CN102041301A - 一种肝癌风险基因测评方法及套组 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种肝癌风险基因测评方法及套组，包括步骤：1)提取受检者样本DNA；2)对样本DNA进行目的基因的PCR扩增、纯化、片段化及荧光素标记；3)荧光素标记的PCR产物进行基因芯片杂交，检测目的基因的SNP位点；4)根据步骤3)得到的基因分型结果，分析受检者肝癌的风险率。通过相关基因分型，可以对受检者进行肝癌风险预估，从而制订最科学健康管理计划，降低甚或避免肝癌发生。
Description
技术领域
本发明涉及一种肝癌风险基因测评方法及套组，更具体地说是测定人各肝癌易感基因中的多态性位点基因型，预测受试者患肝癌的风险几率，该方法可用于疾病的预测、辅助诊断、治疗和新药研发，属于医学生物技术和基因诊断领域。
背景技术
肝癌是常见的恶性肿瘤之一，常见于45岁以上的中老年人群。肝癌的发生与肝炎(尤其是乙肝)、肝硬化等疾病息息相关。全世界人群中肝癌的发病率为6.6/10万，其中男性的发病率为10.2/10万，女性为3.6/10万。在我国，肝癌的发病率和死亡率虽低于肺癌、乳腺癌、胃癌等肿瘤，但在在过去20年间显著上升，目前年死亡率高达约20/10万，约占全世界肝癌死亡率的一半。
目前，疾病的遗传易感性检测是国内外科学研究的热点。而在遗传因素易感性的研究中，采用单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)作为基因组标志的关联分析方法较为有效和常用。SNP是指基因组水平上由单个核苷酸变异引起的DNA序列多态性，在人群中的发生频率大于1％。它是人类可遗传的变异中最常见的一种，占所有已知多态性的90％以上。同微卫星多态性比较而言，SNP遗传稳定性强，易于检测。检测时能通过简单的“+\-”进行基因分型，是理想的遗传标志。
位于基因内部的SNP能直接影响到蛋白质的结构或表达水平，进而影响到组织、器官乃至生理活动。在肝癌人群和正常对照人群中进行SNP对比分析，可以确定SNP为点和(或)邻近变异与肿瘤发病风险的关系，因而可应用于肝癌遗传易感性的研究。本发明涉及到的肝癌易感基因和位点包括：
表1肝癌易感基因和位点
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种肝癌风险基因测评方法及套组，通过对肝癌易感基因中的关键性基因遗传位点进行检测，判断具体基因型，能有效地为肝癌的预防、预测、诊断以及个体化治疗提供依据和指导，从而对加强肝癌防治起到积极作用。
为解决上述技术问题，本发明的肝癌风险基因测评方法及套组，包括步骤：
(1)提取受检者样本DNA；
(2)对样本DNA进行目的基因的PCR扩增、纯化、片段化及荧光素标记，所述目的基因包括CDC6、CTLA-4、CYP1A1、CYP1A2、DLC1、GRP78、HSPA1B、IL-18、IL-1β、MDM2、MIR-146A、MTHFR、MTRR、TGF-β1、TNF-α和TP53基因；
(3)荧光素标记的PCR产物进行基因芯片杂交，检测目的基因的SNP位点，得到基因分型结果。所述的目的基因的SNP位点包括：CDC6基因的rs4134994位点，CTLA-4基因的rs231775位点，CYP1A1基因的rs4646421、rs2198843、rs4886605和rs1048943位点，CYP1A2基因的rs2069514位点，DLC1基因的rs621554位点，GRP78基因的rs430397位点，HSPA1B基因的rs1061581位点，IL-18基因的rs187238位点，IL-1β基因的rs1143627位点，MDM2基因的rs2279744位点，MIR-146A基因的rs2910164位点，MTHFR基因的rs1801131位点，MTRR基因的rs1801394位点，TGF-β1基因的rs1800469位点，TNF-α基因的rs1799724和rs361525位点及TP53基因的rs1042522位点。
所述步骤(2)中的CDC6基因的引物是SEQ ID NO：41～42所示序列的引物，CTLA-4基因的引物是SEQ ID NO：43～44所示序列的引物，CYP1A1基因的引物是SEQ ID NO：45～52所示序列的引物，CYP1A2基因的引物是SEQ ID NO：53～54所示序列的引物，DLC1基因的引物是SEQ ID NO：55～56所示序列的引物，GRP78基因的引物是SEQ ID NO：57～58所示序列的引物，HSPA1B基因的引物是SEQ ID NO：59～60所示序列的引物，IL-18基因的引物是SEQ ID NO：61～62所示序列的引物，IL-1β基因的引物是SEQ ID NO：63～64所示序列的引物，MDM2基因的引物是SEQ ID NO：65～66所示序列的引物，MIR-146A基因的引物是SEQ IDNO：67～68所示序列的引物，MTHFR基因的引物是SEQ ID NO：69～70所示序列的引物，MTRR基因的引物是SEQ ID NO：71～72所示序列的引物，TGF-β1基因的引物是SEQ ID NO：73～74所示序列的引物，TNF-α基因的引物是SEQ ID NO：75～78所示序列的引物，TP53基因的引物是SEQ ID NO：79～80所示序列的引物。
所述步骤(2)中的片段化是将纯化的PCR产物经浓度测定后，用DNase I进行片段化；所述荧光素标记是将片段化PCR产物利用脱氧核苷酸转移酶在3’末端进行荧光素标记。
所述步骤(3)中基因芯片的制备是将预先设计并合成好的探针通过接触式点样或喷墨式点样点载到玻片或硅片材质的固相载体片基上，其中，探针是SEQ ID NO：1～SEQ IDNO：40所示序列的DNA探针。
附图说明
图1是多重PCR扩增后的电泳检测结果图；
图2是PCR产物片段化后的电泳检测结果图；
图3是检测芯片杂交结果图；
具体实施方式
实施例1样本DNA的提取
样本采用FlexiGene DNA Kit(QIAGEN，Cat.No.51206)试剂盒抽提人外周血中基因组DNA。具体方法为：向300μl血液样本中加入750μl Buffer FG1，上下颠倒5次使其混匀。接着在12,000rpm转速下离心1min。离心后倒掉上层清液，再加入150μl Buffer FG2及1.5μl蛋白酶溶液，立即振荡，直至沉淀完全溶解。接下来离心3～5s，然后65℃水浴5min。当溶液从红色变为橄榄绿色后，加入150μl 100％异丙醇，上下充分颠倒离心管，使其混合，直至DNA析出，呈肉眼可见的线状或块状。然后在12,000rpm转速下离心3min。离心后倒掉上层清液，再加入150μl 70％乙醇，并振荡5s。接着重新在12,000rpm转速下离心3min，离心后倒掉上层清液，自然风干沉淀，直至所有的液体都蒸发掉。最后向离心管中加入200μl Buffer FG3，振荡5s，然后65℃水浴10min，使DNA溶解。
使用ND-1000核酸浓度分析仪对所抽提的DNA定量。DNA工作液浓度校正至10ng/μl，置于-20℃冰箱保存。
实施例2目的基因的PCR扩增、纯化、片段化及荧光素标记
(1)目的基因的PCR扩增
用CDC6基因的引物(SEQ ID NO：41～42)、CTLA-4基因的引物(SEQ ID NO：43～44)、CYP1A1基因的引物(SEQ ID NO：45～52)、CYP1A2基因的引物(SEQ ID NO：53～54)、DLC1基因的引物(SEQ ID NO：55～56)、GRP78基因的引物(SEQ ID NO：57～58)、HSPA1B基因的引物(SEQ ID NO：59～60)、IL-18基因的引物(SEQ ID NO：61～62)、IL-1β基因的引物(SEQID NO：63～64)、MDM2基因的引物(SEQ ID NO：65～66)、MIR-146A基因的引物(SEQ IDNO：67～68)、MTHFR基因的引物(SEQ ID NO：69～70)、MTRR基因的引物(SEQ IDNO：71～72)、TGF-β1基因的引物(SEQ ID NO：73～74)、TNF-α基因的引物(SEQ IDNO：75～78)、TP53基因的引物(SEQ ID NO：79～80)对样本DNA进行PCR扩增。PCR扩增用30μl反应体系进行，反应体系是0.3mM dNTP、10mM Tris-HCl、50mM KCl、2mMMgCl2、20％Q solution(Qiagen)、上游和下游引物的浓度0.16μM、基因组DNA 10ng，Taq酶0.6U(Takara)。应用Touch-down PCR反应程序：94℃变性5min；94℃变性40s，64℃退火1min，每个循环降低0.5℃，72℃延伸50s，共10个循环；然后94℃变性40s，59℃退火40s，72℃延伸50s，共30个循环；最后72℃延伸5min。PCR结束后用1.5％琼脂糖凝胶检测扩增结果。
当进行多重PCR反应时，将SEQ ID NO：41～SEQ ID NO：80所示序列的引物放入一个反应体系中进行扩增，体系为50μl。多重PCR的反应体系为：每种dNTP 0.3μmol/L，Tricine-KOH(PH＝8.7)40mmol/L，KCl 16mmol/L，MgCl23.5mmol/L，BSA 3.75μg/ml，每条引物2μmol/L，DNA 80ng和2.2×Titanium Taq DNA聚合酶(Clontech，USA)。多重PCR反应条件：95℃变性3min；95℃变性30s，66℃退火2min，68℃延伸4min，共40个循环；最后68℃延长10min。PCR扩增后，取3μl PCR反应产物做琼脂糖凝胶电泳，这些PCR产物经处理后可用于下面的杂交步骤。
(2)PCR产物纯化和片段化
每个样品的所有PCR产物混合，用QIA quick PCR Purification Kit(Qiagen，Cat.No.28106)纯化。纯化的PCR产物经测定浓度后，用DNase I(脱氧核糖核酸酶I)进行片段化。片段化的反应体系包括：30μl纯化PCR产物(10μg)，4μl的10×DNase I缓冲液，0.12μl的DNase I，5.88μl的ddH2O。反应条件为37℃温浴5min，然后95℃15min。片段化后的产物跑4％琼脂糖凝胶，保证绝大多数的片段处于30-200个碱基对。
(3)荧光素标记
利用脱氧核苷酸转移酶在3’末端进行荧光素标记，标记的40μl反应体系包括：25μl片段化PCR产物，8μl的5×脱氧核苷酸转移酶缓冲液，1μl的CY3-N6-ddCTP(1mM)，3μl的脱氧核苷酸转移酶(20U/μl)，3μl的ddH2O。反应条件为37℃温浴120min，然后95℃加热15min。
实施例3芯片杂交检测SNP位点
(1)探针溶解
将SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：40所示序列探针的每条探针用TE溶液稀释，终浓度为10mM。将浓度为10mM的探针与浓度为200mM的PBS溶液于384孔板中等体积混合，以粘胶片封好384孔板，室温下振荡2分钟，离心，-20℃保存，以备点样使用。
表2不同SNP位点的探针
(2)点样
将预先设计并合成好的探针通过接触式点样或喷墨式点样点载到玻片、硅片等材质的固相载体片基上。片基采用Cell Associates CSS-100醛基片基，GeneMachine公司的Ominigrid100型号的点样仪，在湿度：65-75％(以FullMoon片基为准)，温度为25℃的条件下点样，点样完毕后，放置半小时后，将芯片取出，室温干燥保存。
(3)杂交、洗涤和结果检测
荧光标记的PCR产物95℃变性10min，立即置于冰上，用于杂交，杂交反应20μl体系包括：荧光素标记的PCR产物15μl，20×SSPE 1.2μl，1％Triton 0.2μl，10×Denhandts 0.9μl，甲酰胺0.5μl，ddH2O 2.2μl。反应条件为48℃温浴120min，然后相继用1×洗涤缓冲液I(5×SSC，0.1％SDS)、1×洗涤缓冲液II(2×SSC，0.1％SDS)和1×洗涤缓冲液III(1×SSC)在42℃各洗涤10min，最后用ddH2O洗涤0.5min。
洗涤后的芯片，经甩干后，用GenePix 4000B共聚焦激光扫描仪进行扫描(也可以用其他的激光扫描仪)。扫描杂交后的芯片得到杂交结果，再用GenePix Pro处理图像得到数据文件，然后对数据文件进行分析就可以得到肝癌易感基因检测结果。
实施例4：风险预估
按照实施例2和实施例3方法，对800例肝癌和900例健康人进行分析。通过多个位点和环境因素等交互作用，分析HBV者患肝癌的风险率，统计结果表明不同人群携带易感基因数量具有显著的统计学意义。
本实施例中，易感基因是指增加个体肝癌风险性的基因，其比数比(Odd Ratio，OR)大于1；保护基因是指降低个体肝癌风险性的基因，其比数比(Odd Ratio，OR)小于1。
健康人群中肝癌易感基因携带个数在1-5之间，平均数是3个；肝癌患者肝癌易感基因个数在2-13之间，平均数是5个。其中非HBV肝癌患者易感基因个数在5-14之间，平均数是7个；HBV肝癌患者携带易感基因个数在3-9之间，平均数是4个。对非遗传因素分析发现，60岁及以上、肿瘤家族史和HBV感染对肝癌OR(Odd Ratio)分别为2.78、1.95和2.93。
根据上述结果，制定了肝癌风险指数标准，并制作了相应的HBV肝癌风险性评估软件(上海芯超生物科技有限公司，上海，中国)，标准如下：每个易感基因为+1分；保护基因为-1分；60岁及以上+3分；肿瘤家族史为+2分；HBV感染为3分。利用HBV肝癌风险性评估软件分析发现，健康人肝癌风险指数平均值是2.6分，肝癌患者风险指数平均值是6.2分。因此，我们定义：肝癌风险指数1～3分，个体患肝癌的风险为中度；肝癌风险指数4～6分，个体患肝癌的风险为高度；肝癌风险指数6分以上，患肝癌的风险为极高度。
对上述结果，我们在另外一个独立的样本组(316例健康人、510例HBV携带者、442例感染HBV肝癌患者、121例肝癌患者)中进行了验证。该独立样本组中，HBV肝癌风险性评估软件评定为极高度肝癌风险的HBV携带者中，93％均是肝癌患者；评估软件评定为高度肝癌易感性的HBV携带者中，83％均是肝癌患者；评估软件评定为中度肝癌风险的HBV携带者中，63％为肝癌患者。结果表明对于肝癌极高度和高度风险性的HBV者预测准确性很高，对于这些人群，必须立即进行HBV检测，并根据临床医生建议，进行相应的检测或者治疗。另一方面，从上述结果中，也看到HBV可大大提高肝癌的风险性，对于肝癌中度风险性的检测者，必须注意避免感染HBV。
实施例5：受检者的肝癌的风险率评估
样本：一HBV感染受检者(女性，43岁，无肿瘤家族史)
按照实施例1-3的检测操作流程进行检测，其中，该受检者目的基因多重PCR扩增后的电泳检测结果见图1，PCR产物片段化后的电泳检测结果见图2，检测芯片杂交结果见图3。将所得检测结果导入HBV肝癌评估软件，得到本实施例中的受检者的肝癌风险指数为4分，肝癌风险性为高度。
序列表
<110>上海芯超生物科技有限公司
<120>一种肝癌风险基因测评方法及套组
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<170>PatentIn version 3.5
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Claims (8)
1.一种肝癌风险基因测评方法及套组，包括步骤：
(1)提取受检者样本DNA；
(2)对样本DNA进行目的基因的PCR扩增、纯化、片段化及荧光素标记，所述目的基因包括CDC6、CTLA-4、CYP1A1、CYP1A2、DLC1、GRP78、HSPA1B、IL-18、IL-1β、MDM2、MIR-146A、MTHFR、MTRR、TGF-β1、TNF-α和TP53基因；
(3)荧光素标记的PCR产物进行基因芯片杂交，检测目的基因的SNP位点，得到基因分型结果。
(4)根据步骤3)得到的基因分型结果，分析受检者肝癌的风险率。
2.如权利要求1所述的肝癌风险基因测评方法及套组，其特征在于：所述步骤(2)中的CDC6基因的引物是SEQ ID NO：41～42所示序列的引物，CTLA-4基因的引物是SEQ IDNO：43～44所示序列的引物，CYP1A1基因的引物是SEQ ID NO：45～52所示序列的引物，CYP1A2基因的引物是SEQ ID NO：53～54所示序列的引物，DLC1基因的引物是SEQ IDNO：55～56所示序列的引物，GRP78基因的引物是SEQ ID NO：57～58所示序列的引物，HSPA1B基因的引物是SEQ ID NO：59～60所示序列的引物，IL-18基因的引物是SEQ IDNO：61～62所示序列的引物，IL-1β基因的引物是SEQ ID NO：63～64所示序列的引物，MDM2基因的引物是SEQ ID NO：65～66所示序列的引物，MIR-146A基因的引物是SEQID NO：67～68所示序列的引物，MTHFR基因的引物是SEQ ID NO：69～70所示序列的引物，MTRR基因的引物是SEQ ID NO：71～72所示序列的引物，TGF-β1基因的引物是SEQID NO：73～74所示序列的引物，TNF-α基因的引物是SEQ ID NO：75～78所示序列的引物，TP53基因的引物是SEQ ID NO：79～80所示序列的引物。
3.如权利要求1所述的肝癌风险基因测评方法及套组，其特征在于：所述步骤(2)中的片段化是将纯化的PCR产物经浓度测定后，用DNase I进行片段化；所述荧光素标记是将片段化PCR产物利用脱氧核苷酸转移酶在3’末端进行荧光素标记。
4.如权利要求1所述的肝癌风险基因测评方法及套组，其特征在于：所述步骤(3)基因芯片的制备是将预先设计并合成好的探针通过接触式点样或喷墨式点样点载到玻片或硅片材质的固相载体片基上，其中，探针是SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：40所示序列的DNA探针。
5.如权利要求1所述的肝癌风险基因测评方法及套组，其特征在于：所述步骤(3)目的基因的SNP为点包括：CDC6基因的rs4134994位点，CTLA-4基因的rs23.1775位点，CYP1A1基因的rs4646421、rs2198843、rs4886605和rs1048943位点，CYP1A2基因的rs2069514位点，DLC1基因的rs621554位点，GRP78基因的rs430397位点，HSPA1B基因的rs1061581位点，IL-18基因的rs187238位点，IL-1β基因的rs1143627位点，MDM2基因的rs2279744位点，MIR-146A基因的rs2910164位点，MTHFR基因的rs1801131位点，MTRR基因的rs1801394位点，TGF-β1基因的rs1800469位点，TNF-α基因的rs1799724和rs361525位点及TP53基因的rs1042522位点。
6.如权利要求1所述的肝癌风险基因测评方法及套组，其特征在于：所述步骤(4)中的基因分型结果导入肝癌评估软件进行受检者肝癌风险指数和风险率评估。
7.如权利要求1或6所述的肝癌风险基因测评方法及套组，其特征在于：所述肝癌风险指数评估标准：一个易感基因为+1分；一个保护基因为-1分；无易感基因和保护基因为0分；60岁及以上+3分；肿瘤家族史为+2分；HBV感染+3分；其中，易感基因是指增加个体肝癌风险性的基因，其比数比大于1；保护基因是指降低个体肝癌风险性的基因，其比数比小于1。
8.如权利要求7所述的肝癌风险基因测评方法及套组，其特征在于：所述风险率评估标准：肝癌风险指数1～3分，个体患肝癌的风险为中度；肝癌风险指数4～6分，个体患肝癌的风险为高度；肝癌风险指数6分以上，患肝癌的风险为极高度。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103374625A (zh) * | 2012-04-27 | 2013-10-30 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 先天性心脏病相关基因dlc1及其应用 |
| CN104745710A (zh) * | 2015-04-16 | 2015-07-01 | 上海洛施生物科技有限公司 | 一种与原发性肝细胞癌辅助诊断相关的snp标志物及其应用 |
| CN104762376A (zh) * | 2015-03-18 | 2015-07-08 | 天津市秀鹏生物技术开发有限公司 | 用于检测人类cyp1a2基因分型的引物组及试剂盒 |
| CN106722972A (zh) * | 2017-03-21 | 2017-05-31 | 上海中优医学检验所有限公司 | 针对免疫调控能力相关基因个体化配方食品及其制备方法 |
| CN110093424A (zh) * | 2019-05-29 | 2019-08-06 | 阿吉安(福州)基因医学检验实验室有限公司 | 用于检测hbv相关肝癌易感性的引物、探针及试剂盒 |
| CN112695094A (zh) * | 2020-12-29 | 2021-04-23 | 广东南芯医疗科技有限公司 | 表柔比星个体化用药基因的指导方法及试剂盒 |
| CN113388678A (zh) * | 2021-06-30 | 2021-09-14 | 南通市第一人民医院 | 一种强直性脊柱炎易感基因的检测引物和探针及检测方法 |
-
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Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103374625A (zh) * | 2012-04-27 | 2013-10-30 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 先天性心脏病相关基因dlc1及其应用 |
| CN104762376A (zh) * | 2015-03-18 | 2015-07-08 | 天津市秀鹏生物技术开发有限公司 | 用于检测人类cyp1a2基因分型的引物组及试剂盒 |
| CN104745710A (zh) * | 2015-04-16 | 2015-07-01 | 上海洛施生物科技有限公司 | 一种与原发性肝细胞癌辅助诊断相关的snp标志物及其应用 |
| CN104745710B (zh) * | 2015-04-16 | 2017-10-20 | 上海洛施生物科技有限公司 | 一种与原发性肝细胞癌辅助诊断相关的snp标志物及其应用 |
| CN106722972A (zh) * | 2017-03-21 | 2017-05-31 | 上海中优医学检验所有限公司 | 针对免疫调控能力相关基因个体化配方食品及其制备方法 |
| CN110093424A (zh) * | 2019-05-29 | 2019-08-06 | 阿吉安(福州)基因医学检验实验室有限公司 | 用于检测hbv相关肝癌易感性的引物、探针及试剂盒 |
| CN112695094A (zh) * | 2020-12-29 | 2021-04-23 | 广东南芯医疗科技有限公司 | 表柔比星个体化用药基因的指导方法及试剂盒 |
| CN113388678A (zh) * | 2021-06-30 | 2021-09-14 | 南通市第一人民医院 | 一种强直性脊柱炎易感基因的检测引物和探针及检测方法 |
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