneinander verschiedenen Verdünnungsfaktor verdünnt werden, umfasst das erfindungsgemäße Verfahren beispielsweise die folgenden Schritte:
a) Bereitstellen einer Teilmenge der biologischen Probe, b) Durchführen wenigstens einer Amplifikationsreaktion mit der Teilmenge der biologischen Probe, wobei die wenigstens eine Amplifikationsreaktion daran angepasst ist, eine oder wenigstens zwei zuein- ander homologe und/ oder nicht homologe Sequenzen, die von wenigstens einer der in der biologischen Probe enthaltenen Nukleinsäuren umfasst sind, zu amplifϊzieren, c) Bestimmen der Anzahl der erhaltenen unterschiedlichen Amplifika- tionsprodukte für jede der wenigstens einen Amplifikationsreaktion von Schritt b), d) Bereitstellen einer weiteren Teilmenge der biologischen Probe, Verdünnen der weiteren Teilmenge der biologischen Probe und Durchführen wenigstens einer Amplifikationsreaktion unter denselben Bedingungen wie in Schritt b) mit der verdünnten Probe, e) Bestimmen der Anzahl der erhaltenen unterschiedlichen Amplifika- tionsprodukte für jede der wenigstens einen Amplifikationsreaktion von Schritt d), f) Vergleichen der in Schritt c) bestimmten Anzahl an unterschiedlichen Amplifikationsprodukten mit der in Schritt e) bestimmten Anzahl an unterschiedlichen Amplifikationsprodukten, g) wenn die in Schritt c) bestimmte Anzahl gleich der in Schritt e) bestimmten Anzahl ist: Wiederholen der Schritte d) bis f) mit einem höheren Verdünnungsfaktor der biologischen Probe solange, bis in Schritt e) eine geringere Anzahl an unterschiedlichen Amplifikationsprodukten erhalten wird als in Schritt c), h) Charakterisierung der Amplifikationsprodukte, welche bei der wenigstens einen Amplifikationsreaktion gemäß Schritt b), nicht aber bei der wenigstens einen Amplifikationsreaktion gemäß Schritt d) mit einem Verdünnungsfaktor, bei dem in Schritt e) eine geringere Anzahl an unterschiedlichen Amplifikationsprodukten als in Schritt c) erhalten wurde, erhalten wurden und/ oder Charakterisierung der Amplifikationsprodukte, welche sowohl bei der wenigstens einen Amplifikationsreaktion gemäß Schritt b) als auch bei der wenigstens einen Amplifikationsreaktion gemäß Schritt d) mit einem Verdün- nungsfaktor, bei dem in Schritt e) eine geringere Anzahl an unterschiedlichen Amplifikationsprodukten als in Schritt c) erhalten wurde, erhalten wurden.
Unter Bestimmung des Genotyps einer oder mehrerer Individuen im Sinne der vorliegenden Erfindung wird die Charakterisierung wenigstens einer vorbestimmten Sequenz eines Individuums hinsichtlich An- oder Abwesenheit, Kopienzahl oder Nukleinsäuresequenz verstanden, also insbesondere die Bestimmung der absoluten oder relativen Anzahl einer vorbestimmten Sequenz, beispielsweise eines Genoms, eines Gens oder eines Genabschnitts, und/ oder die Bestimmung der Anwesenheit oder Abwesenheit einer vorbestimmten Sequenz.
Desweiteren umfasst der Begriff unterschiedliches Individuum im Sinne der vorliegenden Erfindung nicht nur - im Falle von Menschen - unterschiedliche Personen, sondern insbesondere auch verschiedene Zelltypen einer Person, welche sich voneinander hinsichtlich ihres Genotyps unterscheiden. Beispiele hierfür sind genetische Mosaike oder Chimären, also Zellen unterschiedlichen Genotyps einer Person, die sich durch Vermischung oder Austausch unterschiedlicher Genotypen erst bilden (Chimäre) oder in einem Individuum entstehen (genetisches Mosaik). Beispiel für ein genetisches Mosaik sind Krebszellen, die durch LOH ("Loss ofhetero- zygosity") entstehen.
Zudem bezeichnet der Begriff homologe Sequenz im Sinne der vorliegenden Erfindung Sequenzen, welche untereinander eine Ähnlichkeit bezüglich deren Nukleotidsequenz von wenigstens 70 %, bevorzugt wenigstens 80 %, besonders bevorzugt wenigstens 90 % und ganz besonders bevorzugt wenigstens 95 % aufweisen, wohingegen nicht homologe Sequenzen solche sind, welche untereinander eine entsprechend geringere Sequenzähnlichkeit aufweisen.
Ferner bedeutet relative quantitative Bestimmung der Anzahl einer vorbestimmten Sequenz in einer biologischen Probe im Sinne der vorliegenden Erfindung die Bestimmung, ob eine biologische Probe weniger, gleich viel oder mehr Kopien einer vorbestimmten Sequenz enthält als eine Referenzprobe und absolute quantitative Bestimmung der Anzahl einer vorbestimmten Sequenz in einer Probe die Bestimmung, welche konkrete Anzahl an Kopien der vorbestimmten Sequenz in der biologischen Probe enthalten sind.
Im Unterschied zu dem aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren zur Bestimmung des Genotyps eines Individuums aus einer biologischen Probe ist das erfindungsgemäße Verfahren nicht nur für biologische Proben, welche die DNA eines Individuums enthalten, geeignet, sondern insbesondere auch für biologische Proben, welche Nukleinsäuren von wenigstens zwei verschiedenen Individuen enthalten. Erfindungsgemäß wird dies dadurch erreicht, dass zunächst mit einer Teilmenge der unverdünnten biologischen Probe wenigstens eine Amplifikationsreaktion durchgeführt wird, welche dazu angepasst ist, eine oder wenigstens zwei zueinander homologe und/ oder nicht homologe Sequenzen, die von wenigstens einer der in der biologischen Probe enthaltenen Nukleinsäuren umfasst sind, zu amplifizieren, und die Anzahl der mit der wenigstens einen Amplifikationsreaktion erhaltenen unterschiedlichen Amplifikationsprodukte verglichen wird mit der Anzahl an erhaltenen Amplifikationsprodukten wenigstens einer unter den gleichen Bedingungen durchgeführten Amplifikationsreaktion mit einer derart verdünnten Teilmenge der biologischen Probe, dass in der Amplifikationsreaktion für die verdünnte Teilmenge weniger Amplifikationsprodukte erhalten werden als mit der an der unverdünnten Teil- menge der biologischen Probe durchgeführten. Das Prinzip des erfindungsgemäßen Verfahrens beruht demnach darauf, eine Teilmenge der biologischen Probe enthaltend Nukleinsäuren unterschiedlicher Individuen so lange zu verdünnen, bis zumindest ein Teil der theoretisch möglichen Amplifikationsprodukte nicht mehr erhalten wird, wobei die "ausfallenden" Amplifikationsprodukte in der Regel solche von der in der biologischen Probe in geringster Konzentration vorliegenden DNA sein werden. In einem heterogenen DNA-Gemisch, wie beispielsweise einer Probe enthaltend Nukleinsäuren unterschiedlicher Individuen, wobei die Nukleinsäuren der einzelnen Individuen in der biologischen Probe in unterschiedlichen Mengen vorliegen, liegen die Sequenzen der Nukleinsäuren der einzelnen Individuen in unterschiedlichen Kopienzahlen vor. Da eine PCR die einzelnen Zielsequenzen exponentiell amplifiziert, kann diese mengenmäßige Ungleichverteilung so sehr verstärkt werden, dass die Zielsequenz, d.h. die durch die in der Amplifikationsreaktion eingesetzten Primer zu amplifizierende Sequenz, der in geringster Konzentration vorliegenden DNA eines Individuums im Verhältnis zu der entsprechenden Zielsequenz der höher konzentrierten DNA eines anderen Individuums so gering vorliegt, dass diese nicht mehr detektiert werden kann. Dies ist analog zu dem "allelic dropouf genannten Effekt, bei dem in einer biologischen Probe enthaltend die DNA nur eines Individuums eines der verschiedenen Allele amplifiziert wird. Die vorliegende Erfindung beruht auf der an Experimenten an Einzelzellen gewonnenen überraschenden Erkenntnis, dass diese dropout-Übergänge sehr scharf auftreten.
Aufgrund des vorgenannten Prinzips und der vorgenannten Zusammenhänge können durch den Vergleich der mit einer unverdünnten Teilmenge der biologischen Probe erhaltenen Anzahl an Amplifikationsprodukten mit der Anzahl an mit einer entsprechend verdünnten Teilmenge der biologischen Probe erhaltenen Amplifikationsprodukten, wobei der Verdün- nungsfaktor so hoch ist, dass mit der verdünnten Probe weniger Amplifi- kationsprodukte erhalten werden als mit der unverdünnten Probe, die einzelnen Amplifikationsprodukte den einzelnen Individuen, von denen Nukleinsäure in der biologischen Ausgangsprobe enthalten ist, zugeordnet werden. Während nämlich die sowohl mit der unverdünnten als auch mit der verdünnten Probe erhaltenen Amplifikationsprodukte dem Individuum zuzuordnen sind, von dem eine höhere Menge an Nukleinsäure in der biologischen Probe enthalten ist, können die mit der unverdünnten biologischen Probe erhaltenen Amplifikationsprodukte, welche mit der verdünnten biologischen Probe nicht mehr erhalten werden, dem Individuum zugeordnet werden, von dem in der biologischen Probe eine geringere DNA- Menge vorliegt. Indem die derart den einzelnen Individuen der biologischen Probe zugeordneten Amplifikationsprodukte weiter charakterisiert werden, kann auf den Genotyp der einzelnen verschiedenen Individuen geschlossen werden.
Dies sei an einem Gedankenexperiment näher erläutert. An einem Tatort werden geringe Spuren einer biologischen Probe sichergestellt, welche (was zunächst nicht bekannt ist) Nukleinsäuren zweier verschiedener Individuen enthält, nämlich Nukleinsäure des Opfers und Nukleinsäure des Täters. Dabei ist (was zunächst ebenfalls nicht bekannt ist) die Nukleinsäure des Opfers in der biologischen Probe in einer größeren Menge vorhanden als die des Täters. Es wird nunmehr eine PCR mit einem Primerpaar zugeführt, welches dazu angepasst ist, genau eine Nukleinsäurese- quenz aus beispielsweise dem Chromosom 18 zu amplifizieren. Da ein gesunder Mensch zwei Chromosomen 18 aufweist, werden für einen heterozygoten Träger des Chromosoms 18 genau zwei Amplifikationsprodukte erwartet. Wenn sowohl das Opfer als auch der Täter jeweils bezüglich des Chromosoms 18 heterozygot sind, liegt die theoretisch maximal mögliche Anzahl an Amplifikationsprodukten für die mit einer Teilmenge der vorge- nannten biologischen Probe durchgeführte Amplifikationsreaktion bei vier Amplifϊkationsprodukten, wobei zwei Amplifikationsprodukte für die beiden Allele des Opfers und zwei Amplifikationsprodukte für die beiden Allele des Täters erhalten werden. Wird eine Teilmenge der biologischen Probe nun sukzessive verdünnt, so tritt ab einem bestimmten Verdünnungsfaktor, bei dem die Konzentration der Nukleinsäure des Täters in der verdünnten biologischen Probe eine gewisse Mindestkonzentration unterschreitet, der Fall ein, dass nur noch die Amplifikationsprodukte für die DNA des Opfers erhalten werden, nicht aber mehr die Amplifikationsprodukte für die DNA des Täters. Aus diesem Grund kann man die mit der so verdünnten Teilmenge der biologischen Probe erhaltenen Amplifikationsprodukte, welche beispielsweise eine Länge von 120 und 130 bp aufweisen, dem Individuum zuordnen, von dem eine größere Menge DNA in der biologischen Probe enthalten ist. Hingegen sind diejenigen Amplifikationsprodukte, welche zwar mit der an der unverdünnten Teilmenge der biologischen Probe durchgeführten Amplifikationsreaktion erhalten wurden, nicht aber mit der an der verdünnten Teilmenge der biologischen Probe durchgeführten Amplifikationsreaktion, die beispielsweise eine Länge von 125 und 135 bp aufweisen, demjenigen Individuum zuzuordnen, von dem eine geringere Menge DNA in der biologischen Probe enthalten ist. Durch weitere Charakterisierung der einzelnen Amplifikationsprodukte kann nun auf den Genotyp der beiden Individuen geschlossen werden. Beispielsweise können die einzelnen Amplifikationsprodukte verglichen werden mit den mit einer an einer Referenzprobe enthaltend Zellen des Opfers durchgeführten PCR erhaltenen Amplifikationsprodukten, so dass genau zugeordnet werden kann, welche der beiden DNA-Proben von dem Opfer stammt. Werden mit der Referenzprobe des Opfers bspw. zwei PCR- Produkte mit einer Länge von 120 und 130 bp erhalten, kann aus dem vorstehend genannten Experiment mit einer gewissen Wahrscheinlichkeit geschlossen werden, dass in der an dem Tatort aufgefundenen biologi- sehen Probe DNA wenigstens zweier unterschiedlicher Individuen vorhanden ist, wobei wenigstens eine DNA von dem Opfer stammt. Zudem lässt das Experiment die Schlussfolgerung zu, dass die in der biologischen Probe in höherer Konzentration vorliegende DNA dem Opfer zuzurechnen ist und die DNA, welche bei der Amplifikationsreaktion zwei Amplifikati- onsprodukte mit einer Länge von 125 und 135 bp ergibt, nicht dem Opfer, sondern dem Täter oder einem an der Tat nicht beteiligten Dritten zuzuordnen ist. Danach können dann gezielt die für den Täter oder den unbeteiligten Dritten erhaltenen Amplifikationsprodukte weiter analysiert werden, um beispielsweise durch Vergleich mit den in einer Datenbank gespeicherten Daten auf die Identität des Täters zu schließen.
Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt darin, dass auf eine Bestimmung der absoluten Fluoreszenzintensität von PCR- Produkten, wie bei den im Stand der Technik bekannten Verfahren zwingend erforderlich, verzichtet werden kann. Vielmehr werden bei dem erfϊn- dungsgemäßen Verfahren lediglich die Anzahlen der mit jeweils wenigstens einer Amplifikationsreaktion erhaltenen unterschiedlichen Amplifikationsprodukte bestimmt und miteinander verglichen. Insofern müssen in dem erfindungsgemäßen Verfahren nicht notwendigerweise fluoreszenzmarkierte Primer eingesetzt werden. Sofern diese zur Detektion der Anzahl an erhaltenen unterschiedlichen Amplifikationsprodukten dennoch eingesetzt werden, muss nicht aufwändig die absolute Fluoreszenzintensität der erhaltenen fluoreszenzmarkierten Amplifikationsprodukte bestimmt werden, sondern lediglich evaluiert werden, ob eine gegebenenfalls über einem definierten Schwellenwert (beispielsweise Faktor 10 oder 100) liegende Fluoreszenz bei einer den eingesetzten Fluoreszenzfaktor entsprechenden Wellenlänge vorhanden ist oder nicht. Daher ist das erfindungsgemäße Verfahren ohne kostenaufwändige Apparaturen zur qualitativen Detektion von Fluoreszenz einfach und kostengünstig durchzuführen. Grundsätzlich ist das erfindungsgemäße Verfahren zur Bestimmung des Genotyps eines oder mehrerer Individuen aus einer biologischen Probe enthaltend Nukleinsäuren unterschiedlicher Individuen geeignet, unabhängig von der konkreten Anzahl an unterschiedlichen Individuen. Besonders gute Ergebnisse werden jedoch erhalten, wenn die biologische Probe Nukleinsäuren von wenigstens zwei, aber weniger gleich 10 verschiedenen Individuen enthält. Besonders bevorzugt enthält die biologische Probe Nukleinsäuren von wenigstens zwei, aber weniger gleich fünf, ganz besonders bevorzugt von zwei oder drei und höchst bevorzugt von genau zwei verschiedenen Individuen.
Auch bezüglich der Mengen- bzw. Konzentrationsunterschiede der einzelnen Nukleinsäuren untereinander ist die vorliegende Erfindung nicht limitiert. Vorzugsweise beträgt der Konzentrationsunterschied der von den einzelnen Individuen in der biologischen Probe enthaltenen Nukleinsäuren untereinander zwischen 1: 1.000 und 1: 1, besonders bevorzugt zwischen 1:500 und 1:5 und ganz besonders bevorzugt zwischen 1: 100 und 1: 10.
Wie bereits vorstehend dargelegt, eignet sich das erfindungsgemäße Verfahren insbesondere für forensische Untersuchungen, beispielsweise im Zusammenhang mit der Verbrechensaufklärung. Allerdings ist das erfindungsgemäße Verfahren nicht darauf beschränkt, sondern kann für jede Art biologischer Probe, welche Nukleinsäuren von wenigstens zwei verschiedenen Individuen enthält, eingesetzt werden.
Eine weitere besondere Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist beispielsweise die Bestimmung des Genotyps eines oder mehrerer Individuen aus einer biologischen Probe enthaltend maternales, d.h. mütterliches, Blut sowie fetale Zellen. Fetale Zellen kommen in mütterlichem Blut mit einer Häufigkeit von etwa 1:1.000.000 vor. Trotz der relativ geringen Anzahl an fetalen Zellen in dem mütterlichen Blut können mit dem erfindungsgemäßen Verfahren schnell und einfach Rückschlüsse auf den Genotyp des Fötus gezogen werden. Hierzu wird zunächst mit einer Teilmenge der unverdünnten Probe eine Amplifikationsreaktion, welche dazu an- gepasst ist, beispielsweise 15 verschiedene Amplifikationsprodukte aus dem Genom der Mutter zu amplifizieren, durchgeführt und dann mit einer weiteren Teilmenge der biologischen Probe eine Verdünnungsreihe erstellt, wobei der Verdünnungsfaktor zwischen den einzelnen Verdünnungsstufen beispielsweise 1:2 beträgt. Anschließend wird mit jeder Verdünnungsstufe eine Amplifikationsreaktion exakt unter den gleichen Bedingungen wie mit der unverdünnten Probe durchgeführt und für jede Amplifikationsreaktion die Anzahl der erhaltenen unterschiedlichen Amplifikationsprodukte bestimmt. Diejenigen Amplifikationsprodukte, welche zwar mit der Teilmenge der unverdünnten biologischen Probe erhalten wurden, nicht aber mit den verdünnten Teilmengen der biologischen Probe, können dem Fötus zugeordnet werden, wohingegen die anderen Amplifikationsprodukte, also diejenigen, welche sowohl mit der unverdünnten biologischen Probe als auch der verdünnten biologischen Probe erhalten wurden, der Mutter zuzuordnen sind. Durch Charakterisierung der Amplifikationsprodukte kann beispielsweise bestimmt werden, ob der Fötus unter Trisomie 21 leidet o- der diesbezüglich gesund ist. Der besondere Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt nun darin, dass diese Charakterisierung aus einer biologischen Probe, welche sowohl mütterliches Blut als auch fetale Zellen enthält, erfolgen kann, ohne dass, wie im Stand der Technik notwendig, die fetalen Zellen aus dem mütterlichen Blut isoliert werden müssen.
Ferner kann das erfindungsgemäße Verfahren dazu eingesetzt werden, durch LOH {"Lost of heterozygosity") entstandene Krebszellen aus einer Mischprobe zu charakterisieren, beispielsweise diese zu typisieren. In die- sem Fall enthält die biologische Probe beispielsweise eine Mischung aus gesunden Zellen und aus durch LOH entstandenen Krebszellen.
Bezüglich der Art der wenigstens einen Amplifikationsreaktion ist das erfindungsgemäße Verfahren nicht beschränkt; vielmehr können alle denkbaren Arten an Amplifikationsreaktionen, mit denen Sequenzvarianten nachgewiesen werden können, eingesetzt werden. Dennoch hat es sich als vorteilhaft erwiesen, als wenigstens eine Amplifikationsreaktion eine PCR durchzuführen, da eine PCR einfach, vergleichsweise schnell sowie mit geringem technischen Aufwand durchzuführen ist und durch die Auswahl geeigneter Primerpaare beliebige Nukleinsäuresequenzen aus der biologischen Probe amplifiziert werden können.
Da mit dem erfindungsgemäßen Verfahren der Genotyp eines oder mehrerer Individuen aus einer biologischen Probe enthaltend Nukleinsäuren unterschiedlicher Individuen bestimmt werden soll, wird in Weiterbildung des Erfindungsgedankens vorgeschlagen, die wenigstens eine Amplifikationsreaktion dazu anzupassen, eine oder wenigstens zwei zueinander homologe und/ oder nicht homologe Sequenzen aus nicht kodierenden DNA- Bereich zu amplifϊzieren. Bekanntermaßen ist der nicht kodierende DNA- Bereich wesentlich polymorpher als der kodierende DNA-Bereich, so dass durch Amplifikation von Sequenzen aus dem nicht kodierenden DNA- Bereich mit einer relativ großen Wahrscheinlichkeit individuenspezifische Sequenzen amplifiziert werden können. Dies ist sowohl bei forensischen Mischproben als auch bei der Charakterisierung des Genotyps fetaler Zellen aus maternalem Blut enthaltend fetale Zellen vorteilhaft.
Desweiteren hat es sich als vorteilhaft erwiesen, die wenigstens eine Amplifikationsreaktion dazu anzupassen, eine oder wenigstens zwei zueinander homologe und/ oder nicht homologe hochpolymorphe Sequenzen zu amplifϊzieren. Insbesondere in den Fällen, in denen die wenigstens eine Amplifikationsreaktion dazu angepasst ist, eine oder wenigstens zueinander homologe und/ oder nicht homologe Sequenzen zu amplifizieren, welche aus der STR-Sequenzen, VNTR-Sequenzen, SNP-Sequenzen und beliebigen Kombinationen hiervon bestehenden Gruppe ausgewählt sind, werden gute Ergebnisse erhalten. STR- bzw. short tandem repeat- Sequenzen sind hochpolymorphe Sequenzen, welche aus lediglich zwei bis vier bp langen Wiederholungseinheiten bestehen und zwischen den einzelnen Individuen eine hohe Variabilität aufweisen. Im Unterschied dazu bestehen VNTR- bzw. variable number of tandem repeat-Sequenzen aus etwa 15 bis 30 bp Länge aufgebauten repetitiven DNA-Abschnitten, deren Gesamtlänge der durch die Anzahl der Wiederholungen dieser Grundeinheit bestimmt sind. Auch VNTR-Sequenzen sind in der Regel hochpoly- morph, d.h. die Anzahl der jeweiligen Wiederholungseinheiten unterscheidet sich zwischen den verschiedenen Individuen sehr stark. Bei SNP' s (single nucleotide polymorphism) handelt es sich um die einfachsten Polymorphismen, bei denen sich die homologen Sequenzen nur durch jeweils eine Base unterscheiden. Auch diese Sequenzen eignen sich hervorragend für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, da sich diese zwischen den einzelnen Individuen sehr stark unterscheiden. Abgesehen davon sind jedoch auch alle anderen hochpolymorphen Sequenzen als Marker für das erfindungsgemäße Verfahren geeignet.
Ferner ist es bevorzugt, dass die wenigstens eine Amplifikationsreaktion dazu angepasst ist, eine oder wenigstens zwei zueinander homologe und/ oder nicht homologe Sequenzen zu amplifizieren, welche in dem Genom des Spenders jeweils pro Allel nur einmal vorkommen. So können bei der Charakterisierung der Amplifikationsprodukte Rückschlüsse auf die einzelnen Allele eines Individuums gezogen werden, so dass beispielsweise die Anzahl einzelner Allele eines Individuums in einer biologischen Probe umfassend Nukleinsäuren verschiedener Individuen bestimmt werden kann.
Vorzugsweise ist die wenigstens eine Amplifikationsreaktion dazu ange- passt, zwischen 1 und 100, vorzugsweise zwischen 2 und 20 und besonders bevorzugt zwischen 5 und 15 zueinander homologe und/ oder nicht homologe Sequenzen zu amplifizieren. Dadurch werden genügend verschiedene Amplifikationsprodukte erhalten, um gezielte individuenspezifische Ergebnisse bei der Charakterisierung der Amplifikationsprodukte zu erhalten. Andererseits ist der experimentelle Aufwand noch nicht zu groß.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird in Schritt b) bzw. Schritt d) des erfindungsgemäßen Verfahrens eine zur Amplifikation von wenigstens zwei zueinander homologen und/ oder nicht homologen Sequenzen angepasste PCR durchgeführt, in der eine der Anzahl der wenigstens zwei zueinander homologen und/ oder nicht homologen Sequenzen entsprechende Anzahl an Primerpaaren, welche dazu an- gepasst sind, die wenigstens zwei zueinander homologen und/oder nicht homologen Sequenzen zu amplifizieren, eingesetzt wird. Ein Vorteil dieser Ausführungsform liegt darin, dass sowohl bei der mit der unverdünnten Teilmenge der biologischen Probe durchgeführten Amplifikationsreaktion als auch mit der oder den Verdünnungsstufen der Teilmenge der biologischen Probe durchgeführten Amplifikationsreaktion jeweils nur eine PCR notwendig ist, so dass das Verfahren schnell und ohne großen Pipettier- aufwand durchgeführt werden kann. Ein Beispiel für eine geeignete Verfahrensführung ist eine Multiplex-PCR, wobei jedoch auch jede andere Amplifikationsreaktion, bei der die eine oder die wenigstens zwei zueinander homologen und/ oder nicht homologen, zu amplifizierenden Sequenzen gleichzeitig in einer Reaktion amplifiziert werden können, eingesetzt werden können. Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird in Schritt b) bzw. Schritt d) eine zur Amplifikation von wenigstens zueinander homologen und/ oder nicht homologen Sequenzen angepasste PCR durchgeführt, wobei in Schritt a) eine der Anzahl der wenigstens zwei zueinander homologen und /oder nicht homologen Sequenzen entsprechende Anzahl an Teilmengen der biologischen Probe bereitgestellt wird, wobei jede Teilmenge die gleiche Menge an biologischem Material enthält, und in Schritt b) bzw. Schritt d) mit jeder der Teilmengen eine PCR, in der jeweils ein Primerpaar eingesetzt wird, durchgeführt wird, wobei die in den verschiedenen PCR's eingesetzten Primerpaare dazu ange- passt sind, die wenigstens zwei zueinander homologen und/ oder nicht homologen Sequenzen zu amplifizieren. Ein Vorteil dieser Verfahrensführung liegt darin, dass sich die einzelnen Amplifikationen nicht gegenseitig, möglicherweise negativ, beeinflussen können.
Insbesondere bei der vorgenannten Ausführungsform, aber auch in den Fällen, in denen eine große Anzahl an Verdünnungsstufen notwendig ist, um mit den verdünnten Proben eine geringere Anzahl an Amplifikati- onsprodukten zu erhalten als mit der unverdünnten Probe, kann es notwendig sein, die biologische Probe vor Durchführung des Verfahrensschritts a), also vor der Bereitstellung einer Teilmenge der biologischen Probe, beispielsweise mit einer un spezifischen PCR, zu amplifizieren, um genügend Ausgangsmaterial zu haben, um die notwendige Anzahl an Teilmengen der biologischen Probe bereitstellen zu können.
Abgesehen von den zwei vorgenannten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind auch Mischformen beider Ausführungsformen denkbar, beispielsweise eine, bei der ein Teil der wenigstens zwei zueinander homologen und/oder nicht homologen, zu amplifizierenden Sequenzen in einer PCR unter Einsatz von wenigstens zwei Primerpaaren und der andere Teil der wenigstens zwei zueinander homologen und/ oder nicht homologen, zu amplifizierenden Sequenzen jeweils in davon getrennten PCR's, wobei bei diesen PCR's jeweils nur ein Primerpaar eingesetzt wird, amplifi- ziert werden.
Um die Anzahl an erhaltenen unterschiedlichen Amplifikationsprodukten bestimmen zu können, muss zunächst die An- bzw. Abwesenheit von Amplifikationsprodukten bestimmt werden. Zur Bestimmung der An- bzw. Abwesenheit von Amplifikationsprodukten können alle dem Fachmann zu diesem Zweck bekannten Verfahren eingesetzt werden, wobei lediglich beispielsweise Gelelektrophorese, gängige Hybridisierungstechniken, beispielsweise solche auf einem DNA-Array, genannt seien. Dabei kann es in Abhängigkeit von den eingesetzten Detektionsverfahren zweckmäßig sein, Schwellenwerte zu definieren, oberhalb derer die Anwesenheit eines PCR- Produktes und unterhalb derer die Abwesenheit eines PCR-Produktes angenommen wird.
Zusätzlich zu der Bestimmung der An- bzw. Abwesenheit eines Amplifika- tionsproduktes muss zur Bestimmung der Anzahl an erhaltenen unterschiedlichen Amplifikationsprodukten ein zweiter, vorzugsweise physikalisch und/ oder chemisch messbarer Parameter bestimmt werden, um die einzelnen Amplifikationsprodukte voneinander unterscheiden zu können. Dabei hängt die Art des zweiten, die einzelnen PCR-Produkte voneinander unterscheidenden Parameters im Wesentlichen von der Art der einen bzw. wenigstens zwei zu amplifizierenden, zueinander homologen und/ oder nicht homologen Sequenzen ab. Werden beispielsweise die PCR-Primer in der wenigstens einen Amplifikationsreaktion so gewählt, dass STR- Abschnitte und/ oder VNTR- Abschnitte als zueinander homologe und/ oder nicht homologe Sequenzen amplifiziert werden, wird als zweiter Parameter bzw. als zweites Unterscheidungsmerkmal der einzelnen PCR-Produkte vorzugsweise die Länge der einzelnen PCR-Produkte gewählt, so dass die Bestimmung der Anzahl der erhaltenen unterschiedlichen Amplifikati- onsprodukte die Prüfung auf An- bzw. Abwesenheit von PCR-Produkten sowie die Bestimmung der Länge der einzelnen PCR-Produkte umfasst, wobei die Anzahl der erhaltenen unterschiedlichen Amplifϊkationsproduk- te der Anzahl der erhaltenen Amplifikationsprodukte mit sich unterscheidender Länge entspricht. Ein geeignetes Verfahren hierfür ist beispielsweise die Kapillarelektrophorese.
Werden hingegen bei der wenigstens einen Amplifikationsreaktion PCR- Primer eingesetzt, welche daran angepasst sind, eine oder wenigstens zwei zueinander homologe und/ oder nicht homologe SNP-Sequenzen zu ampli- fizieren, so ist das zweite Unterscheidungsmerkmal bzw. der zweite Parameter vorzugsweise die Bestimmung der sich unterscheidenden Sequenz, die bei SNP-Abschnitten üblicherweise auf ein Nukleotid beschränkt ist. Auch hierzu können alle dem Fachmann zu diesem Zweck bekannten Verfahren herangezogen werden, wobei lediglich beispielsweise DNA- Sequenzierung oder bekannte Hybridisierungsverfahren genannt seien.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung hat es sich als vorteilhaft erwiesen, die Parameter in der wenigstens einen Amplifikationsreaktion gemäß Schritt b) bzw. gemäß Schritt d) derart einzustellen, dass die relative Häufigkeit für eine positive Amplifikationsreaktion für die eine oder jede der wenigstens zwei zueinander homologen und/ oder nicht homologen Sequenzen jeweils zumindest im Wesentlichen gleich hoch ist. So wird die zu amplifizierende Sequenz der Nukleinsäuren der in der biologischen Probe enthaltenen unterschiedlichen Individuen, sofern diese in einer gleich hohen Menge vorliegen, mit gleicher Effektivität amplifiziert, so dass aus dem Wegfall eines Amplifikationsproduktes ab einer gewissen Verdün- nungsstufe zuverlässig darauf geschlossen werden kann, dass der Wegfall des Amplifikationsproduktes darauf zurückzuführen ist, dass die DNA des entsprechenden Individuums in der biologischen Probe in einer entsprechend geringeren Menge als die der anderen Individuen vorliegt, und der Wegfall nicht lediglich darauf beruht, dass die Effektivität der Amplifikati- onsreaktion für dieses Amplifikationsprodukt selbst bei gleicher DNA- Menge geringer war als die für ein anderes Amplifikationsprodukt. Daher ist es erfindungsgemäß bevorzugt, die Bindungsaffinität der einzelnen PCR-Primer zu deren Primerbindungsstellen sowie die sonstigen Parameter der PCR, insbesondere die Zyklenzahl und die Temperaturführung, derart einzustellen, dass die relative Häufigkeit für eine positive Amplifika- tionsreaktion der wenigstens einen Amplifikationsreaktion für jede der zu amplifizierenden zueinander homologen und/ oder nicht homologen Sequenzen zwischen 0,2 und weniger als 1, bevorzugt zwischen 0,4 und 0,6 sowie besonders bevorzugt etwa 0,5 beträgt. Würde die relative Häufigkeit für eine positive Amplifikationsreaktion für die zueinander homologen und/ oder nicht homologen, zu amplifizierenden Sequenzen bei 1 liegen, wäre ein Wegfall der Amplifikationsprodukte für die in geringer DNA- Konzentration in der biologischen Probe vorliegende Nukleinsäure erst ab einer relativ hohen Verdünnungsstufe zu beobachten. Daher ist es vorteilhaft, die relative Häufigkeit für eine positive Amplifikation der wenigstens einen Amplifikationsreaktion auf einen Wert unterhalb von 1 einzustellen. Um andererseits zu verhindern, dass ein Wegfall der PCR-Produkte schon bei der unverdünnten Probe zu beobachten ist, sollte die relative Häufigkeit für eine positive Amplifikationsreaktion andererseits nicht zu niedrig liegen.
Es gilt jedoch zu berücksichtigen, dass die vorgenannten Werte für die einzustellende relative Häufigkeit für eine positive Amplifikationsreaktion der wenigstens einen Amplifikationsreaktion für jede der zu amplifizieren- den Sequenzen (im Folgenden auch Effektivität genannt) keine festen Größen sind, sondern insbesondere von der Anzahl an in der PCR eingesetzten Startkopien abhängt. Je größer die Zahl der Startkopien, desto geringer sollte die Effektivität der wenigstens einen Amplifikationsreaktion eingestellt werden, um einen Wegfall der Amplifikationsprodukte für die in geringer DNA-Konzentration in der biologischen Probe vorliegende Nukleinsäure schon ab einer relativ geringen Verdünnungsstufe zu erreichen. Diese Abhängigkeit der einzustellenden Effektivität von der Anzahl an Startkopien, d.h. der Anzahl der eingesetzten Zellen bzw. der Anzahl der eingesetzten Kopien, ist in der Fig. 1 dargestellt.
In Weiterbildung des Erfindungsgedankens wird vorgeschlagen, parallel zu der wenigstens einen Amplifikationsreaktion gemäß Schritt b) bzw. Schritt d) eine Amplifikationsreaktion unter gleichen Bedingungen mit einer Kontrollprobe durchzuführen. Dabei führt die Kontrollprobe vorzugsweise zu einer bekannten Anzahl an unterschiedlichen Amplifikationsprodukten. So kann auf einfache Weise festgestellt werden, ob die wenigstens eine Amplifikationsreaktion gemäß Schritt b) bzw. Schritt d) ordnungsgemäß abgelaufen ist, oder, ob möglicherweise durch einen Defekt an dem Ther- mocycler, diese gar nicht oder unzureichend stattgefunden hat.
Der zu wählende Verdünnungsfaktor der Teilmenge der biologischen Probe hängt insbesondere von der Konzentration der Nukleinsäuren in der biologischen Probe ab und kann im Rahmen von fachüblichen Versuchen durch den Fachmann leicht bestimmt werden. Es hat sich jedoch grundsätzlich als vorteilhaft erwiesen, die Teilmenge der biologischen Probe in einem Verhältnis zwischen 1:1 und 1: 1.000, bevorzugt zwischen 1: 1 und 1: 100, besonders bevorzugt zwischen 1: 1 und 1: 10 und ganz besonders bevorzugt zwischen 1: 1 und 1:2 zu verdünnen. Zur Charakterisierung der Amplifϊkationsprodukte können alle dem Fachmann bekannten Techniken eingesetzt werden, die einen Rück- schluss auf den Genotyp des entsprechenden Individuums zulassen. Beispielsweise kann die Charakterisierung der Amplifikationsprodukte die Bestimmung der relativen Anzahl eines oder mehrerer Allele einer vorbestimmten Sequenz umfassen.
Zur Bestimmung der relativen Anzahl an Allelen einer vorbestimmten Sequenz, beispielsweise eines Chromosoms, eines Gens oder eines Genabschnitts, kann jedes dem Fachmann zu diesem Zweck bekannte Verfahren eingesetzt werden. Beispielsweise kann dies dadurch erfolgen, dass wenigstens eine Amplifikationsreaktion unter denselben Bedingungen wie in Schritt b) des erfindungsgemäßen Verfahrens mit einer Referenzprobe durchgeführt wird und die Anzahl der mit dieser wenigstens einen Amplifikationsreaktion mit der Referenzprobe erhaltenen unterschiedlichen Amplifikationsprodukte mit der Anzahl der nur für einen Teil der Teilmengen erhaltenen Amplifikationsprodukte verglichen wird. Vorzugsweise weist die Referenzprobe einen bekannten Genotyp auf; hierzu reicht es beispielsweise aus, zu wissen, ob es sich bei dem Individuum, aus dem die Referenzprobe entnommen wurde, um ein bezüglich der vorbestimmten Sequenz, auf dem das zu bestimmende Allel vorhanden ist, um ein gesundes oder krankes Individuum handelt. Genauso gut kann aber auch die Kopienzahl der vorbestimmten Sequenz der Referenzprobe bekannt sein. Zudem ist es bevorzugt, dass die Referenzprobe in der wenigstens einen Amplifikationsreaktion eine gleich große DNA-Menge eingesetzt wird wie in der wenigstens einen Amplifikationsreaktion gemäß Schritt b) des erfindungsgemäßen Verfahrens. Um dies sicherzustellen, kann es beispielsweise notwendig sein, die DNA-Konzentration in der biologischen Probe - gegebenenfalls nach einer unspezifischen PCR zur Vermehrung des Materials - zu bestimmen. Indem die Anzahl der nur für einen Teil der Teil- mengen erhaltenen unterschiedlichen Amplifikationsprodukte, d.h. die für das Individuum, von dem in der biologischen Probe die größere Menge an DNA enthalten ist, mit der entsprechenden Anzahl an für eine Referenzprobe mit derselben Amplifikationsreaktion erhaltenen unterschiedlichen Amplifikationsprodukten verglichen wird, kann die relative Anzahl der Allele einer vorbestimmten Sequenz, sofern in der wenigstens einen Amplifikationsreaktion entsprechende Primerpaare, welche daran angepasst sind, die von der vorbestimmten Sequenz umfassten Allele zu amplifizieren, eingesetzt wurden, bestimmt werden.
Alternativ zu der vorgenannten Ausführungsform ist es auch möglich, zur Charakterisierung der Amplifikationsprodukte wenigstens eine Amplifikationsreaktion unter denselben Bedingungen wie in Schritt b) mit einer Referenzprobe durchzuführen und die Anzahl der mit dieser wenigstens einen Amplifikationsreaktion erhaltenen unterschiedlichen Amplifikationsprodukte mit der Anzahl der für alle Teilmengen erhaltenen unterschiedlichen Amplifikationsprodukte zu vergleichen. Im Unterschied zu der zuvor genannten Ausführungsform kann damit die relative Anzahl der Allele einer vorbestimmten Sequenz in dem Individuum, von dem die geringere DNA-Menge in der biologischen Probe enthalten ist, bestimmt werden.
In Weiterbildung des Erfindungsgedankens wird vorgeschlagen, zur Charakterisierung der Amplifikationsprodukte die Anzahl der nur für einen Teil der Teilmengen erhaltenen unterschiedlichen Amplifikationsprodukte und /oder die Anzahl der für alle Teilmengen der biologischen Probe bestimmten unterschiedlichen Amplifikationsprodukte mit wenigstens einer Häufigkeitsverteilung zu vergleichen, wobei die Häufigkeitsverteilung bspw. durch getrenntes, jeweils mehrmaliges Durchführen der gleichen und unter denselben Reaktionsbedingungen wie der in Schritt b) einge- setzten wenigstens einen Amplifikationsreaktion, wobei in der wenigstens einen Amplifikationsreaktion die gleiche wie in Schritt a) genannte Menge an Ausgangsmaterial eingesetzt wurde/wird mit wenigstens zwei verschiedenen Referenzproben, wobei die wenigstens zwei verschiedenen Referenzproben jeweils eine bekannte, voneinander verschiedene Kopienzahl der vorbestimmten Sequenz aufweisen, sowie anschließendes Bestimmen der pro Referenzprobe erhaltenen Anzahl an unterschiedlichen Amplifika- tionsprodukten erhalten wurde/wird. Auf diese Weise ist eine besonders zuverlässige Bestimmung der relativen oder sogar absoluten Anzahl von Allelen einer vorbestimmten Sequenz in jedem der Individuen, von denen in der biologischen Probe Nukleinsäuren enthalten sind, möglich.
Ferner ist es auch möglich, zur Charakterisierung der Amplifikationspro- dukte die erhaltenen Amplifikationsprodukte zu sequenzieren oder einem Hybridisierungsverfahren mit geeigneten Sonden zu unterwerfen, beispielsweise um Rückschlüsse auf die Sequenz eines Gens oder Genabschnitts zu erhalten.
Schließlich kann zur Charakterisierung der Amplifikationsprodukte auch mit einer oder mehreren Verdünnungsstufen der biologischen Probe eine Mehrfachbestimmung der PCR durchgeführt werden, um aus dem Vergleich des Mittelwertes der bei den einzelnen Bestimmungen erzielten Anzahlen an erhaltenen unterschiedlichen Amplifikationsprodukten bspw. auf die relative oder absolute Anzahl der vorbestimmten Sequenz in der biologischen Probe zu schließen. Genauso gut ist es möglich mit einer oder mehreren Verdünnungsstufen der biologischen Probe eine Mehrfachbestimmung der PCR durchzuführen und den Mittelwert der Anzahl eines erhaltenen spezifischen, bspw. allelspezifischen Amplifikationsprodukts mit dem Mittelwert der Anzahl eines anderen erhaltenen spezifischen, bspw. allelspezifischen Amplifikationsprodukts zu vergleichen. Beispiels- weise können für die Verdünnungsstufen 1:5 und 1: 10 einer biologischen Probe jeweils eine Fünffachbestimmung einer PCR durchgeführt werden, wobei die in der PCR eingesetzten Primerpaare daran angepasst sind, wenigstens eine allelspezifische Sequenz zu amplifizieren. Werden mit der PCR für das allelspezifische Primerpaar für ein Individuum bspw. 2 Ampli- fikationsprodukte erhalten und treten die beiden Amplifikationsprodukte bei den einzelnen Verdünnungsstufen gleich oft in Erscheinung, bspw. im Durchschnitt jeweils 0,5 mal bei der Verdünnungsstufe 1:5 und 0 mal bei der Verdünnungsstufe 1: 10, kann auf eine biallelische Disomie geschlossen werden. Werden jedoch bei den einzelnen Verdünnungsstufen zwei allelspezifische Amplifikationsprodukte erhalten, von denen eines im Durchschnitt doppelt so häufig auftritt wie das andere, bspw. Amplifikati- onsprodukt 1 im Durchschnitt 0,9 mal bei der Verdünnungs stufe 1:5 und Amplifikationsprodukt 2 im Durchschnitt 0,5 mal bei der Verdünnungsstufe 1: 10, oder eines erst bei einem höheren Verdünnungsfaktor ausfällt als das andere, bspw. Amplifikationsprodukt 1 bei der Verdünnungsstufe 1: 10 zum ersten Mal nicht mehr erhalten wird, wohingegen Amplifikationsprodukt 2 bereits bei der Verdünnungs stufe von 1:5 nicht mehr erhalten wird, zeigt dies eine biallelische Trisomie an. Vorzugsweise beträgt die Anzahl der Mehrfachbestimmungen zwischen 2 und 1.000, besonders bevorzugt zwischen 3 und 100, ganz besonders bevorzugt zwischen 4 und 15 und höchst bevorzugt zwischen 5 und 10.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Kit zur Bestimmung des Genotyps eines oder mehrerer Individuen aus einer biologischen Probe, welche Nukleinsäuren unterschiedlicher Individuen enthält, insbesondere zur Durchführung des vorgenannten Verfahrens umfassend:
a) wenigstens ein Primerpaar, welches dazu angepasst sind, in wenigstens einer PCR eine oder wenigstens zwei zueinander homolo- ge und/ oder nicht homologe Sequenzen, die von wenigstens einer der in der biologischen Probe enthaltenen Nukleinsäuren umfasst sind, zu amplifizieren, bi) eine Referenzprobe mit einem bekannten Genotyp und vorzugsweise mit einer bezüglich einer vorbestimmten Sequenz bekannten Kopienzahl und/ oder b2) das Ergebnis wenigstens einer, unter den gleichen wie in dem Protokoll gemäß d) vorgeschrieben, durchgeführten Amplifikations- reaktion mit einer Referenzprobe, wobei die Reaktionsbedingungen so gewählt waren, dass das wenigstens eine Amplifikati- onsprodukt mit einer Wahrscheinlichkeit zwischen 20% und weniger als 100% gebildet wurde, und/oder bß) wenigstens eine Häufigkeitsverteilung, welche durch getrenntes jeweils mehrmaliges Durchführen der gleichen und unter denselben Reaktionsbedingungen wie der in dem Protokoll d) vorgeschriebenen wenigstens einen Amplifikationsreaktion mit wenigstens zwei verschiedenen Referenzproben, wobei die wenigstens zwei verschiedenen Referenzproben jeweils eine bekannte, voneinander verschiedene Kopienzahl einer vorbestimmten Sequenz aufweisen, sowie anschließendes Bestimmen der pro Referenzprobe erhaltenen Anzahl an unterschiedlichen Amplifikationsproduk- ten erhalten wurde, und c) ggf. PCR-Puffer und d) ein Protokoll für die Durchführung der wenigstens einen PCR in a) und ggf. Angaben zu den bei den wenigstens zwei Teilmengen mit unterschiedlicher Konzentration vorzunehmenden Verdünnungen.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthält das Kit eine Referenzprobe bi) mit einem bekannten Genotyp und vorzugsweise mit einer bezüglich einer vorbestimmten Sequenz bekannten Kopienzahl. Indem mit der Referenzprobe bekannten Genotyps die gleiche wenigstens eine Amplifikationsreaktion durchgeführt wird wie mit den einzelnen Teilmengen der biologischen Probe kann bei der Charakterisierung der Amplifikationsprodukte im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens durch Vergleich der Anzahl der für eine der Teilmengen der biologischen Probe erhaltenen Amplifikationsprodukte mit der Anzahl der für die Referenzprobe in der wenigstens einen Amplifikationsreaktion erhaltenen unterschiedlichen Amplifikationsprodukte auf die relative Kopienzahl der vorbestimmten Sequenz in der in der biologischen Probe enthaltenen Nukleinsäure eines Individuums geschlossen werden. Wenn von der Referenzprobe wenigstens zwei verschiedene Teilmengen unterschiedlicher Konzentration mehrmals jeweils wenigstens einer unter denselben Bedingungen wie die Teilmengen der zu untersuchenden biologischen Probe wenigstens einer Amplifikationsreaktion unterworfen werden, kann sogar auf die absolute Kopienzahl der vorbestimmten Sequenz in der in der biologischen Probe enthaltenen Nukleinsäure eines Individuums geschlossen werden.
Anstelle einer Referenzprobe oder, wenn auch weniger bevorzugt, zusätzlich zu einer Referenzprobe b^ kann das erfindungsgemäße Kit das Ergebnis b2)wenigstens einer, unter den gleichen wie in dem Protokoll gemäß d) vorgeschrieben, durchgeführten Amplifikationsreaktion mit einer Referenzprobe, wobei die Reaktionsbedingungen so gewählt waren, dass das wenigstens eine Amplifikationsprodukt mit einer Wahrscheinlichkeit zwischen 20% und weniger als 100% gebildet wurde, enthalten und/ oder wenigstens eine Häufigkeitsverteilung bß) enthalten, welche durch getrenntes jeweils mehrmaliges Durchführen der gleichen und unter denselben Reaktionsbedingungen wie der in dem Protokoll d) vorgeschriebenen wenigstens einen Amplifikationsreaktion mit wenigstens zwei verschiedenen Re- . ferenzproben, wobei die wenigstens zwei verschiedenen Referenzproben jeweils eine bekannte, voneinander verschiedene Kopienzahl einer vorbe- stimmten Sequenz aufweisen, sowie anschließendes Bestimmen der pro Referenzprobe erhaltenen Anzahl an unterschiedlichen Amplifikationspro- dukten erhalten wurde. Während ein Vergleich des Ergebnisses gemäß b2) mit der in der mit einer Teilmenge der biologischen Probe gemäß dem Protokoll d) durchgeführten wenigstens einen Amplifikationsreaktion erhaltenen Anzahl an unterschiedlichen Amplifikationsprodukten die Bestimmung der relativen Kopienzahl einer vorbestimmten Sequenz in der in der biologischen Probe enthaltenen Nukleinsäure eines Individuums erlaubt, ermöglicht ein entsprechender Vergleich mit der Häufigkeitsverteilung gemäß bß) die Bestimmung der absoluten Kopienzahl einer vorbestimmten Sequenz in der in der biologischen Probe enthaltenen Nukleinsäure eines Individuums.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des Kits gemäß der vorliegenden Erfindung ist das wenigstens eine Primerpaar dazu angepasst, in der wenigstens einen PCR eine oder wenigstens zwei zueinander homologe und/ oder nicht homologe Sequenzen aus dem nicht kodierenden DNA- Bereich, bevorzugt hochpolymorphe zueinander homologe und /oder nicht homologe Sequenzen, welche besonders bevorzugt aus der aus STR- Sequenzen, VNTR-Sequenzen, SNP-Sequenzen und beliebigen Kombinationen hiervon bestehenden Gruppe ausgewählt sind, zu amplifizieren.
In Weiterbildung des Erfindungsgedankens wird vorgeschlagen, das wenigstens eine Primerpaar gemäß a) und/ oder das Protokoll gemäß d) des erfindungsgemäßen Kits daran anzupassen, in der wenigstens einen PCR zwischen 1 und 100, vorzugsweise zwischen 2 und 20 und besonders bevorzugt zwischen 5 und 15 zueinander homologe und /oder nicht homologe Sequenzen zu amplifizieren. Im Folgenden wird die vorliegende Erfindung anhand von diese erläuternden, diese aber nicht einschränkenden Beispielen erläutert:
Beispiel 1
In dem vorliegenden Beispiel soll der Genotyp von in mütterlichem Blut vorliegenden fetalen Zellen bestimmt werden.
Fetale Zellen kommen in mütterlichem Blut mit einer Häufigkeit von etwa 1: 1.000.000 vor. Fetale Zellen lassen sich mittels verschiedener Methoden in mütterlichem Blut anreichern. Beispielsweise können hierzu magnetische Beads mit spezifischen Antikörpern für fetale Zellen eingesetzt werden oder Zellsorter, welche die fetalen Zellen anhand von Membranproteinen erkennen und trennen. Auf diese Weise können die fetalen Zellen in dem mütterlichen Blut bis auf ein Verhältnis von 1 : 1.000 angereichert werden.
Im Folgenden soll anhand einer so aufkonzentrierten Probe bestimmt werden, ob der Fötus von einer Trisomie 21 betroffen ist oder nicht. In diesem Beispiel ist aus einen Zellsorter-Experiment bekannt, dass sich in der Probe etwa 10.000 Zellen finden. Weiterhin ist aus Referenzexperimenten bekannt, dass für das hier verwendet STR-System (bei gleichem Protokoll wie in den Referenzexperimenten) ein dropout, d.h. eine Nicht- Amplifikation der von den eingesetzten Primerpaaren umfassten Amplifi- kationsprodukten, eintritt, wenn bei zwei Kopien des Chromosoms 21 pro Zelle in der PCR weniger als 10 Zellen eingesetzt werden oder bei 3 Kopien des Chromosoms 21 pro Zelle in der PCR weniger als 7 Zellen eingesetzt werden. Zunächst wurde eine Teilmenge einer aufkonzentrierten Mischprobe enthaltend fetale Zellen und mütterliches Blut in einem Verhältnis von 1: 1.000 einer PCR mit einem Primerpaar unterworfen, wobei das Primerpaar dazu angepasst war, jeweils eine STR-Sequenz des Chromosoms 21 zu amplifizieren. Für ein gesundes, bezüglich des Chromosoms 21 homozygotes Individuum werden somit ein Amplifikationsprodukt, für ein gesundes, bezüglich des Chromosoms 21 heterozygotes Individuum zwei Amplifikationsprodukte, für ein Individuum mit monoallelischer Trisomie ein Amplifikationsprodukt, für ein Individuum mit biallelischer Trisomie zwei Amplifikationsprodukte und für ein Individuum mit triallelischer Trisomie drei Amplifikationsprodukte erwartet. Zudem wurde anhand einer weiteren Teilmenge der biologischen Probe eine Verdünnungsreihe pipettiert und mit einer Teilmenge jeder Verdünnungsstufe dieselbe PCR wie für die Teilmenge der unverdünnten Probe durchgeführt. Dabei wurde folgendes Ergebnis erhalten:
Figure imgf000036_0001
pos = positiv (Amplifikationsprodukt erhalten) neg = negativ (kein Amplifikationsprodukt erhalten)
Wie aus der Tabelle ersichtlich, werden die Amplifikationsprodukte mit einer Länge von 132 bp und 144 bp bis zu einer Verdünnungsstufe von 1: 1.000 bzw. 1:500 erhalten, wohingegen die beiden anderen Amplifikati- onsprodukte mit einer Länge von 136 bp und 156 bp schon ab einer Verdünnungsstufe von 1:5 bzw. 1:7 ausfallen. Daraus folgt, dass die Allele mit den Längen 136 bp und 156 bp dem Fötus zuzuordnen sind, da sie bei wesentlich geringeren Verdünnungen ausfallen als die beiden anderen Allele mit den Längen 132 bp und 144 bp. Anhand eines Vergleichs mit mütterlichen Zellen aus Gewebe kann dieses Ergebnis verifiziert werden.
Das vorstehende Ergebnis lässt jedoch noch nicht den sicheren Schluss zu, ob die Allele mit den Längen 136 bp und 156 bp in einer oder in zwei Kopien vorkommen. Hierzu wird mit Teilmengen der biologischen Probe der Verdünnungsstufe 1:5 jeweils dieselbe wie die vorgenannte Amplifika- tionsreaktion in 5 parallel durchgeführten Experimenten durchgeführt. Im Prinzip entspricht dies einer fünffachen Mehrfachbestimmung. Dabei wurde folgendes Ergebnis erhalten:
Figure imgf000037_0001
Exp. = Experiment
Anschließend wurde dasselbe Experiment jeweils fünfmal mit einer Teilmenge der Verdünnungsstufe 1:7 durchgeführt, wobei folgendes Ergebnis erhalten wurde:
Figure imgf000038_0001
Aus den beiden vorstehenden Tabellen ist ersichtlich, dass das Allel mit der Länge 156 bp bei einer gegebenen Verdünnungsstufe mit einer signifikant höheren Wahrscheinlichkeit dropouts, d.h. Ausfälle des zu erwartenden Amplifikationsprodukts, zeigt als das Allel mit der Länge 136 bp. Daraus lässt sich mit einer gewissen Wahrscheinlichkeit schließen, dass das Allel mit der Länge 136 bp mit jeweils zwei Kopien pro Zelle und das Allel mit der Länge 156 bp in einer Kopie pro Zelle vorkommt. Würden beide Allele mit der gleichen Kopienzahl je Zelle vorkommen, so sollten die dropouts bei gleicher Verdünnung auch gleich häufig sein.
Mithin lassen die vorstehenden Experimenten Aussagen über die relative Anzahl von Allelen eines Individuums aus einer biologischen Probe, welche Nukleinsäuren von zwei verschiedenen Individuen enthält, zu. In dem konkreten Fall wurde für den Fötus eine biallelische Trisomie 21 diagnostiziert. Wie der Fachmann erkennt, könnte die Sicherheit der getroffenen Aussagen des vorstehenden Versuches erhöht werden, wenn man bei der Amplifikationsreaktion mehr als zwei Primerpaare einsetzen würde.
Beispiel 2
Es wurde wie in Beispiel 1 beschrieben vorgegangen, wobei jedoch in der PCR eine andere biologische Probe maternalen Bluts enthaltend fetale Zellen eingesetzt wurde. Dabei wurde folgendes Ergebnis erhalten:
Figure imgf000039_0001
pos = positiv (Amplifikationsprodukt erhalten neg = negativ (kein Amplifikationsprodukt erhalten)
Wie aus der vorstehenden Tabelle hervorgeht, fallen die Amplifikati- onsprodukte mit einer Länge von 136 bp, 156 bp und 160 bp bei einer geringeren Verdünnungsstufe aus als die entsprechenden Amplifikati- onsprodukte mit einer Länge von 132 bp und 144 bp. Daraus folgt, dass die drei erstgenannten Amplifikationsprodukte dem in der biologischen Probe in einer geringeren Menge vorliegenden fetalen Zellen zuzuordnen ist, wohingegen die beiden letztgenannten Amplifikationsprodukte der Mutter zuzuordnen sind. Da für die unverdünnte Probe für den Fötus drei Amplifikationsprodukte, für die Mutter hingegen nur zwei Amplifikationsprodukte erhalten wurde, kann man mit einer großen Wahrscheinlichkeit die Aussage getroffen werden, dass der Fötus unter triallelischer Trisomie des Chromosoms 21 leidet.
Beispiel 3
Im Folgenden soll eine forensische Mischprobe, nämlich eine an einem Tatort für ein Gewaltverbrechen sichergestellte biologische Probe enthaltend Nukleinsäuren verschiedener Individuen, charakterisiert werden. Hierzu wurde wie in Beispiel 1 eine Amplifikationsreaktion mit verschiedenen Verdünnungsstufen der biologischen Probe durchgeführt, wobei folgendes Ergebnis erhalten wurde:
Figure imgf000040_0001
pos = positiv (Amplifikationsprodukt erhalten neg = negativ (kein Amplifikationsprodukt erhalten)
Aus der Tabelle ist ersichtlich, dass insgesamt vier Amplifikationsproduk- te erhalten wurden, von denen 2wei, nämlich die Amplifikationsprodukte mit der Länge 132 bp und 144 bp erst bei einer hohen Verdünnungsstufe (1:500 bzw. 1: 1.000) ausfallen, wohingegen die beiden anderen Amplifikationsprodukte, nämlich diejenigen mit einer Länge von 136 bp und 156 bp, bereits bei einer niedrigen Verdünnungs stufe von 1:5 bzw. 1:7 ausfallen. Daraus folgt, dass die biologische Probe Nukleinsäure von zwei verschiedenen Individuen enthält, wobei dem Individuum 1 die Allele mit der Länge 132 bp und 144 bp zuzuordnen sind, während dem Individuum 2 die Allele mit der Länge 136 bp und 156 bp zuzuordnen sind. Dieser Schluss wird nahegelegt, da für diese Kombinationen die dropouts bei ähnlichen Verdünnungsstufen auftreten. Es ist daher sehr unwahrscheinlich, dass noch Nukleinsäure eines dritten Individuums in der biologischen Probe enthalten ist, da dann zwei Individuen nur mit einem Allel in der Probe vorhanden wären. Dies ist jedoch sehr unwahrscheinlich. Die Nukleinsäuren der beiden Individuen können nunmehr wie zuvor beschrieben näher charakterisiert werden.
Wie die vorstehenden Beispiele zeigen, lässt sich über eine Verdünnungsreihe und Durchführung von entsprechenden Amplifikationsreaktionen mit der unverdünnten biologischen Probe und einzelnen Verdünnungsstufen der biologischen Probe sowohl die relative Häufigkeit zumindest einer vorbestimmten Sequenz bestimmen als auch eine Identitätsbestimmung durchführen bzw. die Bestimmung der Kopienzahl einzelner Allele. Voraussetzung dafür ist, dass sich die Menge an Nukleinsäuren der einzelnen Individuen in der biologischen Probe unterscheidet. Bevorzugt beträgt dieser Unterschied zur Identitätsbestimmung in etwa Faktor 10. Es reichen aber auch kleinere Unterschiede aus, wenn beispielsweise die Kopienzahl von Allelen eines Individuums aus einer Mischspur bestimmt werden soll. Allerdings ist dann eine gewisse Redundanz notwendig, etwa durch MuI- tiplex-PCR oder Mehrfachbestimmungen einer PCR mit entsprechenden Teilmengen, um die statistische Sicherheit zu erhöhen.
Beispiel 4
Es soll bestimmt werden, ob eine biologische Probe, die neben maternalem Blut auch fetale Zellen enthalten kann, bspw. im Falle einer schwangeren Frau, solche fetale Zellen enthält und wenn diese vorhanden sind, wie das Verhältnis maternaler zu fetaler Zellen ist.
Die Bestimmung der relativen Zellzahl von fetalen Zellen in maternalem Blut ist nach dem aus dem Stand der Technik bekannten und auf PCR basierenden Verfahren nicht oder, wenn überhaupt, nur schlecht möglich, da fetale Zellen in maternalem Blut nur in einer Häufigkeit von 1 zu 1 MiI- Hon Zellen vorkommen. Insofern müssen bei den aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren mehr als 1 μg maternales Blut in die PCR eingesetzt werden, um überhaupt ein auswertbares Ergebnis zu erhalten. Allerdings läuft eine PCR mit derart hohen DNA-Ausgangsmengen nicht mehr optimal ab, so dass ein nur ungenaues Ergebnis erhalten wird. Um dies zu umgehen wurde bereits vorgeschlagen, fetale Zellen per FACS anzureichern. Allerdings werden durch die Anreicherung die Verhältnisse deutlich verschoben.
Da in der biologischen Probe neben den fetalen Zellen maternale Zellen im Überschuss vorhanden sind und beide Zelltypen jeweils einen diploiden Chromosomensatz aufweisen, sind in der biologischen Probe für jedes Gen maximal 4 verschiedene Allele vorhanden. Die Hypothese wird immer sein, dass die maternalen Zellen im Überschuss vorliegen. In der PCR wurde nunmehr für einen bestimmten Genabschnitt ein allelspezifisches Primerpaar eingesetzt, wobei folgende Ergebnisse erhalten wurden:
Figure imgf000042_0001
pos: positive PCR-Reaktion neg: negative PCR-Reaktion
AUeI I- 1: Allel 1 aus Zelltyp I (fetale Zellen)
Allel II-2: Allel 2 aus Zelltyp II (maternale Zellen)
Aus dem Vergleich der Anzahl der positiven PCR's pro Verdünnungsstufe geht hervor, dass offensichtlich in der biologischen Probe mehr maternale Zellen als fetale Zellen enthalten sind, da bei der Amplifikation der fetalen Zellen DNA-Kopien früher dropouts auftreten als bei den maternalen Zellen. So sind erste dropouts für die fetalen Zellen bereits bei einer Verdünnungsstufe von 1:8 zu beobachten, wohingegen bei einer Verdünnungsstufe von 1: 16 für die fetalen Zellen keine Amplifikation sprodukte mehr erhalten werden. Hingegen beginnen die dropouts für die maternalen Zellen erst bei einer Verdünnungsstufe von 1:32, bevor ab einer Verdünnungsstufe von 1:64 auch für die maternalen Zellen keine Amplifikati- onsprodukte mehr erhalten werden.
Die relative Aussage bezüglich beider Proben aus dem Eintritt der dropouts (Verdünnungsstufe 1:64 für die maternalen Zellen im Vergleich zu Verdünnungsstufe 1: 16 für die fetalen Zellen), die von Anfang an gemischt vorlagen, ist nun, dass die maternalen Zellen in ca. 4-facher Menge als die fetalen Zellen vorlagen.
Die fetalen und/ oder maternalen Zellen können nun wie zuvor beschrieben weiter charakterisiert werden.
Beispiel 5
Es soll bestimmt werden, ob eine biologische Probe einer Person neben gesunden Zellen auch durch LOH entstandene Krebszellen enthält.
Hierzu wurde mit einem den Genabschnitt D85522 amplifizierenden Primerpaar eine Amplifikationsreaktion mit verschiedenen Verdünnungsstufen der biologischen Probe durchgeführt, wobei folgendes Ergebnis erhalten wurde:
Figure imgf000044_0001
pos: positive PCR-Reaktion neg: negative PCR-Reaktion
Aus der Tabelle geht hervor, dass das Allel 1-2 bei allen Verdünnungsstufen erhalten wurde, wohingegen das Allel I- 1 nur bis zu einer Verdünnungsstufe von 1 : 16 amplifiziert wurde. Die zeigt, dass in der biologischen Probe mehr Kopien des Allels 1-2 als des Allels I- 1 vorliegen. Daraus lässt sich mit einer gewissen Wahrscheinlichkeit schließen, dass die biologische Probe eine Mischprobe ist, die sowohl gesunde, bezüglich des Allels I heterozygote Zellen als auch durch LOH entstandene Krebszellen, die bezüglich des Allels I nur homozygot sind, enthält.
Dieses Ergebnis lässt sich dadurch validieren, dass mehrere Teilmengen der biologischen Probe soweit verdünnt werden, dass diese jeweils nur eine Zelle enthalten und anschließend die DNA jeder Teilmenge unspezifisch amplifiziert wird, bevor die DNA jeder Teilmenge durch Gelelektrophorese aufgetrennt und mit einer für den vorgenannten Genabschnitt spezifischen Sonde durch Southern-Blot visualisiert wird. Das Ergebnis nach dem Auftrag zweier Teilmengen ist in der Fig. 2 wiedergegeben.
Wie sich der Fig. 2 entnehmen lässt, enthält die biologische Probe zwei verschiedene Zelltypen, von denen einer zwei Allele des D85522-Gens enthält (die beiden unteren Banden in der Spur "N"), wohingegen der andere Zelltyp nur eines der beiden Allele des D85522-Gens enthält (die untere Bande in der Spur "T"). Bei den in der oberen Hälfte des Gels abgebildeten Banden handelt es sich um "Konformationsbanden", welche durch alternativ gefaltete Sequenzen von jedem Allel entstehen.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Bestimmung des Genotyps eines oder mehrerer Individuen aus einer biologischen Probe, welche Nukleinsäuren unterschiedlicher Individuen enthält, insbesondere ein Verfahren zur Bestimmung der Kopienzahl einer vorbestimmten Sequenz, umfassend die Schritte:
a) Bereitstellen von wenigstens zwei Teilmengen der biologischen Probe mit jeweils unterschiedlicher Konzentration an der biologischen Probe, b) Durchführen von jeweils wenigstens einer Amplifikationsreaktion mit jeder der in Schritt a) bereitgestellten Teilmengen der biologischen Probe, wobei die wenigstens eine Amplifikationsreaktion daran angepasst ist, eine oder wenigstens zwei zueinander homologe und/ oder nicht homologe Sequenzen, die von wenigstens einer der in der biologischen Probe enthaltenen Nukleinsäuren umfasst sind, zu amplifizieren, c) Bestimmen der für jede der wenigstens zwei Teilmengen mit der jeweils wenigstens einen Amplifikationsreaktion gemäß Schritt b) erhaltenen Anzahl an unterschiedlichen Amplifikationsprodukten und Vergleichen der erhaltenen Zahlen, d) wenn die in Schritt c) bestimmte Anzahl an erhaltenen unterschiedlichen Amplifikationsprodukten für jede der wenigstens zwei Teilmengen gleich ist: Bereitstellen wenigstens einer weiteren Teilmenge der biologischen Probe mit jeweils anderer Konzentration als die in Schritt a) bereitgestellten Teilmengen und Wiederholen der Schritte b) und c) und ggf. d) solange, bis in Schritt c) für wenigstens eine Teilmenge eine andere Anzahl an unterschiedlichen Amplifikati- onsprodukten erhalten wird als für die anderen Teilmengen, e) Charakterisierung der Amplifikationsprodukte, welche mit der wenigstens einen Teilmenge, für die in der wenigstens einen Amplifika- tionsreaktion eine andere Anzahl an unterschiedlichen Amplifikati- onsprodukten erhalten wurde als für die anderen Teilmengen, erhalten wurden und/ oder Charakterisierung der Amplifikationsprodukte, welche sowohl für die wenigstens eine Teilmenge, für die in der wenigstens einen Amplifϊkationsreaktion eine andere Anzahl an unterschiedlichen Amplifikationsprodukten erhalten wurde als für die anderen Teilmengen, als auch für die anderen Teilmengen erhalten wurden.
2. Verfahren zur Bestimmung des Genotyps eines oder mehrerer Individuen aus einer biologischen Probe, welche Nukleinsäuren unterschiedlicher Individuen enthält, insbesondere ein Verfahren zur Bestimmung der Kopienzahl einer vorbestimmten Sequenz umfassend die Schritte:
a) Bereitstellen einer Teilmenge der biologischen Probe, b) Durchführen wenigstens einer Amplifikationsreaktion mit der Teilmenge der biologischen Probe, wobei die wenigstens eine Amplifikationsreaktion daran angepasst ist, eine oder wenigstens zwei zueinander homologe und/ oder nicht homologe Sequenzen, die von wenigstens einer der in der biologischen Probe enthaltenen Nukleinsäuren umfasst sind, zu amplifizieren, c) Bestimmen der Anzahl der erhaltenen unterschiedlichen Amplifikationsprodukte für jede der wenigstens einen Amplifikationsreaktion von Schritt b), d) Bereitstellen einer weiteren Teilmenge der biologischen Probe, Verdünnen der weiteren Teilmenge der biologischen Probe und Durch- führen wenigstens einer Amplifikationsreaktion unter denselben Bedingungen wie in Schritt b) mit der verdünnten Probe, e) Bestimmen der Anzahl der erhaltenen unterschiedlichen Amplifika- tionsprodukte für jede der wenigstens einen Amplifikationsreaktion von Schritt d), f) Vergleichen der in Schritt c) bestimmten Anzahl an unterschiedlichen Amplifikationsprodukten mit der in Schritt e) bestimmten Anzahl an unterschiedlichen Amplifikationsprodukten, g) wenn die in Schritt c) bestimmte Anzahl gleich der in Schritt e) bestimmten Anzahl ist: Wiederholen der Schritte d) bis f) mit einem höheren Verdünnungsfaktor der biologischen Probe solange, bis in Schritt e) eine geringere Anzahl an unterschiedlichen Amplifikationsprodukten erhalten wird als in Schritt c), h) Charakterisierung der Amplifikationsprodukte, welche bei der wenigstens einen Amplifikationsreaktion gemäß Schritt b), nicht aber bei der wenigstens einen Amplifikationsreaktion gemäß Schritt d) mit einem Verdünnungsfaktor, bei dem in Schritt e) eine geringere Anzahl an unterschiedlichen Amplifikationsprodukten als in Schritt c) erhalten wurde, erhalten wurden und/ oder Charakterisierung der Amplifikationsprodukte, welche sowohl bei der wenigstens einen Amplifikationsreaktion gemäß Schritt b) als auch bei der wenigstens einen Amplifikationsreaktion gemäß Schritt d) mit einem Verdünnungsfaktor, bei dem in Schritt e) eine geringere Anzahl an unterschiedlichen Amplifikationsprodukten als in Schritt c) erhalten wurde, erhalten wurden.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die biologische Probe Nukleinsäuren von wenigstens zwei verschiedenen Individuen, bevorzugt von wenigstens zwei, aber weniger gleich 10, besonders bevorzugt von wenigstens zwei, aber weniger gleich 5, ganz besonders bevorzugt von zwei oder drei und höchst bevorzugt von genau zwei verschiedenen Individuen enthält.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Konzentrationsunterschied der von den einzelnen Individuen in der biologischen Probe enthaltenen Nukleinsäuren untereinander zwischen 1: 1.000 und 1: 1, bevorzugt zwischen 1:500 und 1:5 und besonders bevorzugt zwischen 1: 100 und 1: 10 beträgt.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass als biologische Probe eine forensische Probe eingesetzt wird.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die biologische Probe maternales Blut enthaltend fetale Zellen umfasst oder bevorzugt aus maternalem Blut enthaltend fetale Zellen besteht.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die biologische Probe eine Mischung aus gesunden Zellen und aus durch LOH entstandenen Krebszellen ist.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die wenigstens eine Amplifikationsreaktion eine PCR- Reaktion ist.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die wenigstens eine Amplifikationsreaktion dazu angepasst ist, eine oder wenigstens zwei zueinander homologe und/ oder nicht homologe Sequenzen aus dem nicht kodierenden DNA-Bereich zu amplifizieren.
10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die wenigstens eine Amplifikationsreaktion dazu angepasst ist, eine oder wenigstens zwei zueinander homologe und/ oder nicht homologe hochpolymorphe Sequenzen zu amplifizieren.
11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die wenigstens eine Amplifikationsreaktion dazu angepasst ist, eine oder wenigstens zwei zueinander homologe und /oder nicht homologe Sequenzen zu amplifizieren, welche aus der aus STR- Sequenzen, VNTR-Sequenzen, SNP-Sequenzen und beliebigen Kombinationen hiervon bestehenden Gruppe ausgewählt sind.
12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die wenigstens eine Amplifikationsreaktion dazu angepasst ist, eine oder wenigstens zwei zueinander homologe und /oder nicht homologe Sequenzen zu amplifizieren, welche in dem Genom des Spenders jeweils pro Allel nur einmal vorkommen.
13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die wenigstens eine Amplifikationsreaktion dazu angepasst ist, zwischen 1 und 100, vorzugsweise zwischen 2 und 20 und besonders bevorzugt zwischen 5 und 15 zueinander homologe und/ oder nicht homologe Sequenzen zu amplifizieren.
14. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt b) bzw. Schritt d) eine zur Amplifikation von wenigstens zwei zueinander homologen und/ oder nicht homologen Sequen- zen angepasste PCR durchgeführt wird, in der eine der Anzahl der wenigstens zwei zueinander homologen und /oder nicht homologen Sequenzen entsprechende Anzahl an Primerpaaren, welche dazu angepasst sind, die wenigstens zwei zueinander homologen und/ oder nicht homologen Sequenzen zu amplifizieren, eingesetzt wird.
15. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt b) bzw. Schritt d) eine zur Amplifikation von wenigstens zwei zueinander homologen und/ oder nicht homologen Sequenzen angepasste PCR durchgeführt wird, wobei in Schritt a) eine der Anzahl der wenigstens zwei zueinander homologen und/ oder nicht homologen Sequenzen entsprechende Anzahl an Teilmengen der biologischen Probe bereitgestellt wird, wobei jede Teilmenge die gleiche Menge an biologischem Material enthält, und in Schritt b) bzw. Schritt d) mit jeder der Teilmengen eine PCR, in der jeweils ein Primerpaar eingesetzt wird, durchgeführt wird, wobei die in den verschiedenen PCR's eingesetzten Primerpaare dazu angepasst sind, die wenigstens zwei zueinander homologen und/ oder nicht homologen Sequenzen zu amplifizieren.
16. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die biologische Probe vor Durchführung des Verfahrensschritts a) mit einer unspezifischen PCR amplifiziert wird und ggf. das so erhaltene Reaktionsprodukt in die erforderliche Anzahl an Teilmengen unterteilt wird.
17. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die An- bzw. Abwesenheit von Amplifikation sprodukten mittels Gelelektrophorese, mittels einer Hybridisierungstechnik auf einem DNA-Array, einem Bead-System oder einer anderen optischen, elektrischen oder elektrochemischen Messung erfolgt.
18. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zur Bestimmung der Anzahl der erhaltenen unterschiedlichen Amplifikationsprodukte nach der Amplifikationsreaktion die An- bzw. Abwesenheit des einen oder der wenigstens zwei zueinander homologen und/ oder nicht homologen Sequenzen sowie von den erhaltenen Amplifikationsprodukten ein zweiter physikalisch und/ oder chemisch messbarer Parameter bestimmt wird.
19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die eine oder wenigstens zwei zueinander homologen und/ oder nicht homologen Sequenzen STR- Abschnitte und/ oder VNTR-Ab schnitte sind und als zweiter Parameter die Länge der erhaltenen Amplifikationsprodukte bestimmt wird, wobei die Anzahl der erhaltenen unterschiedlichen Amplifikationsprodukte der Anzahl der erhaltenen Amplifikationsprodukte mit sich unterscheidender Länge entspricht.
20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die
Länge der Amplifikationsprodukte mit Kapillarelektrophorese bestimmt wird.
21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass die eine oder wenigstens zwei zueinander homologen und /oder nicht homologen Sequenzen SNP-Abschnitte sind und als zweiter Parameter die Sequenz der erhaltenen Amplifikationsprodukte bestimmt wird, wobei die Anzahl der erhaltenen unterschiedlichen Amplifikationsprodukte der Anzahl der erhaltenen Amplifikationsprodukte mit sich unterscheidender Sequenz entspricht.
22. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass die
Sequenz der Amplifikationsprodukte durch DNA-Sequenzierung oder ein Hybridisierungsverfahren bestimmt wird.
23. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Parameter in der wenigstens einen PCR in Schritt b) bzw. Schritt d) derart gewählt werden, dass die relative Häufigkeit für eine positive Amplifikationsreaktion für die eine oder jede der wenigstens zwei zueinander homologen und/ oder nicht homologen Sequenzen jeweils zumindest im Wesentlichen gleich ist.
24. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Parameter in der wenigstens einen PCR in Schritt b) bzw. Schritt d) derart gewählt werden, dass die relative Häufigkeit für eine positive Amplifikationsreaktion für die eine oder jede der wenigstens zwei zueinander homologen und /oder nicht homologen Sequenzen zwischen 0,2 und weniger als 1, bevorzugt zwischen 0,4 und 0,6 sowie besonders bevorzugt etwa 0,5 beträgt.
25. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass parallel zu der wenigstens einen Amplifikationsreaktion gemäß Schritt b) bzw. Schritt d) eine Amplifikationsreaktion unter gleichen Bedingungen mit einer Kontrollprobe durchgeführt wird.
26. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Teilmenge der biologischen Probe in Schritt d) des Verfahrens gemäß Patentanspruch 2 in einem Verhältnis zwischen 1 : 1 und 1: 1.000, bevorzugt zwischen 1: 1 und 1: 100, besonders bevorzugt zwischen 1: 1 und 1: 10 und ganz besonders bevorzugt zwischen 1: 1 und 1:2 verdünnt wird.
27. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass bei der Charakterisierung der Amplifikationsprodukte die relative Anzahl Allele einer vorbestimmten Sequenz bestimmt wird.
28. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zur Charakterisierung der Amplifikationsprodukte wenigstens eine Amplifikationsreaktion unter denselben Bedingungen wie in Schritt b) mit einer Referenzprobe, welche vorzugsweise die gleiche Menge an DNA aufweist, wie die biologische Probe, und, welche vorzugsweise einen bekannten Genotyp aufweist, durchgeführt wird und die Anzahl der mit dieser wenigstens einen Amplifikationsreaktion erhaltenen unterschiedlichen Amplifikationsprodukte mit der Anzahl der für nur einen Teil der Teilmengen erhaltenen unterschiedlichen Amplifikationsprodukte bzw. mit der Anzahl der in Schritt c) abzüglich der in Schritt e) gemäß dem Verfahren nach Patentanspruch 2 erhaltenen unterschiedlichen Amplifikationsprodukte und/ oder mit der Anzahl der für alle Teilmengen erhaltenen unterschiedlichen Amplifikationsprodukte bzw. der Anzahl der in Schritt e) des Verfahrens gemäß Patentanspruch 2 bestimmten unterschiedlichen Amplifikationsprodukte verglichen wird.
29. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 27, dadurch gekennzeichnet, dass die Anzahl der in Schritt c) abzüglich der in Schritt e) erhaltenen unterschiedlichen Amplifikationsprodukte und/ oder die Anzahl der in Schritt e) bestimmten unterschiedlichen Amplifikationsprodukte mit wenigstens einer Häufigkeitsverteilung verglichen wird, welche durch getrenntes jeweils mehrmaliges Durchführen der gleichen und unter denselben Reaktionsbedingungen wie der in Schritt b) eingesetzten wenigstens einen Amplifikationsreaktion, wobei in den Amplifikationsreaktionen die gleiche wie in Schritt a) genannte Menge an Ausgangsmaterial eingesetzt wurde/wird, mit wenigstens zwei verschiedenen Referenzproben, wobei die wenigstens zwei verschiedenen Referenzproben jeweils eine bekannte, voneinander verschiedene Kopienzahl der vorbestimmten Sequenz aufweisen, sowie anschließendes Bestimmen der pro Referenzprobe erhaltenen Anzahl an unterschiedlichen Amplifikationsprodukten, erhalten wurde/wird.
30. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zur Charakterisierung der Amplifikationsprodukte die erhaltenen Amplifikationsprodukte sequenziert oder einem Hybridisierungs- verfahren unterzogen werden.
31. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zur Charakterisierung der Amplifikationsprodukte mit einer oder mehreren Verdünnungsstufen der biologischen Probe eine Mehrfachbestimmung wenigstens einer PCR, bei der vorzugsweise wenigstens ein allelspezifisches Primerpaar eingesetzt wird, durchgeführt wird.
32. Verfahren nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, dass die
Anzahl der Mehrfachbestimmungen zwischen 2 und 1.000, besonders bevorzugt zwischen 3 und 100, ganz besonders bevorzugt zwischen 4 und 15 und höchst bevorzugt zwischen 5 und 10 beträgt.
33. Kit zur Bestimmung des Genotyps eines oder mehrerer Individuen aus einer biologischen Probe, welche Nukleinsäuren unterschiedlicher Individuen enthält, insbesondere zur Durchführung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 32, umfassend: a) wenigstens ein Primerpaar, welches dazu angepasst sind, in wenigstens einer PCR eine oder wenigstens zwei zueinander homologe und/ oder nicht homologe Sequenzen, die von wenigstens einer der in der biologischen Probe enthaltenen Nukleinsäuren umfasst sind, zu amplifizieren, bi) eine Referenzprobe mit einem bekannten Genotyp und vorzugsweise mit einer bezüglich einer vorbestimmten Sequenz bekannten Kopienzahl und /oder b2) das Ergebnis wenigstens einer, unter den gleichen wie in dem Protokoll gemäß d) vorgeschrieben, durchgeführten Amplifikations- reaktion mit einer Referenzprobe, wobei die Reaktionsbedingungen so gewählt waren, dass das wenigstens eine Amplifikati- onsprodukt mit einer Wahrscheinlichkeit zwischen 20% und weniger als 100% entstand, und/ oder bß) wenigstens eine Häufigkeitsverteilung, welche durch getrenntes jeweils mehrmaliges Durchführen der gleichen und unter denselben Reaktionsbedingungen wie der in dem Protokoll d) vorgeschriebenen wenigstens einen Amplifikationsreaktion mit wenigstens zwei verschiedenen Referenzproben, wobei die wenigstens zwei verschiedenen Referenzproben jeweils eine bekannte, voneinander verschiedene Kopienzahl einer vorbestimmten Sequenz aufweisen, sowie anschließendes Bestimmen der pro Referenzprobe erhaltenen Anzahl an unterschiedlichen Amplifikationsproduk- ten erhalten wurde, und c) ggf. PCR-Puffer und d) ein Protokoll für die Durchführung der wenigstens einen PCR in a) und ggf. Angaben zu den vorzunehmenden Verdünnungen.
34. Kit nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, dass das wenigstens eine Primerpaar dazu angepasst ist, in der wenigstens einen PCR eine oder wenigstens zwei zueinander homologe und /oder nicht homologe Sequenzen aus dem nicht kodierenden DNA-Bereich, bevorzugt hochpoly- morphe zueinander homologe und/ oder nicht homologe Sequenzen, welche besonders bevorzugt aus der aus STR- Sequenzen, VNTR-Sequenzen, SNP-Sequenzen und beliebigen Kombinationen hiervon bestehenden Gruppe ausgewählt sind, zu amplifizieren.
35. Kit nach Anspruch 33 oder 34, dadurch gekennzeichnet, dass das wenigstens eine Primerpaar gemäß a) und /oder das Protokoll gemäß d) daran angepasst ist, in der wenigstens einen PCR zwischen 1 und 100, vorzugsweise zwischen 2 und 20 und besonders bevorzugt zwischen 5 und 15 zueinander homologe und /oder nicht homologe Sequenzen zu amplifizieren.
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