CN105441405B - Bmx剪切体及其在肺癌耐药性中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种BMX剪切体，所述的BMX剪切体核苷酸序列在对应于SEQ ID NO:3所示。本发明还提供包含编码所述BMX剪切体的基因的宿主细胞以及利用所述宿主细胞检测所述的BMX剪切体功能的方法。本发明的BMX剪切体或包含本发明BMX剪切体的宿主细胞还用于测试肺癌细胞的耐药性。

Description

BMX剪切体及其在肺癌耐药性中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及BMX剪切体及其在肺癌耐药性中的应用。

背景技术

肺癌是当今全球范围内危害性最大的疾病之一。临床上，第三代基于铂的联合疗法治疗非小细胞肺癌虽具有一些优势，但是结合几种细胞毒类药物的治疗方式并没有取得比铂双试剂治疗更好的效果，表明这种治疗方法已经达到了瓶颈。

随着对肺癌生物学的深入研究以及对肺癌发病分子机制的进一步了解，根据不同患者个体肿瘤中存在的关键致病基因进行针对性的分子靶向治疗。比较成功的例子即针对表皮生长因子受体(EGFR)激活型突变(比如L858R点突变、19号外显子缺失突变)所设计的靶向EGFR激酶域的小分子抑制剂，包括吉非替尼(Gefitinib,Iressa)和厄洛替尼(Erlotinib,Tarceva)。临床上这些小分子抑制剂对具有上述EGFR激酶域突变的肺癌患者疗效显著，然而一些耐药突变(比如EGFR激酶域T790M点突变、MET或HER2基因的扩增等)的出现却极大削弱了靶向药物的治疗效果，且目前并没有很好的解决策略。因此，寻找和鉴定肺癌中潜在的关键致病基因和耐药相关基因，对于研发新的靶向药物和解决耐药性问题具有重大意义。

近几年来癌症基因组学研究发现，除了致癌的基因突变外，由于基因组的不稳定而导致的融合基因或基因非正常剪切也是癌症发生的关键因素。比如，ALK的融合基因在各种恶性肿瘤包括淋巴癌和肺癌中都有发生，其中肺癌中两种形式的ALK融合基因是TFG-ALK和KIF5B-ALK，这些基因与ALK融合后使得ALK具有持续的酪氨酸激酶的活性。

在检测融合基因的同时很多基因的非正常剪切被发现存在。研究发现一些基因的可变剪切与癌症的发生发展以及抗药存在密切的联系。典型的例子是抑癌基因P53，它的可变体存在于54.7％的卵巢癌中，降低卵巢癌细胞对化疗药物的敏感响应，其表达与卵巢癌的复发成正相关。

综上所述，为了诊断和治疗癌症，本领域迫切需要开发与癌症发生或抗癌药物耐药性相关的物质。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有促进肺癌细胞增殖和增加肺癌细胞对抗癌药物耐药性的BMX非正常剪切体。

本发明的另一目的是提供一种BMX非正常剪切体检测方法和应用。

本发明的第一方面，提供了一种BMX非正常剪切体(以下称其为BMXΔN)，所述的剪切体蛋白缺失野生型BMX的N端，仅保留C端激酶域。

在另一优选例中，所述的剪切体蛋白缺失野生型BMX氨基酸序列的第1-383位。

在另一优选例中，所述的野生型BMX氨基酸序列如SEQ ID NO.:2所示。

在另一优选例中，所述的剪切体蛋白缺失如SEQ ID NO.:2第1-383位所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述的剪切体蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.:4第1-292位所示。

本发明的第二方面，提供了一种多核苷酸，所述的多核苷酸编码本发明的第一方面所述的BMX的剪切体蛋白。

在另一优选例中，所述的多核苷酸含有SEQ ID NO.:3所示的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述的多核苷酸不编码野生型BMX蛋白(如SEQ ID NO.:2所示的氨基酸序列)。

在另一优选例中，所述的多核苷酸BMXΔN是野生型BMX的核苷酸序列通过第942位特异性剪切位点剪切而形成，第942位之前为8号内含子部分序列。

本发明的第三方面，提供了一种载体，所述的载体含有如本发明的第二方面所述的多核苷酸。

本发明的第四方面，提供了一种遗传工程化宿主细胞，所述的遗传工程化宿主细胞包含本发明的第三方面所述的载体或基因组中整合有本发明的第二方面所述的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的宿主细胞包括原核细胞(如大肠杆菌等)或真核细胞(酵母细胞、CHO细胞等)。

本发明的第五方面，提供了一种制备如本发明的第一方面所述的剪切体蛋白的方法，包括步骤：

(a)在适合表达的条件，培养本发明第四方面所述的遗传工程化宿主细胞，从而表达本发明第一方面所述的BMX剪切体蛋白；和

(b)分离或纯化所述的BMX剪切体蛋白。

本发明的第六方面，提供了一种本发明的第一方面所述的剪切体蛋白或本发明的第二方面所述的多核苷酸的用途，它被(a)用于制备检测癌症易感性和/或癌症细胞耐药性的试剂或试剂盒；或(b)用于筛选抑制BMXΔN的抑制剂，所述抑制剂特异性或选择性抑制BMXΔN。

在另一优选例中，所述的癌症包括非小细胞肺癌、胃癌。

在另一优选例中，所述的试剂包括：引物、探针、对照品、芯片。

在另一优选例中，所述的试剂盒包括所述的试剂和使用说明书。

本发明的第七方面，提供了一种用于扩增如本发明的第三方面所述的多核苷酸或其片段的PCR引物对，所述的PCR引物对包括第一引物和第二引物，所述第一引物的接合位点位于BMX基因的8号内含子，第二引物的接合位点位于BMX基因的9号外显子，并且所述引物对所扩增出的扩增产物的长度≥150bp。

在另一优选例中，所述引物对所扩增出的扩增产物的长度≥250bp，较佳地≥400bp。

在另一优选例中，所述引物对不扩增野生型BMX的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述的第一引物的序列如SEQ ID NO.:7所示。

在另一优选例中，所述第一引物和第二引物的长度为15-50bp，较佳地为15-35bp。

在另一优选例中，所述的第一引物和第二引物如SEQ ID NO.:9和10所示。

在另一优选例中，当扩增体系中存在BMXΔN的多核苷酸序列时，所述引物对所扩增出的PCR扩增产物含有所述BMX剪切体的上述剪切位点。

本发明的第八方面，提供了一种可用于定量检测如本发明的第一方面所述的剪切体的核糖核酸的生物芯片，所述的芯片包括固相载体以及位于所述固相载体上的检测位点，所述检测位点含有用于特异性地检测本发明的第二方面中所述的多核苷酸的探针。

在另一优选例中，所述探针含有所述BMX剪切体的上述剪切位点。

本发明的第九方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含：

一容器以及位于所述容器内的用于测定本发明的第一方面所述的BMX剪切体蛋白的试剂、用于检测本发明的第二方面所述的多核苷酸的试剂、或其组合；和

使用说明书。

在另一优选例中，所述的用于检测第二方面所述的多核苷酸的试剂包括核酸芯片。

在另一优选例中，所述的试剂选自下组：

(a)特异性扩增所述剪切体的引物或引物对；

(b)特异性与所述剪切体的核酸分子进行杂交的探针。

在另一优选例中，所述的试剂盒用于检测选自下组的样品：人类非小细胞肺癌的肿瘤组织样品、人类非小细胞肺癌细胞系。

本发明的第十方面，提供了一种确定待测试物是否是抑制或促进如本发明的第一方面所述的BMX剪切体蛋白活性的物质的方法，其特征在于，包括步骤：

(a)在测试组中，在待测试物存在下，培养肺癌细胞；并且在阴性对照组中，在无所述测试物存在且其它条件相同的情况下，培养所述肺癌细胞；

(b)检测测试组中所述肺癌细胞中所述BMX剪切体mRNA或其蛋白的表达量A；并与对照组中所述肺癌细胞中所述BMX剪切体mRNA或其蛋白的表达量B进行比较；

其中，如果所述表达量A显著低于所述表达量B，则表示所述待测试物是抑制如本发明的第一方面所述的BMX剪切体蛋白活性的物质；

如果所述表达量A显著高于所述表达量B，则表示所述待测试物是促进如本发明的第一方面所述的BMX剪切体蛋白活性的物质。

在另一优选例中，所述的“显著低于”指表达量A与表达量B的之比≤0.5，较佳地≤0.3，更佳地≤0.2。

在另一优选例中，所述的“显著低于”指表达量A与表达量B的之比≥2，较佳地≥3，更佳地≥4。

在另一优选例中，所述的方法还包括步骤(c)：对于上一步骤鉴别出的抑制本发明第一方面所述的BMX剪切体蛋白活性的物质，进一步测定其对肿瘤细胞生长的抑制能力或对肿瘤细胞的杀灭能力。

在另一优选例中，所述的待测试物质包括：小分子化合物、miRNA、siRNA、蛋白(如抗体)等。

在另一优选例中，所述的筛选细胞包括非小细胞肺癌细胞。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。

图1显示了Exon Array检测BMX基因各个外显子的表达水平。

图2显示了5'RACE结合测序技术鉴定BMX非正常剪切情况。其中，各泳道如下：1871和2491代表2个用于检测的肺癌样本cDNA，均有BMXΔN阳性表达，Neg1和Neg2代表无BMXΔ表达的两个肺癌样本cDNA，作为阴性对照。

图3显示了RT-PCR检测BMXΔN在肺癌细胞系及肺癌组织中的表达。其中，图3A显示特异性RT-PCR检测多种肺癌细胞系中BMXΔN的结果。图3B显示特异性RT-PCR对临床肺癌和癌旁对照组织样本进行检测BMXΔN的表达结果。图3C显示特异性RT-PCR检测174例非小细胞肺癌中表达BMXΔN的结果。

其中，各泳道如下：图3A中，1848、5800、5803、5807、5810、5844、5866、5872、5883、5907、5908代表11种不同的人类肺腺癌细胞系，5889代表人类肺鳞状细胞癌细胞系。图3B中，#1、#2、#3、#4代表4个肺癌病人的编号，Neg1和Neg2代表2个肺癌样本中无BMXΔN表达的病人，N代表取自该病人的癌旁正常肺组织，T代表取自该病人的肺肿瘤组织。图3C中，#5-21代表17个肺癌病人的肺癌样本，neg代表无BMXΔN表达的肺癌病人的肺癌样本。

图4显示了用定量Real-time PCR检测总BMX在临床肺癌和癌旁对照组织样本的表达。

图5显示了BMXΔN表达促进肺癌细胞A549的增殖和非锚定依赖生长。其中，图5A显示通过载体在肺癌细胞系A549中转染全长BMX及BMXΔN后用Western Blot测定两者表达的结果。图5B显示被转染全长BMX及BMXΔN后的肺癌细胞A549和未被转染的对照细胞的增殖结果。图5C和5D显示了被转染全长BMX及BMXΔN后的肺癌细胞A549和未被转染的对照细胞的非锚定依赖生长结果。

图6显示了BMXΔN下调抑制肺癌细胞CRL5803的增殖和非锚定依赖生长。其中，图6A显示realtime PCR检测被分别转染了靶向BMX的两种不同shRNA(sh1和sh2)后的肺癌细胞系CRL5803中的BMXΔN的mRNA表达水平。图6B显示被分别转染了靶向BMX的两种不同shRNA(sh1和sh2)后的肺癌细胞系CRL5803中的BMXΔN的生长结果。图6C和D显示被分别转染了靶向BMX的两种不同shRNA(sh1和sh2)后的肺癌细胞系CRL5803的非锚定依赖生长结果。

图7显示了BMXΔN表达提高EGFR突变肺癌细胞PC9对于吉非替尼的耐受情况。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现，在人非小细胞肺癌组织中存在一种BMX的非正常剪切体，该非正常剪切体非常适合作为检测肿瘤细胞(尤其是肺癌细胞)对靶向EGFR激活突变类药物的耐药程度的标志物(marker)，在此基础上完成了本发明。

具体地，本发明人采用高通量Exon Array进行全基因组外显子表达谱分析，检测人非小细胞肺癌组织和癌旁正常组织样本的BMX基因外显子的表达水平，并采用5'RACE克隆BMX氮末端序列，通过测序RACE产物知道BMX末端序列，进一步设计特异性PCR引物得到BMX和BMXΔN产物，比较两者序列，再设计针对BMXΔN的特异性PCR引物，在300人非小细胞肺癌组织和大量对照组样本中，发现BMXΔN在12％的人非小细胞肺癌患者组织中有表达，通过转染BMXΔN，对于被转染后的肺癌细胞的生长速度、非锚定生长情况及在针对EGFR小分子抑制剂吉非替尼不同浓度下的细胞生长结果的研究结果表明，BMXΔN可以作为肺癌细胞对抗癌药物耐药性形成和程度的相关因子。

酪氨酸激酶BMX(Bone marrow X-linked kinase)和BMXΔN

BMX(Bone marrow X-linked kinase)，也叫ETK，是胞内非受体类酪氨酸激酶，参与多条信号转导途径包括激活STAT3信号。

人的全长的野生型BMX的核苷酸序列的登录号为660(NCBI Gene中的Gene ID)，全长为2530 bp(SEQ ID NO.:1)，其ORF位于112-2139位，野生型BMX的氨基酸序列的登录号为CAA58169.1，全长为675aa(SEQ ID NO.:2)，成熟蛋白位于1-675位，其中7-147位为PH结构域，289-394位为SH2结构域，412-667位为激酶结构域。

本发明的研究表明，至少在人非小细胞肺癌患者组织中有12％表达一种BMX的非正常剪切体BMXΔN。BMXΔN也有在多种肺癌细胞系中表达。BMXΔN过表达和增加细胞内BMX蛋白总量相关，并促进肺癌细胞增殖和非锚定依赖生长，还与对EGFR小分子抑制剂吉非替尼产生耐药有关联性。

此外，本发明的研究表明，与野生型BMX相比，本发明BMXΔN能够更显著地促进肿瘤细胞的形成耐药性，尤其是针对EGFR抑制剂(如吉非替尼等替尼类药物)。

BMXΔN的分离和鉴别

本发明还提供了BMXΔN的分离和鉴别方法。基于本发明所提供的信息，可以方便地通过常规方法或设备来分离和鉴别BMXΔN。

在本发明的一个具体实施例中，所述方法包括：用40例肺癌的肿瘤组织和20例癌旁对照组织进行全基因组外显子表达谱分析。按照Affymetrix公司Human Exon 1.0 ST芯片的标准操作流程操作，简单的来说即先进行RNA样本的处理和标记，然后进行后续的杂交、洗脱、染色和扫描等步骤。利用RMA(Robust Multichip Average)方法对exon探针集的信号进行背景校正、标准化(normalization)和累加。比较各外显子的相对表达水平，找到BMX基因可能的断点位置，进行后续的实验验证和研究。

在本发明的另一优选例中，分离或制备BMXΔN的方法包括步骤：

(1)收集非小细胞肺癌的肿瘤组织；

(2)提取上述肿瘤组织的RNA；

(3)处理和标记上述肿瘤组织的RNA；

(4)上述肿瘤组织的RNA与Human Exon 1.0 ST芯片杂交，洗脱，染色和扫描；

(5)用RMA方法对Exon探针集的信号进行校正，标准化和累加；

(6)Exon Array分析BMX各外显子的表达水平；

(7)通过5'RACE克隆BMX氮末端序列；

(8)通过测序5'RACE所得的克隆BMX氮末端序列比较剪切体的序列，设计特异性PCR引物以获取所述的BMX剪切体。

获取BMXΔN核苷酸序列或对应互补序列的方法

本发明还提供了一种获取BMXΔN核苷酸序列或对应互补序列的方法，包括步骤：

(1)收集样本；

(2)处理样本的RNA；

(3)将步骤(2)获得的RNA样本用Exon Array分析BMX各外显子的表达水平；

(4)通过5'RACE克隆BMX的N末端序列并测序；

(5)设计特异性PCR引物鉴定扩增BMX和BMXΔN产物并测序比较，获得BMXΔN序列和非正常剪切位点；

(6)设计针对扩增BMXΔN的特异性PCR引物以获取BMXΔN序列产物。

在本发明的一个优选例中，步骤(2)所述的BMXΔN选自下组：人非小细胞肺癌组织。

在另一优选例中，所述的待测样品包括：人非小细胞肺癌组织、细胞、器官、或其组合。

在另一优选例中，所述的待测样品来自多种肺癌细胞系。待测样品来自人或非人哺乳动物，更佳地为人。

在本发明中，检测BMXΔN的方法没有特别限制，代表性来自包括(但并不限于)：Exon Array方法、Robust Multichip Average方法、5'RACE方法、RT-PCR方法、real-timePCR方法、软琼脂集落形成法、慢病毒转染法、细胞培养法、原位杂交(ISH)、恒温滚环扩增(RCA)、(Sanger测序法)或生物芯片方法。

芯片

本发明还提供了一种用于检测BMXΔN的生物芯片，所述的芯片包括固相载体以及位于所述固相载体上的检测点，所述检测点用于特异性地(或捕获)检测BMXΔN或其对应的核酸序列或互补序列。

该芯片包括以下组分：

固相载体(如基片或微球)以及有序固定在固相载体上的寡核苷酸探针。

本发明的检测芯片可以含有一个或多个，较佳地含有≥5个，更佳地≥10个，最佳地≥20个BMXΔN的检测点。

所述固相载体可采用基因芯片领域的各种常用材料，例如但不限于尼龙膜，经活性基团(如醛基、氨基等)修饰的玻片或硅片，未修饰的玻片、塑料片等。所述的寡核苷酸探针是生物素化或带荧光标记的探针。

所述的BMXΔN芯片的制备可采用本领域已知的生物芯片的常规制造方法。例如，如果固相载体采用的是修饰玻片或硅片，探针的5'端含有氨基修饰的聚dT串，可将寡核苷酸探针配制成溶液，然后采用点样仪将其点在修饰玻片或硅片上，排列成预定的序列或阵列，放置过夜以固定，就可得到本发明的BMXΔN芯片。

试剂盒

本发明还提供了一种试剂盒，该试剂盒包含测定BMXΔN的试剂或芯片；

其中，所述的试剂选自下组：

(a)特异性扩增所述BMXΔN的引物或引物对；

(b)特异性与所述BMXΔN的核酸分子进行杂交的探针；

其中，所述的芯片是核酸芯片，所述芯片具有特异性检测所述BMXΔN的核酸分子的检测点。

由于野生型BMX的成熟mRNA序列中无8号内含子序列，因此可以用特异性结合于8号内含子序列的引物来特异扩增本发明的可变剪切体。

在本发明中，一种优选的PCR引物对包括第一引物和第二引物，所述第一引物的接合位点位于BMX基因的8号内含子，第二引物的接合位点位于BMX基因的9号外显子，并且所述引物对所扩增出的扩增产物的长度≥150bp，更佳地，≥250bp，较佳地≥400bp。通常，所述扩增产物的长度≤1200bp。

本发明的主要优点包括：

(1)本发明的BMXΔN可用于检测肿瘤细胞(尤其是肺癌细胞)或其生长情况。

(2)本发明的BMXΔN可用于检测肿瘤细胞的耐药性作用。

(3)本发明的BMXΔN可作为靶点，用于研发新的靶向药物和开发新的抗肿瘤药物。

(4)本发明的BMXΔN可作为反映临床EGFR小分子抑制剂治疗预后情况的参考指标。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

通用方法

1.细胞总RNA的提取：

(A)用于RNA提取的器皿均经去RNase处理，玻璃器皿及加样枪用去RNase试剂RNaseZapTM(RNase Decontamination solution)处理；塑料制品用含1/1000 DEPC的无菌水浸泡24小时，120℃，30min高压灭菌两次，60℃烤干；去离子水按1/1000加入DEPC处理24小时，高压消毒；

(B)配制DEPC水：称取1g的DEPC用1000ml的灭菌水溶解，37℃磁力搅拌器搅拌1h或室温搅拌过夜，高压灭菌；

(C)取出待收集总RNA的细胞，弃去60mm细胞培养皿中的培养基，PBS洗2次后，加入1ml Trizol，将细胞吹下，移至1.5ml EP管(DNase和RNase-free)，室温静置5min；

(D)每1ml Trizol试剂加0.2ml氯仿，振荡15秒，室温静置2-3min；

(E)4℃，12000g离心，15min；将上层水相转入新的EP管中，加入等量的异丙醇，混匀，室温放置10min，4℃，12000g离心15min；

(F)弃上清，加1ml 75％的乙醇洗涤RNA沉淀，4℃，7500g离心5min，弃上清，空气中干燥10min；

(G)加入50μl无RNase的水溶解RNA，充分溶解；

(H)1％琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性，分光光度计检测RNA的浓度及纯度，记录后，分装冻于-80℃保存；

2.RT(逆转录)

(A)取每种细胞总RNA各2μg，按以下体系逐次加样(体积15μl)：

RNA 2μg

随机引物 1μl

水(μl) 配平至15μl

(B)置70℃恒温PCR仪中5min，之后立即取出置于冰上；

(C)加入下列混合物10μl/管，冰上操作：

(D)42℃恒温PCR仪中反应60min；

4℃冷却，-20℃保存cDNA。

3.RT-PCR

(A)将上述cDNA产物用无菌水稀释5倍，取1-2μl稀释后的cDNA作为模板进行PCR反应；

(B)按照下列体系逐一加入反应成分：

10×PCR buffer(含MgCl<sub>2</sub>20mM)	2.5μl
		dNTP mix(各10mM)	2.0μl
Primer1(Forward,10μM)	0.5μl
		Primer2(Reverse,10μM)	0.5μl
Taq酶(5u/μl)	0.3μl
		cDNA	1.0μl
dd H<sub>2</sub>O	18.2μl
		总计	25μl

(C)加完样后，离心数秒，置PCR仪中进行扩增反应，条件如下：

(D)PCR产物电泳：称2g琼脂糖粉加入100ml 0.5×TBE缓冲液中(2％的琼脂糖凝胶)，在微波炉中加热至琼脂糖颗粒全部溶化后倒在事先已封好的胶模上，插上梳子，赶走气泡，半小时后待胶凝固加样：5μlPCR产物+1μl 6×上样缓冲液；80V，电泳20min；之后用凝胶成相仪分析，拍照。

4.Real-time RT-PCR

(A)将cDNA产物用无菌水稀释100倍，取1μl稀释后的cDNA作为模板进行以下反应；

(B)按照下列体系逐一加入反应成分：

2×SYBR Green Realtime PCR Master Mix	10μl
		Primer1(Forward,10μM)	0.4μl
Primer2(Reverse,10μM)	0.4μl
		cDNA(1:100稀释后)	9.2μl
总计	20μl

(C)加完样后，离心数秒，置ABI-7500 fast real-time PCR仪中进行扩增反应，条件如下：

熔解曲线(Melting Curve)分析

(D)结果分析：用ABI-7500 fast real-time PCR仪的专用软件AppliedBiosystems进行数据分析。

细胞株

在本发明中所用的细胞株均为市售的或常规的细胞株，主要包括：

人类肺癌细胞系CRL-1848、CRL-5800、CRL-5803、CRL-5807、CRL-5810、CRL-5844、CRL-5866、CRL-5872、CRL-5883、CRL-5889、CRL-5907、CRL-5908和A549

实施例15'RACE分析BMX非正常剪切位点

5'RACE按照SMARTer^TM RACE cDNA Amplification Kit(Clontech LaboratoriesInc,Mountain View,CA)试剂盒说明书操作。

首先，按照RNeasy Mini Kit(Qiagen,Hilden,Germany)试剂盒说明书从肺肿瘤组织中抽提RNA，随后取1μg RNA，用试剂盒提供的5'RACE CDS引物A和SMARTer II A寡核苷酸进行逆转录；用与RACE通用引物A混合物(UPM)5'-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3'(SEQ ID NO.:5)和5'-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3'(SEQ ID NO.:6)偶联的BMX基因特异引物GSP1：5'-GGTTCAAGTCCTTTTCCGTGACTCCTCA-3'(SEQ ID NO.:7)或GSP2：5'-CCCGAAGTGGTTCAATGGAAGACAGGA-3'(SEQ ID NO.:8)进行PCR反应，对PCR产物进行直接测序，或将PCR产物克隆进pGEM-T载体(购自Promega公司)后再进行测序。

结果

对肺癌临床样本进行人类全基因组外显子测序，发现很多基因的各个外显子之间表达存在差异，包括BMX基因(见图1)。通过5'RACE结合测序技术在这些肺癌样本中发现了一种新的非正常BMX剪切体(以下称其为BMXΔN)，其在转录水平保留了一段内含子序列，并缺失了氮端的外显子。

如图2所示，其中显示了引物GSP1和GSP2在BMX编码区序列中所对应的位置，以及BMX可变剪切的断裂点位置。PCR结果表明，通用引物和GSP1引物扩增的片段长度为1177bp，通用引物和GSP2引物扩增的片段长度为695bp，2个肺癌样本中BMX可变剪切的断裂点位置是一样的；其中，泳道1871和2491代表2个用于检测的肺癌样本cDNA，均有BMXΔN阳性表达，Neg1和Neg2代表无BMXΔ表达的两个肺癌样本cDNA，作为阴性对照。测序结果表明，可变剪接发生在8号内含子和9号外显子之间。

实施例2.RNA抽提、RT-PCR和realtime PCR

本实施例中使用RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit(购自美国Fermentas公司，货号K1622)，SYBR Green Realtime PCR Master Mix(购自美国TOYOBO公司，货号TY-QPK-201),Taq酶等试剂和仪器。

目的基因引物如下：

BMXΔN(RT-PCR所用引物序列):

Forward primer：5'-AGGGTGGGATTTGATATTGCATGG-3'(SEQ ID NO.:9)

Reverse primer：5'-CCAGGGACACAGAGTCGGGGA-3'(SEQ ID NO.:10)

BMXΔN(realtime所用引物序列):

Forward primer：5'-CAGTAACCAAAAAGAAAGAAATG-3'(SEQ ID NO.:11)

Reverse primer：5'-TGTGTTGATGATAATGAATAAGC-3'(SEQ ID NO.:12)

GAPDH:Forward primer：5'-GCGACACCCACTCCTCCACCTTT-3'(SEQ ID NO.:13)

Reverse primer：5'-TGCTGTAGCCAAATTCGTTGTCATA-3'(SEQ ID NO.:14)

用RT-PCR检测BMXΔN在肺癌细胞系(CRL-1848、CRL-5800、CRL-5803、CRL-5807、CRL-5810、CRL-5844、CRL-5866、CRL-5872、CRL-5883、CRL-5889、CRL-5907、CRL-5908)及肺癌组织中的表达。

结果如见图3A，3B和3C所示，GAPDH为对照。在图3A中，BMXΔN在所检测的12中人类非小细胞肺癌细胞系中均有表达。(1848、5800、5803、5807、5810、5844、5866、5872、5883、5907、5908代表11种不同的人类肺腺癌细胞系，5889代表人类肺鳞状细胞癌细胞系)。

在图3B中，BMXΔN在4个肺癌病人的肺肿瘤组织中均有表达，在癌旁肺正常组织中无表达。(#1、#2、#3、#4代表4个肺癌病人的编号，Neg1和Neg2代表2个肺癌样本中无BMXΔN表达的病人，N代表取自该病人的癌旁正常肺组织，T代表取自该病人的肺肿瘤组织。)。

在图3C中，BMXΔN在所检测的另外17个肺癌病人的肺癌组织中均有表达。(#5-21代表17个肺癌病人的肺癌样本，neg代表无BMXΔN表达的肺癌病人的肺癌样本。)

在BMXΔN为阳性的临床肺癌组织样本中，通过定量real-timePCR发现在这些细胞中总BMX蛋白的表达水平显著高于BMXΔN阴性的临床肺癌组织样本(图4)。

实施例3.细胞增殖实验

在本实施例中，用对照组质粒pCDH-CopGFP和分别表达BMX和BMXΔN两种蛋白的质粒包装慢病毒并感染A549细胞；用对照组质粒pLKO.1-puro和表达靶向BMX的shRNA的质粒包装慢病毒并感染CRL-5803细胞。

正常培养细胞，待细胞生长至对数期时，消化并重悬细胞，调整细胞悬液浓度为7500cells/ml，每孔加入200μl细胞悬液进行96孔板的铺板，每组细胞做5个复孔，共接种4～6块96孔板；

将细胞置于37℃,5％CO₂培养箱培养，12h后进行第一次MTT检测并记为第零天，以后每隔24h检测一次，共收取4～5天的数据；

检测时每孔加入20μl MTT溶液，37℃孵育4小时后，用真空泵吸尽上清，每孔加入100μl DMSO溶解紫色结晶，室温振荡直至充分溶解；

酶标仪检测570nm波长处的吸光值，以630nm作为参比波长；

根据测得的吸光值，以第零天的吸光值为基准计算相对吸光值，并以培养时间为横坐标相对吸光值为纵坐标，绘制每组细胞的生长曲线。

结果

将携带有全长野生型BMX及BMXΔN序列的载体(pCDH-CMV-EF1-CopGFP)分别表达在肺癌细胞系A549中，转染有空载体的细胞为对照。图5A显示野生型BMX及BMXΔN蛋白在A549细胞系中均有表达。同时，BMX和BMXΔN都能提高A549细胞的增殖能力(图5B)。

将靶向BMX的两种不同的sh1RNA和sh2RNA表达在肺癌细胞株CRL-5803中，两种shRNA都显著下调内源性BMXΔN的mRNA水平(见图6A)，且两种shRNA都能有效抑制CRL-5803细胞系的体外增值能力(图6B)。

BMX sh1_正向序列:

5'-CCGGGAGTGCTGATAAGAATGAATACTCGAGTATTCATTCTTATCAGCACTCTTTTTG-3'(SEQID NO.:15)

BMX sh1_反向序列:

5'-AATTCAAAAAGAGTGCTGATAAGAATGAATACTCGAGTATTCATTCTTATCAGCACTC-3'(SEQID NO.:16)

靶序列:

GAGTGCTGATAAGAATGAATA(SEQ ID NO.:17)

BMX sh2_正向序列:

5'-CCGGCCATTGAACCACTTCGGGAAACTCGAGTTTCCCGAAGTGGTTCAATGGTTTTTG-3'(SEQID NO.:18)

BMX sh2_反向序列:

5'-AATTCAAAAACCATTGAACCACTTCGGGAAACTCGAGTTTCCCGAAGTGGTTCAATGG-3'(SE QID NO.:19)

靶序列:

CCATTGAACCACTTCGGGAAA(SEQ ID NO.:20)

实施例4.软琼脂集落形成实验

在本实施例，通过软琼脂集落形成实验，用于分析肿瘤细胞的非锚定依赖生长能力。方法如下：

1)配制3％低熔点琼脂糖(Agarose)：用1×PBS配制，高压灭菌后，冷却至39℃，后置于39℃水浴锅中保温，防止凝固；

2)1％下层胶铺板：取2倍体积的完全培养基(37℃预热)稀释3％的低熔点琼脂糖至1％的终浓度，如：9ml完全培养基+4.5ml的3％低熔点琼脂糖，充分混匀，向6孔板中的每个孔中加入2ml 1％的低熔点琼脂糖，室温静置15min，待其自然冷却至凝固；

3)0.8％上层胶的配制：配好的上层胶置于39℃水浴锅中保温，防止凝固。配方如下：

4)实验细胞的准备：0.125％胰酶消化对数生长期的细胞，离心并对细胞进行计数，将悬浮细胞的密度稀释至5×10³/ml；

5)配制含细胞的上层胶混合液：将0.8％Ag/Media与上述细胞悬液(5×10³/ml)按1:1的体积比混合，吹匀；

6)种植细胞：将含细胞的上层胶混合液种植于1％下层胶上，6孔板的每个孔加入2ml混合液，置于4℃冷却10min，至含细胞的上层胶凝固，后每个孔加入2ml完全培养基，置于37℃细胞培养箱中培养；

7)观察拍照：培养10～14天，观察软琼脂中集落出现日期及生长情况，拍照记录；

8)结晶紫染色：2周后，弃去孔中的完全培养基，用0.005％结晶紫溶液室温染色2小时，之后于脱色摇床上用ddH₂O漂洗6次，每次5min；

9)统计分析：拍照，用Image J软件统计克隆数，进行数据分析。

结果

将携带有全长野生型BMX及BMXΔN序列的载体(pCDH-CMV-EF1-CopGFP)分别表达在肺癌细胞系A549中，转染有空载体的细胞为对照。体外软琼脂集落形成试验显示BMX和BMXΔN在肺癌细胞株A549中的过表达都能增加细胞的非锚定依赖生长能力，其中BMXΔN的过表达相对于BMX的过表达对增加A549细胞株的非锚定依赖生长能力更强(见图5C和图5D)。

将靶向BMX的两种不同的sh1RNA和sh2RNA表达在肺癌细胞株CRL-5803中。体外软琼脂集落形成试验显示BMXΔN的下调显著抑制了CRL-5803细胞株的非锚定依赖生长能力(图6C和6D)。

实施例5.检测细胞对于药物的耐受性

在本实施例中，研究BMXΔN阳性细胞对药物的耐受性。其中，将携带有全长野生型BMX及BMXΔN序列的载体分别表达在带有EGFR激活型突变的肺癌细胞系PC9中，转染有空载体的细胞为对照。通过细胞存活实验检测PC9细胞对于EGFR小分子抑制剂吉非替尼的耐受程度。方法如下：

1)用对照组质粒pCDH-CopGFP(购自System Biosciences(SBI)公司)和分别表达BMX和BMXΔN两种蛋白的质粒包装慢病毒并感染PC9细胞(购自ATCC公司)；

2)正常培养细胞，待细胞生长至对数期时，消化并重悬细胞，调整细胞悬液浓度为7500细胞/ml，每孔加入200μl细胞悬液进行96孔板的铺板；设置一系列不同的药物浓度梯度，每组细胞每个药物浓度做5个复孔；

3)将细胞置于37℃,5％CO₂培养箱培养，24h后加入含有相应浓度药物的培基；培养72h；

4)检测时每孔加入20μl MTT溶液，37℃孵育4小时后，用真空泵吸尽上清，每孔加入100μl DMSO溶解紫色结晶，室温振荡直至充分溶解；

5)酶标仪检测570nm波长处的吸光值，以630nm作为参比波长；

6)根据测得的吸光值，以药物浓度为零的吸光值为基准计算相对吸光值，并以梯度药物浓度为横坐标相对吸光值为纵坐标绘制曲线。

结果

如图7所示，MTT(细胞存活和生长检测方法)结果显示，随着吉非替尼浓度的增加，过表达BMXΔN的PC9细胞显示出对吉非替尼更强的耐受性(图7)，这表明了BMXΔN表达提高了EGFR突变肺癌细胞PC9对于吉非替尼的耐受。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (20)

1.一种BMX剪切体蛋白，其特征在于，所述的剪切体蛋白缺失野生型BMX氨基酸序列的第1-383位；

并且所述的野生型BMX的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

2.一种多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸编码权利要求1所述的BMX的剪切体蛋白。

3.如权利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸的核苷酸序列如SEQ IDNO:3所示。

4.如权利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸不编码野生型BMX蛋白。

5.一种载体，其特征在于，所述的载体含有如权利要求2所述的多核苷酸。

6.一种遗传工程化宿主细胞，其特征在于，所述的遗传工程化宿主细胞包含权利要求5所述的载体或基因组中整合有权利要求2所述的多核苷酸。

7.如权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞包括原核细胞或真核细胞。

8.一种制备如权利要求1所述的剪切体蛋白的方法，其特征在于，包括步骤：

(a)在适合表达的条件，培养权利要求6所述的遗传工程化宿主细胞，从而表达权利要求1所述的BMX剪切体蛋白；和

(b)分离或纯化所述的BMX剪切体蛋白。

9.一种如权利要求1所述的剪切体蛋白或权利要求2所述的多核苷酸的用途，其特征在于，(a)用于制备检测癌症易感性和/或癌症细胞耐药性的试剂或试剂盒；或(b)用于筛选抑制仅保留C端激酶域的BMX剪切体蛋白的抑制剂，所述抑制剂特异性或选择性抑制仅保留C端激酶域的BMX剪切体蛋白；并且所述的癌症为非小细胞肺癌。

10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述的试剂包括：引物、探针、对照品。

11.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述的试剂盒包括所述的试剂和使用说明书。

12.一种用于扩增如权利要求2所述的多核苷酸或其片段的PCR引物对，其特征在于，所述的PCR引物对包括第一引物和第二引物，并且所述的第一引物和第二引物如SEQ ID NO:9和10所示。

13.如权利要求12所述的引物对，其特征在于，当扩增体系中存在仅保留C端激酶域的BMX剪切体蛋白的多核苷酸序列时，所述引物对所扩增出的PCR扩增产物含有所述BMX剪切体的剪切位点。

14.一种可用于定量检测如权利要求1所述的剪切体的核糖核酸的生物芯片，其特征在于，所述的芯片包括固相载体以及位于所述固相载体上的检测位点，所述检测位点含有用于特异性地检测权利要求2所述的多核苷酸的探针。

15.如权利要求14所述的生物芯片，其特征在于，所述探针含有所述BMX剪切体的剪切位点。

16.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含：

一容器以及位于所述容器内的用于测定权利要求1所述的BMX剪切体蛋白的试剂、用于检测权利要求2所述的多核苷酸的试剂、或其组合；和

使用说明书；

其中，所述的试剂选自下组：

(a)特异性扩增所述剪切体的引物或引物对；

(b)特异性与所述剪切体的核酸分子进行杂交的探针；

其中，所述引物对包括第一引物和第二引物，并且所述的第一引物和第二引物如SEQID NO:9和10所示；

所述探针含有所述BMX剪切体的剪切位点，所述剪切位点为野生型BMX的核苷酸序列的第942位特异性剪切位点。

17.如权利要求16所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒用于检测选自下组的样品：人类非小细胞肺癌的肿瘤组织样品、人类非小细胞肺癌细胞系。

18.一种确定待测试物是否是抑制或促进如权利要求1所述的BMX剪切体蛋白活性的物质的方法，其特征在于，包括步骤：

(a)在测试组中，在待测试物存在下，培养肺癌细胞；并且在阴性对照组中，在无所述测试物存在且其它条件相同的情况下，培养所述肺癌细胞；

(b)检测测试组中所述肺癌细胞中所述BMX剪切体mRNA或其蛋白的表达量A；并与对照组中所述肺癌细胞中所述BMX剪切体mRNA或其蛋白的表达量B进行比较；

其中，如果所述表达量A显著低于所述表达量B，则表示所述待测试物是抑制如权利要求1所述的BMX剪切体蛋白活性的物质；

如果所述表达量A显著高于所述表达量B，则表示所述待测试物是促进如权利要求1所述的BMX剪切体蛋白活性的物质；

其中，所述的“显著低于”指表达量A与表达量B的之比≤0.5，所述的“显著高于”指表达量A与表达量B的之比≥2。

19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述的方法还包括步骤(c)：对于上一步骤鉴别出的抑制权利要求1所述的BMX剪切体蛋白活性的物质，进一步测定其对肿瘤细胞生长的抑制能力或对肿瘤细胞的杀灭能力。

20.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述的待测试物包括：小分子化合物、miRNA、siRNA、蛋白。