CN106868197B

CN106868197B - 基因标志物在多发性骨髓瘤中的应用

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Publication number: CN106868197B
Application number: CN201710270534.XA
Authority: CN
Inventors: 刘志国; 高利波; 孙长法
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2017-04-24
Filing date: 2017-04-24
Publication date: 2019-07-05
Anticipated expiration: 2037-04-24
Also published as: CN106868197A

Abstract

本发明公开了基因标志物在多发性骨髓瘤中的应用，基因标志物IFFO1在多发性骨髓瘤组织中表达下调，通过检测IFFO1的表达水平可以用于多发性骨髓瘤患者的早期诊断。进一步实验证明，上调IFFO1的表达可以有效的抑制多发性骨髓瘤细胞的增殖，提示IFFO1可用于治疗多发性骨髓瘤。本发明同时公开了一种筛选治疗多发性骨髓瘤的潜在物质的方法，即筛选的潜在物质可以上调或增加IFFO1的表达水平或者表达产物活性。

Description

基因标志物在多发性骨髓瘤中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种基因标志物在多发性骨髓瘤中的应用，具体地涉及基因标志物为IFFO1。

背景技术

多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是一类发生于分化不完全浆细胞的恶性肿瘤，是恶性浆细胞病中最常见的一种类型。以骨髓内异常克隆性浆细胞(即骨髓瘤细胞)增殖并积聚为特征，临床上出现反复感染、溶骨性病变、贫血、肾功能不全等表现。其年发病率约为4/10万，占血液系统恶性肿瘤10％，约占所有恶性肿瘤0.8％，属于中老年性疾病。在我国患者中位发病年龄大多在50-60岁，但随着我国人口的逐渐老龄化，近10年来，不论是MM的发病率还是死亡率均有逐步增高趋势。对人民生命和生活质量构成越来越严重的威胁。

近年来，随着对MM发病机制等各方面的深入研究，目前临床上大剂量化、放疗后采用自体造血干/祖细胞移植以及雷利度胺、硼替佐米、二磷酸盐类、砷剂及免疫治疗等新方法的应用，使多发性骨髓瘤的治疗有效率大幅度提高，缓解率和生存期有所改善，但最终难免复发或病情恶化，因此近年来治疗MM的总生存率仍然很低。

随着分子生物学和生物信息学技术的发展，准医学模式的倡导为多发性骨髓瘤的诊断和治疗打开了崭新的思路。精准医学是基于分子生物信息学的医学模式，其关键是利用有效的生物标志物，进行特异性个体化治疗。现有技术中如专利201610602127.X、201610599598.X也对精准医学进行了探索，但是其在临床上的应用还有待进一步研究。因此，寻找多发性骨髓瘤新的有效的分子生物标志物和信号通路，进一步阐明多发性骨髓瘤的发生发展机制，对当今多发性骨髓瘤的个体化精准治疗具有重要的意义。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种可用于多发性骨髓瘤诊治的基因生物标志物，本发明所提供的基因生物标志物对于人多发性骨髓瘤具有较高的灵敏度和特异性，可作为新型生物标志物用于多发性骨髓瘤的检测和治疗。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了IFFO1基因或其蛋白在制备诊断多发性骨髓瘤的产品中的应用。

进一步，所述产品包括芯片、制剂或试剂盒。

其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片；所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测IFFO1基因转录水平的针对IFFO1基因的寡核苷酸探针；所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体的IFFO1蛋白的特异性抗体；所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒；所述基因检测试剂盒包括用于检测IFFO1基因转录水平的试剂；所述蛋白免疫检测试剂盒包括IFFO1蛋白的特异性抗体

本发明提供了一种芯片、制剂或试剂盒，其包括检测IFFO1基因或其蛋白的试剂，当样本中IFFO1表达显著下调时，患者患有多发性骨髓瘤或者存在患多发性骨髓瘤的风险。

进一步，所述试剂包选自：特异性识别IFFO1的探针或特异性性扩增IFFO1的引物；或特异性结合IFFO1蛋白的抗体或配体。

进一步，所述芯片可用于检测包括IFFO1基因在内的多个基因(例如，与多发性骨髓瘤相关的多个基因)的表达水平；所述试剂盒可用于检测包括IFFO1基因在内的多个基因(例如，与多发性骨髓瘤相关的多个基因)的表达水平。

本发明提供了上面所述的芯片、制剂或试剂盒在制备诊断多发性骨髓瘤的产品中的应用。

本发明提供了IFFO1基因或蛋白在筛选治疗人多发性骨髓瘤的潜在物质中的用途。

本发明提供了一种筛选治疗多发性骨髓瘤潜在物质的方法，所述潜在物质可以促进IFFO1基因或其蛋白的表达或活性。

本发明提供了IFFO1基因或其蛋白在制备预防或治疗多发性骨髓瘤的药物组合物中的应用。

进一步，所述药物组合物包括IFFO1基因、IFFO1蛋白和/或其表达产物的促进剂。

本发明提供了一种用于预防或治疗多发性骨髓瘤的药物组合物，所述药物组合物包括治疗有效量的IFFO1基因、IFFO1蛋白和/或其表达产物的促进剂。

进一步，所述药物组合物还包括与所述促进剂配伍的其他药类以及药学上可接受的载体和/或辅料。

本发明的药物组合物还可与其他治疗多发性骨髓瘤的药物联用，其他治疗性化合物可以与主要的活性成分同时给药，甚至在同一组合物中同时给药。

本发明的药物组合物还可以以单独的组合物或与主要的活性成分不同的剂量形式单独给予其它治疗性化合物。主要成分的部分剂量可以与其它治疗性化合物同时给药，而其它剂量可以单独给药。在治疗过程中，可以根据症状的严重程度、复发的频率和治疗方案的生理应答，调整本发明药物组合物的剂量。

本发明的优点和有益效果：

本发明首次发现了IFFO1的差异表达与多发性骨髓瘤的发生发展相关，通过检测受试者样本中IFFO1的表达，可以判断受试者是否患有多发性骨髓瘤或者患有多发性骨髓瘤的风险，从而指导临床医师给受试者提供预防方案或者治疗方案。

基因IFFO1作为潜在的分子靶标，为多发性骨髓瘤的临床诊断和治疗提供了新的可能，同时为多发性骨髓瘤的机理研究提供了理论依据，为多发性骨髓瘤患者的个性化治疗提供了新的途径。

附图说明

图1是利用QPCR检测IFFO1基因在多发性骨髓瘤组织中的表达情况图；

图2是利用QPCR检测IFFO1在多发性骨髓瘤细胞中的转染情况图；

图3是用MTT法检测IFFO1基因对多发性骨髓瘤细胞增殖的影响图。

具体的实施方式

本发明经过广泛而深入的研究，通过大量筛选，首次发现了多发性骨髓瘤中IFFO1呈现特异性低表达。实验证明，通过特异提高IFFO1的表达平或表达产物的活性，能够有效地抑制多发性骨髓瘤细胞的生长，从而达到抑制多发性骨髓瘤的效果

基因标志物

术语“基因标志物”或“生物标志物”是其在组织或细胞中的表达水平与正常或健康细胞或组织的表达水平相比发生改变的任何基因。

本领域技术人员将认识到，本发明的实用性并不局限于对本发明的标志物基因的任何特定变体的基因表达进行定量。作为非限制性的实例，标志物基因可具有SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2指定的核苷酸序列或氨基酸序列。在一些实施方案中，其具有与所列的序列至少70％相同或相似的cDNA序列诸如上述所列的序列至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少 99％相同或相似的cDNA序列。

本发明可以利用本领域内已知的任何方法测定基因表达。本领域技术人员应当理解，测定基因表达的手段不是本发明的重要方面。可以在转录水平上检测生物标志物的表达水平。

在一些实施方案中，在转录水平上检测生物标志物的表达水平。利用核酸杂交技术进行具体DNA和RNA测量的多种方法是本领域技术人员已知的。一些方法涉及电泳分离(例如，用于检测DNA的Southern印迹和用于检测RNA的Northern印迹)，但是也可以在不利用电泳分离的情况下进行DNA和RNA的测量(例如，通过斑点印迹)。基因组DNA(例如，来自人)的Southern印迹可用于筛选限制性片段长度多态性(RFLP)，以检测影响本发明多肽的遗传病症的存在。可以检测所有形式的RNA。

芯片

本发明的所述的芯片包括基因芯片和蛋白芯片，所述基因芯片包括：固相载体；以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性地对应于IFFO1所示的部分或全部序列；所述蛋白芯片包括：固相载体；以及固定在固相载体上的抗体或配体；所述抗体或配体能够特异性的结合IFFO1蛋白。

具体地，可根据本发明所述的基因，设计出适合的探针，固定在固相载体上，形成“寡核苷酸阵列”。所述的“寡核苷酸阵列”是指具有可寻址位置(即以区别性的，可访问的地址为特征的位置)的阵列，每个可寻址位置均含有一个与其相连的特征性寡核苷酸。根据需要，可将寡核苷酸阵列分成多个亚阵。

在本发明中，所述固相载体包括塑料制品、微颗粒、膜载体等。所述塑料制品可通过非共价或物理吸附机制与抗体或蛋白抗原相结合，最常用的塑料制品为聚苯乙烯制成的小试管、小珠和微量反应板；所述微颗粒是由高分子单体聚合成的微球或颗粒，其直径多为微米，由于带有能与蛋白质结合的功能团，易与抗体(抗原)形成化学偶联，结合容量大；所述膜载体包括硝酸纤维素膜、玻璃纤维素膜及尼龙膜等微孔滤膜。

术语“探针”指能与另一分子的特定序列或亚序列或其它部分结合的分子。除非另有指出，术语“探针”通常指能通过互补碱基配对与另一多核苷酸(往往称为“靶多核苷酸”)结合的多核苷酸探针。根据杂交条件的严格性，探针能和与该探针缺乏完全序列互补性的靶多核苷酸结合。探针可作直接或间接的标记，其范围包括引物。杂交方式，包括，但不限于：溶液相、固相、混合相或原位杂交测定法。

术语“互补的”或“互补性”用于指代通过碱基配对原则相关的多核苷酸(即，核苷酸的序列)。例如，序列“5'-A-G-T-3'”与序列“3'-T-C-A-5'”互补。互补性可以是“部分的”，其中只有一些核酸的碱基根据碱基配对原则匹配。或者，也可在核酸之间存在“完全”或“总”互补性。核酸链之间的互补程度对于核酸链之间的杂交效率和强度具有显著的影响。这在扩增反应以及依赖核酸之间的结合的检测方法中尤其重要。

术语“严格性”用于指代进行核酸杂交所处的条件：温度、离子强度和其他化合物(诸如有机溶剂)的存在。在“低严格条件”下，所关注的核酸序列将与其精确互补序列、具有单个碱基错配的序列、密切相关的序列(例如，具有90％或更高同源性的序列)以及只有部分同源性的序列(例如，具有50-90％同源性的序列)杂交。在“中等严格性条件”下，所关注的核酸序列将只与其精确互补序列、具有单个碱基错配的序列和密切相关的序列(例如，90％或更高同源性)杂交。在“高严格性条件”下，所关注的核酸序列将只与其精确互补序列和(取决于诸如温度的条件)具有单个碱基错配的序列杂交。换句话讲，在高严格性条件下，可升高温度以排除与具有单个碱基错配的序列杂交。

本发明中针对IFFO1基因的寡核苷酸探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。所述探针自身互补序列最好少于4个碱基对，以免影响杂交效率。

本发明中所述IFFO1蛋白的特异性抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体。所述GIF蛋白的特异性抗体包括完整的抗体分子、抗体的任何片段或修饰，例如，嵌合抗体、scFv、Fab、F(ab’)²、Fv等。只要所述片段能够保留与IFFO1蛋白的结合能力即可。用于检测蛋白质水平的抗体的制备是本领域技术人员公知的，并且本发明可以使用任何方法来制备所述抗体，如所述的片段可以通过化学法从头合成或利用重组DNA技术合成。

本发明中所述固相载体可采用基因芯片领域的各种常用材料，例如但不限于尼龙膜，经活性基团(如醛基、氨基等)修饰的玻片或硅片、未修饰的玻片、塑料片等。

所述的IFFO1芯片的制备可采用本领域已知的生物芯片的常规制造方法。例如，如果固相载体采用的是修饰玻片或硅片，探针的5’端含有氨基修饰的聚dT串，可将寡核苷酸探针配制成溶液，然后采用点样仪将其点在修饰玻片或硅片上，排列成预定的序列或阵列，然后通过放置过夜来固定，就可得到本发明的基因芯片。

试剂盒

本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括基因试剂盒和蛋白免疫试剂盒；所述试剂盒可用于检测IFFO1的表达或蛋白活性。

优选的，所述的制剂或试剂盒中还含有用于标记RNA样品的标记物，以及与所述标记物相对应的底物。此外，所述的试剂盒中还可包括用于提取RNA、PCR、杂交、显色等所需的各种试剂，包括但不限于：抽提液、扩增液、杂交液、酶、对照液、显色液、洗液等。此外，所述的试剂盒中还包括使用说明书和/或芯片图像分析软件。

药物筛选

本发明提供了IFFO1在筛选人多发性骨髓瘤诊治药物中的用途。即：用候选物质处理表达IFFO1的体系；和检测所述体系中IFFO1的表达或活性；若所述候选物质可促进IFFO1的表达或活性，则表明该候选物质是抑制多发性骨髓瘤的潜在物质。

所述的表达IFFO1的体系例如可以是细胞(或细胞培养物)体系，所述的细胞可以是内源性表达IFFO1的细胞；或可以是重组表达IFFO1的细胞。所述的表达IFFO1的体系还可以是亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系(如动物模型，优选非人哺乳动物的动物模型，如鼠、兔、羊、猴等)等。

IFFO1的促进剂和药物组合物

基于本发明的发现，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含IFFO1的促进剂。

所述的IFFO1的促进剂是指任何可提高IFFO1基因或表达产物稳定性、上调IFFO1的表达、增加基因IFFO1的有效作用时间或促进IFFO1基因的转录的物质，这些物质均可用于本发明，作为对于上调IFFO1基因的表达有用的物质，从而可用于预防或治疗多发性骨髓瘤。

作为本发明的一种优选方式，所述的IFFO1的促进剂是一种含有IFFO1的表达载体。所述的表达载体通常还含有启动子、复制起点和/或标记基因等。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建本发明所需的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如卡拉霉素、庆大霉素、潮霉素、氨苄青霉素抗性。

在本发明中，是本领域已知的各种载体，如市售的载体、包括质粒、粘粒、噬菌体、病毒等。表达载体向宿主细胞中的导入可以使用电穿孔法、磷酸钙法、脂质体法、DEAE葡聚糖法、显微注射、病毒感染、脂质体转染、与细胞膜透过性肽的结合等周知的方法。

术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，如CHO细胞、COS细胞等。

药物组合物

本发明中的药物组合物包括IFFO1的促进剂、和/或与所述促进剂配伍的其他药类以及药学上可接受的载体和/或辅料。

药学上可接受的载体可以是一种也可以是多种，所述载体包括但不限于稀释剂如乳糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、淀粉、水等；粘合剂如淀粉、预胶化淀粉、糊精、麦芽糖糊精、蔗糖、阿拉伯胶、明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素、乙基纤维素、聚乙烯醇、聚乙二醇、聚乙烯比咯烷酮、海藻酸及海藻酸盐、黄原胶、羟丙基纤维素和羟丙基甲基纤维素等；表面活性剂如聚氧化乙烯山梨聚糖脂肪酸酯、十二烷基硫酸钠、硬脂酸单甘油酯、十六烷醇等；致湿剂如甘油、淀粉等；吸附载体如淀粉、乳糖、斑脱土、硅胶、高岭土和皂粘土等；润滑剂如硬脂酸锌、单硬脂酸甘油酯、聚乙二醇、滑石粉、硬脂酸钙和镁、聚乙二醇、硼酸粉末、氢化植物油、硬脂富马酸钠、聚氧乙烯单硬脂酸酯、单月桂蔗糖酸酯、月桂醇硫酸钠、月桂醇硫酸镁、十二烷基硫酸镁等；填充剂如甘露醇(粒状或粉状)、木糖醇、山梨醇、麦芽糖、赤藓糖、微晶纤维素、聚合糖、偶合糖、葡萄糖、乳糖、蔗糖、糊精、淀粉、海藻酸钠、海带多糖粉末、琼脂粉末、碳酸钙和碳酸氢钠等；崩解剂如交联乙烯吡咯烷酮、羧甲基淀粉钠、低取代羟丙基甲基、交联羧甲基纤维素钠、大豆多糖等。

本发明中的药物组合物还可以包括稳定剂、杀菌剂、缓冲剂、等渗剂、螯合剂、pH控制剂及表面活性剂等添加剂。

术语“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、缓冲液。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。所述的载体中还可以含有细胞转染试剂。

本发明中，可以采用本领域熟知的多种方法来将所述的促进剂或其转录基因、或其药物组合物给药于哺乳动物。包括但不限于：皮下注射、肌肉注射、经皮给予、局部给予、植入、缓释给予等；优选的，所述给药方式是非肠道给予的。

优选的，可采用基因治疗的手段进行。比如，可直接将IFFO1的促进剂通过诸如注射等方法给药于受试者；或者，可通过一定的途径将携带IFFO1的促进调剂的表达单位(比如表达载体或病毒等)递送到靶点上，具体情况需视所述的促进剂的类型而定，这些均是本领域技术人员所熟知的。

本发明所述的IFFO1的促进剂的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的IFFO1的促进剂的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。

术语“样本”以其最广泛的含义使用。在一种含义中，意在包括从任何来源获得的标本或培养物，以及生物和环境样本。生物样本可获自动物(包括人)并涵盖液体、固体、组织和气体。生物样本包括血液制品，诸如血浆、血清等。然而，此类样本不应解释为限制适用于本发明的样本类型。

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1筛选与多发性骨髓瘤相关的基因标志物

1、样品收集

收集多发性骨髓瘤患者和正常人的骨髓液标本各6例，其中确诊的多发性骨髓瘤患者男性3例，女性3例，中位年龄55岁。多发性骨髓瘤的诊断根据WHO诊断多发性骨髓瘤的标准，上述所有标本的取得都获得病人的知情同意以及通过组织伦理委员会的同意。

2、RNA样品的制备

抽取病例组及对照组人骨髓液5-10ml，放入抗凝管中。提取骨髓细胞后，加入1mlTrizol试剂(Invitrogen公司)，充分混匀，-80℃保存标本，以用于RNA提取。

利用Trizol法提取样品中的RNA，用Nanodrop2000紫外分光光度计测量RNA纯度及浓度，冻存于-70℃。RNA质量判定标准：RNA样本的OD260/OD280值为1.7-2.2之间；总RNA电泳图谱有清晰的28S、18S条带；70℃水浴保温1小时后的电泳图谱与水浴保温前的图谱无明显差异。

3、逆转录和标记

用Low RNA Input Linear Amplification Kit将mRNA逆转录成cDNA，同时用Cy3分别标记实验组和对照组。

4、杂交

基因芯片采用Aglient公司的人全基因组表达谱芯片，按芯片使用说明书的步骤进行。

5、数据分析

利用Agilent GeneSpring软件对芯片结果进行分析，筛选表达量具有显著性差异(标准为该基因在多发性骨髓瘤组织与正常骨髓组织中的表达量相差2倍以上，而且p<0.05)的基因。

6、结果

芯片结果显示，共筛选出839个差异表达基因，上调基因530个，下调309个，其中DRAP1在多发性骨髓瘤组织中的表达量显著高于正常骨髓组织中的表达量。

实施例2QPCR测序验证IFFO1基因的差异表达

1、对IFFO1基因差异表达进行大样本QPCR验证。按照实施例1中的样本收集方式选择多发性骨髓瘤组织和正常骨髓组织各50例。

2、RNA提取步骤如实施例1所述。

3、逆转录

1)反应体系：

RNA模板1μl，随机引物1μl，双蒸水加至12μl，混匀，低转速离心，65℃5min，然后放在冰上冷却。

继续在12μl反应液中加入下列成分：

5×反应缓冲液4μl，RNA酶抑制剂(20U/μl)1μl，10mM dNTP混合液 2μl，AMV反转录酶(200U/μl)1μl；充分混匀并进行离心处理；

2)逆转录反应条件

25℃5min，42℃60min，70℃5min。

3)聚合酶链反应

引物设计：

IFFO1基因引物序列：

正向引物为5’-TAGCCTGGAGAAGGTGAT-3’(SEQ ID NO.3)；

反向引物为5’-GCTCTATCTGGTCAATGGT-3’(SEQ ID NO.4)。

GAPDH基因引物序列：

正向引物为5’-AATCCCATCACCATCTTCCAG-3’(SEQ ID NO.5)；

反向引物为5’-GAGCCCCAGCCTTCTCCAT-3’(SEQ ID NO.6)。

配制PCR反应体系：2×qPCR混合液 12.5μl，基因引物2.0μl，反转录产物2.5μl，ddH₂O 8.0μl。

PCR反应条件：95℃10min，(95℃15s，60℃60s)×40个循环，60℃5min延伸反应。75℃至95℃，每20s升温1℃，绘制溶解曲线。以SYBR Green作为荧光标记物，在Light Cycler荧光定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量。

5、统计学方法

实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS18.0统计软件来进行统计分析的，多发性骨髓瘤组织和正常骨髓组织的配对比较采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

6、结果

结果如图1所示，与正常骨髓组织相比，IFFO1在多发性骨髓瘤组织中表达下调，差异具有统计学意义(P<0.05)，同芯片检测结果一致。

实施例3IFFO1的过表达

1、细胞培养

取出冻存的人多发性骨髓瘤细胞系RPMI8226在培养瓶中复苏，以含10％胎牛血清和1％P/S的RPMI1640培养基在37℃、5％CO₂、相对湿度为90％的培养箱中培养。2-3天换液1次，使用0.25％含EDTA的胰蛋白酶常规消化传代。

将培养瓶中的细胞用胰酶进行消化，按1×10⁶个细胞/孔接种在24孔培养板中。

2、基因过表达载体的构建

合成特异PCR扩增引物，引物序列如下：

正向引物：5’-CCGAAGCTTGCCACCATGAATCCGTTATTCG-3’(SEQ ID NO.7)

反向引物：5’-CGGCTCGAGTCTCATGGAGCTGTCAGATGAG-3’(SEQ ID NO.8)

在5’端引物和3’端引物分别添加HindIII和XhoI两个限制性酶切位点。以多发性骨髓瘤患者组织提取和反转录得到的cDNA作为扩增模板，上述cDNA序列经限制性内切酶HindIII和XhoI双酶切后插入到经HindIII和XhoI双酶切的真核细胞表达载体pcDNA3.1中，连接获得的重组载体pcDNA3.1-1用于后续实验。

3、转染

将多发性骨髓瘤细胞分为3组，分别为对照组(RPMI8226)、空白对照组(转染pcDNA3.1-NC)、实验组(转染pcDNA3.1-1)。使用脂质体2000进行载体的转染，具体转染方法按照说明书的指示进行。pcDNA3.1空载体和pcDNA3.1-1的转染浓度均为0.5μg/ml。

4、QPCR检测IFFO1基因的转录水平

4.1细胞总RNA的提取

将6孔板中的细胞培养液倒掉，用PBS冲洗两次，各孔加入1ml Trizol试剂，室温放置5min；加入0.2ml氯仿，剧烈震荡15s，4℃，12000g离心15min。将水相转移到新管中，加入4.5ml异丙醇，室温放置10min后4℃、10000g离心10min，倒掉液体，用lml的75％乙醇洗EP管壁。4℃，7500g，离心5min；倒掉清洗后的75％乙醇，室温晾置5-10min，然后加入25μl无RNA酶的DEPC水，-80℃保存。

4.2逆转录步骤同实施例2。

4.3QPCR扩增步骤同实施例2。

5、统计学方法

实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS18.0统计软件来进行统计分析的，IFFO1基因过表达组与对照组之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

6、结果

结果如图2显示，与非转染组和转染空白质粒组相比，转染IFFO1组中过表达IFFO1，差异具有统计学意义(P<0.05)。

实施例4IFFO1基因对多发性骨髓瘤细胞增殖的影响

采用MTT实验检测IFFO1基因对多发性骨髓瘤细胞增殖能力影响。

1、细胞培养与转染步骤同实施例3。

2、分别取各组细胞以每孔1×10⁴个接种于96孔板中，每组均设置三个复孔。

3、分别取培养24h、48h、72h、96h各组细胞加入新鲜配置的浓度为5mg/ml的MTT 20μl，继续培养4h，离心去上清，每孔加入DMSO100μl，轻轻震荡，用酶标仪选择490nm波长测其吸光度，每组重复试验3次。

4、以时间为横坐标，各细胞组OD值为纵坐标绘制细胞生长曲线。。

5、统计学分析

实验都是按照重复3次来完成的，采用SPSS18.0统计软件来进行统计分析，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

6、结果

结果如图3所示，与对照相比，实验组在转染pcDNA3.1-1后，细胞的增殖明显受到了抑制，差异具有统计学意义(P<0.05)说明IFFO1具有抑制细胞增殖的作用。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 刘志国高利波孙长法

<120> 基因标志物在多发性骨髓瘤中的应用

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1755

<212> DNA

<213> 人源

<400> 1

atgaatccgt tattcggccc caacctcttc ctcctgcagc aggagcagca gggcctggcc 60

gggccactgg gggactcact gggaggcgac cacttcgccg ggggaggaga cttgcccccg 120

gcgcctctct cgccggccgg ccctgctgcc tactcgccgc ccgggccggg cccggccccg 180

cctgccgcca tggccctccg caatgacctg ggctccaaca tcaacgtgct caagaccctg 240

aacctccggt tccgctgctt cctggccaag gtgcatgagc tggagcgccg gaaccggctg 300

ttggagaagc aactgcagca agcgctggag gagggtaagc agggccggcg gggcctgggt 360

cgtcgcgacc aggcagtgca gaccggcttc gtcagcccca tccggcccct ggggctgcag 420

ctgggcgccc ggccggccgc tgtctgcagc ccttcggcgc gcgtgctggg ctcgcccgcg 480

cgctccccgg ccggccccct cgcgccctcc gcggccagcc tctcgtcgtc ctccacctcc 540

acctccacca cctattcctc gtcggcccgc ttcatgcccg gcaccatctg gtcgttctcg 600

cacgcccgcc ggctcgggcc gggactggag cccactctgg tgcaagggcc tggcttgtcg 660

tgggtgcacc cggatggggt gggcgtccag atcgacacca tcacgcccga gatccgcgct 720

ctctacaacg tgctggccaa agtgaagcgg gagcgggacg agtacaagcg gaggtgggaa 780

gaggagtaca cggtgcggat ccagctgcaa gaccgtgtaa atgagctcca ggaggaagcc 840

caggaggctg atgcctgcca ggaggagctg gcactgaagg tggaacagtt gaaggctgag 900

ctggtggtct tcaaggggct catgagtaac aacctgtcgg agctggacac caagatccag 960

gagaaagcca tgaaggtgga tatggacatc tgccgccgca tcgacatcac cgccaagctc 1020

tgcgatgtgg ctcagcagcg caactgcgag gacatgatcc agatgttcca gaagaagctg 1080

tctctgcact tgtctcccat taaggtccca tccatggggg ggcggaagcg ggagcgcaag 1140

gctgccgtcg aggaggacac ctccctgtcg gagagtgagg ggccccgcca gcccgatggg 1200

gatgaggagg agagcacagc cctcagcatc aacgaggaga tgcagcgcat gctcaaccag 1260

ctgagggagt atgattttga ggacgactgt gacagcctga cttgggagga gactgaggag 1320

accctgctgc tttgggagga tttctcaggc tatgccatgg cagctgcaga ggcccaggga 1380

gagcagcagg aagatagcct ggagaaggtg attaaagata cggagtccct gttcaaaacc 1440

cgggagaagg agtatcagga gaccattgac cagatagagc tggagttggc cacggccaag 1500

aacgacatga accggcacct gcacgagtac atggagatgt gcagcatgaa gcgcggcctg 1560

gacgtgcaga tggagacctg ccgccggctc atcacccagt ctggagaccg aaagtctcct 1620

gctttcactg cggtcccgct tagcgacccg ccgccgccgc caagcgaggc tgaggactcc 1680

gatcgcgatg tctcatctga cagctccatg agatagcaca taaaaaatgc ttagtaaata 1740

gatacacaaa tgttt 1755

<210> 2

<211> 571

<212> PRT

<213> 人源

<400> 2

Met Asn Pro Leu Phe Gly Pro Asn Leu Phe Leu Leu Gln Gln Glu Gln

1 5 10 15

Gln Gly Leu Ala Gly Pro Leu Gly Asp Ser Leu Gly Gly Asp His Phe

20 25 30

Ala Gly Gly Gly Asp Leu Pro Pro Ala Pro Leu Ser Pro Ala Gly Pro

35 40 45

Ala Ala Tyr Ser Pro Pro Gly Pro Gly Pro Ala Pro Pro Ala Ala Met

50 55 60

Ala Leu Arg Asn Asp Leu Gly Ser Asn Ile Asn Val Leu Lys Thr Leu

65 70 75 80

Asn Leu Arg Phe Arg Cys Phe Leu Ala Lys Val His Glu Leu Glu Arg

85 90 95

Arg Asn Arg Leu Leu Glu Lys Gln Leu Gln Gln Ala Leu Glu Glu Gly

100 105 110

Lys Gln Gly Arg Arg Gly Leu Gly Arg Arg Asp Gln Ala Val Gln Thr

115 120 125

Gly Phe Val Ser Pro Ile Arg Pro Leu Gly Leu Gln Leu Gly Ala Arg

130 135 140

Pro Ala Ala Val Cys Ser Pro Ser Ala Arg Val Leu Gly Ser Pro Ala

145 150 155 160

Arg Ser Pro Ala Gly Pro Leu Ala Pro Ser Ala Ala Ser Leu Ser Ser

165 170 175

Ser Ser Thr Ser Thr Ser Thr Thr Tyr Ser Ser Ser Ala Arg Phe Met

180 185 190

Pro Gly Thr Ile Trp Ser Phe Ser His Ala Arg Arg Leu Gly Pro Gly

195 200 205

Leu Glu Pro Thr Leu Val Gln Gly Pro Gly Leu Ser Trp Val His Pro

210 215 220

Asp Gly Val Gly Val Gln Ile Asp Thr Ile Thr Pro Glu Ile Arg Ala

225 230 235 240

Leu Tyr Asn Val Leu Ala Lys Val Lys Arg Glu Arg Asp Glu Tyr Lys

245 250 255

Arg Arg Trp Glu Glu Glu Tyr Thr Val Arg Ile Gln Leu Gln Asp Arg

260 265 270

Val Asn Glu Leu Gln Glu Glu Ala Gln Glu Ala Asp Ala Cys Gln Glu

275 280 285

Glu Leu Ala Leu Lys Val Glu Gln Leu Lys Ala Glu Leu Val Val Phe

290 295 300

Lys Gly Leu Met Ser Asn Asn Leu Ser Glu Leu Asp Thr Lys Ile Gln

305 310 315 320

Glu Lys Ala Met Lys Val Asp Met Asp Ile Cys Arg Arg Ile Asp Ile

325 330 335

Thr Ala Lys Leu Cys Asp Val Ala Gln Gln Arg Asn Cys Glu Asp Met

340 345 350

Ile Gln Met Phe Gln Lys Lys Leu Ser Leu His Leu Ser Pro Ile Lys

355 360 365

Val Pro Ser Met Gly Gly Arg Lys Arg Glu Arg Lys Ala Ala Val Glu

370 375 380

Glu Asp Thr Ser Leu Ser Glu Ser Glu Gly Pro Arg Gln Pro Asp Gly

385 390 395 400

Asp Glu Glu Glu Ser Thr Ala Leu Ser Ile Asn Glu Glu Met Gln Arg

405 410 415

Met Leu Asn Gln Leu Arg Glu Tyr Asp Phe Glu Asp Asp Cys Asp Ser

420 425 430

Leu Thr Trp Glu Glu Thr Glu Glu Thr Leu Leu Leu Trp Glu Asp Phe

435 440 445

Ser Gly Tyr Ala Met Ala Ala Ala Glu Ala Gln Gly Glu Gln Gln Glu

450 455 460

Asp Ser Leu Glu Lys Val Ile Lys Asp Thr Glu Ser Leu Phe Lys Thr

465 470 475 480

Arg Glu Lys Glu Tyr Gln Glu Thr Ile Asp Gln Ile Glu Leu Glu Leu

485 490 495

Ala Thr Ala Lys Asn Asp Met Asn Arg His Leu His Glu Tyr Met Glu

500 505 510

Met Cys Ser Met Lys Arg Gly Leu Asp Val Gln Met Glu Thr Cys Arg

515 520 525

Arg Leu Ile Thr Gln Ser Gly Asp Arg Lys Ser Pro Ala Phe Thr Ala

530 535 540

Val Pro Leu Ser Asp Pro Pro Pro Pro Pro Ser Glu Ala Glu Asp Ser

545 550 555 560

Asp Arg Asp Val Ser Ser Asp Ser Ser Met Arg

565 570

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tagcctggag aaggtgat 18

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gctctatctg gtcaatggt 19

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

aatcccatca ccatcttcca g 21

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gagccccagc cttctccat 19

<210> 7

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ccgaagcttg ccaccatgaa tccgttattc g 31

<210> 8

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

cggctcgagt ctcatggagc tgtcagatga g 31

Claims

1.IFFO1基因或其蛋白在制备诊断多发性骨髓瘤的产品中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括芯片、制剂或试剂盒。

3.一种芯片、制剂或试剂盒在制备诊断多发性骨髓瘤的产品中的应用，其特征在于，所述芯片、制剂或试剂盒包括检测IFFO1基因或其蛋白的试剂。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂包选自：特异性识别IFFO1的探针或特异性性扩增IFFO1的引物；或特异性结合IFFO1蛋白的抗体或配体。

5.IFFO1基因或其蛋白在筛选治疗人多发性骨髓瘤的潜在物质中的用途。

6.一种筛选治疗多发性骨髓瘤潜在物质的方法，其特征在于，所述潜在物质可以促进IFFO1基因或其蛋白的表达或活性。

7.IFFO1基因或其蛋白在制备预防或治疗多发性骨髓瘤的药物组合物中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述药物组合物包括IFFO1基因、IFFO1其表达产物的促进剂。

9.一种用于预防或治疗多发性骨髓瘤的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括治疗有效量的IFFO1基因、IFFO1表达产物的促进剂。