CN104745710A

CN104745710A - 一种与原发性肝细胞癌辅助诊断相关的snp标志物及其应用

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Publication number: CN104745710A
Application number: CN201510181231.1A
Authority: CN
Inventors: 戴俊程; 江玥; 王一雄; 李绵
Original assignee: Luo Shi Bio Tech Ltd Shanghai
Current assignee: Luo Shi Bio Tech Ltd Shanghai
Priority date: 2015-04-16
Filing date: 2015-04-16
Publication date: 2015-07-01
Anticipated expiration: 2035-04-16
Also published as: CN104745710B

Abstract

本发明属于基因工程及肿瘤医学领域，公开了一种与原发性肝癌辅助诊断相关的SNP标志物及其应用。该标志物为rs7574865、rs1012068、rs17401966、rs2596542、rs455804、rs9272105、rs9275319和rs9275572的组合。该标志物可用于制备肝癌辅助诊断试剂盒。

Description

一种与原发性肝细胞癌辅助诊断相关的SNP标志物及其应用

技术领域

本发明属于基因工程及肿瘤医学领域，涉及原发性肝细胞癌辅助诊断相关的SNP标志物及其应用。

背景技术

原发性肝癌是世界上最为常见的恶性肿瘤之一，其中肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)约占其85％。据2012年国际癌症研究署(IARC)估计，全球肿瘤发病1410万人，其中肝癌新发病人数达到78.25万，死亡病例达到74.55万，其中有50％发生在中国。据中国国家癌症中心2014年收集的全国2011年肿瘤发病和死亡数据的分析报告，我国新发肝癌病例约35.56万，位居我国所有恶性肿瘤的第四位；死亡病例约32.24万，位居全部癌症死亡病例第二位。因此，肝癌是严重危害我国人民生命健康的最主要癌症之一，是亟需解决的重大公共卫生问题。

肝癌的发生是一个多因素、多阶段的过程，主要环境危险因素包括慢性肝炎病毒(HBV/HCV)感染、饮食摄入黄曲霉毒素和饮水中的微囊藻毒素等。其中，HBV/HCV导致的慢性肝炎病毒感染被认为是肝癌发生最为重要的危险因素，与全球75％的肝癌有关，在发展中国家甚至达到85％。其他危险因素如黄曲霉毒素的摄入等，单独存在时影响较小，其作用机制可能是与病毒感染共同参与肝癌的发生。在这两种病毒中，HBV感染更有普遍性，除日本之外(主要是HCV感染)，HBV感染流行程度基本与全球肝癌发病的地理分布一致。在中国，HBV感染也是首要的危险因素，但HCV的作用同样不可忽视，尤其当合并感染时，危险度的加成更为显著。在中国台湾地区，HBV疫苗接种计划早在1984年就开始实行，对于肝癌发病率的影响已经初步显现。江苏启东地区作为一个传统的肝癌高发区，近年来通过防治肝炎、管粮防霉和改良饮水等综合措施，肝癌在青少年一代开始显示下降的趋势，但疫苗等措施作用的真正体现可能还需要10-20年。

然而，相同的环境危险因素暴露或HBV感染携带者中，仅有少数个体最终发生肝癌，这说明不同个体对环境暴露的反应存在不同的易感性，这种易感性目前被认为是由个体的遗传因素所决定。单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种。SNP的存在被认为赋予了个体不同的表型性状，以及对于环境暴露、药物治疗等因素的不同反应性，因此SNP可能是导致个体对常见疾病发病和预后易感性差异的重要遗传基础。利用疾病易感的SNP谱预测疾病的发生，不仅灵敏、准确和快速，具有广阔的应用前景，而且通过SNP预测谱的构建，还可以实现中国古语中“上医治未病”的理想，对疾病作出前瞻性的“基因诊断”。近年来，利用SNP预测疾病的发生发展已经成为临床和科研工作者的研究热点，在肿瘤和心脑血管疾病等常见重大疾病预测上的应用价值已初见端倪。

然而，目前还没有将SNP应用肝癌诊断的报道，若能筛选出肝癌易感的SNP作为生物标志物，并研制相应的诊断试剂盒，对我国肝癌诊断现状必将是一次有力的推动，也为其药物筛选、药效评价及靶向治疗开辟了新的途径。

发明内容

本发明的目的是针对上述技术问题，提出一种与肝癌辅助诊断相关的SNP标志物及其应用。

本发明的第二个目的是提供上述SNP标志物的特异性引物。

本发明的第三个目的是提供上述SNP标志物的特异性延伸引物。

本发明的第四个目的是提供上述SNP标志物及其特异性引物和特异性延伸引物在制备肝癌辅助诊断试剂盒中的应用。

本发明第五个目的是提供肝癌辅助诊断试剂盒。

发明人通过分离和研究肝癌患者及与其年龄匹配的健康对照外周血DNA中的单核苷酸多态性，寻找一组与肝癌高度相关的高特异性和敏感性的SNP，并研制出可便于临床应用的肝癌辅助诊断试剂盒，为肝癌的筛查和诊断提供数据支持，为发现具有潜在治疗价值的新型小分子药物提供数据支持。

本发明的目的是通过下列技术方案实现的：

一种肝癌辅助诊断试剂盒，该试剂盒用于检测外周血DNA中rs7574865、rs1012068、rs17401966、rs2596542、rs455804、rs9272105、rs9275319和rs9275572。

所述的诊断试剂盒，该试剂盒含有上述SNP标志物的特异性引物。

所述的诊断试剂盒，该试剂盒含有的SNP标志物的特异性引物为：

rs10212068的引物序列为SEQ ID No：1、SEQ ID No：2和SEQ ID NO：3；

rs455804的引物序列为SEQ ID No：4、SEQ ID No：5和SEQ ID NO：6；

rs9275319的引物序列为SEQ ID No：7、SEQ ID No：8和SEQ ID NO：9；

rs2596542的引物序列为SEQ ID No：10、SEQ ID No：11和SEQ ID NO：12；

rs9272105的引物序列为SEQ ID No：13、SEQ ID No：14和SEQ ID NO：15；

rs9275572的引物序列为SEQ ID No：16、SEQ ID No：17和SEQ ID NO：18；

rs17401966的引物序列为SEQ ID No：19、SEQ ID No：20和SEQ ID NO：21；

rs7574865的引物序列为SEQ ID No：22、SEQ ID No：23和SEQ ID NO：24。

所述诊断试剂盒，该试剂盒还可以包括PCR反应常用的酶和试剂，如Taq酶、dNTP混合液、Mgcl2溶液、去离子水等；还可以含有标准品和/或对照品。

具体地说，本发明解决问题的技术方案包括：(1)建立统一标准的标本库和数据库：以标准操作程序(SOP)采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人口学资料和临床资料。(2)基因型检测：选择肝癌病例，与肝癌病例年龄、性别匹配的对照，利用高密度SNP芯片，在全基因组范围内找出与肝癌相关的SNP。(3)对筛选出的阳性关联SNP，进一步采用Sequenom MassARRAY基因分型平台进行检测，验证其应用于临床诊断的可重复性。(4)肝癌辅助诊断试剂盒的研制：根据肝癌病例和健康对照中基因型分布频率有显著差异的SNP开发SNP辅助诊断试剂盒。

本发明人以标准操作程序(SOP)采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人口学资料、临床资料等，并采用了Illumina Human OmniExpress12v1芯片进行全基因组扫描，Sequenome基因分型进行单个位点的检测等。

具体来说研究的实验方法主要包括以下几个部分：

1.研究样本的选择

(1)经病理学明确诊断的肝癌病例；

(2)与病例年龄、性别匹配的对照；

本研究共采用7323例符合标准的样本进行研究。

2.酚-氯仿法提取外周血基因组DNA，按常规方法操作。通常能得到20-50ng/μl DNA，纯度(紫外260OD与280OD比值)在1.6-2.0。

3.Human OmniExpress12v1芯片检测

(1)取受试者全基因组DNA样本；

(2)在Human OmniExpress12v1芯片(购于美国Illumina公司，下同)上进行全基因组扫描；

(3)检测并比较各基因型在肝癌病例与健康对照中的分别差异。

4.单个SNP的Sequenome基因分型

(1)取受试者DNA样本；

(2)设计单个SNP的特异性引物；

(3)进行PCR反应及延伸反应；

(4)检测并比较肝癌病例与健康对照中不同基因型的分布差异。

5.诊断试剂盒制备方法

Human OmniExpress12v1芯片进行全基因组扫描和单个SNP检测后确定肝癌病例与健康对照中基因型分布频率有显著差异的SNP，作为肝癌诊断的指标。最后筛选出的与肝癌发病有关的SNP组成辅助诊断试剂盒(rs7574865、rs1012068、rs17401966、rs2596542、rs455804、rs9272105、rs9275319和rs9275572)。诊断试剂可以包括这些SNP的特异性引物，以及Taq酶、dNTP等试剂。

6.统计分析方法

运用卡方检验(用于分类变量)或者student t检验(用于连续性变量)比较人口学特征等在研究对象组间分布的差异。用logistic回归分析中的additive模型进行关联分析。

为了进一步研究这8个SNP构成的综合指征用于早期诊断的效果，我们构建了一个数学公式，综合考虑每个SNP与肝癌发病的正、负关联情况和联系强度。具体来说，我们对每个SNP的三种基因型进行评分，野生纯合型＝“0”，杂合型＝“1”，变异纯合型＝“2”，以单个SNP分析时的additive模型下的回归系数为权重，综合考虑每个SNP的情况给每个研究研究对照确定一个危险分值。危险分值的计算方法如下：危险分值＝(1.19×rs7574865的评分)+(1.31×rs1012068的评分)+(1.22×rs17401966的评分)+(1.25×rs2596542的评分)+(1.23×rs455804的评分)+(1.32×rs9272105的评分)+(1.33×rs9275319的评分)+(1.34×rs9275572的评分)，获得的危险分值系数以及界限值被直接应用于全基因组关联研究的3003例样本中。

统计学分析均通过专门的统计学分析软件完成(PLINK1.07)。统计学显著性水平P值设为0.05，所有统计学检验均为双侧检验。

以下是本发明进一步的说明：

在上述1538例符合条件的肝癌病例及1465例健康对照中，两组年龄、性别均衡可比。我们将这两组人群经Human OmniExpress12v1芯片进行全基因组扫描获得相关结果。

根据Human OmniExpress12v1芯片检测，本发明人检测到在“肝癌病例”组和“健康对照”组中基因型分布频率存在差异的SNP包括：rs7574865、rs1012068、rs17401966、rs2596542、rs455804、rs9272105、rs9275319和rs9275572。

根据上述检测结果，我们将这8个与肝癌发病相关的SNP在另外2112例肝癌病例和与其年龄、性别匹配的2208例健康对照中进行了单个SNP的检测，结果与芯片检测一致。

单因素和多因素Logistic回归分析结果均表明，这8个SNP与肝癌的发病存在着显著关联。

进一步分析这8个SNP的组合用于肝癌诊断的效果，发现其组合能够很好的区分病例与对照。

根据上述实验结果，本发明人制备了一种能用于肝癌辅助诊断的试剂盒，包含测定受试者血标本DNA中上述SNP的特异性引物和其他检测试剂。

具体而言，这8个SNP的组合，或者这8个SNP的特异性引物的组合构成的相关诊断试剂盒有助于肝癌的辅助诊断，为临床医生快速准确掌握患者的疾病状态和病情严重程度，及时采取更具个性化的防治方案提供支持。

本发明有益效果：

本发明提供的SNP标志物作为肝癌辅助判断的标志物的优越性在于：

(1)SNP是一种新型基因生物标志物，区别于传统生物标志物，稳定、微创、易于检测，将大大提高疾病诊断的敏感性和特异性，该类生物标志物的成功开发将为肝癌的诊断和治疗开创全新局面，为其他疾病生物标志物的研制提供借鉴。

(2)SNP试剂盒是一种系统、全面的诊断试剂盒，可用于肝癌的辅助诊断，有助于反映患者的疾病状态，为临床医生快速准确掌握患者病情、及时采取更具个性化的防治方案提供支持。

(3)采用严密的验证和评价体系，本发明人初期采用全基因组芯片扫描以获取疾病相关的SNP谱，并应用Sequenome基因分型方法在大样本中进行了验证；以上方法和策略的应用加速和保证了SNP生物标志物和诊断试剂盒在临床上的应用，也为其他疾病生物标志物的研制提供方法和策略上的借鉴。

本发明通过控制年龄、性别、吸烟、饮酒等对疾病发展的影响因素，研究SNP在肝癌辅助诊断的应用前景，阐述SNP对于肝癌进展的影响，揭示其诊断价值。因此，本发明获得了肝癌发病相关SNP谱和特异性标志物；通过SNP生物标志物和诊断试剂盒的研制和应用，可使得肝癌的诊断更加方便易行，为临床医生快速准确掌握患者病情，为临床治疗效果评价奠定基础，并为发现具有潜在治疗价值的新型小分子药物靶标提供帮助。

附图说明

图1：显示全基因组关联研究病例组和对照组的ROC曲线。

显示肝癌病例组对健康对照组为参照的ROC曲线。

具体实施方式

实施例1 样品的收集和样品资料的整理

发明人于2004年开始至2013年从江苏及其周边地区收集了大量的肝癌患者血标本，通过对样品资料的整理，发明人从中选择了7323例符合下列标准的样本全基因组芯片扫描和单个SNP Sequenom MassARRAY基因分型的实验样品：

1、病理学明确诊断的肝癌患者；

2、与病例年龄、性别匹配的健康对照；

并系统采集了这些样本的人口学资料和临床资料等情况。

实施例2 外周血DNA中SNP的全基因组扫描

在上述符合条件的1538例肝癌患者和1465例健康对照中，两组年龄、性别匹配。将这两组人群经Human OmniExpress12v1芯片检测获得相关结果。具体步骤为：

1、向储存于2ml冻存管中的白细胞加入溶血试剂，颠倒混匀后完全转入。

2、去除红细胞：用溶血试剂将5ml离心管补至4ml，颠倒混匀，4000rpm离心10分钟，弃上清。向沉淀中加入4ml溶血试剂，再次颠倒混匀清洗一次，4000rpm离心10分钟，弃上清。

3、抽提DNA：向沉淀中加1ml抽提液(每300ml中含有122.5ml 0.2M氯化钠，14.4ml0.5M乙二胺四乙酸，15ml 10％十二烷基硫酸钠，148.1ml双蒸水，下同)和8μl蛋白酶K，震荡器上充分震荡混匀，37℃水浴过夜。

4、去除蛋白质：加1ml饱和酚充分混匀(手轻摇15分钟)，4000rpm离心10分钟，取上清转入新的5ml离心管中。在上清液中加入等体积氯仿与异戊醇混合液(氯仿：异戊醇＝24：1，v/v，下同)，充分混匀后(手摇15分钟)，4000rpm离心10分钟，取上清(分入两个1.5ml的离心管)。

5、DNA沉淀：在上清液中加入3M的醋酸钠60μl,再加入与上清液等体积的冰无水乙醇，上下轻摇，可见白色絮状沉淀物，再以12000rpm离心10min。

6、DNA洗涤：在沉淀中加入冰无水乙醇1ml,12000rpm离心10min,弃上清后真空抽干或置于清洁干燥环境中蒸干。

7、测量浓度:通常能得到20-50ng/μl DNA，纯度(紫外260OD与280OD比值)在1.6-2.0。

8、进行全基因组扫描；

9、数据分析与处理:在“肝癌病例”组和“健康对照”组中发现的基因型分布频率有显著差异的SNP在上文中已经罗列出，结果见表1。

表1.病例组与对照组全基因组关联分析结果

实施例3 单个SNP的Sequenom MassARRAY基因分型

将上述全基因组扫描发现与肝癌发病有关的SNP在另外2112肝癌病例和2208健康对照中进行检测，具体步骤为：

1、向储存于2ml冻存管中的外周血加入溶血试剂(即裂解液，40份量配置方法如下：蔗糖219.72g、氯化镁2.02g和曲拉通X-100(amresco 0694)20ml混合后，用TrisHcl溶液定容至2000ml，下同)，颠倒混匀后完全转入。

3、抽提DNA：向沉淀中加1ml抽提液(每300ml中含有122.5ml 0.2M氯化钠，14.4ml 0.5M乙二胺四乙酸，15ml 10％十二烷基硫酸钠，148.1ml双蒸水，下同)和8μl蛋白酶K，震荡器上充分震荡混匀，37℃水浴过夜。

5、DNA沉淀：在上清液中加入3M的醋酸钠60μl，再加入与上清液等体积的冰无水乙醇，上下轻摇，可见白色絮状沉淀物，再以12000rpm离心10min。

6、DNA洗涤：在沉淀中加入冰无水乙醇1ml，12000rpm离心10min，弃上清后真空抽干或置于清洁干燥环境中蒸干。

7、测量浓度：通常能得到20-50ng/μl DNA，纯度(紫外260OD与280OD比值)在1.6-2.0。

8、进行Sequenom MassARRAY基因分型：

1)使用Sequenom公司Genotyping Tools及MassARRAY Assay Design软件对全基因组扫描发现的25个阳性关联的SNP设计PCR扩增引物及单碱基延伸引物(表2)。反应体系包括4μl Sequenom MassARRAY基因分型PCR master mix(Hotstar Taq 0.5U，每条扩增引物0.5pmol，0.1μl的25mM dNTPs，1.9μl双蒸水)，加入1μl DNA。仪器使用的是Sequenom MassARRAY Nanodispenser，PCR反应条件为：94℃ 4分钟；94℃ 20秒，56℃ 30秒，72℃ 1分钟，45个循环；72℃ 3分钟；4℃保持。

表2.相关SNP引物信息

2)在PCR反应结束后，将PCR产物用SAP(shrimp alkaline phosphatase，虾碱性磷酸酶)处理，以去除体系中游离的dNTPs。

3)在碱性磷酸酶处理结束后，进行单碱基延伸反应，反应体系包括：2μl EXTEND Mix(单碱基延伸反应液，包括其中各延伸反应引物混合物0.94μl，iPLEX酶0.041μl，延伸混合物0.2μl)，7μl SAP处理后PCR产物。PCR反应条件：I.94℃ 30秒；II.94℃ 5秒；III.52℃ 5秒；IV.80℃ 5秒；V.重复III、IV 4个循环；VI.重复II、III、IV、V39个循环；VII.72℃ 3分钟；VIII.4℃保持。

4)树脂纯化：

(1)将Clean Resin树脂平铺到6mg的树脂板中；

(2)加16μl水到延伸产物的对应孔内；

(3)将干燥后的树脂倒入延伸产物板中，封膜，低速垂直旋转30分钟，使树脂与反应物充分接触；

(4)离心使树脂沉入孔底部。

5)芯片点样：启动MassARRAY Nanodispenser RS1000点样仪，将树脂纯化后的延伸产物移至384孔SpectroCHIP(Sequenom)芯片上。

6)质谱检测：将点样后的SpectroCHIP芯片使用MALDI-TOF(matrix-assisted laser desorption/ionization–time of fligh，基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱)分析，检测结果使用TYPER 4.0软件(sequenom)分型并输出结果。

9、基因型判读：采用TYPER 4.0软件(sequenom)进行。

10、数据处理和分析：利用logistic回归模型中的additive模型比较每个SNP的三种基因型在病例组和对照组中分布频率的差异，结果与全基因组扫描类似不再列出。

实施例4 利用危险度评分方法进一步分析SNP与肝癌发病

根据上述结果，本发明人通过对2组样品(“肝癌病例组”和“健康对照组”)基因型分布频率的比较，选择阳性关联的SNP，以全基因组扫描样本中单个SNP回归系数为权重，进一步求得危险分值，绘制ROC来评估预测的灵敏性和特异性，进而评估这些SNP对肝癌发病的判断能力。对8个SNP标志物的联合分析发现，这8个SNP以69.45％的AUC将健康对照组和肝癌病例组分开，最佳临界点的灵敏度为78.35％，特异度：62.32％(图1)。

因此，本发明人证明了采用rs7574865、rs1012068、rs17401966、rs2596542、rs455804、rs9272105、rs9275319和rs9275572的组合能够很好地将健康对照和肝癌患者区分。

实施例5 用于肝癌辅助诊断SNP试剂盒的制作SNP试剂盒的制作和操作流程是基于Illumina Human OmniExpress12v1芯片检测和Sequenome基因分型技术。试剂盒含有一批SNP特异性引物(包括下列引物：

rs10212068的引物序列为SEQ ID No：1、SEQ ID No：2和SEQ ID NO：3；

rs455804的引物序列为SEQ ID No：4、SEQ ID No：5和SEQ ID NO：6；

rs9275319的引物序列为SEQ ID No：7、SEQ ID No：8和SEQ ID NO：9；

rs2596542的引物序列为SEQ ID No：10、SEQ ID No：11和SEQ ID NO：12；

rs9272105的引物序列为SEQ ID No：13、SEQ ID No：14和SEQ ID NO：15；

rs9275572的引物序列为SEQ ID No：16、SEQ ID No：17和SEQ ID NO：18；

rs17401966的引物序列为SEQ ID No：19、SEQ ID No：20和SEQ ID NO：21；

rs7574865的引物序列为SEQ ID No：22、SEQ ID No：23和SEQ ID NO：24)，还可以有相应PCR技术所需的常用试剂，如：dNTPs，双蒸水，Taq酶等，这些常用试剂都是本领域技术人员熟知的，另外还可以有标准品和对照(如确定基因型的标准品和空白对照等)。此试剂盒的价值在于只需要外周血而不需要其它组织样品，通过最精简和特异的引物及质谱仪检测SNP，再通过SNP谱辅助判断肝癌，不仅稳定，检测方便，且精确，大大提高疾病诊断的敏感性和特异性，因此将此试剂盒投入实践，可以帮助指导诊断和更有效的个体化治疗。

<110>上海洛施生物科技有限公司

<120>一种与原发性肝癌辅助诊断相关的SNP标志物及其应用

<160> 24

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> rs1012068上游引物

<400> 1

ACGTTGGATGGACTGATAGGTTTTTAGCCAC 30

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> rs1012068下游引物

<400> 2

ACGTTGGATGTCTATGTGCCCCATATCGCC 30

<210> 3

<211> 15

<212> DNA

<213> rs1012068延伸引物

<400> 3

CCTGGGGTGCTCTTC 15

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> rs455804上游引物

<400> 4

ACGTTGGATGCAAGGCAGAGTCGTGAAATG 30

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> rs455804下游引物

<400> 5

ACGTTGGATGTGATCTAGTTACTGCCTATG 30

<210> 6

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<212> DNA

<213> rs455804延伸引物

<400> 6

GTAGGCTGTGCTCCT 15

<210> 7

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<212> DNA

<213> rs9275319上游引物

<400> 7

ACGTTGGATGCCACCCTTCATTTTTCTCCC 30

<210> 8

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<212> DNA

<213> rs9275319下游引物

<400> 8

ACGTTGGATGCCTCAAAAGTAGGGAAGCTG 30

<210> 9

<211> 15

<212> DNA

<213> rs9275319延伸引物

<400> 9

TCTGTGGTTGAAGGTC 15

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> rs2596542上游引物

<400> 10

ACGTTGGATGTGGGCACATCTTTTCATAGC 30

<210> 11

<211> 30

<212> DNA

<213> rs2596542下游引物

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ACGTTGGATGAATCGTCTCCCAAAGAACAG 30

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<212> DNA

<213> rs2596542延伸引物

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CCAAAGAACAGCTACAC 16

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<212> DNA

<213> rs9272105上游引物

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ACGTTGGATGTATAAGTTTCCTCTGCTTC 30

<210> 14

<211> 30

<212> DNA

<213> rs9272105下游引物

<400> 14

ACGTTGGATGAGTCCTGTATGCTGATATCC 30

<210> 15

<211> 17

<212> DNA

<213> rs9272105延伸引物

<400> 15

TGATATCCAGTCACATGG 17

<210> 16

<211> 30

<212> DNA

<213> rs9275572上游引物

<400> 16

ACGTTGGATGCAAAGATGTGGACTTTAGGG 30

<210> 17

<211> 30

<212> DNA

<213> rs9275572下游引物

<400> 17

ACGTTGGATGCTTGAACTTAGACTAGGTCC 30

<210> 18

<211> 18

<212> DNA

<213> rs9275572延伸引物

<400> 18

GACTAGGTCCTTTAATGAAG 18

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<211> 30

<212> DNA

<213> rs17401966上游引物

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ACGTTGGATGCCAGCACTTAATGAAAACAC 30

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<211> 30

<212> DNA

<213> rs17401966下游引物

<400> 20

ACGTTGGATGACCTCTAAGAACACTTGAC 30

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> rs17401966延伸引物

<400> 21

TCTAAGAACACTTGACTCAATA 20

<210> 22

<211> 29

<212> DNA

<213> rs7574865上游引物

<400> 22

ACGTTGGATGGTCAAGTGTGAACCTTTCC 29

<210> 23

<211> 31

<212> DNA

<213> rs7574865下游引物

<400> 23

ACGTTGGATGCCACAAATTATATCTTTTCC 31

<210> 24

<211> 22

<212> DNA

<213> rs7574865延伸引物

<400> 24

CCATTTTTATTTAATTAGGTAAACATAG 22

Claims

1.一种与肝癌辅助诊断相关的SNP标志物，其特征在于该标志物为rs7574865、rs1012068、rs17401966、rs2596542、rs455804、rs9272105、rs9275319和rs9275572的组合。

2.权利要求1所述的SNP标志物的特异性扩增引物，其特征在于该引物为：

rs10212068的引物序列为SEQ ID No：1和SEQ ID No：2；

rs455804的引物序列为SEQ ID No：4和SEQ ID No：5；

rs9275319的引物序列为SEQ ID No：7和SEQ ID No：8；

rs2596542的引物序列为SEQ ID No：10和SEQ ID No：11；

rs9272105的引物序列为SEQ ID No：13和SEQ ID No：14；

rs9275572的引物序列为SEQ ID No：16和SEQ ID No：17；

rs17401966的引物序列为SEQ ID No：19和SEQ ID No：20；

rs7574865的引物序列为SEQ ID No：22和SEQ ID No：23。

3.权利要求1所述的SNP标志物的特异性延伸引物，其特征在于该引物为：

rs10212068的引物序列为SEQ ID NO：3；

rs455804的引物序列为SEQ ID NO：6；

rs9275319的引物序列为SEQ ID NO：9；

rs2596542的引物序列为SEQ ID NO：12；

rs9272105的引物序列为SEQ ID NO：15；

rs9275572的引物序列为SEQ ID NO：18；

rs17401966的引物序列为SEQ ID NO：21；

rs7574865的引物序列为SEQ ID NO：24。

4.权利要求1所述的SNP标志物在制备肝癌辅助诊断试剂盒中的应用。

5.权利要求2和3所述的SNP标志物的特异性引物在制备肝癌辅助诊断试剂盒中的应用。

6.一种肝癌辅助诊断试剂盒，其特征在于该试剂盒用于检测外周血DNA中rs7574865、rs1012068、rs17401966、rs2596542、rs455804、rs9272105、rs9275319和rs9275572。

7.根据权利要求6所述的诊断试剂盒，其特征在于该试剂盒含有权利要求2所述SNP标志物的特异性引物。

8.根据权利要求6或7所述诊断试剂盒，其特征在于该试剂盒还可以包括PCR技术常用的试剂。