CN101921861A - 荧光标记str进行人类基因分型的试剂盒及检测方法 - Google Patents

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李淑瑾
谢杨
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Abstract

本发明公开了一种荧光标记STR进行人类基因分型的试剂盒及检测方法，属于人类基因的分析检测领域。所述试剂盒包括a)PCR扩增体系：引物、PCR缓冲溶液、TaqDNA聚合酶、模板DNA、dNTP和MgCl2，b)检测试剂：去离子甲酰胺溶液和GS500LIZ内标；所述引物为下述基因座的引物：Amelogenin、D8S1132、D12S391、GATA198B05、D7S3048、D2S1772、D11S2368、D6S1043和D13S325。所述检测方法按照下列步骤进行：提取DNA，复合扩增基因座，检测、确定扩增产物。本发明与现有商品化试剂盒联合应用于单亲鉴定及疑难亲缘关系鉴定案件，可提高鉴定结论的科学性，作为现有STR试剂盒的有益补充。

Description

荧光标记STR进行人类基因分型的试剂盒及检测方法
技术领域
本发明涉及人类基因检测，特别涉及STR(short tandem repeats，短串联重复序列)的分析，具体地说是采用荧光标记STR进行人类基因分型的试剂盒及检测方法。
背景技术
STR遗传标记系统由于在人类基因组中分布广泛，并且具有高度的遗传多态性及简单快捷的检测方法，被广泛应用于法医学、考古学、遗传学等领域。目前，用于个人识别和亲权鉴定常用的STR商品化试剂盒主要有AmpFLSTRIdentifiler、PowerPlex
Figure BSA00000247456900011
16两种。AmpFLSTR Identifiler系统包括15个常染色体基因座：D8S1179、D21S11、D7S820、CSF1PO、D3S1358、TH01、D13S317、D16S539、D2S1338、D19S433、VWA、TPOX、D18S51、D5S818、FGA和一个性别鉴定位点Amelogenin；PowerPlex
Figure BSA00000247456900012
16系统包括15个常染色体基因座：Penta E、D18S51、D21S11、TH01、D3S1358、FGA、TPOX、D8S1179、vWA、Penta D、CSF1PO、D16S539、D7S820、D13S317、D5S818和一个性别鉴定位点Amelogenin；基本能够满足大部分个体识别和三联体亲子鉴定案件的检验。
但对于二联体单亲鉴定或其它一些疑难的亲缘关系鉴定，单独应用上述的商品化试剂盒，二者的系统效能均小于0.9999，不能满足其鉴定要求。因此，用于二联体亲子鉴定的试剂盒有待进一步完善。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种荧光标记STR进行人类基因分型的试剂盒及检测方法，用于针对二联体单亲鉴定或其他一些疑难的亲缘关系鉴定，作为AmpFLSTR Identifiler和PowerPlex
Figure BSA00000247456900013
16试剂盒的补充，提高单亲鉴定结论的科学性和可靠性。
为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：一种荧光标记STR进行人类基因分型的试剂盒，其由PCR扩增体系和检测试剂组成；所述PCR扩增体系包括引物、PCR缓冲溶液、TaqDNA聚合酶、模板DNA、dNTP和MgCl2；所述检测试剂包括去离子甲酰胺溶液和GS500LIZ内标；所述引物为下述基因座的引物：Amelogenin、D8S1132、D12S391、GATA198B05、D7S3048、D2S1772、D11S2368、D6S1043和D13S325。
利用上述试剂盒进行人类基因分型的检测方法，按照下述步骤进行：
步骤二、在PCR扩增体系中加入步骤一所得的DNA提取液，然后在扩增仪中进行扩增，扩增条件：94℃、3min预变性；然后依次在94℃、1min，60℃、1min，72℃、1.5min，进行10个循环；再依次在90℃、1min，60℃、1min，72℃、1.5min，进行20个循环；再在60℃保持60min，最终保持在4℃，得扩增产物；
步骤三、检测扩增产物
取步骤二所得扩增产物1.0μL，加入去离子甲酰胺和GS500LIZ内标，混匀，经95℃、3min和4℃、2min变性后，用基因分析仪检测；
步骤四、确定扩增产物
根据扩增产物片段大小，确定扩增产物的基因型。
上述基因座根据以下标准进行选取：(1)多态性程度高，杂合度大于0.7；(2)系统内的STR基因座之间处于连锁平衡状态；(3)重复单位不含有插入的非重复单位碱基；(4)突变率小于0.002。选择的上述基因座在中国人群中具有较高的鉴别能力，只有D12S391与CODIS的VWA基因座有可能有连锁关系，其余基因座均无连锁关系，可做为商品化DNA分型试剂盒的补充，解决单亲鉴定及疑难亲子鉴定案件。其相关信息见表1。
表1STR基因座有关信息
Figure BSA00000247456900021
  D11S2368   11   18964780-18965510   0.810   0.837   0.778   0.768   272-307
  D6S1043   6   89668994-89669257   0.905   0.856   0.828   0.880   103-151
  D13S325   13   23976750-23977290   0.825   0.818   0.784   0.790   207-245
采用上述试剂盒和商品化试剂盒联合应用即可对单亲鉴定及疑难亲子鉴定案件进行准确鉴定。下面通过试验数据来说明本发明试剂盒的优势。
选取本实验室日常积累的单亲鉴定案件10例，分别用AmpFLSTRIdentifiler(简称ID)和PowerPlex16(简称PP-16)试剂盒单独扩增计算二联体累积非父排除概率及累积父权指数，以及其与新构建的本发明试剂盒(简称9-STR)联合应用时的二联体累积非父排除概率和累积父权指数。由于D12S391可能和vWA基因座有连锁关系，在联合应用计算时剔除基因座D12S391。计算结果见表2、表3-1和表3-2。
表2ID、PP-16、9-STR二联体非父排除概率
  二联体累积非父排除概率
  ID   0.999769
  ID与9-STR联合使用   0.9999990
  PP-16   0.999842
  PP-16与9-STR联合使用   0.9999993
表3-1 9-STR与PP-16试剂盒联合应用检测5个单亲案例
Figure BSA00000247456900032
表3-2 9-STR与ID试剂盒联合应用检测5个单亲案例
Figure BSA00000247456900041
目前三联体亲子鉴定的标准要求该体系的系统效能需大于0.9999，二联体亲子鉴定参照三联体亲子鉴定的标准。计算结果可见，将AmpFLSTR Identifiler和PowerPlex16试剂盒与本发明联合应用，可以使二联体累积非父排除概率达到0.9999以上，达到亲子鉴定要求。而且联合应用可使累积父权指数提高2～4个数量级，大大提高单亲鉴定结论的可靠性。
采用本发明产生的有益效果在于：本发明与现有商品化试剂盒联合应用于单亲鉴定及疑难亲缘关系鉴定案件，可提高鉴定结论的科学性，作为现有STR试剂盒的有益补充，大大提高了单亲鉴定结论的可靠性。
附图说明
图1是本发明基因分型检测结果。
具体实施方式
荧光标记STR进行人类基因分型的试剂盒，其由PCR扩增体系和检测试剂组成；所述PCR扩增体系包括引物、PCR缓冲溶液、TaqDNA聚合酶、模板DNA、dNTP和MgCl2；所述检测试剂包括去离子甲酰胺溶液和GS500LIZ内标；所述引物为下述基因座的引物：Amelogenin、D8S1132、D12S391、GATA198B05、D7S3048、D2S1772、D11S2368、D6S1043和D13S325。
其中PCR扩增体系的组分、浓度及含量见表4。
所述引物的序列见表5。
利用上述试剂盒进行人类基因分型的检测方法，按照下述步骤进行：
步骤一、提取DNA，得DNA提取液
用干净的眼科剪从血痕中间位置剪出约3mm×3mm大小的血痕，置于1.5mL试管中(眼科剪用75％酒精浸泡擦干)；向装有检材的试管中加入500μL高温灭菌水，盖好管盖震荡混匀于25℃静置20分钟(静置期间每隔2～3分钟上下颠倒一次)，56℃水浴加热10分钟；振荡混匀，13000转/分，离心3分钟；弃去上清液约450～460μL，留30～50μL清液覆盖住沉淀；加入100μL5％Chelex-100溶液，加入时要不断振荡以使Chelex-100颗粒加入量均匀；56℃水浴加热30分钟，振10秒；100℃水浴加热8分钟，振10秒；13000转/分，离心3分钟；仔细吸取80μl上清液并转移到相应编号的新试管中，得DNA提取液；
步骤二、复合扩增基因座，并标记
采用PCR扩增(polymerase chain reaction，聚合酶链式反应)。PCR扩增体系见表4。
表4PCR扩增体系的组分、浓度和含量
Figure BSA00000247456900051
PCR扩增体系中还包括去离子水，其总体积为20μL。
用于PCR扩增的基因座的引物及荧光标记染料参见表5。
表中，FAM即羧基荧光素，作为蓝色荧光标记染料；TAMRA即四甲基-6羧基罗丹明，作为黄色荧光标记染料；HEX即六氯荧光素，作为绿色荧光标记染料；ROX即若丹明，作为红色荧光标记染料。引物由上海生工生物技术有限公司合成。
表5引物及荧光标记染料
  基因座   引物   染料标记
  Amelogenin   F：5’-CCCTGGGCTCTGTAAAGAATAGTG-3’   [FAM]
  R：5’-ATCAGAGCTTAAACTGGGAAGCTG-3’
  D8S1132   F：5’-GGCTAGGAAAGGTTAGTGGC-3’   [FAM]
  R：5’-GTTTCTTCCCTCTCTCTTTCGAGCAAT-3’
  D12S391   F：5’-ACTGTATTAGTAAGGCTTCT-3’   [FAM]
  R：5’-GTTTCTTCCATGCTCCTAGTGTCC-3’
  GATA198B05   F：5’-GGAGCCAATTCACCTAAT-3’   [HEX]
  R：5’-GTTTCTTGAGAGACAGAACCTATAGCATGC-3’
  D7S3048   F：5’-CTGGAGCTGCATAGTGTCCT-3’   [HEX]
  R：5’-GTTTCTTAATCATCCCTGTGTGCTTTC-3’
  D2S1772   F：5’-TTCTAAGTAAAGAGTCTTCTTTGGG-3’   [TAMRA]
  R：5’-GTAATTCAAATCTTTCCTGTCAGG-3’
  D11S2368   F：5’-AAAAAAGACTATGAAGTGGGTAGG-3’   [TAMRA]
  R：5’-GTTTCTTCTGTTTCTACAGTGCATTGTATACG-3’
  D6S1043   F：5’-CAAGGATGGGTGGATCAATA-3’   [ROX]
  R：5’-GTTGTATGAGCCACTTCCCAT-3’
  D13S325   F：5’-TCCTTTAAGTGTCTAGAGAGGAGG-3’   [ROX]
  R：5’-TCTCTCTCAGAAGTTTGGAAGC-3’
PCR扩增条件：
在ABI 9700PCR或PTC-200扩增仪中进行扩增，热循环参数：94℃、3min预变性；然后在94℃、1min，60℃、1min，72℃、1.5min，共进行10个循环；90℃、1min，60℃、1min，72℃、1.5min，共进行20个循环；60℃，保持60min，最终保持在4℃，得扩增产物。
步骤三、检测扩增产物
取步骤二所得扩增产物1.0μL，加入去离子甲酰胺12.0μL和GS500LIZ内标0.3μL混匀，经95℃、3min，4℃、2min变性后，用基因分析仪检测；用Genemapper 3.2软件分析结果。再根据测序结果进行基因分型和命名。检测结果见图1。
步骤四、确定扩增产物
根据扩增产物片段大小，确定扩增产物的基因型，检测结果见图1。
综上，本发明所选取的基因座多态性良好，满足法医DNA检验实际工作的要求，和现有商品化试剂盒联合应用于单亲鉴定及疑难亲缘关系鉴定案件，可提高鉴定结论的科学性，可做为现有STR试剂盒有益的补充。
Figure ISA00000247457100011
Figure ISA00000247457100021
Figure ISA00000247457100041

Claims (3)

1.一种荧光标记STR进行人类基因分型的试剂盒，其由PCR扩增体系和检测试剂组成；所述PCR扩增体系包括引物、PCR缓冲溶液、TaqDNA聚合酶、模板DNA、dNTP和MgCl2；所述检测试剂包括去离子甲酰胺溶液和GS500LIZ内标；其特征在于所述引物为下述基因座的引物：Amelogenin、D8S1132、D12S391、GATA198B05、D7S3048、D2S1772、D11S2368、D6S1043和D13S325。
2.根据权利要求1所述的荧光标记STR进行人类基因分型的试剂盒，其特征在于，所述引物的序列分别为：
Amelogenin  F：5’-CCCTGGGCTCTGTAAAGAATAGTG-3’
            R：5’-ATCAGAGCTTAAACTGGGAAGCTG-3’
D8S1132     F：5’-GGCTAGGAAAGGTTAGTGGC-3’
            R：5’-GTTTCTTCCCTCTCTCTTTCGAGCAAT-3’
D12S391     F：5’-ACTGTATTAGTAAGGCTTCT-3’
            R：5’-GTTTCTTCCATGCTCCTAGTGTCC-3’
GATA198B05  F：5’-GGAGCCAATTCACCTAAT-3’
            R：5’-GTTTCTTGAGAGACAGAACCTATAGCATGC-3’
D7S3048     F：5’-CTGGAGCTGCATAGTGTCCT-3’
            R：5’-GTTTCTTAATCATCCCTGTGTGCTTTC-3’
D2S1772     F：5’-TTCTAAGTAAAGAGTCTTCTTTGGG-3’
            R：5’-GTAATTCAAATCTTTCCTGTCAGG-3’
D11S2368    F：5’-AAAAAAGACTATGAAGTGGGTAGG-3’
            R：5’-GTTTCTTCTGTTTCTACAGTGCATTGTATACG-3’
D6S1043     F：5’-CAAGGATGGGTGGATCAATA-3’
            R：5’-GTTGTATGAGCCACTTCCCAT-3’
D13S325     F：5’-TCCTTTAAGTGTCTAGAGAGGAGG-3’
            R：5’-TCTCTCTCAGAAGTTTGGAAGC-3’：
3.利用权利要求1所述的试剂盒进行人类基因分型的检测方法，其特征在于按照下述步骤进行：
步骤一、提取DNA，得DNA提取液；
步骤二、在PCR扩增体系中加入步骤一所得的DNA提取液，然后在扩增仪中进行扩增，扩增条件：94℃、3min预变性；然后依次在94℃、1min，60℃、1min，72℃、1.5min，进行10个循环；再依次在90℃、1min，60℃、1min，72℃、1.5min，进行20个循环；再在60℃保持60min，最终保持在4℃，得扩增产物；
步骤三、检测扩增产物
取步骤二所得扩增产物1.0μL，加入去离子甲酰胺和GS500LIZ内标，混匀，经95℃、3min和4℃、2min变性后，用基因分析仪检测；
步骤四、确定扩增产物
根据扩增产物片段大小，确定扩增产物的基因型。
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