CN105821145A - 一种用于检测HLA-DQ基因rs9275319位点多态性的引物及检测方法 - Google Patents

一种用于检测HLA-DQ基因rs9275319位点多态性的引物及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种用于检测HLA‑DQ基因rs9275319位点多态性的引物，包括正向引物5’‑CTTCCATGAACCTTACAG‑3’和反向引物5’‑AAATGGCTACTTCCCTA‑3’。采用该引物检测HLA‑DQ基因rs9275319位点多态性的方法，包括以下步骤：(1)采集样品并提取其基因组DNA；(2)采用上述引物对基因组DNA进行PCR扩增，对扩增产物进行胶回收；(3)对胶回收产物进行浓度测定，然后PCR扩增并纯化；(4)将步骤(3)中的纯化产物在3730型全自动序列分析仪上样，用Chromas软件对SNP分型进行分析。该引物和检测方法特异性好、灵敏度高、准确性好。

Description

一种用于检测HLA-DQ基因rs9275319位点多态性的引物及检测方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于检测HLA-DQ基因rs9275319位点多态性的引物及检测方法。
背景技术
肝癌是一种常见的原发性肝脏恶性肿瘤，是我国常见的恶性肿瘤，自上世纪末以来已迅速上升至我国恶性肿瘤第二位，仅次于肺癌。肝癌平均年生存率仅有9％，我国每年死于肝癌的人数占全球肝癌死亡人口总数的45％，给患者的家庭和社会均带来了严重的负担。我国是乙肝高发区，仅HBs Ag携带者人数已占全球携带者人数的34.3％(3.5亿)。据调查，在我国乙型肝炎病毒(HBV)携带者肝癌发病率较高，HBV持续的慢性感染是导致肝癌发生的主要原因，除了病毒自身以及环境因素外，遗传因素在肝癌的发生也起到了重要作用。目前国内早期肝癌临床筛查主要包括超声检查、甲胎蛋白检查、CT检查、PET-CT检查、核磁共振检查等，这些方法都是建立在肝癌已经发生的基础上，如果能在肝癌还没发生之前进行易感基因筛查，找出肝癌高危人群并采取积极有效的预防措施，可以极大程度的减少肝癌的发生和死亡。
人类白细胞抗原(HLA)是决定人类免疫遗传功能的主要基因群，定位于第6染色体短臂上(6p21.3)，全长3600kb，可分为I、II、III类基因，其中HLA-QA属于HLA-II类抗原。有GWAS研究报道，HLA-DQ的rs9275319位点SNP和乙肝后肝癌的发生密切相关。因此，通过对HLA-DQ基因rs9275319位点SNP的检测，有助于肝癌的早期预测预防。
检测易感基因常见方法有限制性片段长度多态性聚合酶链反应、多重PCR、飞行质谱检测、基因芯片、荧光定量PCR等方法。目前最简单的方法是限制性 片段长度多态性聚合酶链反应(PCR-RFLP)，该方法所需仪器简单，但操作复杂，样本量大时容易造成PCR产物的交叉污染并且容易出现酶切不充分或者酶切过度而出现假阴性或假阳性结果，可靠性低。多重PCR方法虽然特异性有所提高，但是该方法的原理仍然是基于普通PCR原理，低引物特异性以及低保真Taq酶等因素均可造成对结果的影响。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)技术灵敏度高，准确性有保障，适合大样本量操作，但对SNP位点两侧序列以及样本质量要求高，仪器也非常昂贵。基因芯片更适合高通量基因检测，不合适几个基因的检测。荧光定量PCR中高分辨率溶解曲线法是一种快速、简便、经济、实用的分型方法，但SNP分型以来于仪器温度控制的精密性，假阳性高。荧光定量PCR中的Taqman探针的方法采用特异性的荧光标记的探针，特异性强，灵敏度高且操作方便，快速，但该方法探针、试剂价格偏高，机器灵敏度高，对样本质量以及人员操作要求高。
发明内容
针对现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种用于检测HLA-DQ基因rs9275319位点多态性的引物及检测方法，可有效解决特异性和灵敏度不高，对样品质量要求高的问题。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种用于检测HLA-DQ基因rs9275319位点多态性的引物，包括正向引物5’-CTTCCATGAACCTTACAG-3’和反向引物5’-AAATGGCTACTTCCCTA-3’。
采用上述引物检测HLA-DQ基因rs9275319位点多态性的方法，包括以下步骤：
(1)采集样品并提取其基因组DNA；
(2)采用上述引物对基因组DNA进行PCR扩增，对扩增产物进行胶回收；
(3)对胶回收产物进行浓度测定，然后PCR扩增并纯化；
(4)将步骤(3)中的纯化产物在3730型全自动序列分析仪(美国Applied Biosystems公司)上样，用Chromas软件对SNP分型进行分析。
进一步地，步骤(2)中PCR扩增体系为：DNA模板含量为100-150ng，浓度为5pmol/μL的正向引物3.0μL，浓度为5pmol/μL的反向引物3.0μL，Prime STAR MAX 25.0μL，用ddH2O补足体积至50μL。
进一步地，步骤(2)中PCR扩增反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃退火15s，72℃延伸15s，30个循环，最后72℃延伸5min后于4℃保存。
进一步地，步骤(3)中PCR扩增体系为：DTCS Master Mix 2.5μL，浓度为5pmol/μL的反向引物1.0μL，DNA模板20ng，用ddH2O补足体积至10μL。
进一步地，步骤(3)中PCR扩增反应条件为：94℃预变性30s，94℃变性25s，55℃退火25s，60℃延伸3min，30个循环，最后60℃延伸20min。
本发明提供的一种用于检测HLA-DQ基因rs9275319位点多态性的引物及检测方法，具有以下有益效果：
(1)本发明提供了一种检测HLA-DQ基因rs9275319位点多态性的引物，该引物特异性好，准确性好，实现了HLA-DQ基因rs9275319位点多态性的检测，提高了检测效率。
(2)本发明还提供了一种检测HLA-DQ基因rs9275319位点多态性的方法，通过使用特异性的PCR扩增引物，其检测结果也具有特异性好，灵敏度高，准确性好等优点，可以为肝癌的疾病预防提供指导。
附图说明
图1为使用本发明引物对待测样品进行PCR扩增后的产物电泳图；
图2为样品的HLA-DQ基因rs9275319位点多态性检测结果图；
图3为采用荧光探针法对样品进行检测及测序结果图。
具体实施方式
实施例1
针对HLA-DQ基因rs9275319位点设计了大量的引物，通过引物反应条件的优化和比较，筛选出特异性好的一对引物，分别为HLA-DQ-F：5’-CTTCCATGAACCTTACAG-3’(SEQ ID No：1)；HLA-DQ-R：5’-AAATGGCTACTTCCCTA-3’(SEQ ID No：2)，该引物扩增片段位于chrl:32698036-32698748，长度为713，序列中R为突变碱基，具体序列见(SEQ ID No：3)。
使用该引物对待测基因组DNA进行PCR扩增，PCR扩增体系为：DNA模板aμL使其含量为100-150ng，去离子水19-aμL，浓度为5pmol/μL的正向引物3.0μL，浓度为5pmol/μL的反向引物3.0μL，Primer STAR MAX 25.0μL；扩增反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃退火15s，72℃延伸15s，30个循环，最后72℃延伸5min后于4℃保存；将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示，由图1可知，PCR产物大小与设计长度吻合，且特异性好。
实施例2 HLA-DQ基因rs9275319位点多态性的检测
(1)提取EDTA抗凝外周血(肘静脉血)的DNA样品，提取方法参照血液基因组DNA提取试剂盒(购自北京天根生化科技有限公司)的说明书；
(2)对上述DNA样品进行PCR扩增，PCR扩增采用Primer STAR MAX Premix(2X)(购自北京天根生化科技有限公司)，反应体系如表1所示，引物浓度为5pmol/μL，模板DNA的量为100-150ng，加入aμL(根据提取的DNA浓度计算)，PCR扩增反应条件见表2；PCR产物用2％琼脂糖凝胶电泳分离切胶、 DNA胶回收试剂盒回收DNA；电泳参数为：电压120V，400mA，时间30min；胶回收方法参照胶回收试剂盒(购自TaKaRa)说明书；
表1 PCR反应体系
试剂 体积(μL)
DNA a
ddH2O 19-a
Primer F 3.0
Primer R 3.0
Primer STAR MAX 25.0
total 50.0
表2 PCR反应条件
(3)将回收后的产物测定其DNA浓度后，采用所述引物的正向引物进行PCR扩增(荧光标记反应)，PCR反应体系见表3，模板的量为20ng，根据纯化后DNA的浓度计算后加入bμL(根据提取的DNA浓度计算)，PCR扩增条件见表4；然后将浓度为3mol/L，pH值为5.2的醋酸钠缓冲液、0.1mol/L，pH值为8.0的Na2EDTA缓冲液和Glycogen以体积比为2:2:1配制终止液，取5μL终止液加入到PCR产物中，然后用乙醇对产物进行纯化，具体纯化步骤为：取5μL 终止液加入到PCR产物中充分混匀，离心，将液体转移至一只新的1.5mL EP管中，然后加入50μL预冷无水乙醇，充分混匀，放入冰箱-20℃冷冻10min后于12000r/min离心5min，弃去上清，再向EP管中加入150μL预冷70％乙醇，放入高速离心机离心，12000r/min离心2min，弃去上清，稍离心，用移液器吸干EP管内剩余的液体，打开EP管盖，室温晾干至白色沉淀变透明，再向EP管中加入25μL SLS(Sample Loading Solution)溶解DNA；
表3 PCR反应体系
试剂 体积(μL)
DTCS Master Mix 2.5
Primer R 1.0
ddH2O 6.5-b
模板DNA b
总计 10.0
表4 PCR反应条件
(4)将纯化产物点样后装入ABI3730全自动序列分析仪，通过Chromas软件，将所测序列与标准序列进行比对，寻找该SNP位点，通过该SNP位点处碱基的类型，就可以得到该SNP位点的基因型，SNP分型结果如图2(具体见图2-1， 2-2，2-3)。
HLA-DQ rs9275319位点SNP易感基因型为AA和AG，非易感基因型为GG。由图2-1可知，该样品的HLA-DQ rs9275319位点基因型为AA，说明该样品的该位点基因型为易感基因型。
实施例3 检测肝癌易感基因SNP位点的特异性
本检测方法将特异性定义为测序结果峰图无套峰、背景峰、杂峰、飘峰等现象。
按照本发明提供的检测方法对50个样品进行检测，测序峰图单一，无双峰、背景峰等现象，50个样品检测结果均相同，峰图结果见图2，说明本发明提供的检测方法特异性为100％。
实施例4 检测肝癌易感基因SNP位点的灵敏度和准确度
本检测方法将灵敏度定义为杂合子符合率。
按照本发明提供的检测方法对50个样品进行检测，同时采用荧光探针法进行验证，两种方法对50个样品的检测结果一致，结果见图3，说明本发明提供的检测方法灵敏度和准确度高。
实验例5 检测肝癌易感基因SNP位点的精密度
本检测方法将精密度定义为对多个样品分别进行重复检测后，结果一致。
按照本发明提供的检测方法，重复检测不同人员、不同时间和同一样品不同孔间的对比实验，所得结果均一致，说明该检测方法精密度为100％。
。

Claims (6)

1.一种用于检测HLA-DQ基因rs9275319位点多态性的引物，其特征在于，包括正向引物5’-CTTCCATGAACCTTACAG-3’和反向引物5’-AAATGGCTACTTCCCTA-3’。
2.采用权利要求1中所述引物检测HLA-DQ基因rs9275319位点多态性的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)采集样品并提取其基因组DNA；
(2)采用上述引物对基因组DNA进行PCR扩增，对扩增产物进行胶回收；
(3)对胶回收产物进行浓度测定，然后PCR扩增并纯化；
(4)将步骤(3)中的纯化产物在序列分析仪上样，然后对SNP分型进行分析。
3.根据权利要求2所述的检测HLA-DQ基因rs9275319位点多态性的方法，其特征在于，步骤(2)中PCR扩增体系为：DNA模板含量为100-150ng，浓度为5pmol/μL的正向引物3.0μL，浓度为5pmol/μL的反向引物3.0μL，PrimeSTAR MAX 25.0μL，用ddH2O补足体积至50μL。
4.根据权利要求2所述的检测HLA-DQ基因rs9275319位点多态性的方法，其特征在于，步骤(2)中PCR扩增反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃退火15s，72℃延伸15s，30个循环，最后72℃延伸5min后于4℃保存。
5.根据权利要求2所述的检测HLA-DQ基因rs9275319位点多态性的方法，其特征在于，步骤(3)中PCR扩增体系为：DTCS Master Mix 2.5μL，浓度为5pmol/μL的反向引物1.0μL，DNA模板20ng，用ddH2O补足体积至10μL。
6.根据权利要求2所述的检测HLA-DQ基因rs9275319位点多态性的方法，其特征在于，步骤(3)中PCR扩增反应条件为：94℃预变性30s，94℃变性25s，55℃退火25s，60℃延伸3min，30个循环，最后60℃延伸20min。
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