DE102005008583B4 - Verfahren zur Typisierung eines Individuums mittels short tandem repeat (STR)-Loci der genomischen DNA - Google Patents

Verfahren zur Typisierung eines Individuums mittels short tandem repeat (STR)-Loci der genomischen DNA Download PDF

Info

Publication number
DE102005008583B4
DE102005008583B4 DE102005008583A DE102005008583A DE102005008583B4 DE 102005008583 B4 DE102005008583 B4 DE 102005008583B4 DE 102005008583 A DE102005008583 A DE 102005008583A DE 102005008583 A DE102005008583 A DE 102005008583A DE 102005008583 B4 DE102005008583 B4 DE 102005008583B4
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
typing
str
individual
dna
individual according
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
DE102005008583A
Other languages
English (en)
Other versions
DE102005008583A1 (de
Inventor
Klaus Bender
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Johannes Gutenberg Universitaet Mainz
Original Assignee
Johannes Gutenberg Universitaet Mainz
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Johannes Gutenberg Universitaet Mainz filed Critical Johannes Gutenberg Universitaet Mainz
Priority to DE102005008583A priority Critical patent/DE102005008583B4/de
Priority to PCT/EP2006/001701 priority patent/WO2006089762A1/de
Priority to EP06707244A priority patent/EP1853723A1/de
Priority to US11/816,895 priority patent/US20080286773A1/en
Publication of DE102005008583A1 publication Critical patent/DE102005008583A1/de
Application granted granted Critical
Publication of DE102005008583B4 publication Critical patent/DE102005008583B4/de
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification

Abstract

Verfahren zur Typisierung eines Individuums, umfassend die Schritte von
a) zur Verfügung stellen von stark degradierter genomischer DNA von dem Individuum,
b) Amplifikation von mindestens zwei short tandem repeat (STR)-Loci der genomischen DNA mittels Paaren von Amplifikations-Primern, wobei mindestens ein Primer mit einer Bindungsgruppe versehen ist,
c) Auftrennung der amplifizierten STR-Fragmente mittels der Bindungsgruppe in mindestens zwei Fraktionen von Amplifikaten, und
d) getrennter Nachweis der STR-Fragmente der Fraktionen.

Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue STR Typisierungsstrategie, die die gleichzeitige Amplifikation und anschließende Analyse von mehreren (z.B. elf) polymorphen Systemen mit Amplikongrößen von weniger als 270 bp ermöglicht. Dabei wird nach PCR Amplifikation die Multiplexreaktion in zwei Sets von STR Multiplexen aufgeteilt und getrennt analysiert. Dieses Multiplexsystem wurde speziell für die Verwendung in forensischer Ermittlungsarbeit entwickelt und getestet, wenn nur begrenzte Mengen oder stark degradierte DNA erhältlich ist, zum Beispiel, wenn aus Telogenhaarwurzeln isoliert. Die vorliegende Erfindung betrifft zudem ein entsprechendes Kit zur STR Typisierung.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Für die Typisierung von Spuren und Personen werden heute fast ausschließlich Merkmale der genomischen DNA in Form sogenannter "Short Tandem Repeat" (STR)-Polymorphismen verwendet [T.R. Moretti, A.L. Baumstark, D.A. Defenbaugh, K.M. Keys, J.B. Smerick, B. Budowle, Validation of short tandem repeats (STRs) for forensic usage: performance testing of fluorescent multiplex STR Systems and analysis of authentic and simulated forensic samples, J Forensic Sei 46 (2001) 647–660]. Dabei handelt es sich um unabhängig vererbte autosomale Short Tandem Repeat-Systeme (STR-Systeme), die nach PCR-Amplifikation in Multiplex-PCR-Systemen z.B. kapillarelektrophoretisch aufgetrennt werden.
  • Aufgrund des Abstands der verwendeten Primer zu den sich wiederholenden Repeat Einheiten ergeben sich nach PCR-Amplifikation fest definierte Fragmentlängen. Diese liegen bei den kommerziell verwendeten Multiplex-Systemen zwischen 100 und 400 bp. Damit müssen zu typisierende DNA-Stücke mindestens dieselbe Länge haben oder größer sein [B.E. Krenke, A. Tereba, S.J. Anderson, E. Buel, S. Culhane, C.J. Finis, C.S. Tomsey, J.M. Zachetti, A. Masibay, D.R. Rabbach, E.A. Amiott, C.J. Sprecher, Validation ofa 16-locus fluorescent multiplex System, J Forensic Sei 47 (2002) 773–785, E.A. Cotton, R.F. Allsop, J.L. Guest, R.R. Frazier, P.
  • Koumi, 1.P. Callow, A. Seager, R.L. Sparkes, Validation of the AMPFISTR SGM plus system for use in forensic casework, Forensic Sci Int 112 (2000) 151–161].
  • Die Untersuchung von Minimalspuren, wie z.B. Knochenfragmenten, Fingerabdrücken und telogenen Haaren erfordert sehr effektive Typisierungsverfahren, die eine hohe Sensitivität mit der Bestimmung von möglichst vielen DNA-Merkmalen verbinden. Die Amplifikation erfolgt normalerweise unter optimierten Bedingungen bei geringsten DNA-Mengen (11 μl Probenvolumen/34 PCR-Zyklen). Dieses Verfahren zum Nachweis von "low copy number" DNA-Molekülen muß bei derartigen biologischen Spuren angewandt werden, da hier nur minimalste Mengen menschlicher DNA zu erwarten sind. Auch kann die Amplifikation nur einmal durchgeführt werden, da die extrahierte DNA vollständig aufgebraucht wird. Aus den bisherigen Verfahren ergibt sich weiterhin daß bei Verwendung von drei unterschiedlichen Fluoreszenzfarben als Markierungen bei der Analyse maximal fünf bis sechs STR-Systeme ohne Überlappung der PCR-Fragmente in einem Ansatz analysiert werden können.
  • Trotzdem führen in Fällen, in denen nur eine sehr geringe Menge von DNA erhältlich ist und/oder die Qualität der DNA aufgrund von Degradation schlecht ist, kommerzielle Multiplexkits oft zu keinen oder nur teilweisen DNA Profilen [P.M. Schneider, K. Bender, et al., STR analysis of artificially degraded DNA-results of a collaborative European exercise, Forensic Sci Int 139 (2004) 123–134].
  • Ein direkter Zusammenhang zwischen Amplifikationseffizienz und Amplikongröße wurde klar gezeigt [K. Bender, M.J. Farfan, P.M. Schneider, Preparation of degraded human DNA under controlled conditions, Forensic Sci Int 139 (2004) 135–140; D.T. Chung, J. Drabek, K.L. Opel, J.M. Butler, B.R. McCord, A study on the effects of degradation and template concentration on the Amplifikation efficiency of the STR Miniplex primer sets, J Forensic Sci 49 (2004) 733–740]. In vielen Fällen können Haare von dem Opfer oder von dem möglichen Angreifer an einer Verbrechensstelle gefunden werden, von diesen sind jedoch mehr als 90% sogenannte Telogenhaare, die keine anheftenden Haarwurzelzellen aufweisen. Mit den kommerziellen STR Kits werden gewöhnlich Amplikongrößen erzeugt, die von 100 bis 400 bp reichen. Bei der Typisierung von DNA aus Telogenhaaren wird bei größeren STR Fragmentgrößen gewöhnlich ein Verlust der Signalstärke beobachtet, aufgrund der Tatsache, daß die DNA während der Haarentwicklung in kleinere Stücke fragmentiert wurde [H. Matsuda, K. Imaizumi, S. Kubota, S. Miyasaka, M. Yoshino, S. Seta, Technical Investigation of DNA extraction from single hair shaft., Rep Nat Res Inst Police Sci 50 (1997) 23–28]. Falls keine Haarwurzel vorhanden ist, ist nur eine Typisierung von mitochondrieller-(mt)DNA (Haarfragmente) möglich, oder es können die neuen STR Systeme für verkürzte Amplikongrößen können verwendet werden. Für diese Typisierung von schwierigen DNAs, d.h. stark degradierter DNA wie sie z.B. bei der Extraktion aus Haaren vorliegt, wurden daher in den letzten Jahren verkürzte Primer entwickelt. Dabei werden die Primer auf der DNA-Sequenz näher an die Repeat-Einheit herangerückt, so daß insgesamt kürzere DNA-Fragmente analysiert werden können. Die minimale Länge dieser Fragmente liegt bei 60 bis 250 bp [P. Grubwieser, R. Muhlmann, W. Parson, New sensitive amplification primers for the STR locus D2S1338 for degraded casework DNA, Int J Legal Med 117 (2003) 185–188; J.M. Butler, Y. Shen, B.R. McCord, The development of reduced size STR amplicons as tools for analysis of degraded DNA, J Forensic Sei 48 (2003) 1054–1064; P. Wiegand, M. Kleiber, Less is more – length reduction of STR amplicons using redesigned primers, Int J Legal Med 114 (2001) 285–287; Y. Shigeta, Y. Yamamoto, Y. Doi, S. Miyaishi, H. Ishizu, Evaluation of a method for typing the microsatellite D 12S391 locus using a new primer pair and capillary electrophoresis, Acta Med Okayama 56 (2002) 229–236].
  • Bisher wurden entweder Einzel-PCR-Reaktionen oder kleine Multiplex-PCRs durchgeführt [J.M. Butler, Y. Shen, B.R. McCord, The development of reduced size STR amplicons as tools for analysis of degraded DNA, J Forensic Sei 48 (2003) 1054–1064; P. Wiegand, M. Kleiber, Less is more – length reduction of STR amplicons using redesigned primers, Int J Legal Med 114 (2001) 285–287].
  • Ein weiterer Ansatz ist die aufeinanderfolgende Amplifikation von Einzel-STR-Systemen, wobei die DNA an eine Membran gebunden ist (Festphasen-PCR) [A. Hellmann, U. Rohleder, H. Schmitter, M. Wittig, STR typing of human telogen hairs – a new approach, Int J Legal Med 114 (2001) 269–273]. Dieser Ansatz, speziell für die Typisierung von Telogenhaarwurzeln entwickelt, verwendet eine Reihe von einzelnen STR Typisierungsschritten, während die aus dem Haar extrahierte DNA währen der aufeinanderfolgenden PCR Reaktionen auf einer Membran fixiert ist. Diese sogenannte Festphasen-PCR, anfänglich für drei STR Systeme publiziert, wurde jetzt bis auf sieben STR Systeme zuzüglich Amelogenin erweitert (H. Schmitter und A. Hellmann, persönliche Mitteilung). Obwohl der Test gut funktioniert, ist diese Prozedur sehr zeitintensiv und der Erfolg der Typisierung hängt stark von der Qualität der für die Bindung der DNA verwendeten Membran ab. Um diese repetitiven PCR Amplifikationsschritte zu vermeiden, wurden durch einige Arbeitsgruppen kurze PCR Multiplexe ent wickelt [J.M. Butler, Y. Shen, B.R. McCord, The development of reduced size STR amplicons as tools for analysis of degraded DNA, J Forensic Sci 48 (2003) 1054–1064; P. Wiegand, M. Kleiber, Less is more – length reduction of STR amplicons using redesigned primers, Int J Legal Med 114 (2001) 285–287; C. Meissner, persönliche Mitteilung]. Wie in allen kommerziellen STR Multiplexkits werden die verschiedenen STR Systeme durch ihre Amplikongrößen und den Fluoreszenzfarbstoff für den entsprechenden Locus unterschieden. Wenn die maximalen Größen der amplifizierten PCR Produkte auf ungefähr 250 bp begrenzt sind, kann zur Typisierung von hoch fragmentierter DNA nur eine kleine Zahl von STR in diesem Größenbereich angeordnet werden.
  • Nachteihafterweise können somit bei der Einzel-PCR, bei Vorhandensein von minimalsten Mengen an DNA, nur ein STR System analysiert werden. Bei den kleinen Multiplexen können ebenfalls nur wenige STR Systeme analysiert werden. Meist sind darunter zu wenig in der Datenbank verwertbare Systeme vorhanden. Bei der Festphasen-PCR besteht durch die häufigen Waschschritte zudem eine erhöhte Kontaminationsgefahr, des weiteren ist die Durchführung der Analyse stark abhängig von der Qualität der verwendeten Membran.
  • Kaderali L et al (in Kaderali L, Deshpande A, Nolan JP, White PS. Primer-design for multiplexed genotyping. Nucleic Acids Res. 2003 Mar 15;31(6):1796–802) und Fan et al. (in: Fan JB, Chen X, Halushka MK, Berno A, Huang X, Ryder T, Lipshutz RJ, Lockhart DJ, Chakravarti A. Parallel genotyping of human SNPs using generic high-density oligonucleotide tag arrays. Genome Res. 2000 Jun;10(6):853–60) beschreiben die SNP-Analyse auf einem DNA Mikrochip, z.B. mittels vorgewählter Oligonukleotide und Fluoreszenzmarkern. Die Verfahren sind aufwendig und teuer und erfordern eine Chipanalyse, die STR-Analyse ist mit den Systemen ebenfalls nicht möglich. Auch kann degenerierte DNA nicht effektiv analysiert werden. Zudem bringen die Verfahren Probleme mit möglicher Kontaminierung mit sich.
  • Die Untersuchung von Minimalspuren, wie z.B. Knochenfragmenten, Fingerabdrücken und telogenen Haaren erfordert somit sehr effektive Typisierungsverfahren, die eine hohe Sensitivität mit der Bestimmung von möglichst vielen DNA-Merkmalen verbindet.
  • In einem ersten Aspekt davon wird diese Aufgabe der vorliegenden Erfindung durch ein Verfahren zur Typisierung eines Individuums gelöst, das die Schritte umfaßt von a) zur Verfügung stellen von stark degradierter genomischer DNA von dem Individuum, b) Amplifikation von mindestens zwei short tandem repeat (STR)-Loci der genomischen DNA mittels Paaren von Amplifikations-Primern, wobei mindestens ein Primer mit einer Bindungsgruppe versehen ist, c) Auftrennung der amplifizierten STR-Fragmente mittels der Bindungsgruppe in mindestens zwei Fraktionen von Amplifikaten, und d) getrennter Nachweis der STR-Fragmente der Fraktionen.
  • Durch die Kombination von zwei (Multiplex)-PCR-Reaktion, die im Laufe der Analyse wieder voneinander getrennt werden, ist es möglich, eine verbesserte Qualität der STR-Analyse, insbesondere bei kleinsten Mengen an DNA, zu erzielen. Zudem ist es erstmals möglich, in einem Ansatz mindestens 10 autosomale STR-Systeme plus dem geschlechts-spezifischen Amelogenin-System zu analysieren.
  • Dies wird erfindungsgemäß dadurch erreicht, daß in einer bevorzugten Ausführungsform zwei kleinere Multiplex-PCR-Reaktionen (eine 5-Plex und eine 6-Plex) gemeinsam als Multiplex-PCR amplifiziert werden. Durch die Verwendung von z.B. biotinylierten PCR-Primern bei einem der beiden kleinen Multiplexe können dessen Produkte nach erfolgter PCR nach Bindung an z.B. Streptavidin beschichtete Sepharosebeads abgetrennt werden und auf der Kapillargelelektrophorese getrennt untersucht werden. Damit würden sie die PCR-Produkte zwar im Multiplex überlappen, jedoch nicht bei der Trennung der Multiplexe und separater Kapillarelektrophorese. Der Unterschied zu den o.g. Verfahren ist somit die Verwendung von mit einer Bindungsgruppe versehenen (z.B. biotinylierten) PCR-Primern bei einem Subset der Multiplex-Reaktion. Dies ermöglicht die Amplifikation von sich in der Länge überlappenden PCR-Fragmenten, die ohne Trennung nicht gemeinsam auf der Kapillarelektrophorese untersucht werden könnten.
  • Vorteilhafterweise ermöglicht die Erfindung die Bestimmung von möglichst vielen DNA-Merkmalen auch aus geringsten DNA-Spuren in einem Ansatz. Dadurch wird zum einem möglichst wenig Spurenmaterial verwendet, um eine zweite unabhängige Analyse zu ermöglichen bzw. bei geringsten DNA-Mengen, wenn die gesamte isolierte DNA eingesetzt werden muß, überhaupt mehrere Merkmale bestimmen zu können. Im Vergleich zur sukzessiven Amplifikation mit der Festphasen-PCR nach z.B. Hellmann et al. ergibt sich zudem eine deutliche Zeitersparnis und eine deutlich geringere Kontaminationsgefahr. Im Vergleich zu anderen Multiplex-Reaktionen ist eine deutliche Steigerung in der Anzahl der untersuchbaren DNA-Merkmale möglich.
  • Bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Verfahren zur Typisierung eines Individuums, wobei das Individuum ein Säugetier, wie zum Beispiel ein Mensch ist.
  • Weiter bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Verfahren zur Typisierung eines Individuums, wobei die STR-Loci ausgewählt sind aus der Gruppe, umfassend D3S1358, D8S1179, D21S11, TH01, FGA, VWA, D2S1338, D12S391, TPOX, D5S818, D18S51, FES und Amelogenin.
  • Noch weiter bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Verfahren zur Typisierung eines Individuums, wobei mehr als drei, vier, fünf sechs, sieben, acht, neun, zehn oder elf STR-Loci amplifiziert werden. Erfindungsgemäß kann die Amplifikation mittels PCR und/oder Multiplex-Amplifikation erfolgen.
  • Auch weiter bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Verfahren zur Typisierung eines Individuums, wobei die Primer markiert sind, zum Beispiel mit einem Fluoreszenzfarbstoff. Der Fluoreszenzfarbstoff kann jeder geeignete Farbstoff sein, insbesondere ist er ausgewählt aus der Gruppe, umfassend 6-FAM, JOE, NED und PET(rot).
  • Auch weiter bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Verfahren zur Typisierung eines Individuums, wobei die Bindungsgruppe ausgewählt ist aus der Gruppe, umfassend Biotin, Streptavidin, einem His-tag, hitzestabilen Antigen und Oligonukleotid. Erfindungsgemäß können alle Bindungsgruppen verwendet werden, die nicht mit der Amplifikation interferieren und sich für eine anschließende Abtrennung der Fraktionen eignen. Diese Auftrennung der amplifizierten STR-Fragmente mittels der Bindungsgruppe kann eine feste Phase umfassen, auf der z.B. Biotin, Streptavidin, Antikörper oder komplementäre Oligonukleotide immobilisiert sind Erfindungsgemäß kann die feste Phase eine Membran, Sepharose beads oder magnetische Sepharose beads umfassen. Geeignete andere Phasen sind dem Fachmann bestens bekannt.
  • Bevorzugt ist dann ein erfindungsgemäßes Verfahren zur Typisierung eines Individuums, wobei die genomische DNA aus Blut, Blutbestandteilen, Sperma und/oder Telogenhaaren stammt.
  • Weiter bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Verfahren zur Typisierung eines Individuums, wobei der Nachweis der STR-Fragmente der Fraktionen eine Längenbestimmung der Fragmente umfaßt, zum Beispiel mittels Kapillargelelektrophorese. Geeignete andere Nachweisverfahren sind dem Fachmann ebenfalls bestens bekannt.
  • Noch weiter bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Verfahren zur Typisierung eines Individuums, wobei als Primerpaare mindestens zwei Paare ausgewählt aus der Gruppe der SEQ ID Nrn. 1–3; 4 und 5; 6 und 7; 8 und 9; 10 und 11; 12 und 13; 14 und 15; 16 und 17; 18 und 19; 20 und 21; und 22 und 23 (siehe Tabelle 1) eingesetzt werden.
  • Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft dann ein Verfahren zur Typisierung eines Individuums, das weiterhin eine Identifizierung des Individuums anhand der nachgewiesenen STR-Fragmente umfaßt.
  • Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft dann einen diagnostischen Kit, umfassend mindestens zwei Paare von STR-Primern zur Durchführung des Verfahrens wie oben, gegebenenfalls mit weiteren Materialien und Hilfsstoffen. Entsprechende Materialien und Hilfsstoffe sind zum Beispiel PCR-Reagenzien, Puffer, feste Phasen, Gebrauchsanweisungen, Farbstoffe und anderes.
  • Ein letzter Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft dann die Verwendung des Verfahrens wie oben oder des Kits wie oben im Rahmen der Forensik.
  • Eine neue STR Typisierungsstrategie wurde entwickelt, die die gleichzeitige Amplifikation und anschließende Analyse von (z.B.) elf polymorphen Systemen mit Amplikongrößen kleiner als 270 bp ermöglicht. Die Multiplex Amplifikationsreaktion schließt sechs STR Loci aus dem europäischen Standardset von Loci (ESS) für DNA Datenbanken (D3S1358, D8S1179, D21S11, TH01, FGA und VWA), sowie vier zusätzliche STR Systeme ein, die aufgrund ihrer Robustheit ausgewählt wurden (D2S1338, D12S391, TPOX und D5S818), zusammen mit dem Geschlechts-spezifischen Locus Amelogenin. Nach der PCR Amplifikation wird die Multiplexreaktion in zwei Sets von STR Multiplexen unter der Verwendung von Biotin markierten Primern nur für ein Set aufgeteilt. Unter der Verwendung von Streptavidin-beschichteten Sepharosebeads werden z.B. fünf STR Systeme (oder auch zwischen zwei und neun) von den restlichen (z.B. sechs) Systemen abgetrennt, bevor sie in zwei verschiedenen Läufen auf einem Kapillar-Gelelektrophoreseinstrument analysiert werden. Dieses Multiplexsystem wurde speziell für die Verwendung in forensischer Ermittlungsarbeit entwickelt und getestet, wenn nur begrenzte Mengen oder stark degradierte DNA erhältlich ist, zum Beispiel, wenn aus Telogenhaarwurzeln isoliert.
  • In der vorliegenden Erfindung beschreiben die Erfinder ein Verfahren worin z.B. zwei 5-plex und 6-plex PCR Reaktionen in eine große Multiplexreaktion kombiniert werden. 10 STR Systeme plus Amelogenin werden ko-amplifiziert, mit maximalen Fragmentgrößen bis zu 262 Basenpaaren (Tabelle 2), und dann in die zwei anfänglichen kleinen Multiplexreaktionen aufgeteilt. Die Primersequenzen wurden aus veröffentlichten Daten ausgewählt [P. Grubwie ser, R. Muhlmann, W. Parson, New sensitive Amplifikation primers for the STR locus D2S1338 for degraded casework DNA, Int J Legal Med 117 (2003) 185–188; Y. Shigeta, Y. Yamamoto, Y. Doi, S. Miyaishi, H. Ishizu, Evaluation of a method for typing the microsatellite D12S391 locus using a new primer pair and capillary electrophoresis, Acta Med Okayama 56 (2002) 229–236; J.M. Butler, Y. Shen, B.R. McCord, The development of reduced size STR amplicons as tools for analysis of degraded DNA, J Forensic Sci 48 (2003) 1054–1064; A. Hellmann, U. Rohleder, H. Schmitter, M. Wittig, STR typing of human telogen hairs – a new approach, Int J Legal Med 114 (2001) 269–273], aus einem käuflich erhältlichen Multiplexkit entnommen, sowie freundlicherweise durch Dr. Schmitter und Dr. Hellmann (Bundeskriminalamt, Wiesbaden, Germany) zur Verfügung gestellt. In diesem neuen Multiplexansatz wurden z.B. fünf von 11 STR Systemen unter der Verwendung von Biotin-markierten reversen Primern amplifiziert. Daher ist es möglich, die biotinylierten Amplikons von der Multiplex PCR, z.B. unter der Verwendung von Streptavidin-beschichteten Sepharosebeads, abzutrennen. Die zwei abgetrennten Multiplexe wurden dann jeweils auf ABI Prism 310 und/oder 3100avant Genetic Analyzern analysiert.
  • Der vorliegende innovative Ansatz kombiniert gleichzeitig die Multiplex-Amplifikation von z.B. elf Loci mit sehr kurzen Amplikons mit der biochemischen Auftrenung der Amplikons in z.B. zwei Fraktionen von Fragmenten für die anschließende elektrophoretische Analyse. Obwohl das z.B. Biotin Separationsverfahren ein wenig mehr Arbeit verursacht und Zeit benözigt, weist es den hauptsächlichen Vorteil auf, daß es wertvolles Probenmaterial dadurch schont, daß es die gleichzeitige Analyse von zehn kurzen Amplikon STR Systemen aus einem einzigen DNA Aliquot erlaubt. Diese Verfahren kann in Fällen verwendet werden, wenn die meisten der herkömmlich verwendeten Multiplex STR Kits nicht in der Lage sind, verläßliche Ergebnisse zu produzieren. Der Multiplex schließt sechs der sieben europäischen STR Loci für nationale DNA Datenbanken und acht STR Loci aus der U.S. CODIS Datenbank [P.D. Martin, H. Schmitter, P.M. Schneider, A brief history of the formation of DNA databases in forensic science within Europe, Forensic Sci Int 119 (2001) 225–231 ] ein. Das hier vorgestellte sogenannte "BioPlex-11" Multiplex PCR System, mit seiner hohen Unterscheidungs(PD)-Wert von 4,21 × 1012 für alle zehn STRs und 5,24 × 107 für die sechs europäischen Datenbanken STR Systeme, stellt ein signifikantes und sensitives System für eine schlagkräftige Analyse von degradierten und "low copy" DNA Proben zur Verfügung.
  • Die vorliegende Erfindung soll nun auf Basis der folgenden Beispiele unter Bezug auf die beigefügten Figuren weiter verdeutlicht werden.
  • In den Figuren zeigt:
  • 1. Die allelischen Leitern für das neue Bioplex-11 wurden aus den allelischen Standards der SGM PlusTM (Applied Biosystems) oder PowerPlex® 16 (Promega) Kits und der "self-assembled" D12S391 Leiter reamplifiziert. Die drei oberen Panel stellen die zwei 6-FAM-markierten STR Systeme D3S1358 und D2S1338 zusammen mit Amelogenin, die zwei JOE-markierten STR Systeme D8S1179 und D21S11, sowie das D12S391 System, das zu dem 6-plex Teil des Multiplex gehört, dar. Die drei unteren Panel zeigen die zwei 6-FAM-markierten STR Systeme TH01 und FGA, die zwei JOE-markierten STR System TPOX und VWA, sowie das D5S818 System aus dem biotinylierten 5-plex Submultiplex.
  • 2. Sensitivitätsuntersuchung unter der Verwendung von aufeinanderfolgenden Verdünnungen von genomischer DNA von 500 pg abwärts bis 6,25 pg. Für eine bessere Übersicht zeigt der Screenshot nur das Elektrophorogramm aus dem 5-plex Teil des Multiplex. PCR Produkte wurden aufgetrennt und auf dem ABI PRISM 310 Genetic Analyzer nachgewiesen. Pfeile zeigen Peaks, die N- und N+1 Fragmente anzeigen, die typischerweise für die Überamplifikation von DNA Proben sind.
  • Figure 00110001
  • Figure 00120001
    Tabelle 1: PCR Primersequenzen für Amelogenin und STR-Systeme. Unterstrichen sind C-Stretch-Sequenzen für die Verlängerung des PCR Produkts. Die Referenzsequenzen für die STR Marker wurden aus der GenBank® (http://cstl.nist.gov) erhalten.
  • Beispiele
  • Die Abk. "M", "mM" und stehen im Folgenden für die Einheiten mol/l, mmol/l bzw. nmmol/l.
  • DNA Extraktion. Menschliche genomische DNA wurde aus Blut und forensischen Telogenhaarproben extrahiert. Blutproben wurden mit dem E.Z.N.A. Blood DNA Kit II (peqlab Biotechnologie GmbH, Deutschland) extrahiert. Kontroll-DNA von NA3657A Zellen wurde freundlicherweise durch Dr. R. Szibor [R. Szibor, J. Edelmann, S. Hering, I. Plate, H. Wittig, L. Roewer, P. Wiegand, F. Cali, V. Romano, M. Michael, Cell line DNA typing in forensic genetics – the necessity of reliable standards, Forensic Sci Int 138 (2003) 37–43.], Institut für Rechtsmedizin, Universität Magdeburg, Deutschland zur Verfügung gestellt. Die NA9947A DNA Probe wurde aus dem PowerPlex® 16 Kit (Promega, Madison, USA) entnommen. Haarproben wurden aus früheren Fällen verwendet. DNA aus Telogenhaaren wurde wie schon bei Hellmann et al. beschrieben wurde [A. Hellmann, U. Rohleder, H. Schmitter, M. Wittig, STR typing of human telogen hairs-a new approach, Int J Legal Med 114 (2001) 269–273.] extrahiert. Kurz, es wurde ungefähr ein cm eines Haarfragments, enthaltend die Telogenwurzel in 500 μl TNca Puffer verdaut. Nach Reinigung durch Standard Phenol/Chloroform Verfahren wurde die DNA mit einem Microcon-30 Mikrokonzentrator (Millipore, Eschborn, Deutschland) konzentriert. Die STR-Analyse von künstlich degradierter DNA wurde unter der Verwendung von Aliquots an DNA aus den P 118 und HepG2 Zellinien durchgeführt, die von unserer kollaborativen europäischen Übung an degradierter DNA gelagert wurden [P.M. Schneider, K. Bender, et al. STR analysis of artificially degraded DNA-results of a collaborative European exercise, Forensic Sci Int 139 (2004) 123–134, K. Bender, M.J. Farfan, P.M. Schneider, Preparation of degraded human DNA under controlled conditions, Forensic Sci Int 139 (2004) 135–140.].
  • PCR Amplifikation. Für die Amplifikation von sehr kurzen Tandem Repeat Systemen wurde das käuflich erhältliche Quiagen® Multiplex PCR Kit (Quiagen, Hilden, Deutschland) gemäß den Anweisungen des Herstellers mit Applied Bioystems Gene®Amp PCR System 2400/2700 Thermocyclern verwendet. Die PCR wurde in 25 μl Reaktionsvolumen durchgeführt, die 11 μl Templat-DNA, 12.5 μl Multiplex PCR Puffer [besteht aus HotStar Taq® DNA Polymerase, dNTP Mix, 6 mM MgCl2, 10 μM jedes Primer (Tabelle 2) unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: anfängliche Denaturierung bei 95°C für 15 min, 34 Zyklen von Denaturierung bei 94°C für 30 sec, Primerannealing bei 57°C für 90 sec, Verlängerung bei 60°C für 90 sec und ein finaler Verlängerungsschritt bei 60°C für 30 min.
  • Amplifikation von allelischen Leitern. Allelische Leitern aus den käuflich erhältlichen SGM PlusTM (Applied Biosystems) oder PowerPlex® 16 (Promega) Kits wurden als Template verwendet. Leiteraliquots aus den Kits wurden 1 in 1.000.000 verdünnt und in individuellen PCR Reaktionen amplifiziert, unter der Verwendung derselben Bedingungen wie für die Multiplex PCR beschrieben, mit der Ausnahme einer verringerten Zahl von 30 Zyklen. Um die Genauigkeit dieser Leitern zu zeigen, wurden die allelischen Bestimmungen aller Loci zwischen Proben verglichen, die mit dem SGM PlusTM und dem PowerPlex® 16 Kit und dem neuen Bioplex-11 Multiplexkit typisiert wurden. Alle Ergebnisse wurden als identisch gefunden (1). Die allelische Leiter für D21S391 wurde aus einer Leiter reamplifiziert, die in einer vorherigen Studie verwendet wurde [W. Waiyawuth, L. Zhang, C. Rittner, P.M. Schneider, Genetic analysis of the short tandem repeat system D12S391 in the German and three Asian populations, Forensic Sci Int 94 (1998) 25–31].
  • Wenn derselbe Fluoreszenzfarbstoff für mehr als einen STR Locus verwendet wurde, wurden die allelischen Leitern so aufgebaut, daß sie nicht überlappen. Zum Beispiel sind die JOE-markierten Systeme D8S1179 und D21S11 (die von jeweils 76–120 Basen und von 153–209 Basen reichen) und die 6-FAM-markierten Systeme TH01 und FGA (die von jeweils 56–95 Basen und von 124–262 Basen reichen) um ungefähr 30 Basen getrennt. Einige STR Loci sind nur durch ein paar Basenpaare getrennt, z.B. die 6-FAM-markierten Systeme D3S1358 und D2S1338 sowie die JOE-markierten Systeme TPOX und VWA. Um falsche Allelsignale für Allele außerhalb des Leiterbereichs zu verhindern, liegen die Fragmentgrößen der angrenzenden STR Systeme eine oder zwei Basen außerhalb des tetrameren Leserahmens für die Allelbestimmung. Dies wurde durch Erhöhen der Größen der Amplikons der größeren Systeme durch Hinzufügen von bis zu sechs Basen an das 5' Ende beider Primer (siehe Tabelle 2) erreicht.
  • Figure 00140001
    Tabelle 2. Allelbereiche und die entsprechenden Fragmentgrößen für Amelogenin und alle STR-Systeme; * – biotinylierter Primer.
  • Weiterhin, um allelische Peaks von dem anderen Multiplex im Fall von schlechter Biotin-Streptavidin Auftrennung nachzuweisen, überlappen die allelischen Leitern nicht im Hin blick auf ihre tetrameren Repeatgrößenzwischen den 6-plex und den 5-plex Reaktionen, wenn derselbe Fluoreszenzfarbstoff verwendet wird. Multiplex Auftrennung und Kapillargelelektrophorese. Die biotinylierten Produkte aus der PCR Reaktion wurden auf Streptavidin-beschichtete Sepharosebeads (Streptavidin SepharoseTM HP, Amersham Biosciences Ltd.) immobilisiert. Kurz, es wurden drei Mikroliter Sepharosebeads-Lösung mit 20 μl PCR Produkten, Bindungspuffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,6; 2 M NaCl; 1 mM EDTA, pH 8,0; 0.1 % Tween 20) und Wasser in einem finalen Volumen von 80 μl gemischt. Das Gemisch wurde für 15 Minuten bei Raumtemperatur unter kontinuierlichem Mischen auf einer Schüttelvorrichtung (2000 U/min) inkubiert. Nach Immobilisierung wurden die Beads abzentrifugiert, der Überstand wurde weiter mit dem MSB Spin PCRapace Kit (Invitek GmbH, Deutschland) gemäß den Anweisungen des Herstellers gereinigt, und die PCR Produkte wurden zuletzt in 20 μl Elutionspuffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0) gesammelt. Auf Sepharosebeads immobilisierte PCR Produkte wurden zweimal gewaschen, zuerst mit 150 μl Waschpuffer (10 mM Tris-Acetat, pH 7,6) und dann mit dem selben Volumen an 70 % Ethanol. Zuletzt wurden die Beads in 20 μl Elutionspuffer aus dem MSB Spin PCRapace Kit resuspendiert. Fünf Mikroliter jeder gereinigten PCR Fraktion wurden mit 25 μl Formamid, enthaltend 1,2 μl internen Spur Standard 600 (ILS600, Promega), gemischt und durch Kapillargelelektrophorese (unter der Verwendung von POP-6 Polymer) in an ABI PRISM 310 oder 3100avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) aufgetrennt.
  • Spezifität und Reproduzierbarkeit. Um die Spezifität des neuen STR Multiplex zu überprüfen, wurden 66 pg von nicht-degradierter menschlicher DNA aus 15 Blutproben mindestens zweimal amplifiziert, aufgetrennt und durch Kapillargelelektrophorese analysiert. Die Ergebnisse wurden mit den Typisierungen mit den SGM PlusTM (Applied Biosystems) oder Power-Plex® 16 (Promega) Kits und der einzelnen Amplifikation des D12S391 STR Systems verglichen [W. Waiyawuth, L. Zhang, C. Rittner, P.M. Schneider, Genetic analysis of the short tandem repeat system D12S391 in the German und three Asian populations, Forensic Sci Int 94 (1998) 25–31]. Der Erfinder beobachtete nur 0,4 % Ausfall-Allele und kein extra Allele unter allen analysierten Proben. Mittels Typisierung von 100 pg an genomischer DNA wurden alle Allele richtig angezeigt. Nach Auftrennung und Reinigung der zwei Multiplexe wurde eine Kreuzkontaminierung zwischen den zwei kleinen Multiplexen nie beobachtet.
  • Empfindlichkeit und Degradationsuntersuchung. Für die Validierung der Test-Empfindlichkeit wurden Proben erfolgreich bis herunter zu to 25 pg DNA typisiert, dem Äquivalent von ungefähr vier Zellkernen, verglichen mit Standard Amplifikation mit 100 pg an DNA (2). Die Verwendung von DNA Mengen größer als 100 pg führte oft zu N- und N+1 Fragmente, die typischerweise im Fall von Überamplifikation gefunden werden [R. Sparkes, C. Kimpton, S. Gilbard, P. Came, J. Andersen, N. Oldroyd, D. Thomas, A. Urquhart, P. Gill, The validation of a 7-locus multiplex STR test for use in forensic casework. (II), Artefacts, casework studies and success rates, Int J Legal Med 109 (1996)195–204]. Sogar mit 25 pg menschlicher DNA wurden nur wenige "Ausfall-Allele" beobachtet. Mit einer niedrigeren DNA Konzentration stieg das Risiko für Ausfall-Allele dramatisch. Die Ausfälle begannen bei 50 pg aufzutreten, und nahmen drastisch zu bei 12,5 pg. "Drop in"-Allele wurden nicht beobachtet. Diese Ausfälle spiegeln stochastische Effekte wider, wenn extrem geringe DNA Mengen für die Amplifikation verwendet werden.
  • Um die Amplifikationseffizienz für stark degradierte DNA zu untersuchen, haben die Erfinder DNA analysiert, die vorher für ihre Untersuchung an degradierter DNA präpariert wurde [P.M. Schneider, K. Bender, et al. STR analysis of artificially degraded DNA-results of a collaborative European exercise, Forensic Sci Int 139 (2004) 123–134, K. Bender, M.J. Farfan, P.M. Schneider, Preparation of degraded human DNA under controlled conditions, Forensic Sci Int 139 (2004) 135–140]. Die künstlich degradierte DNA aus den zwei humanen Zellinien HepG2 und P 118 wurde mit dem neuen Multiplex typisiert. Eine erfolgreiche Amplifikation mittels käuflich erhältlicher STR Multiplex Kits wurde nur für Fragmente bis ca. 220 bp erhalten. Keine oder nur schlechte Ergebnisse wurden für die längeren Systeme, wie D2S1338 und FGA erhalten. Dagegen wurden korrekte Genotypen für alle getesteten Proben mittels dem Bioplex-11 erhalten.
  • Fälle und heterozygote Peakbalance. Um den neuen Multiplextest in praktischerer Arbeit zu testen, haben die Erfinder Telogenhaare aus realen Ermittlungen analysiert. Nach Multiplex STR Typisierung wurden Loci mit heterozygoten Genotypen untersucht, um die Peakbalance, Ausfall-Allele und andere Artefakte zu untersuchen. Die Typisierung von 104 Telogenhaarproben aus Ermittlungs-Untersuchungen führte zu 68 vollen DNA Profilen, 23 partiellen Profilen und in 13 Fällen keinen Amplifikationsergebnissen. Aus den erfolgreich analysierten Haarproben wurde die Zahl von Ausfällen und extra-Allelen aus einer Gesamtzahl von 1224 typisierten Allelen mit jeweils 4,8 % und 8,7 % berechnet. Die Peakbalance für jedes het erozygote STR System wurde gemäß Whitaker und Gill [J.P. Whitaker, E.A. Cotton, P. Gill, A comparison of the characteristics of profiles produced mit the AMPFISTR SGM Plus multiplex system for both standard and low copy number (LCN) STR DNA analysis, Forensic Sci Int 123 (2001) 215–223] berechnet und ist in Tabelle 3 zusammengefaßt. Die höchste Peakimbalance wurde für D2S1338 und FGA gefunden, den STR Systemen mit den größten Amplifikationsprodukten, und konnte manchmal nur schwer von Stotter-Peaks unterschieden werden. Das durchschnittliche Peakhöhen Verhältnis für alle Loci war 0,91.
  • Figure 00170001
    Tabelle 3: Heterozygote Balancen für alle STR Loci in Haarproben (n = 104)
  • Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

Claims (16)

  1. Verfahren zur Typisierung eines Individuums, umfassend die Schritte von a) zur Verfügung stellen von stark degradierter genomischer DNA von dem Individuum, b) Amplifikation von mindestens zwei short tandem repeat (STR)-Loci der genomischen DNA mittels Paaren von Amplifikations-Primern, wobei mindestens ein Primer mit einer Bindungsgruppe versehen ist, c) Auftrennung der amplifizierten STR-Fragmente mittels der Bindungsgruppe in mindestens zwei Fraktionen von Amplifikaten, und d) getrennter Nachweis der STR-Fragmente der Fraktionen.
  2. Verfahren zur Typisierung eines Individuums nach Anspruch 1, wobei das Individuum ein Säugetier, wie zum Beispiel ein Mensch ist.
  3. Verfahren zur Typisierung eines Individuums nach Anspruch 1 oder 2, wobei die STR-Loci ausgewählt sind aus der Gruppe, umfassend D3S1358, D8S1179, D21S11, TH01, FGA, VWA, D2S1338, D12S391, TPOX, D5S818, D18S51, FES und Amelogenin.
  4. Verfahren zur Typisierung eines Individuums nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei mehr als drei, vier, fünf, sechs, sieben, acht, neun, zehn oder elf STR-Loci amplifiziert werden.
  5. Verfahren zur Typisierung eines Individuums nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Amplifikation mittels PCR und/oder Multiplex-Amplifikation erfolgt.
  6. Verfahren zur Typisierung eines Individuums nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Primer markiert sind, zum Beispiel mit einem Fluoreszenzfarbstoff.
  7. Verfahren zur Typisierung eines Individuums nach Anspruch 6, wobei der Fluoreszenzfarbstoff ausgewählt ist aus der Gruppe, umfassend 6-FAM, JOE, NED und PET(rot).
  8. Verfahren zur Typisierung eines Individuums nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Bindungsgruppe ausgewählt ist aus der Gruppe, umfassend Biotin, Streptavidin, einem Histag, hitzestabilen Antigen und Oligonukleotid.
  9. Verfahren zur Typisierung eines Individuums nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die genomische DNA aus Blut, Blutbestandteilen, Sperma und/oder Telogenhaaren stammt.
  10. Verfahren zur Typisierung eines Individuums nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die Auftrennung der amplifizierten STR-Fragmente mittels der Bindungsgruppe eine feste Phase umfaßt, auf die Biotin, Streptavidin, Antikörper(n) oder komplementären Oligonukleotiden immobilisiert sind.
  11. Verfahren zur Typisierung eines Individuums nach Anspruch 10, wobei die feste Phase eine Membran, Sepharose beads oder magnetische Sepharose beads umfaßt.
  12. Verfahren zur Typisierung eines Individuums nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei der Nachweis der STR-Fragmente der Fraktionen eine Längenbestimmung der Fragmente umfaßt, zum Beispiel mittels Kapillargelelektrophorese.
  13. Verfahren zur Typisierung eines Individuums nach einem der Ansprüche 1 bis 12, weiterhin umfassend eine Identifizierung des Individuums anhand der nachgewiesenen STR-Fragmente.
  14. Verfahren zur Typisierung eines Individuums nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei als Primerpaare mindestens zwei Paare ausgewählt aus der Gruppe der SEQ ID Nrn. 1–3; 4 und 5; 6 und 7; 8 und 9; 10 und 11; 12 und 13; 14 und 15; 16 und 17; 18 und 19; 20 und 21; und 22 und 23 eingesetzt werden.
  15. Diagnostischer Kit, umfassend mindestens zwei Paare von STR-Primern zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 14, gegebenenfalls mit weiteren Materialien und Hilfsstoffen.
  16. Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 14 oder des Kits nach Anspruch 15 im Rahmen der Forensik.
DE102005008583A 2005-02-24 2005-02-24 Verfahren zur Typisierung eines Individuums mittels short tandem repeat (STR)-Loci der genomischen DNA Expired - Fee Related DE102005008583B4 (de)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE102005008583A DE102005008583B4 (de) 2005-02-24 2005-02-24 Verfahren zur Typisierung eines Individuums mittels short tandem repeat (STR)-Loci der genomischen DNA
PCT/EP2006/001701 WO2006089762A1 (de) 2005-02-24 2006-02-24 Verfahren zur typisierung eines individuums mittels short tandem repeat (str)-loci der genomischen dna
EP06707244A EP1853723A1 (de) 2005-02-24 2006-02-24 Verfahren zur typisierung eines individuums mittels short tandem repeat (str)-loci der genomischen dna
US11/816,895 US20080286773A1 (en) 2005-02-24 2006-02-24 Method for Typing an Individual Using Short Tandem Repeat (Str) Loci of the Genomic Dna

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE102005008583A DE102005008583B4 (de) 2005-02-24 2005-02-24 Verfahren zur Typisierung eines Individuums mittels short tandem repeat (STR)-Loci der genomischen DNA

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE102005008583A1 DE102005008583A1 (de) 2006-09-07
DE102005008583B4 true DE102005008583B4 (de) 2007-10-25

Family

ID=36588827

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE102005008583A Expired - Fee Related DE102005008583B4 (de) 2005-02-24 2005-02-24 Verfahren zur Typisierung eines Individuums mittels short tandem repeat (STR)-Loci der genomischen DNA

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20080286773A1 (de)
EP (1) EP1853723A1 (de)
DE (1) DE102005008583B4 (de)
WO (1) WO2006089762A1 (de)

Families Citing this family (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7666588B2 (en) 2001-03-02 2010-02-23 Ibis Biosciences, Inc. Methods for rapid forensic analysis of mitochondrial DNA and characterization of mitochondrial DNA heteroplasmy
US20040121313A1 (en) 2002-12-06 2004-06-24 Ecker David J. Methods for rapid detection and identification of bioagents in organs for transplantation
US7226739B2 (en) 2001-03-02 2007-06-05 Isis Pharmaceuticals, Inc Methods for rapid detection and identification of bioagents in epidemiological and forensic investigations
US20030027135A1 (en) 2001-03-02 2003-02-06 Ecker David J. Method for rapid detection and identification of bioagents
US7217510B2 (en) 2001-06-26 2007-05-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for providing bacterial bioagent characterizing information
US8073627B2 (en) 2001-06-26 2011-12-06 Ibis Biosciences, Inc. System for indentification of pathogens
JP2006516193A (ja) 2002-12-06 2006-06-29 アイシス・ファーマシューティカルス・インコーポレーテッド ヒトおよび動物における病原体の迅速な同定方法
US8057993B2 (en) 2003-04-26 2011-11-15 Ibis Biosciences, Inc. Methods for identification of coronaviruses
US8158354B2 (en) 2003-05-13 2012-04-17 Ibis Biosciences, Inc. Methods for rapid purification of nucleic acids for subsequent analysis by mass spectrometry by solution capture
US7964343B2 (en) 2003-05-13 2011-06-21 Ibis Biosciences, Inc. Method for rapid purification of nucleic acids for subsequent analysis by mass spectrometry by solution capture
US8097416B2 (en) 2003-09-11 2012-01-17 Ibis Biosciences, Inc. Methods for identification of sepsis-causing bacteria
US8546082B2 (en) 2003-09-11 2013-10-01 Ibis Biosciences, Inc. Methods for identification of sepsis-causing bacteria
US7956175B2 (en) 2003-09-11 2011-06-07 Ibis Biosciences, Inc. Compositions for use in identification of bacteria
US7666592B2 (en) 2004-02-18 2010-02-23 Ibis Biosciences, Inc. Methods for concurrent identification and quantification of an unknown bioagent
CA2567839C (en) 2004-05-24 2011-06-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Mass spectrometry with selective ion filtration by digital thresholding
US20050266411A1 (en) 2004-05-25 2005-12-01 Hofstadler Steven A Methods for rapid forensic analysis of mitochondrial DNA
US7811753B2 (en) 2004-07-14 2010-10-12 Ibis Biosciences, Inc. Methods for repairing degraded DNA
WO2006135400A2 (en) 2004-08-24 2006-12-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for rapid identification of recombinant organisms
US8182992B2 (en) 2005-03-03 2012-05-22 Ibis Biosciences, Inc. Compositions for use in identification of adventitious viruses
US8084207B2 (en) 2005-03-03 2011-12-27 Ibis Bioscience, Inc. Compositions for use in identification of papillomavirus
AU2006272776B2 (en) 2005-07-21 2012-01-19 Ibis Biosciences, Inc. Methods for rapid identification and quantitation of nucleic acid variants
EP2064332B1 (de) 2006-09-14 2012-07-18 Ibis Biosciences, Inc. Gezielte gesamtgenomamplifizierung zur identifizierung von krankheitserregern
WO2008104002A2 (en) * 2007-02-23 2008-08-28 Ibis Biosciences, Inc. Methods for rapid forensic dna analysis
US9598724B2 (en) 2007-06-01 2017-03-21 Ibis Biosciences, Inc. Methods and compositions for multiple displacement amplification of nucleic acids
CN101144774B (zh) * 2007-08-24 2010-05-19 张兹钧 人类STRtyper PCR扩增荧光检测试剂盒
EP2349549B1 (de) 2008-09-16 2012-07-18 Ibis Biosciences, Inc. Mischpatronen, mischstationen und verwandte ausrüstungen, und system
EP2344893B1 (de) 2008-09-16 2014-10-15 Ibis Biosciences, Inc. Mikroplatten-handhabungssysteme und verfahren
EP2347254A2 (de) 2008-09-16 2011-07-27 Ibis Biosciences, Inc. Probenverarbeitungseinheiten, -systeme und damit verbundene verfahren
EP2396803A4 (de) 2009-02-12 2016-10-26 Ibis Biosciences Inc Ionisationssondenanordnungen
WO2011001274A2 (en) * 2009-07-02 2011-01-06 Nucleix Methods for distinguishing between natural and artificial dna samples
US8950604B2 (en) 2009-07-17 2015-02-10 Ibis Biosciences, Inc. Lift and mount apparatus
WO2011008972A1 (en) 2009-07-17 2011-01-20 Ibis Biosciences, Inc. Systems for bioagent identification
EP3225695A1 (de) 2009-10-15 2017-10-04 Ibis Biosciences, Inc. Multiple-displacement-amplifikation
US9783850B2 (en) 2010-02-19 2017-10-10 Nucleix Identification of source of DNA samples
US9752187B2 (en) 2009-12-11 2017-09-05 Nucleix Categorization of DNA samples
US10004561B2 (en) * 2012-10-15 2018-06-26 Life Genetics Lab, Llc Method for genetic detection using interspersed genetic elements: a multiplexed DNA analysis system
US9476100B1 (en) 2015-07-06 2016-10-25 Nucleix Ltd. Methods for diagnosing bladder cancer
IL265451B (en) 2019-03-18 2020-01-30 Frumkin Dan Methods and systems for the detection of methylation changes in DNA samples

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE69840416D1 (de) * 1997-10-28 2009-02-12 Los Alamos Nat Security Llc Identifizierung von dna-polymorphismen mittels durchflusszytometrie
US20050112591A1 (en) * 2003-11-25 2005-05-26 Applera Corporation Novel method for isolating single stranded product

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FAN, J.B. u.a.: Parallel genotyping of human SNPs using generic high-density oligonucleotide tag arrays. Genome Res. (2000) 10 (6) 853-60 *
KADERALI, L. u.a.: Primer-design for multiplexed genotyping. Nucleic Acids Res. (2003) 31 (6) 1796-802 *
SCHNEIDER, P.M. u.a.: STR analysis of artificially degraded DNA-results of a collaborative European exercise. Forensic Sci. Int. (2004) 139 (2-3) 123-34 *

Also Published As

Publication number Publication date
DE102005008583A1 (de) 2006-09-07
EP1853723A1 (de) 2007-11-14
WO2006089762A1 (de) 2006-08-31
US20080286773A1 (en) 2008-11-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE102005008583B4 (de) Verfahren zur Typisierung eines Individuums mittels short tandem repeat (STR)-Loci der genomischen DNA
EP1034309B1 (de) Verfahren zur herstellung komplexer dna-methylierungs-fingerabdrücke
DE60218182T2 (de) Methoden um dns von verschiedenen individuen nachzuweisen
DE69233657T2 (de) Drei Mikrosatelliten-Repeat-Polymorphe DNA-Marker mit hoher Informationsdichte
DE69736637T2 (de) Multiplex amplifikation kurzer tandem repeat loci
EP1771577A2 (de) Verfahren zum bestimmen der h[ufigkeit von sequenzen in einer probe
EP1135530A2 (de) Multiplex amplifizierung von kurzen tandemwiederholungs-loci
DE60014350T2 (de) Verfahren zur erkennung und/oder analyse, unter verwendung von primertechniken, von einfachen nukleotidpolymorphismen in restriktionsfragmenten speziell aus amplifizierten restriktionsfragmenten generiert durch aflp
CN102851366A (zh) 一种β-地中海贫血突变荧光定量PCR检测试剂盒
AT503721A1 (de) Alleldetektion
US20110124517A1 (en) Process for Determining the Genotype from a Biological Sample Containing Nucleic Acids of Different Individuals
DE102005045560B4 (de) Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Kopienzahl einer vorbestimmten Sequenz in einer Zelle
CN106520980A (zh) 一种对男性个体进行y‑str分型的方法和系统
WO1995033075A1 (en) A method for the identification of nucleic acid samples from dna-containing organisms
EP2315854A1 (de) Verfahren zur quantitativen bestimmung der kopienzahl einer vorbestimmten sequenz in einer probe
DE102004005497B4 (de) Diagnose von uniparentaler Disomie anhand von Single-Nukleotid-Polymorphismen
EP1537246B1 (de) Verfahren zur Amplifikation genetischer Information mittels an mehrere Stellen im Genom bindende Primer
DE60311263T2 (de) Verfahren zur bestimmung der kopienzahl einer nukleotidsequenz
DE19825314B4 (de) Verfahren zur Kopplung von SSCP und DGGE zur verbesserten Erkennung von Punktmutationen
DE112018008028B4 (de) Verfahren zur mehrfachanalyse von amplikon unter verwendung der fluoreszenzbasierten mehrfachschmelzanalyse
WO2001036670A2 (de) Diagnose-kit, verfahren und mikroarray zur bestimmung der menschlichen entgiftungsfähigkeit
EP1561823A1 (de) Verfahren zum Nachweis von Einzelnukleotid-polymorphismen (SNP) in Genen des Arzneimittelmetabolismus und Testkit zur Durchführung des Verfahrens
WO2003050299A2 (de) Verfahren zur untersuchung der erblichen infertilität des mannes
DE10065814A1 (de) Verfahren für die simultane Amplifikation vieler Sequenzen in einer PCR-Reaktion und deren Markierung
WO2001040507A2 (de) Verfahren zur detektion und evaluierung einer potentiell aberrant methylierten dns-region am x-chromosom oder der klonalität

Legal Events

Date Code Title Description
OP8 Request for examination as to paragraph 44 patent law
8364 No opposition during term of opposition
R119 Application deemed withdrawn, or ip right lapsed, due to non-payment of renewal fee

Effective date: 20130903