CN101144774B - 人类STRtyper PCR扩增荧光检测试剂盒 - Google Patents

人类STRtyper PCR扩增荧光检测试剂盒 Download PDF

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CN101144774B CN200710029862A CN200710029862A CN101144774B CN 101144774 B CN101144774 B CN 101144774B CN 200710029862 A CN200710029862 A CN 200710029862A CN 200710029862 A CN200710029862 A CN 200710029862A CN 101144774 B CN101144774 B CN 101144774B
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Abstract

本发明公开了一种检测快速、准确、重复性好、通用性好、经济实用的人类STRtyper PCR扩增荧光检测试剂盒，该检测试剂盒对中国人的适用性尤其显著。本发明系列产品由以下三个kit组成：(1)全球STR基因座最多、识别能力最强的STRtyper-20G kit；(2)更适合用作中国人群罪犯DNA数据库建设和身份识别的STRtyper-16GC kit；(3)具有全新STR基因座的STRtyper-10F/G kit。每个kit产品均由下列成分组成：STR PCR反应混合物1.1ml×1管；STRtyper引物混合物0.55ml×1管；HS-Taq DNA聚合酶120μl×1管；STR对照DNA0.3ml×1管；STRtyper等位基因混合物50μl×1管；内标0.5ml×1管；310光谱校正标准品30μl×1管；3100光谱校正标准品30μl×1管。

Description

人类STRtyper PCR扩增荧光检测试剂盒
技术领域
本发明涉及一种人类基因检测试剂盒，尤其涉及一种人类STRtyper PCR扩增荧光检测试剂盒。
背景技术
人类基因组DNA有3×109bp，其中10％是串联重复序列，称为卫星DNA。按重复单位的长短，又可分为大卫星、中卫星、小卫星和微卫星。其中重复单位仅由2～7bp组成的叫微卫星，又称它为短片段串联重复序列(Short Tandem Repeat，简称STR)。不同人体基因组微卫星DNA重复单位的数目是可变的，因此，形成了极其复杂的等位基因片段长度多态性。根据这一规律，近年来建立了一种崭新的STR基因分型技术，该技术可将不同个体进行鉴别，并可进行个体间的遗传学分析，从而给法医学、考古学、遗传学以及肿瘤学等领域的发展带来了新的革命性变化。到目前为止，在国外只有美国的PE和Promega两家公司先后推出了STR基因型检测试剂盒，但该类STR基因型检测试剂盒重点是针对白种人群的STR基因座设计的，对中国人所属的黄种人的STR基因型检测的适用性比较差，而且价格昂贵，用进口试剂建立中国人自己的罪犯DNA数据库也容易受外来因素的干扰。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种检测快速、准确、重复性好、通用性好、经济实用的人类STRtyper PCR扩增荧光检测试剂盒，该检测试剂盒对中国人的适用性尤其显著。
本发明所采用的技术方案是：本发明提供一种人类STRtyper PCR扩增荧光检测试剂盒，它由下列成分组成：
STR PCR反应混合物         1.1ml×1管；
STRtyper引物混合物        0.55ml×1管；
HS-Taq DNA聚合酶          120μl×1管；
STR对照DNA                0.3ml×1管；
STRtyper等位基因混合物    50μl×1管；
内标                      0.5ml×1管；
310光谱校正标准品         30μl×1管；
3100光谱校正标准品        30μl×1管；
其中，所述STR PCR反应混合物为5×浓缩液，所述5×浓缩液包括缓冲液，在所述缓冲液中溶有MgCl2和脱氧三磷酸核苷酸；所述STRtyper引物混合物为10×浓缩液，所述10×浓缩液包括含有荧光素标记和未标记的引物；所述HS-Taq DNA聚合酶的浓度为5U/μl；所述STR对照DNA的浓度为10ng/μl；所述内标为R-500ILS或者O-500ILS，所述内标的片段长度分别为：80，100，120，140，160，180，200，220，240，260，280，300，320，340，360，380，400，420，440，460，480，500；所述310光谱校正标准品及所述3100光谱校正标准品为5色或4色校正标准品。
进一步，第一种人类STRtyper PCR扩增荧光检测试剂盒中的基因座组成及引物序列如下：
基因座   模板DNA序列参考文献 引物序列位置   引物标记的荧光素
  D3S1358   gb|AC099539.2   77721～77851 蓝
  TH01   gb|M23597.1   1183～1347 蓝
  D21S11   dbj|AP000433.2   4267～4489 蓝
  D18S51   gb|AC021803.8   75615～75944   蓝
  Penta E   gb|AC027004.15   84386～84764 蓝
  D5S818   gb|AC008512.8   80858～80992   绿
 D13S317   emb|AL391354.12   16729～16920   绿
 D7S820   gb|AC187632.2   26571～26803   绿
 D16S539   gb|AC092327.4   100764～101051   绿
 CSF1PO   gb|U63963.1   11701～12045   绿
 Penta D   dbj|BS000238.1   91919～92302   绿
 Amelgenin   gb|AY694820.1   4336～4441 黄
基因座   模板DNA序列参考文献 引物序列位置   引物标记的荧光素
 vWA   gb|AC006576.15   20602～20752 黄
 D8S1179   gb|AF216671.7   3156～3382 黄
 TPOX   gb|DQ011222.1   78139～78409 黄
 FGA   gb|AC107385.4   63318～63663   黄
 D19S433   gb|AC008507.11   23153～23279   红
 D12S391   gb|AC007621.34   77346～77534   红
 D6S1043   emb|AL132766.13   24551～24827   红
 D2S1338   gb|AC010136.8   66783～67195   红
进一步，第二种人类STRtyper PCR扩增荧光检测试剂盒中的基因座组成及引物序列如下：
基因座   模板DNA序列参考文献 引物序列位置   引物标记的荧光素
 D8S1179   gb|AF216671.7   3167～3314   蓝
 D21S11   dbj|AP000433.2   4242～4446   蓝
 D7S820   gb|AC187632.2   26574～26848   蓝
基因座   模板DNA序列参考文献 引物序列位置   引物标记的荧光素
 CSF1PO   gb|U63963.1   11853～12181   蓝
 D3S1358   gb|AC099539.2   77722～77851   绿
 D12S391   gb|AC007621.34   77350～77527   绿
 D13S317   emb|AL391354.12   16708～16936   绿
 D16S539   gb|AC092327.4   100786～101064   绿
 D2S1338   gb|AC010136.8   66783～66827   绿
 D19S433   gb|AC008507.11   23153～23279 黄
 vWA   gb|AC006576.15   20601～20780 黄
 D5S818   gb|AC008512.8   80791～81031 黄
 D18S51   gb|AC021803.8   75602～75923 黄
 Amelgenin   gb|AY694820.1   4336～4441   红
 D6S1043   emb|AL132766.13   24626～24776   红
 FGA   gb|AC107385.4   63436～63669   红
进一步，第三种人类STRtyper PCR扩增荧光检测试剂盒中的基因座组成及引物序列如下：
基因座   模板DNA序列参考文献 引物序列位置   引物标记的荧光素
  Amelgenin   gb|AY694820.1   4336～4441   蓝
  D18S1364   gb|AC090358.16   104047～104183   蓝
  D12S391   gb|AC007621.34   77349～77534 蓝
  D13S325   emb|AL139382.12   100237～100483 蓝
  D6S1043   emb|AL132766.13   24551～24827   绿
  D2S1772   gb|AC009474   73238～73452   绿
  D11S2368   gb|AC009652.14   48653～48937   绿
  D22-GATA198B05   gb|AC005300.10   60923～61050   黄
  D8S1132   dbj|AP000430.3   136239～136415 黄
  D7S3048   AC078791   59245～59495   黄
本发明的有益效果是：本发明与国外公司生产的同类产品相比，具有如下优点：
(1)本发明所选用的二十六个基因座中有十七个是国际刑警组织和外国厂家推荐的基因座，在国际罪犯DNA数据库中已应用过的，便于本发明试剂盒的检测结果可与国际罪犯DNA数据库的数据共享；另外新增加了D18S1364、D12S391、D13S325、D6S1043、D2S1772、D11S2368、D22-GATA198B05、D8S1132、D7S3048共九个更适合中国人群的基因座，这九个基因座是国内外首次使用，它们的个体识别能力和非父排除率等指标比国内外已使用过的大部分基因座都要好，从而大大提高了本发明的实用价值，更具有普遍适用性，通用性好，对中国人的适用性尤其显著；
(2)本发明人类STRtyper PCR扩增荧光检测试剂盒的价格比进口试剂盒低一半以上，经济实用；
(3)本发明中各基因座引物的设计、位置排列和浓度搭配合理，反应混合物组分和扩增参数等都经过反复优化，具有高灵敏度的特异扩增效果，并具有很好的重复性和稳定性；
(4)用分子克隆技术制备的内标(ISL)和等位基因(Ladder)的核苷酸序列与相应模板的扩增产物序列完全相同，从而确保了它们的电泳迁移率保持不变，可比性强；用这种方法生产的内标和等位基因的工艺简单、产量高、产品稳定，易于批量化、标准化生产，产品质量完全可以达到甚至可超过同类进口试剂的水平；
(5)本发明中筛选的提取DNA的简易方法，不但简单、快速、有半定量效果、纯度高，而且价格便宜、对人体和环境也无任何污染，特别是对一些用常规方法难以提到DNA的检材，如骨髂、附着在牛仔服和土壤上的检材以及陈旧材料等，都可用本法提取DNA以达到满意的扩增效果；
(6)本发明中使用的DNA聚合酶为热启动酶(HS-Taq DNAPolymerase)，与普通的Taq酶相比，最大的优点是在复合扩增系统中减少了非特异片段的扩增，并大大提高了特异片段的扩增效率，同时该酶在相同保存条件下更加稳定，与进口同类产品相比质量相当，而价格要比进口产品低好几倍；
(7)本发明中每个产品所要求的扩增参数、Matrix、内标和电泳模式均完全相同，所以在同一台PCR仪或基因分析仪上使用本发明的系列产品时，不需要更换相应参数，运用起来特别方便；
(8)本发明中所述引物序列、所述基因座排列、所述内标及所述STRtyper等位基因混合物(简称Ladder)的制备，所述STR PCR反应混合物的组成、扩增参数、提取DNA的试剂和方法、以及所述HS-Taq DNA聚合酶的制备等，都是经过反复试验后进行优化的，检测快速、准确、重复性好，特别适合于包括中国人在内的黄种人群；
(9)迄今为止，发达国家基本上都建立了他们自己的罪犯DNA数据库，我国也开始在进行这项工作，但所用的试剂仍靠进口，本发明的产品推出后可替代进口试剂建立中国人自己的罪犯DNA数据库，在任何时候、任何情况下均不会受到任何外来因素的干扰。
具体实施方式
实施例一：
本实施例的人类STRtyper PCR扩增荧光检测试剂盒是STRtyper-20Gkit，由下列成分组成：
STR PCR反应混合物         1.1ml×1管；
STRtyper引物混合物        0.55ml×1管；
HS-Taq DNA聚合酶          120μl×1管；
STR对照DNA                0.3ml×1管；
STRtyper等位基因混合物    50μl×1管；
内标                      0.5ml×1管；
310光谱校正标准品         30μl×1管；
3100光谱校正标准品        30μl×1管；
其中，所述STR PCR反应混合物为5×浓缩液，所述5×浓缩液包括缓冲液，在所述缓冲液中溶有MgCl2和脱氧三磷酸核苷酸；所述STRtyper引物混合物为10×浓缩液，所述10×浓缩液包括含有荧光素标记和未标记的引物；所述HS-Taq DNA聚合酶的浓度为5U/μl；所述STR对照DNA的浓度为10ng/μl；所述内标为O-500ILS，所述内标的片段长度分别为：80，100，120，140，160，180，200，220，240，260，280，300，320，340，360，380，400，420，440，460，480，500；所述310光谱校正标准品及所述3100光谱校正标准品为5色或4色校正标准品。
本实施例所述检测试剂盒的基因座组成及引物序列如下：
基因座   模板DNA序列参考文献 引物序列位置   引物标记的荧光素
  D3S1358   gb|AC099539.2   77721～77851 蓝
  TH01   gb|M23597.1   1183～1347   蓝
  D21S11   dbj|AP000433.2   4267～4489   蓝
  D18S51   gb|AC021803.8   75615～75944   蓝
  Penta E   gb|AC027004.15   84386～84764   蓝
  D5S818   gb|AC008512.8   80858～80992   绿
  D13S317   emb|AL391354.12   16729～16920   绿
  D7S820   gb|AC187632.2   26571～26803   绿
  D16S539   gb|AC092327.4   100764～101051   绿
  CSF1PO   gb|U63963.1   11701～12045   绿
  Penta D   dbj|BS000238.1   91919～92302   绿
  Amelgenin   gb|AY694820.1   4336～4441   黄
基因座   模板DNA序列参考文献 引物序列位置   引物标记的荧光素
vWA gb|AC006576.15 20602～20752 黄
  D8S1179   gb|AF216671.7   3156～3382   黄
TPOX gb|DQ011222.1 78139～78409 黄
FGA gb|AC107385.4 63318～63663 黄
  D19S433   gb|AC008507.11   23153～23279   红
  D12S391   gb|AC007621.34   77346～77534   红
  D6S1043   emb|AL132766.13   24551～24827   红
  D2S1338   gb|AC010136.8   66783～67195   红
本实施例试剂盒中各种试剂的保存要求如下：保存温度除HS-Taq DNA聚合酶需放-20℃保存外，其它试剂均放4℃保存；含荧光素的试剂要避光保存，以防荧光素脱落；STR PCR反应混合物、STRtyper引物混合物、HS-TaqDNA聚合酶要与其它试剂严格分开保存，以防污染PCR扩增反应。
本实施例中所述检测试剂盒的基因座由十九个基因座加上性别基因座组成，包含了国外两个厂家生产的Identifiler、PPlex和China STR kit三个试剂盒中的所有基因座，因此是目前世界上同类产品中基因座最多、识别能力最强的kit，特别适合作亲权鉴定中的单亲鉴定。
本发明的产品制备过程如下：
1、筛选并确定所述检测试剂盒的基因座组成及引物序列；
2、制备Matrix标准品和内标；
3、用Matrix标准品对基因分析仪作光谱校正；
4、设计和合成引物，并测定各引物对的浓度：为了确保在同一扩增体系中各基因座的扩增产物量大致相等，而且无非特异带被扩增，所以各引物之间浓度的搭配至关重要，各引物间浓度的搭配程序如下：
(1)先用超纯水或TE将合成的引物溶解成100～200PM；
(2)成对的引物等体积混合后，分别稀释成0.2PM/100μl、0.1PM/100μl、0.05PM/100μl、0.025PM/100μl的反应体积，在相同体系中进行扩增；
(3)选择无非特异带、而且特异带较清楚的引物浓度为初筛浓度；
(4)在同一复合扩增体系中，用各基因座引物的初筛浓度进行复合扩增；
(5)根据各基因座之间扩增的产物量，以及非特异带出现的情况，在对相应基因座的引物浓度进行增减；
(6)一直调到每组中所有基因座的扩增产物量基本相等，而且无明显非特异带，方为合格；
5、将每个复合扩增系统中的各基因座的引物对按一定比例合并后，进行复合扩增；
6、调整各引物对之间的浓度，使其各引物对的扩增灵敏度一致，然后配制STRtyper引物混合物的10×浓缩液；
7、至少扩增200份以上无亲缘关系的中国汉族DNA样品，以寻找每个基因座的所有等位基因；
8、用基因克隆技术制备各等位基因片段；
9、对每个等位基因片段的序列进行测定，并按国际标准进行命名；
10、定量测定每个等位基因片段，并将每个基因座的所有等位基因片段进行等量混合后，即成为每个复合扩增体系的Ladder；
11、将各基因座的相应参数输入GeneMapper，以建立该系列产品的分型软件；
12、将每个复合扩增体系的Ladder和相应基因座的复合扩增产物在相同条件下电泳，并用荧光检测技术作分型鉴定，至少作200份以上无亲缘关系的中国汉族DNA样品检测，并统计每个基因座的每个等位基因的频率分布；
13、制备对照模板：培养9947 A细胞株，然后提取DNA，并稀释至10ng/μl后放-20℃备用；
14、用珠海科登生物工程有限公司生产的DNA提取液制备模板DNA；
15、配制扩增混合物，并进行扩增：将以下试剂震荡混匀5秒钟后短暂离心，25μl反应体积按以下比例混合：
 5×STRPCR反应混合物   5μl
 10×STRtyper引物混合物   2.5μl
 HS-Taq DNA聚合酶(5U/μl)   0.5μl
 样品DNA(总量在1ng左右的检测峰最好)   Xμl
 ddH<sub>2</sub>O   加至25μl
本发明扩增体系中所用的HS-Taq DNA聚合酶为热启动酶，因此必须在高温度维持一定时间之后，才能恢复酶的活性，本发明选定的预变性条件为95℃，2分钟，在这一预变性条件下，人类基因组DNA得到了彻底变性，根据本发明中所选择的各引物的TM值，确定61℃为退火温度。本试剂盒的PCR反应条件是在ABI 9700型PCR热循环仪上建立的，经筛选优化的循环参数为：95℃ 2minutes+(94℃ 30seconds+61℃ 1minute+70℃ 1minute)×5+(92℃ 30seconds+61℃ 1minute+70℃ 1minute)×25+60℃ 45minutes+12℃ soak；
16、PCR产物电泳：
(1)在Hi-Di Formamide中加入5％分子量内标(ILS)，混匀后放4℃备用(最好不要超过一个月)，四色荧光检测用红色内标(R-500ILS)，五色荧光检测用橙色内标(O-500ILS)；
(2)每个样品的扩增产物或STRtyper等位基因(Allelic Ladder)与Hi-DiFormamide的比例为1∶10，震荡混匀后简短离心，然后95℃变性3min，迅速置冰中冷却3min，每电泳一批样品至少要有一个Allelic Ladder；
(3)分别运行ABI PRISM 310或3100的Collection软件，用相应的模式进行电泳，并接收荧光信号；
17、数据分析和处理：用相应的基因分析仪和软件进行数据分析，并将分析的结果进行数据处理；在进行数据分析前，要用以上所述步骤2中制备的Matrix标准品分别作四色(377和310用F模式，3100和3130用Any 4 Dye模式)或五色(G5模式)的光谱校正；电泳时，Matrix标准品和Hi-Di Formamide的比例为1∶10；
18、结果输出：按不同要求分别输出片段分析结果、基因分型结果及输出CODIS报表。
内标和Ladder是各等位基因的参照物，是判断各等位基因的标准、并进行统计学计算和结果分析的基础，所以它们在本发明中的作用至关重要，在本发明中利用分子克隆技术制备内标和Ladder，其程序如下：
(1)DNA的提取：按常规方法或按如后所述的本发明的简易方法提取人的基因组DNA；
(2)从汉族中收集无任何血缘关系的检材200份以上，分别用单基因座的引物进行扩增，从中筛选出每个基因座的所有基因片段和内标中所需长度的扩增片断；
(3)按《PCR技术实验指南》中第八章的程序，对PCR产物进行克隆；
(4)按《分子克隆》中文版第二版第19页上的程序提取质粒DNA，并进行纯度和定量测定；
(5)按基因扩增技术制备各等位基因片段，然后对各种片段进行纯化和定量测定；
(6)将各等位基因片段分别进行核酸序列分析，以测定各片段的大小和串联单位的重复次数，在此基础上，对各等位基因片段按国际通用的法则进行命名；
(7)将各基因座的等位基因片段等量混合后，加入稳定剂，并按适当量进行分装；
(8)出厂前再次进行质量检测。
在以上步骤(1)中，DNA提取的好坏直接影响到扩增和检测结果。常规方法中需要用酚和氯仿等有害试剂，而且程序繁琐，所需时间长，还容易造成DNA的丢失；进口的几种DNA提取试剂盒虽然省去了一些步骤，但价格昂贵。本发明中筛选的提取DNA的试剂和简易方法，不但简单、快速、有半定量效果、纯度高，而且价格便宜、对人体和环境也无任何污染，特别是对一些用常规方法难以提到DNA的检材，如骨髂、附着在牛仔服和土壤上的检材以及陈旧材料等，都可用本法提取DNA以达到满意的扩增效果。本发明对不同检材提取DNA的简易方法如下：
(1)从有核细胞中提取DNA：在装有发根、头屑、骨髓、精斑、血痕、组织切片、血沙等有核细胞管中，加入由珠海科登生物工程有限公司提供的DNA提取液使其全部淹没，再在95℃煮10分钟，12000rpm离心5分钟，取上清到另一干净的离心管中，以便与泥沙等固体附材分离，再加入预先剪成1mm2左右的滤纸小片，使游离的DNA定量吸附到滤纸片上，再用超纯水来回洗三至五遍，以洗去多余的DNA和干扰PCR扩增的物质，然后取一小片滤纸，吸干水份后接放入PCR管中进行扩增；
(2)从附材上提取DNA：用剪刀或其它锐器将带有人类有核细胞的布料、纸屑等检材分割成小米大小后，放入0.5ml塑料离心管中，再加入由珠海科登生物工程有限公司提供的DNA提取液使其全部淹没，再在95℃煮10分钟，用超纯水来回洗三至五遍，然后取一小片或小粒(1mm2左右)附材，吸干水份后直接放入PCR管中进行扩增。
本发明中使用的HS-Taq DNA聚合酶为热启动酶，该酶是在制备普通Taq酶的基础上，将酶的活性基团封闭起来，使其在常规或稍高温度下不具有酶的活性，只有经过高温处理，多肽片段变性之后，酶的活性才得以恢复，与普通的Taq DNA聚合酶相比，最大的优点是在复合扩增系统中减少了非特异片段的扩增，并大大提高了特异片段的扩增效率，同时该酶在相同保存条件下更加稳定。
本发明所述STR PCR反应混合物中各组分之间的搭配和pH值将直接影响到扩增产物量的高低以及非特异扩增带的多少，特别是在复合扩增体系中各组分之间的搭配更为最要，其调整程序如下：
(1)首先按以上所述步骤4中的方法调整复合体系中各引物对之间的最佳浓度；
(2)将调整好的引物混合物和反应混合物中的各组分进行棋盘滴定；
(3)根据滴定结果，在无非特异带出现的前提下，选择扩增产量最高的相应组分的浓度为最后选定的浓度。
实施例二：
本实施例的人类STRtyper PCR扩增荧光检测试剂盒是STRtyper-16GCkit，由下列成分组成：
STR PCR反应混合物         1.1ml×1管；
STRtyper引物混合物        0.55ml×1管；
HS-Taq DNA聚合酶          120μl×1管；
STR对照DNA                0.3ml×1管；
STRtyper等位基因混合物    50μl×1管；
内标                    0.5ml×1管；
310光谱校正标准品       30μl×1管；
3100光谱校正标准品      30μl×1管；
其中，所述STR PCR反应混合物为5×浓缩液，所述5×浓缩液包括缓冲液，在所述缓冲液中溶有MgCl2和脱氧三磷酸核苷酸；所述STRtyper引物混合物为10×浓缩液，所述10×浓缩液包括含有荧光素标记和未标记的引物；所述HS-Taq DNA聚合酶的浓度为5U/μl；所述STR对照DNA的浓度为10ng/μl；所述内标为R-500ILS或者O-500ILS，所述内标的片段长度分别为：80，100，120，140，160，180，200，220，240，260，280，300，320，340，360，380，400，420，440，460，480，500；所述310光谱校正标准品及所述3100光谱校正标准品为5色或4色校正标准品。
本实施例所述检测试剂盒的基因座组成及引物序列如下：
基因座   模板DNA序列参考文献 引物序列位置   引物标记的荧光素
 D8S1179   gb|AF216671.7   3167～3314 蓝
 D21S11   dbj|AP000433.2   4242～4446 蓝
 D7S820   gb|AC187632.2   26574～26848 蓝
 CSF1PO   gb|U63963.1   11853～12181 蓝
 D3S1358   gb|AC099539.2   77722～77851   绿
 D12S391   gb|AC007621.34   77350～77527   绿
 D13S317   emb|AL391354.12   16708～16936   绿
 D16S539   gb|AC092327.4   100786～101064   绿
 D2S1338   gb|AC010136.8   66783～66827   绿
D19S433 gb|AC008507.11 23153～23279 黄
 vWA   gb|AC006576.15   20601～20780 黄
 D5S818   gb|AC008512.8   80791～81031 黄
基因座   模板DNA序列参考文献 引物序列位置   引物标记的荧光素
 D18S51   gb|AC021803.8   75602～75923 黄
 Amelgenin   gb|AY694820.1   4336～4441   红
 D6S1043   emb|AL132766.13   24626～24776   红
 FGA   gb|AC107385.4   63436～63669   红
本实施例中所述检测试剂盒的基因座是将国外同类试剂盒中两个频率分布最差的TH01和TPOX分别替换成D12S391和D6S1043，从而大大提高了识别能力，这个kit中的扩增片段都在350bp之内，对于大部份检材都有很好的扩增效果，在人员身份识别和亲权鉴定中都可得到满意的鉴定结果。
下面以本发明用于人员个体识别对本实施例作出说明。
在STR-PCR基因分型的电泳图谱上，纯合子表现为一条特征峰，杂合子表现为两条特征峰。根据H-W定律，在处于遗传平衡的群体，纯合子基因型频率等于基因频率的平方，杂合子基因型频率等于两基因频率乘积的2倍，在个人识别鉴定中，当二份物证材料的STR基因型不同时，可排除二份材料来源于同一个体；如果二份材料的STR基因型相同，则按上述方法计算偶合概率。以某个案例中的两份检材在STRtyper 16GC kit中所有基因型均完全相同为例，偶合概率PM为多个STR基因型频率的乘积，下表为这一实际案例的计算结果：
Figure G2007100298627D00141
Figure G2007100298627D00151
通过上述计算说明，用于比较的这两份检材不相同的可能性(即偶合概率PM)为3.7705×10-18，这个结果说明在全世界总人口(60亿人)中不可能有第二个重复的可能性，从而可以认定这两份检材来自同一个体。
下面再以本发明用于亲子鉴定对本实施例作出说明。
(1)原理：判定亲生关系的理论依据是孟德尔遗传的分离律。按照这一规律，在配子细胞形成时，成对的等位基因彼此分离，分别进入各自的配子细胞，精、卵细胞受精形成子代，孩子的两个基因组一个来自母亲，一个来自父亲，因此同对的等位基因也就是一个来自母亲，一个来自父亲，鉴定的结果如果符合该规律，则不排除亲生关系，若不符合，则排除亲生关系(变异情况除外)。
在大多数情况下，母、子关系是已知的，要求鉴定假设父和孩子是否亲生关系。此时首先从母、子基因型的对比中，可以确定孩子基因中可能来自父亲的基因(生父基因，OG)；然后观察假设父亲的基因型，如果不具有生父基因，则可排除假设父与孩子的亲生关系，若假设父也具有生父基因，结果就不能排除假设父的亲生关系。假设某案例中母亲是vWA-16/17型，孩子为16/18型，从比较中可确定生父基因是vWA-18，此案中假设父1为vWA-14/20型；假设父2为vWA-14/18型，；其中假设父1不具备生父基因vWA-18，故可排除他与孩子的亲生关系；相比之下，假设父2因具有vWA-18，不排除与孩子有亲生关系。
(2)亲权指数的计算：上例中假设父2不能排除父子亲生关系，但他不一定是孩子的生父，因为人群中vWA-18基因频率为0.1947，虽然生父必须有生父基因，但有vWA-18基因的男人不一定就是孩子的生父。按照概率理论，具有生父基因的假设父和具有生父基因的随机男人都有成为孩子生父的可能性。假设父提供生父基因成为孩子生父的可能性和随机男人提供生父基因成为孩子生父的机会的比值叫作亲权指数(Paternity Index，简称PI)。前一种可能性假设为x，后一种可能性假设为y。上例中的假设父2基因型为vWA-14/18杂合子，他提供生父基因vWA-18的可能性为1/2，即x＝1/2；随机男人提供生父基因vWA-18的机会为该基因的频率，即y＝0.1947。因此，此例的PI值为0.5/0.1947＝2.5680。如果假设父2的确是孩子的生父，则不论检测多少基因座，均不会排除他与孩子的亲生关系，在所有检测的基因座，每一个基因座都可以计算出一个PI值，多个基因座的累计PI值等于各个基因座PI值的乘积，但前提条件是所检测的各基因座之间没有遗传连锁关系。
STR基因座单亲PI计算可归纳简化为：
①假设父为纯合子时x＝1，假设父为杂合子时x＝0.5；
②子为纯合子时y＝p，子为杂合子时y＝2p；
③假设父、子为相同基因型杂合子时x＝0.5(p+q)，y＝2pq。
其计算式如下表所示：
STR基因座单亲PI简化计算表
  假设父   孩子   PI   假设父   孩子   PI
  A   A   1/p   AB   AB   (p+q)/(4pq)
  A   AB   1/(2p)   AC   AB   1/(4p)
  AB   A   1/(2p)   BC   AB   1/(4q)
设p、q分别为A、B基因频率。
STR基因座标准三联体PI计算可归纳简化为：
①假设父为纯合子时x＝1，假设父为杂合子时x＝0.5；但当假设父、母、子为相同基因型杂合子时x＝1；
②母与子有一个基因相同时，只有一个生父基因，y＝p；母与子有两个基因相同时，有两个生父基因，y＝p+q。
其计算式如下表所示：
STR基因座标准三联体PI简化计算表
  假设父(AF)   孩子   母亲   PI
  A   A   A(或AB)   1/p
  A   AB   B(或BC)   1/p
  A   AB   AB   1/(p+q)
  AB   AB   AB   1/(p+q)
  AB   A   A(或AB、AC)   0.5/p
  AB   AB   B(或BC)*   0.5/p
  AB   AC   C(或CB、CD)   0.5/p
  AC   AB   AB   0.5/(p+q)
设p、q分别为A、B基因频率。*母亲表型为A或AC时，PI＝0.5/q。
例如某亲子鉴定案例的检测结果如下：
经过15个基因座检测，均不排除孩子与AF有亲生关系，可计算出这15个基因座的PI值，然后各值相乘得到此案的累积亲权指数为3555396250.1。
(3)父子关系相对机会(Relative Chance of Paternity，简称RCP)：上述计算出的PI值是一个绝对值，为使鉴定结果能够以概率形式表达父子关系的相对机会，PI值须转换成一种相对值RCP。计算出PI值后，RCP＝(PI/(PI+1))×100％。按照国内亲子鉴定的标准，当RCP的值大于99.99％时，则可以认为假设父与孩子具有亲生关系；如果RCP的值达不到99.99％，应该增加检测基因座数直至RCP大于99.99％为止。上例中检测这15个STR基因座都不能排除父子关系，RCP值为99.999999％，该值已大大超过99.99％，可以认定AF-C是亲生关系。
实施例三：
本实施例的人类STRtyper PCR扩增荧光检测试剂盒是STRtyper-10F/Gkit，由下列成分组成：
STR PCR反应混合物         1.1ml×1管；
STRtyper引物混合物        0.55ml×1管；
HS-Taq DNA聚合酶          120μl×1管；
STR对照DNA                0.3ml×1管；
STRtyper等位基因混合物    50μl×1管；
内标                      0.5ml×1管；
310光谱校正标准品         30μl×1管；
3100光谱校正标准品        30μl×1管；
其中，所述STR PCR反应混合物为5×浓缩液，所述5×浓缩液包括缓冲液，在所述缓冲液中溶有MgCl2和脱氧三磷酸核苷酸；所述STRtyper引物混合物为10×浓缩液，所述10×浓缩液包括含有荧光素标记和未标记的引物；所述HS-Taq DNA聚合酶的浓度为5U/μl；所述STR对照DNA的浓度为10ng/μl；所述内标为R-500ILS或者O-500ILS，所述内标的片段长度分别为：80，100，120，140，160，180，200，220，240，260，280，300，320，340，360，380，400，420，440，460，480，500；所述310光谱校正标准品及所述3100光谱校正标准品为5色或4色校正标准品。
本实施例所述检测试剂盒的基因座组成及引物序列如下：
基因座   模板DNA序列参考文献 引物序列位置   引物标记的荧光素
  Amelgenin   gb|AY694820.1   4336～4441 蓝
  D18S1364   gb|AC090358.16   104047～104183   蓝
  D12S391   gb|AC007621.34   77349～77534   蓝
  D13S325   emb|AL139382.12   100237～100483 蓝
基因座   模板DNA序列参考文献 引物序列位置   引物标记的荧光素
  D6S1043   emb|AL132766.13   24551～24827   绿
  D2S1772   gb|AC009474   73238～73452   绿
  D11S2368   gb|AC009652.14   48653～48937   绿
  D22-GATA198B05   gb|AC005300.10   60923～61050 黄
  D8S1132   dbj|AP000430.3   136239～136415 黄
  D7S3048   AC078791   59245～59495 黄
本实施例所述检测试剂盒的所有基因座都是从几千个STR基因座中精选出来的，D18S1364、D12S391、D13S325、D6S1043、D2S1772、D11S2368、D22-GATA198B05、D8S1132、D7S3048这九个基因座在中国人群中都具有很好的多态性，它们的扩增产物都在300bp之内，重复序列都是由最稳定的四碱基串联而成，不但在亲权鉴定出现微变异的情况下是一个很好的补充kit，对于所有检材(包括腐败检材)都有很好的扩增效果和识别能力。本实施例中的所有基因座都用了两套荧光素标记，从而组成两个复合扩增体系，其中之一可在五色荧光系统中运行G5模式，另一扩增体系可在只能作四色电泳的基因分析仪上(如377等)运行F模式。
本发明中所涉及的基因座的频率统计如下表所示：
STR等位基因频率统计表(中国汉族)
Figure G2007100298627D00211
Figure G2007100298627D00221
Figure G2007100298627D00222
Figure G2007100298627D00231
Figure G2007100298627D00232
本发明开发和生产该产品的主要技术路线如下：首先在互联网上查询并初筛人类STR基因座；再经过引物设计、PCR扩增和电泳检测等程序进行精选；然后对有用基因座的等位基因(Ladder)进行频率调查；并用基因克隆技术制备Ladder；与此同时对PCR的各种参数进行优化；在此基础上建立了三个多基因座复合扩增荧光检测的系列产品，即以上实施例一～三的STRtyper-20G kit，STRtyper-16GC kit，STRtyper-10F/G kit。这三种试剂盒所要求的扩增参数、光谱校正、内标和电泳模式均完全相同，所以应用起来特别方便。经反复对比实验，该系列试剂盒的特异性、稳定性都达到了同类进口试剂的水平。由于配制该系列试剂盒的所有成份均为国产试剂，所以大大降低了成本，可为国家节省大量外汇。用国产化试剂建设中国人自己的罪犯DNA数据库，可以完全避免用进口试剂所带来的各种隐患。
本发明主要应用于公安、法院、计划生育等部门的法医对罪犯、遇难人员的身份进行快速、准确的识别和亲权鉴定，另外在考古学、遗传学、肿瘤学以及组织配型等方面也有广泛的用途。

Claims (3)

1.一种人类STRtyper PCR扩增荧光检测试剂盒，其特征在于：它由下列成分组成：
STR PCR反应混合物          1.1ml×1管；
STRtyper引物混合物        0.55ml×1管；
HS-Taq DNA聚合酶          120μl×1管；
STR对照DNA                 0.3ml×1管；
STRtyper等位基因混合物     50μl×1管；
内标                       0.5ml×1管；
310光谱校正标准品          30μl×1管；
3100光谱校正标准品         30μl×1管；
其中，所述STR PCR反应混合物为5×浓缩液，所述5×浓缩液包括缓冲液，在所述缓冲液中溶有MgCl2和脱氧三磷酸核苷酸；所述STRtyper引物混合物为10×浓缩液，所述10×浓缩液包括含有荧光素标记和未标记的引物；所述HS-Taq DNA聚合酶的浓度为5U/μl；所述STR对照DNA的浓度为10ng/μl；所述内标为R-500ILS或者O-500ILS，所述内标的片段长度分别为：80，100，120，140，160，180，200，220，240，260，280，300，320，340，360，380，400，420，440，460，480，500；所述310光谱校正标准品及所述3100光谱校正标准品为5色或4色校正标准品；
所述检测试剂盒的基因座组成及引物序列如下：
基因座   模板DNA序列参考文献 引物序列位置   引物标记的荧光素   D3S1358   gb|AC099539.2   77721～77851 蓝   TH01   gb|M23597.1   1183～1347 蓝   D21S11   dbj|AP000433.2   4267～4489 蓝   D18S51   gb|AC021803.8   75615～75944 蓝   Penta E   gb|AC027004.15   84386～84764 蓝   D5S818   gb|AC008512.8   80858～80992   绿   D13S317   emb|AL391354.12   16729～16920   绿
基因座   模板DNA序列参考文献 引物序列位置   引物标记的荧光素  D7S820   gb|AC187632.2   26571～26803   绿  D16S539   gb|AC092327.4   100764～101051   绿  CSF1PO   gb|U63963.1   11701～12045   绿  PentaD   dbj|BS000238.1   91919～92302   绿  Amelgenin   gb|AY694820.1   4336～4441 黄  vWA   gb|AC006576.15   20602～20752 黄  D8S1179   gb|AF216671.7   3156～3382 黄  TPOX   gb|DQ011222.1   78139～78409 黄  FGA   gb|AC107385.4   63318～63663   黄  D19S433   gb|AC008507.11   23153～23279   红  D12S391   gb|AC007621.34   77346～77534   红  D6S1043   emb|AL132766.13   24551～24827   红  D2S1338   gb|AC010136.8   66783～67195   红
2.一种人类STRtyper PCR扩增荧光检测试剂盒，其特征在于：它由下列成分组成：
STR PCR反应混合物          1.1ml×1管；
STRtyper引物混合物        0.55ml×1管；
HS-Taq DNA聚合酶          120μl×1管；
STR对照DNA                 0.3ml×1管；
STRtyper等位基因混合物     50μl×1管；
内标                       0.5ml×1管；
310光谱校正标准品          30μl×1管；
3100光谱校正标准品         30μl×1管；
其中，所述STR PCR反应混合物为5×浓缩液，所述5×浓缩液包括缓冲液，在所述缓冲液中溶有MgCl2和脱氧三磷酸核苷酸；所述STRtyper引物混合物为10×浓缩液，所述10×浓缩液包括含有荧光素标记和未标记的引物；所述HS-Taq DNA聚合酶的浓度为5U/μl；所述STR对照DNA的浓度为10ng/μl；所述内标为R-500ILS或者O-500ILS，所述内标的片段长度分别为：80，100，120，140，160，180，200，220，240，260，280，300，320，340，360，380，400，420，440，460，480，500；所述310光谱校正标准品及所述3100光谱校正标准品为5色或4色校正标准品；
所述检测试剂盒的基因座组成及引物序列如下：
基因座   模板DNA序列参考文献 引物序列位置   引物标记的荧光素  D8S1179   gb|AF216671.7   3167～3314 蓝  D21S11   dbj|AP000433.2   4242～4446 蓝  D7S820   gb|AC187632.2   26574～26848 蓝  CSF1PO   gb|U63963.1   11853～12181 蓝  D3S1358   gb|AC099539.2   77722～77851   绿  D12S391   gb|AC007621.34   77350～77527   绿  D13S317   emb|AL391354.12   16708～16936   绿  D16S539   gb|AC092327.4   100786～101064   绿  D2S1338   gb|AC010136.8   66783～66827   绿  D19S433   gb|AC008507.11   23153～23279 黄  vWA   gb|AC006576.15   20601～20780 黄
基因座   模板DNA序列参考文献 引物序列位置   引物标记的荧光素  D5S818   gb|AC008512.8   80791～81031 黄  D18S51   gb|AC021803.8   75602～75923 黄  Amelgenin   gb|AY694820.1   4336～4441   红  D6S1043   emb|AL132766.13   24626～24776   红  FGA   gb|AC107385.4   63436～63669   红
3.一种人类STRtyper PCR扩增荧光检测试剂盒，其特征在于：它由下列成分组成：
STR PCR反应混合物         1.1ml×1管；
STRtyper引物混合物       0.55ml×1管；
HS-Taq DNA聚合酶         120μl×1管；
STR对照DNA                0.3ml×1管；
STRtyper等位基因混合物    50μl×1管；
内标                      0.5ml×1管；
310光谱校正标准品         30μl×1管；
3100光谱校正标准品    30μl×1管；
其中，所述STR PCR反应混合物为5×浓缩液，所述5×浓缩液包括缓冲液，在所述缓冲液中溶有MgCl2和脱氧三磷酸核苷酸；所述STRtyper引物混合物为10×浓缩液，所述10×浓缩液包括含有荧光素标记和未标记的引物；所述HS-Taq DNA聚合酶的浓度为5U/μl；所述STR对照DNA的浓度为10ng/μl；所述内标为R-500ILS或者O-500ILS，所述内标的片段长度分别为：80，100，120，140，160，180，200，220，240，260，280，300，320，340，360，380，400，420，440，460，480，500；所述310光谱校正标准品及所述3100光谱校正标准品为5色或4色校正标准品；
所述检测试剂盒的基因座组成及引物序列如下：
基因座   模板DNA序列参考文献 引物序列位置   引物标记的荧光素   Amelgenin   gb|AY694820.1   4336～4441 蓝
基因座   模板DNA序列参考文献 引物序列位置   引物标记的荧光素   D18S1364   gb|AC090358.16   104047～104183 蓝   D12S391   gb|AC007621.34   77349～77534 蓝   D13S325   emb|AL139382.12   100237～100483 蓝   D6S1043   emb|AL132766.13   24551～24827   绿   D2S1772   gb|AC009474   73238～73452   绿   D11S2368   gb|AC009652.14   48653～48937   绿 D22-GATA198B05 gb|AC005300.10 60923～61050 黄   D8S1132   dbj|AP000430.3   136239～136415 黄   D7S3048   AC078791   59245～59495 黄
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