CN107190005B

CN107190005B - lncRNA作为生物标志物在肺腺癌诊治中的应用

Info

Publication number: CN107190005B
Application number: CN201710055680.0A
Authority: CN
Inventors: 田子强; 王明博; 苏鹏
Original assignee: Fourth Hospital of Hebei Medical University Hebei Cancer Hospital
Current assignee: Fourth Hospital of Hebei Medical University Hebei Cancer Hospital
Priority date: 2017-01-25
Filing date: 2017-01-25
Publication date: 2018-05-04
Anticipated expiration: 2037-01-25
Also published as: CN107190005A

Abstract

本发明公开了lncRNA作为生物标志物在肺腺癌诊治中的应用，所述lncRNA为LOC101930114，LOC101930114在肺腺癌组织中呈低表达。进一步地，本发明发现了促进LOC101930114基因的表达可以促进肺腺癌细胞的凋亡，抑制癌细胞的迁移和侵袭。本发明为肺腺癌的诊断和治疗提供了新的临床手段。

Description

lncRNA作为生物标志物在肺腺癌诊治中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及lncRNA作为生物标志物在肺腺癌诊治中的应用，所述lncRNA生物标志物为LOC101930114。

背景技术

肺癌在世界范围内的死亡率居于首位。目前在中国，肺癌的发病率呈逐年上升的趋势。肺癌按照临床病理类型的不同可分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌(non-small celllung cancer,NSCLC)两类。其中，非小细胞肺癌在肺癌中最常见，约占肺癌中的85％，肺腺癌又是其中最主要的部分。对于非小细胞肺癌而言，手术治疗仍是临床治疗的首选，对于早期的非小细胞肺癌患者(I和II期，以及较理想的IIIA期患者)，肺癌根治术仍是首要的治疗方法。相关文献报道，IIIA期患者术后的1,2,5年生存率明显高于非手术治疗组。对于失去肺癌根治手术时机的晚期患者来说，治疗应以化疗为主。近些年来，随着精确放疗技术发展，通过减少放疗次数，增加单次放疗的剂量，放疗的疗效有了很大的提高。

随着人类对肿瘤在基因和分子水平的深入认识，分子靶向药物由于它的准确性和较低的药物毒副作用，越来越受到医疗界人士的重视和关注，成为当今肺癌研究领域的热点。如目前在非小细胞治疗领域最为成熟的TKT(小分子酪氨酸激酶抑制剂)。该类药物通过与EGFR的细胞内磷酸化酶作用位点相结合，抑制磷酸化酶的活化，从而抑制EGFR和下游信号通路的活化。当前分子靶向治疗的研究重点主要是寻找更高效的癌症编码及调控基因，通过对其作用机制的研究，进而调节和控制基因的表达，抑制肿瘤的发展。

RNA按照经典分类方法可分为信使RNA(mRNA)、转运RNA(tRNA)和核糖体RNA。除此之外，按照是否能够具有编码蛋白功能可分为编码RNA和非编码RNA(non-coding RNA)。早期，人们对于RNA的研究仅限于编码RNA，但经过研究发现，该部分RNA仅占基因组的1％，剩下的均为非编码RNA。于是，对于非编码RNA功能的挖掘成为了近些年来科学家们关注的重点。而ncRNA根据所含碱基数量的多少又可以分为小分子非编码RNA(miRNA，microRNA)和长链非编码RNA(lncRNA，long non-coding RNA)。其中，miRNA经过这些年的研究已经取得了长足的进步，一些miRNA已经成为肿瘤靶向治疗的新药运用于临床。但lncRNA的研究目前刚处于起步阶段，在这一领域，还有很大的空白需要研究人员去填补。

这些年来，在人类各种肿瘤中，不断有新的异常表达的lncRNA被挖掘。从目前的研究来看，lncRNA在肿瘤中的作用贯穿肿瘤的整个发生和发展的过程中。既可对癌细胞的周期、凋亡、转移等产生影响，也可在表观遗传的层面上宏观调控肿瘤细胞的很多特征。由于lncRNA与肿瘤的发生和发展有重要关系，人们看到了它在肿瘤的诊治中可能具有的重大潜力。诊断方面，在肿瘤组织中往往有lncRNA的异常表达，其可能成为重要的肿瘤标志物，尤其在一些肿瘤的早期，由于肿瘤组织很小，传统的影像学方法很难发现。而通过检测血液中的某种lncRNA水平，却可以方便快速了解病人患某种肿瘤的可能性。治疗方面，对lncRNA在癌症中作用和机制的研究可以找到新的肿瘤治疗靶点，研制出新的高效、精准、低毒副作用的抗癌新药。

目前，lncRNA的研究还处于起步阶段，对其机制和功能的认识也还在探索之中。lncRNA不仅在生物体中发挥各种重要的生物学功能，同时也参与多种疾病的发生和发展。在肿瘤研究领域，lncRNA仍是一个相对未知的领域，我们需要通过对lncRNA的不断研究来为肿瘤的诊治提供新的契机。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种可用于肺腺癌诊治的lncRNA生物标志物，本发明所提供的lncRNA生物标志物对于人肺腺癌具有较高的灵敏度和特异性，可作为新型生物标志物用于肺腺癌的检测。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了一种肺腺癌的生物标志物，所述标志物为LOC101930114，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明提供了上述的LOC101930114基因及其表达产物在制备诊断肺腺癌的产品中的应用。

进一步，上面所述的产品能够通过检测样本中的LOC101930114基因的表达水平来诊断患者是否患有肺腺癌，LOC101930114在肺腺癌患者中表达下调。

进一步，所述诊断肺腺癌的产品包括芯片、制剂或试剂盒。

本发明提供了一种芯片、制剂或试剂盒，其含有上述的LOC101930114。

进一步，所述芯片可用于检测包括LOC101930114基因在内的多个基因(例如，与肺腺癌相关的多个基因)的表达水平；所述试剂盒可用于检测包括LOC101930114基因在内的多个基因(例如，与肺腺癌相关的多个基因)的表达水平。

本发明提供了上面所述的芯片、制剂或试剂盒在制备诊断肺腺癌的产品中的应用。

本发明提供了上述的LOC101930114在筛选人肺腺癌诊治药物中的用途。

本发明提供了LOC101930114在制备预防或治疗肺腺癌的药物组合物中的应用。

进一步，所述药物组合物包括LOC101930114基因和/或其表达产物的促进剂。

本发明提供了一种用于预防或治疗肺腺癌的药物组合物，所述药物组合物包括治疗有效量的上面所述的促进剂。

进一步，所述药物组合物还包括与所述促进剂配伍的其他药类以及药学上可接受的载体和/或辅料。

本发明的药物还可与其他治疗肺腺癌的药物联用，其他治疗性化合物可以与主要的活性成分同时给药，甚至在同一组合物中同时给药。

还可以以单独的组合物或与主要的活性成分不同的剂量形式单独给予其它治疗性化合物。主要成分的部分剂量可以与其它治疗性化合物同时给药，而其它剂量可以单独给药。在治疗过程中，可以根据症状的严重程度、复发的频率和治疗方案的生理应答，调整本发明药物组合物的剂量。

本发明的优点和有益效果：

本发明首次发现了LOC101930114的差异表达与肺腺癌的发生发展相关，通过检测受试者样本中LOC101930114的表达，可以判断受试者是否患有肺腺癌，从而指导临床医师给受试者提供预防方案或者治疗方案。

本发明发现了一种肺腺癌的新的生物标志物-LOC101930114，利用生物标志物来预防或治疗肺腺癌，更为敏感、特异。

附图说明

图1是利用QPCR检测LOC101930114基因在肺腺癌组织中的表达情况图；

图2是利用QPCR检测LOC101930114在肺腺癌细胞中的转染情况图；

图3是用CCK-8法检测LOC101930114基因对肺腺癌细胞增殖的影响图；

图4是用流式细胞仪检测LOC101930114基因对肺腺癌细胞凋亡的影响图；

图5是利用Transwell小室检测LOC101930114对肺腺癌细胞迁移和侵袭的影响图；其中图A是LOC101930114对肺腺癌细胞迁移的影响图；图B是LOC101930114对肺腺癌细胞侵袭的影响图。

具体的实施方式

本发明经过广泛而深入的研究，通过大量筛选，首次发现了肺腺癌中LOC101930114呈现特异性低表达。实验证明，通过特异提高LOC101930114的表达平或表达产物的活性，能够有效地抑制肺腺癌细胞的生长和侵袭，从而达到抑制肺腺癌的效果。

生物标志物

术语“生物标志物”是其在组织或细胞中的表达水平与正常或健康细胞或组织的表达水平相比发生改变的任何基因。

本领域技术人员将认识到，本发明的实用性并不局限于对本发明的标志物基因的任何特定变体的基因表达进行定量。作为非限制性的实例，标志物基因可具有SEQ ID NO.1指定的核苷酸序列。在一些实施方案中，其具有与所列的序列至少85％相同或相似的cDNA序列诸如上述所列的序列至少 90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％相同或相似的cDNA序列。

本发明可以利用本领域内已知的任何方法测定基因表达。本领域技术人员应当理解，测定基因表达的手段不是本发明的重要方面。可以在转录水平上检测生物标志物的表达水平。

在一些实施方案中，在转录水平上检测生物标志物的表达水平。利用核酸杂交技术进行具体DNA和RNA测量的多种方法是本领域技术人员已知的。一些方法涉及电泳分离(例如，用于检测DNA的Southern印迹和用于检测RNA的Northern印迹)，但是也可以在不利用电泳分离的情况下进行DNA和RNA的测量(例如，通过斑点印迹)。基因组DNA(例如，来自人)的Southern印迹可用于筛选限制性片段长度多态性(RFLP)，以检测影响本发明多肽的遗传病症的存在。可以检测所有形式的RNA。

芯片

本发明的所述的lncRNA芯片包括：固相载体；以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性地对应于LOC101930114所示的部分或全部序列。

具体地，可根据本发明所述的lncRNA，设计出适合的探针，固定在固相载体上，形成“寡核苷酸阵列”。所述的“寡核苷酸阵列”是指具有可寻址位置(即以区别性的，可访问的地址为特征的位置)的阵列，每个可寻址位置均含有一个与其相连的特征性寡核苷酸。根据需要，可将寡核苷酸阵列分成多个亚阵。

术语“探针”指能与另一分子的特定序列或亚序列或其它部分结合的分子。除非另有指出，术语“探针”通常指能通过互补碱基配对与另一多核苷酸(往往称为“靶多核苷酸”)结合的多核苷酸探针。根据杂交条件的严格性，探针能和与该探针缺乏完全序列互补性的靶多核苷酸结合。探针可作直接或间接的标记，其范围包括引物。杂交方式，包括，但不限于：溶液相、固相、混合相或原位杂交测定法。

术语“互补的”或“互补性”用于指代通过碱基配对原则相关的多核苷酸(即，核苷酸的序列)。例如，序列“5'-A-G-T-3'”与序列“3'-T-C-A-5'”互补。互补性可以是“部分的”，其中只有一些核酸的碱基根据碱基配对原则匹配。或者，也可在核酸之间存在“完全”或“总”互补性。核酸链之间的互补程度对于核酸链之间的杂交效率和强度具有显著的影响。这在扩增反应以及依赖核酸之间的结合的检测方法中尤其重要。

术语“严格性”用于指代进行核酸杂交所处的条件：温度、离子强度和其他化合物(诸如有机溶剂)的存在。在“低严格条件”下，所关注的核酸序列将与其精确互补序列、具有单个碱基错配的序列、密切相关的序列(例如，具有90％或更高同源性的序列)以及只有部分同源性的序列(例如，具有50-90％同源性的序列)杂交。在“中等严格性条件”下，所关注的核酸序列将只与其精确互补序列、具有单个碱基错配的序列和密切相关的序列(例如，90％或更高同源性)杂交。在“高严格性条件”下，所关注的核酸序列将只与其精确互补序列和(取决于诸如温度的条件)具有单个碱基错配的序列杂交。换句话讲，在高严格性条件下，可升高温度以排除与具有单个碱基错配的序列杂交。

本发明中针对LOC101930114基因的寡核苷酸探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。所述探针自身互补序列最好少于4个碱基对，以免影响杂交效率。

本发明中所述固相载体可采用基因芯片领域的各种常用材料，例如但不限于尼龙膜，经活性基团(如醛基、氨基等)修饰的玻片或硅片、未修饰的玻片、塑料片等。

所述的LOC101930114芯片的制备可采用本领域已知的生物芯片的常规制造方法。例如，如果固相载体采用的是修饰玻片或硅片，探针的5’端含有氨基修饰的聚dT串，可将寡核苷酸探针配制成溶液，然后采用点样仪将其点在修饰玻片或硅片上，排列成预定的序列或阵列，然后通过放置过夜来固定，就可得到本发明的lncRNA芯片。

试剂盒

本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒可用于检测LOC101930114的表达。

优选的，所述的制剂或试剂盒中还含有用于标记RNA样品的标记物，以及与所述标记物相对应的底物。此外，所述的试剂盒中还可包括用于提取RNA、PCR、杂交、显色等所需的各种试剂，包括但不限于：抽提液、扩增液、杂交液、酶、对照液、显色液、洗液等。此外，所述的试剂盒中还包括使用说明书和/或芯片图像分析软件。

药物筛选

本发明提供了LOC101930114在筛选人肺腺癌诊治药物中的用途。即：用候选物质处理表达LOC101930114的体系；和检测所述体系中LOC101930114的表达或活性；若所述候选物质可促进LOC101930114的表达或活性，则表明该候选物质是抑制肺腺癌的潜在物质。所述的表达LOC101930114的体系例如可以是细胞(或细胞培养物)体系，所述的细胞可以是内源性表达LOC101930114的细胞；或可以是重组表达LOC101930114的细胞。所述的表达LOC101930114的体系还可以是亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系(如动物模型，优选非人哺乳动物的动物模型，如鼠、兔、羊、猴等)等。

LOC101930114的促进剂和药物组合物

基于本发明的发现，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含LOC101930114的促进剂。

所述的LOC101930114的促进剂是指任何可提高LOC101930114基因或表达产物稳定性、上调LOC101930114的表达、增加lncRNA LOC101930114的有效作用时间或促进LOC101930114基因的转录的物质，这些物质均可用于本发明，作为对于上调LOC101930114基因的表达有用的物质，从而可用于预防或治疗肺腺癌。

作为本发明的一种优选方式，所述的LOC101930114的促进剂是一种含有LOC101930114的表达载体。所述的表达载体通常还含有启动子、复制起点和/或标记基因等。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建本发明所需的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如卡拉霉素、庆大霉素、潮霉素、氨苄青霉素抗性。

在本发明中，是本领域已知的各种载体，如市售的载体、包括质粒、粘粒、噬菌体、病毒等。表达载体向宿主细胞中的导入可以使用电穿孔法、磷酸钙法、脂质体法、DEAE葡聚糖法、显微注射、病毒感染、脂质体转染、与细胞膜透过性肽的结合等周知的方法。

术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，如CHO细胞、COS细胞等。

药物组合物

本发明中的药物组合物包括LOC101930114的促进剂、和/或与所述促进剂配伍的其他药类以及药学上可接受的载体和/或辅料。

术语“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、缓冲液。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。所述的载体中还可以含有细胞转染试剂。

本发明中，可以采用本领域熟知的多种方法来将所述的促进剂或其转录基因、或其药物组合物给药于哺乳动物。包括但不限于：皮下注射、肌肉注射、经皮给予、局部给予、植入、缓释给予等；优选的，所述给药方式是非肠道给予的。

优选的，可采用基因治疗的手段进行。比如，可直接将LOC101930114的促进剂通过诸如注射等方法给药于受试者；或者，可通过一定的途径将携带LOC101930114的促进调剂的表达单位(比如表达载体或病毒等)递送到靶点上，具体情况需视所述的促进剂的类型而定，这些均是本领域技术人员所熟知的。

本发明所述的LOC101930114的促进剂的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的LOC101930114的促进剂的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。

术语“样本”以其最广泛的含义使用。在一种含义中，意在包括从任何来源获得的标本或培养物，以及生物和环境样本。生物样本可获自动物(包括人)并涵盖液体、固体、组织和气体。生物样本包括血液制品，诸如血浆、血清等。然而，此类样本不应解释为限制适用于本发明的样本类型。

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1筛选与肺腺癌相关的基因标志物

1、样品收集

各收集8例肺腺癌癌旁组织和肺腺癌组织样本。肺腺癌肿瘤组织标本取材部位为主要肿瘤区域，位于肿瘤肿块中外1/3与正常组织交接处，排除肿瘤中心明显坏死、钙化部分以及肿瘤外围正常肺组织；癌旁正常肺组织标本取自肿瘤边缘5cm以上的部位，肉眼观察无明显变化。上述所有标本的取得均通过组织伦理委员会的同意。

2、RNA样品的制备(利用E.Z.N.A.kit进行操作)

在研钵中导入液氮，取上述获得的组织放入研钵中，在液氮中剪碎并研磨成粉末，剪碎后投入液氮中并研磨至粉末状，随后转入玻璃匀浆器中；组织匀浆在玻璃匀浆器中加入Trizol试剂，在冰上研磨组织。将匀浆后组织匀浆液转入无RNA酶的EP管中，室温下静置5min。按照试剂盒中的说明书提取分离RNA。具体如下：

1)RNA的分离：

在EP管中加入0.2m1氯仿，盖紧EP管盖，手动剧烈振荡15s，使其充分混匀。室温下孵化5min。然后在4℃下以14000g离心15min。离心后样品分为三层，RNA存在于上层水相中。

2)RNA沉淀

将分离得的水相取450μl移至新的无RNA酶的EP管中，按照1:1的比例加入450μl异丙醇，上下颠倒混匀后在室温下孵化10min，4℃14000g离心10min。

3)RNA洗脱

离心后小心移去上清，加入1ml75％乙醇(灭酶处理，现用现配并在冰上预冷)冲洗RNA，随后4℃7500g离心5min。

4)RNA再溶解

小心移去洗涤之后的上清，在超净工作台中打开EP管管盖，在室温下放置RNA样本5-10min，晾干。加入无RNA酶处理水20-50μl，55-60℃水浴箱中水浴10min。

5)RNA样品的质量分析

分光光度计检测：

NanoDrop1000分光光度计检测RNA样品，RNA-seq测序的样品要求：OD260/OD280为1.8-2.2。

琼脂糖凝胶电泳检测：

将上述提取的RNA进行琼脂糖凝胶电泳，Agilent Technologies2100Bioanalyzer检测RNA样品质量，观察28S rRNA和18S rRNA主带明显、无降解、RNA完整性指数合格、浓度达到要求，可以用于芯片的lncRNA表达谱及筛选实验。

3、逆转录和标记

用Low RNA Input Linear Amplification Kit将mRNA逆转录成cDNA，同时用Cy3分别标记实验组和对照组。

4、杂交

基因芯片采用康城生物-Human lncRNA Array，按芯片使用说明书的步骤进行杂交。

5、数据分析

利用Agilent GeneSpring软件对芯片结果进行分析，筛选表达量具有显著性差异(标准为该lncRNA在癌与癌旁的表达量相差2倍以上，而且p<0.05)的lncRNA。

6、结果

结果显示，LOC101930114在肺腺癌组织中的表达量显著低于癌旁组织中的表达量。

实施例2 QPCR测序验证LOC101930114基因的差异表达

1、对LOC101930114基因差异表达进行大样本QPCR验证。按照实施例1中的样本收集方式选择肺腺癌癌旁组织和肺腺癌组织各50例。

2、RNA提取步骤如实施例1所述。

3、逆转录

1)反应体系：

RNA模板1μl，随机引物1μl，双蒸水加至12μl，混匀，低转速离心，65℃5min，然后放在冰上冷却。

继续在12μl反应液中加入下列成分：

5×反应缓冲液4μl，RNA酶抑制剂(20U/μl)1μl，10mM dNTP混合液 2μl，AMV反转录酶(200U/μl)1μl；充分混匀并进行离心处理；

2)逆转录反应条件

25℃5min，42℃60min，70℃5min。

3)聚合酶链反应

引物设计：

根据Genebank中LOC101930114基因和GAPDH基因的序列设计QPCR扩增引物，由博迈德生物公司合成。具体引物序列如下：

LOC101930114基因：

正向引物为5’-GGAGATGATGGAGAGTAT-3’(SEQ ID NO.2)；

反向引物为5’-CCACTTATTCCACACTTC-3’(SEQ ID NO.3)。

GAPDH基因：

正向引物为5’-AATCCCATCACCATCTTCCAG-3’(SEQ ID NO.4)；

反向引物为5’-GAGCCCCAGCCTTCTCCAT-3’(SEQ ID NO.5)。

配制PCR反应体系：

2×qPCR混合液 12.5μl，基因引物2.0μl，反转录产物2.5μl，ddH₂O 8.0μl。

PCR反应条件：95℃10min，(95℃15s，60℃60s)×40个循环，60℃5min延伸反应。75℃至95℃，每20s升温1℃，绘制溶解曲线。以SYBR Green作为荧光标记物，在Light Cycler荧光定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量。

5、统计学方法

实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS18.0统计软件来进行统计分析的，癌与癌旁组织的配对比较采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

6、结果

结果如图1所示，与肺腺癌癌旁组织相比，LOC101930114在肺腺癌组织中表达下调，差异具有统计学意义(P<0.05)，同芯片检测结果一致。

实施例3 LOC101930114过表达

1、细胞培养

人肺腺癌细胞株A549，以含10％胎牛血清和1％P/S的RPMI1640培养基在37℃、5％CO₂、相对湿度为90％的培养箱中培养。2-3天换液1次，使用0.25％含EDTA的胰蛋白酶常规消化传代。

将培养瓶中的细胞用胰酶进行消化并接种在6孔板中，保证细胞数为2-8×10⁵个/孔，加入细胞培养基。过夜，第二天观察细胞密度，细胞密度为70％以上可进行转染。

2、基因过表达载体的构建

根据LOC101930114的cDNA序列(NR_134509.1，如SEQ ID NO.1所示)合成特异的PCR扩增引物，在5’端引物和3’端引物分别添加HindIII和XhoI两个限制性酶切位点。以肺腺癌患者血液提取和反转录得到的cDNA作为扩增模板，上述cDNA序列经限制性内切酶HindIII和XhoI双酶切后插入到经HindIII和XhoI双酶切的真核细胞表达载体pcDNA3.1中，连接获得的重组载体pcDNA3.1-1用于后续实验。

3、转染

将肺腺癌细胞分为3组，分别为对照组(A549)、空白对照组(转染pcDNA3.1-NC)、实验组(转染pcDNA3.1-1)。使用脂质体2000进行载体的转染，具体转染方法按照说明书的指示进行。pcDNA3.1空载体和pcDNA3.1-1的转染浓度均为0.5μg/ml。

4、QPCR检测LOC101930114基因的转录水平

4.1细胞总RNA的提取

1)将6孔板中的细胞培养液倒掉，用PBS冲洗两次，各孔加入1ml Trizol试剂，室温放置5min。

2)加入0.2m1氯仿，剧烈震荡15s，4℃，12000g离心15min。

3)水相转移到新管中，加入4.5m1异丙醇，室温放置10min；4℃，10000g离心10min。

4)倒掉液体，用lml的75％乙醇洗EP管壁。4℃，7500g，离心5min。

5)倒掉清洗后的75％乙醇，室温晾置5-10min。

6)加入25μ1无RNA酶的DEPC水，-70℃保存。

4.2逆转录步骤同实施例2。

4.3 QPCR扩增步骤同实施例2。

5、统计学方法

实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS18.0统计软件来进行统计分析的，LOC101930114基因过表达组与对照组之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

6、结果

结果如图2显示，与非转染组与转染空白质粒组相比，转染LOC101930114组中过表达LOC101930114，差异具有统计学意义(P<0.05)。

实施例4 LOC101930114基因对肺腺癌细胞增殖的影响

采用CCK-8实验检测LOC101930114基因对肺腺癌细胞增殖能力影响。

1、细胞培养与转染步骤同实施例3。

2、第二天将细胞取出，显微镜下观察细胞生长情况，1ml/孔加入含EDTA的胰酶，进行细胞消化，待消化完成后去除胰酶，加入细胞培养基混匀使细胞悬浮，然后进行细胞计数。

3、将细胞悬液浓度稀释为15000个/ml，之后往96孔板中进行接种，每孔加入细胞悬液200μ1，细胞控制在3000个左右，接种8个复孔。设置pcDNA3.1-1实验组和pcDNA3.1-NC对照组。共铺4块96孔板分别用于24h、48h、72h、96h4个检测时间点。

4、24h后，将第一块96孔板取出，每孔中加入10μ1的CCK-8检测液，将96孔板继续放入细胞培养箱中孵育4h左右，用酶标仪检测各孔在450nm波长处的吸光度值并记录数据。

5、在48h、72h、96h后分别重复步骤4中的操作，最后统计出各时间点的吸光度值，作出生长曲线图。

6、统计学分析

实验都是按照重复3次来完成的，采用SPSS18.0统计软件来进行统计分析，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

7、结果

结果如图3所示，与对照相比，实验组在转染pcDNA3.1-1后，细胞的增殖明显受到了抑制，差异具有统计学意义(P<0.05)说明LOC101930114具有抑制细胞增殖的作用。

实施例5 LOC101930114基因对肺腺癌细胞凋亡的影响

使用流式细胞仪检测LOC101930114基因对细胞凋亡的影响。

1、细胞培养步骤同实施例3。

2、细胞转染步骤同实施例3。

3、步骤

1)将3m1 10×上样缓冲液用27m1蒸馏水稀释。

2)收集细胞样本并用预冷的PB S清洗。

3)将细胞加入lml 1×上样缓冲液，300g离心10min，吸出缓冲液。

4)再次加入lml 1×上样缓冲液，将细胞悬液中细胞浓度调整为1×10⁶个/ml。

5)将细胞悬液取出100μ1，加入EP管中。

6)将5μl的Annexin V FITC加入EP管中，混匀EP管中的液体，在室温下避光孵育10min。

7)向EP管中加入5μ1PI染液，在室温下避光5min。

8)在EP管中加入500μl的PBS溶液，轻轻混匀，1h内上流式细胞仪进行检测。

3、统计学方法

实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用的t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

4、结果：

结果如图4所示，实验组与对照组相比，细胞凋亡率具有显著的变化(P<0.05)，该结果说明，LOC101930114对肺腺癌细胞的凋亡有明显的影响。

实施例6细胞迁移及侵袭实验

1、Transwell小室制备

无菌条件下Matrigel冰浴融化，用PBS进行20倍稀释，以50μl/孔的体积铺在Transwell小室的聚碳酸酯膜上。37℃放置4h，待Matrigel胶聚合成凝胶后取出，轻轻吸出上层析出液。每孔中加入50μl的含BSA的无血清培养液对基底膜进行水化处理，37℃放置30min。

2、配置细胞悬液

细胞撤血清饥饿处理12-24h，对细胞进行消化处理，终止消化后进行离心，去除上层培养液。用PBS对沉淀细胞进行清洗，加入含有BSA的无血清培养基对其进行重悬。调整细胞的密度至5×l0⁵个/ml。

3、细胞接种

取细胞悬液200μ1(迁移实验为100μ1，侵袭实验为200μ1)加入到Transwell小室中。在24孔板下室加入500μ1含FBS的1640培养基。把细胞放入细胞培养箱中培养24h。

4、染色

细胞在培养结束后使用DAPI染色。把小室细胞先用PBS漂洗2遍，放入DAPI工作液中室温染色5-20min。用PBS漂洗2遍，放入荧光显微镜下观察并计数。

5、结果

结果如图5所示，在肺腺癌细胞转染质粒之后，与对照组相比，实验组的迁移及侵袭能力均有明显下降，结果说明LOC101930114能够抑制肺腺癌的迁移及侵袭。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 河北医科大学第四医院

<120> lncRNA作为生物标志物在肺腺癌诊治中的应用

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 456

<212> DNA

<213> 人源

<400> 1

cacactctgc tcaccaccct gtgggccttg tcccaggact catcccttct cttctggagc 60

catttccaat tctgcccaaa aggacagcct gaagtgctgg accctgggta cctggctgaa 120

gactttggac tttaacctgg agatgatgga gagtatgcag gataaagtcc ataccaaatc 180

caacgcctag caaatggaga acaagccaaa actaacaaga taaaatgtag caggaaaaag 240

tgcaaagagc tgaagtgtgg aataagtggg agaggtctgc catgccctat ctgaccttgc 300

tgccatgatc tttaaggctg tgtgtcctgg ttggtgcagc tacaagatgg cagaaatgcc 360

taagtgatgg tatggaacag aggatccctc ttctcaccat tgtcttgcat gtttccttgt 420

gtgaaccaca aataaacttt tgttatgtta agctgc 456

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ggagatgatg gagagtat 18

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ccacttattc cacacttc 18

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

aatcccatca ccatcttcca g 21

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gagccccagc cttctccat 19

Claims

1.检测LOC101930114基因表达的试剂在制备诊断肺腺癌的产品中的应用，所述LOC101930114基因的序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的产品包括芯片、制剂或试剂盒。

3. LOC101930114基因在筛选人肺腺癌治疗药物中的用途，所述LOC101930114基因的序列如SEQ ID NO.1所示。

4. LOC101930114基因在制备治疗肺腺癌的药物组合物中的应用，所述LOC101930114基因的序列如SEQ ID NO.1所示，其特征在于，所述药物组合物包括LOC101930114基因的促进剂和/或其表达产物的促进剂。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述药物组合物还包括与所述促进剂配伍的其他药类以及药学上可接受的载体和/或辅料。