CN113736812A - 一种pcMINI载体及其构建方法与应用 - Google Patents

一种pcMINI载体及其构建方法与应用 Download PDF

Info

Publication number
CN113736812A
CN113736812A CN202111038155.0A CN202111038155A CN113736812A CN 113736812 A CN113736812 A CN 113736812A CN 202111038155 A CN202111038155 A CN 202111038155A CN 113736812 A CN113736812 A CN 113736812A
Authority
CN
China
Prior art keywords
pcmini
vector
intron
exon
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202111038155.0A
Other languages
English (en)
Inventor
杨国华
胡俊
陈志毅
李婷
张德庆
袁天立
林宝仪
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wuhan Yikang Gene Technology Co ltd
Wuhan University WHU
Original Assignee
Wuhan Yikang Gene Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wuhan Yikang Gene Technology Co ltd filed Critical Wuhan Yikang Gene Technology Co ltd
Priority to CN202111038155.0A priority Critical patent/CN113736812A/zh
Publication of CN113736812A publication Critical patent/CN113736812A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/65—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression using markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/66—General methods for inserting a gene into a vector to form a recombinant vector using cleavage and ligation; Use of non-functional linkers or adaptors, e.g. linkers containing the sequence for a restriction endonuclease
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification

Abstract

本发明公开了一种pcMINI载体及其构建方法与应用。所述pcMINI载体是由载体pcDNA3.1+改造而成，所述pcMINI载体包含CMV增强子、PCMV启动子、多克隆位点(MCS)、外显子‑内含子基因片段和BGH_PA_terminator终止子，所述多克隆位点(MCS)用于插入外显子‑内含子结合处存在突变的基因片段；本发明的pcMINI载体系统只需通过更换插入的DNA片段即可实现对不同基因突变的检测，使用范围广，操作简便；构建的pcMINI载体所需插入的DNA片段更小，载体构建更为高效快速；同时pcMINI载体的内含子元件包含了高效的剪接受体和剪接供体位点，能确保插入DNA片段有效进行RNA剪接；本发明提供了一套完整可行的基于pcMINI载体的真核生物mRNA异常剪切验证方法。

Description

一种pcMINI载体及其构建方法与应用
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种pcMINI载体及其构建方法与应用。
背景技术
真核生物中，无论是蛋白质还是除mRNA之外的其他RNA分子(如microRNA、cirRNA、lncRNA等)都有对应的编码基因，这些编码基因通常被非编码的间隔序列(内含子)分隔为若干个外显子，上述编码基因也被称为断裂基因。在转录过程中，断裂基因首先被转录为含有外显子和内含子的mRNA前体(precursor messenger RNA,pre-mRNA)，随后mRNA前体经RNA剪接(RNA splicing)，将内含子剪切去除，并将外显子RNA部分有序连接，最终产生成熟的mRNA。RNA剪接是真核细胞基因表达的重要生物学机制，正确的RNA剪接依赖于剪接体(spliceosome)及RNA结合蛋白与mRNA前体顺式作用元件的正确结合。调控RNA剪接的顺式作用元件包括：1)内含子5’端的剪接供体(donor)位点GT和内含子3’端的剪接受体(acceptor)位点AG；2)近邻内含子的外显子序列，即外显子5’端的第1个碱基和3’端的最后3个碱基；这两类元件共同构成了外显子内含子接头序列，除了接头序列，基因外显子和内含子区域内部存在的剪接调控元件如增强子和沉默子亦会调控基因的剪接。
明确遗传病的致病基因是实现精准医疗的前提，随着高通量测序技术的完善和测序成本的降低，越来越多的基因突变得以被发现。在这些新发现的突变中，一部分位于基因编码区的无义突变、错义突变、移码突变等突变因直接影响编码蛋白的结构和功能，其致病性和临床意义能很快明确；但是，还有大量突变因其功能不明而被列为未知意义变异(variants of uncertain significant,VUS)，明确这些未知意义变异与遗传病的相关性是基因诊断要解决的重要问题。目前研究表明，有大量的人类遗传病与mRNA异常剪接有直接关系：外显子内含子接头序列的突变可以导致邻近的内含子滞留或外显子缺失；基因内部突变产生新的接头序列可以导致RNA剪接异常；剪接调控元件序列突变会影响RNA剪接效率，从而影响基因表达水平。因此，如何能快速、高效地在体外对mRNA异常剪接进行验证一直是研究的热点和难点，现有技术中报道的在体外对mRNA异常剪接进行验证的载体系统存在着效率不高、准确性差等问题。
发明内容
针对以上现有技术中的不足，本发明提供了一种pcMINI载体及其构建方法与应用。通过克隆带有可能与mRNA剪接相关的基因突变(包括外显子内含子接头序列附近以及深度内含子中的点突变、插入及缺失等变异)的目标基因组片段，构建重组表达载体，转染真核细胞株后进行RT-PCR，再利用琼脂糖凝胶电泳和sanger测序技术验证该突变对mRNA剪接的影响(外显子缺失、内含子滞留)，本发明构建的载体能快速、高效并准确的验证一些突变对mRNA剪接异常的影响。
本发明的一个目的在于提供一种pcMINI载体。
一种pcMINI载体，所述pcMINI载体是由载体pcDNA3.1+改造而成，所述pcMINI载体包含CMV增强子、PCMV启动子、多克隆位点(MCS)、外显子-内含子基因片段和BGH_PA_terminator终止子，所述多克隆位点(MCS)用于插入外显子-内含子结合处存在突变的基因片段。
进一步地，所述多克隆位点(MCS)位于所述外显子-内含子基因片段之间，并且按“外显子A-内含子A-MCS-内含子B-外显子B”顺序排列，所述内含子A带有mRNA剪切供体(donor)GT，所述内含子B带有mRNA剪切受体(acceptor)AG。
进一步地，所述外显子A的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述内含子A的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述内含子B的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；所述外显子B的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
本发明的另外一个目的在于提供一种pcMINI载体的构建方法。
上述任一项所述的pcMINI载体的构建方法，包括如下步骤：
S1、以人基因组DNA为模板，设计扩增引物，经PCR扩增获得“外显子A+内含子A”DNA片段，然后经HindIII/KpnI双酶切插入载体pcDNA3.1+多克隆位点区域，获得重组中间载体pcDNA3.1-A；
S2、以人基因组DNA为模板，设计扩增引物，经PCR扩增获得“内含子B+外显子B”DNA片段，然后经XhoI/XbaI双酶切后插入步骤S1中得到的pcDNA3.1-A载体多克隆位点区域，获得pcMINI重组载体；
S3、将步骤S2中得到的pcMINI重组载体转化至大肠杆菌DH5α感受态细菌，培养后提取重组质粒，即为pcMINI载体。
进一步地，步骤S1中，PCR扩增“外显子A+内含子A”DNA片段的引物为pcMINI-HindIII-F和pcMINI-KpnI-R，其序列分别如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示。
进一步地，步骤S2中，PCR扩增“内含子B+外显子B”DNA片段的引物为pcMINI-XhoI-F和pcMINI-XbaI-R，其序列分别如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示。
进一步地，步骤S3中具体方法如下：将得到的pcMINI重组载体通过热激法转化至大肠杆菌DH5α感受态细菌，并通过氨苄青霉素抗性筛选获得阳性重组质粒。
更进一步地，所述抗性筛选的具体方法如下：挑取单菌落接种于含氨苄青霉素的LB液体培养基中，在37℃、200rpm的条件下培养过夜，使用商品化质粒小提试剂盒提取重组pcMINI载体质粒DNA。
本发明的最后一个目的在于提供一种pcMINI载体的应用。
上述任一项所述的pcMINI载体在体外验证真核生物mRNA异常剪切中的应用。
进一步地，所述应用方法包括如下步骤：
S101、分别将含有突变位点的野生型DNA片段和突变型DNA片段插入pcMINI载体的多克隆位点区域，构建表达野生型和突变型基因的重组表达载体；
S102、将步骤S101中构建的野生型和突变型基因的重组表达载体转染真核细胞，转染24小时后收集细胞；
S103、提取步骤S102中收集的细胞总RNA，然后逆转录合成cDNA；
S104、以步骤S103中合成的cDNA为模板，使用引物扩增目标基因的转录产物；所述引物为pcMINI-F和pcMINI-R，其序列分别如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示；
S105、琼脂糖凝胶电泳检测野生型和突变型基因片段的转录产物，并观察上述基因片段的差异；
S106、将步骤S105中得到的野生型和突变型基因的转录产物进行sanger测序，比对测序结果，分析此突变的影响。
与现有技术，本发明具有如下优点：
1)本发明的pcMINI载体系统只需通过更换插入的DNA片段即可实现对不同基因突变的检测，使用范围广，操作简便；
2)本发明构建的pcMINI载体所需插入的DNA片段更小，载体构建更为高效快速；
3)本发明的pcMINI载体的内含子元件包含了高效的剪接受体和剪接供体位点，能确保插入DNA片段有效进行RNA剪接；
4)本发明提供了一套完整可行的基于pcMINI载体的真核生物mRNA异常剪切验证方法。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明构建的pcMINI载体图谱；
图2为本发明构建的pcMINI-TSC1载体图谱；
图3为minigene检测载体pcMINI-TSC1-wt(图A)和pcMINI-TSC1-mut(图B)测序结果图；
图4为TSC1基因转录产物检测结果图；其中，图a为琼脂糖电泳检测RT-PCR扩增产物结果；图b为2个转录本的结构示意图；图c和图d分别为野生型和突变型基因片段的2个转录本的测序结果。
具体实施方式
下面将结合具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
其他常规试剂和设备，如无特别说明，均可市售获得；若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
以下实施例以人TSC1基因c.1550_1551del突变导致的mRNA剪接异常检测为例，阐述本发明的技术方案和应用方式。
实施例1pcMINI载体的构建
1.1重组中间载体pcDNA3.1-A的构建
以人基因组DNA为模板，使用引物pcMINI-HindIII-F和pcMINI-KpnI-R扩增“外显子A+内含子A”DNA片段；所述引物的序列如下所示：
pcMINI-HindIII-F：ACTTAAGCTTatgagtgggctttggggtggccggtt(SEQ ID NO:5)
pcMINI-KpnI-R：GCTCGGTACCtacccatgagccatgtg(SEQ ID NO:6)
将上述PCR片段纯化回收后，使用HindIII/KpnI双酶切扩增片段，同时使用HindIII/KpnI双酶切pcDNA3.1+质粒；使用T4 DNA连接酶连接片段和载体，使用热激法将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，对经氨苄青霉素抗性筛选的阳性克隆进行菌落PCR检测和测序检测双重验证后，获得重组中间载体pcDNA3.1-A。
1.2pcMINI载体的构建
以人基因组DNA为模板，使用引物pcMINI-XhoI-F和pcMINI-XbaI-R扩增“内含子B+外显子B”DNA片段；所述引物的序列如下所示：
pcMINI-XhoI-F：GCCGCTCGAGgaaaactgccct(SEQ ID NO:7)
pcMINI-XbaI-R：GCCCTCTAGActggtcattccggctc(SEQ ID NO:8)
将PCR片段纯化回收后，使用XhoI/XbaI双酶切扩增片段，同时使用XhoI/XbaI双酶切步骤1.1中获得的pcDNA3.1-A重组质粒；使用T4 DNA连接酶连接片段和载体，使用热激法将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑选经氨苄青霉素抗性筛选的阳性克隆进行菌落PCR检测和PCR测序，获得pcMINI表达载体，pcMINI载体图谱如图1所示。
本实施例中，外显子A、B和内含子A、B均来自人ASL基因组序列，其中，内含子A和内含子B分别带有高效的mRNA剪切供体(donor)GT和mRNA剪切受体(acceptor)AG，是经过大量的筛选得到的，能确保插入的基因正确进行mRNA剪切。
实施例2人TSC1基因c.1550_1551del突变导致的mRNA剪接异常的检测
2.1pcMINI-TSC1载体的构建
TSC1基因的c.1550_1551del突变位于TSC1基因的第15号外显子上，将含有部分14号内含子(316bp)、15号外显子(559bp)和部分15号内含子(304bp)的基因片段连入pcMINI载体构建表达质粒，所述表达质粒的图谱如图2所示。
对于TSC1野生型表达载体，以人基因组DNA为模板，使用引物TSC1-37525-F/TSC1-39957-R和引物TSC1-37892-F/TSC1-39618-R进行巢式PCR扩增；所述引物的序列如下所示：
TSC1-37525-F：gtattctgacttgactatatc(SEQ ID NO:11)
TSC1-39957-R：ctgtgttgttagcttaacacag(SEQ ID NO:12)
TSC1-37892-F：gtaatgtatgtgggattgctatg(SEQ ID NO:13)
TSC1-39618-R：tccccaagcacctgtaaagtag(SEQ ID NO:14)
再以扩增产物为模板，使用引物pcMINI-TSC1-Kpn1-F和pcMINI-TSC1-BamH1-R进行PCR扩增，所述引物的序列如下所示：
pcMINI-TSC1-Kpn1-F：ggtaGGTACCcacctcagcctcctgagtagctg(SEQ ID NO:15)
pcMINI-TSC1-BamH1-R：TAGTGGATCCcttgcagagggcacatatgaaag(SEQ ID NO:16)
扩增片段回收纯化后，经KpnI/BamHI双酶切后插入pcMINI载体，筛选阳性克隆即得pcMINI-TSC1-wt质粒。
对于TSC1突变型表达载体，以人pcMINI-TSC1-wt质粒为模板，分别使用pcMINI-TSC1-Kpn1-F(SEQ ID NO:15)/TSC1-mut-R和TSC1-mut-F/pcMINI-TSC1-BamH1-R(SEQ IDNO:16)引物进行PCR扩增，所述引物的序列如下所示：
TSC1-mut-F：CTCCCAGGTTCTCAGCAAGACCCACTCGGCAG(SEQ ID NO:17)
TSC1-mut-R：CTGCCGAGTGGGTCTTGCTGAGAACCTGGGAG(SEQ ID NO:18)
以上述2个PCR产物为模板，使用引物pcMINI-TSC1-Kpn1-F(SEQ ID NO:15)和pcMINI-TSC1-BamH1-R(SEQ ID NO:16)进行重叠PCR，扩增片段即为携带有TSC1 c.1550_1551del突变的片段；该片段经KpnI/BamHI双酶切后插入pcMINI载体，筛选阳性克隆即得pcMINI-TSC1-mut质粒。
sanger测序结果(图3)显示，pcMINI-TSC1-wt和pcMINI-TSC1-mut质粒插入片段序列与预期一致，pcMINI-TSC1-mut质粒中成功导入了c.1550_1551del突变。
2.2TSC1基因c.1550_1551del突变对转录的影响
将步骤2.1中得到的pcMINI-TSC1-wt和pcMINI-TSC1-mut质粒分别转染至人宫颈癌细胞系Hela细胞系，转染48小时后收集细胞，常规提取总RNA并逆转录合成cDNA，使用pcMINI-F/pcMINI-R引物进行RT-PCR检测，所述引物的序列如下：
pcMINI-F：GCTTACTGGCTTATCGAAATT(SEQ ID NO:9)
pcMINI-R：GGCAAACAACAGATGGCTGGC(SEQ ID NO:10)
经琼脂糖凝胶电泳检测检测野生型和突变型基因片段的转录产物，并观察上述基因片段的差异；继续将上述野生型和突变型基因的转录产物进行sanger测序，比对测序结果，分析此突变的影响，结果见图4。
图4结果表明，pcMINI-TSC1-wt和pcMINI-mut均产生了2个转录本，说明TSC1基因本身存在可变剪切，并且c.1550_1551del突变则使转录本b的转录水平增加了；sanger测序结果表明：转录本a完整表达了exonA+TSC1 exon15+exonB序列，而转录本b中TSC1exon15有417bp缺失，因此，本发明构建的pcMINI载体能快速、高效并准确的在体外验证一些突变对真核生物mRNA剪接异常的影响。
以上实施例，仅为本发明的具体实施方式，用以说明本发明的技术方案，而非对其限制，本发明的保护范围并不局限于此，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改或可轻易想到变化，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改、变化或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 武汉翼康基因科技有限公司
<120> 一种pcMINI载体及其构建方法与应用
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 192
<212> DNA
<213> 外显子A(ExonA)
<400> 1
agtgggcttt ggggtggccg gtttgtgggt gcagtggacc ccatcatgga gaagttcaac 60
gcgtccattg cctacgaccg gcacctttgg gaggtggatg ttcaaggcag caaagcctac 120
agcaggggcc tggagaaggc agggctcctc accaaggccg agatggacca gatactccat 180
ggcctagaca ag 192
<210> 2
<211> 206
<212> DNA
<213> 内含子A(intronA)
<400> 2
gtacttgccg tggcccaagc cccacccaag gccccttccc tgtggcccca ggctcccacc 60
aaatccctga gcaaacagtg cagtgttgcc catctgtggt ttcacattga actaattata 120
tactcaagtg ctgtttaact gtgtgccttg atgactgcct ctctccatcc tttaatgacc 180
cctgtggccc acatggctca tgggta 206
<210> 3
<211> 71
<212> DNA
<213> 内含子B(intronB)
<400> 3
gaaaactgcc ctgcctgggt tgactcctct gggggtatag accgtgaccc tgggtctccc 60
ttcacctcca g 71
<210> 4
<211> 57
<212> DNA
<213> 外显子B(ExonB)
<400> 4
gagctcattg gtgcaacggc agggaagctg cacacgggac ggagccggaa tgaccag 57
<210> 5
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
acttaagctt atgagtgggc tttggggtgg ccggtt 36
<210> 6
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gctcggtacc tacccatgag ccatgtg 27
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gccgctcgag gaaaactgcc ct 22
<210> 8
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gccctctaga ctggtcattc cggctc 26
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gcttactggc ttatcgaaat t 21
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ggcaaacaac agatggctgg c 21
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gtattctgac ttgactatat c 21
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ctgtgttgtt agcttaacac ag 22
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gtaatgtatg tgggattgct atg 23
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
tccccaagca cctgtaaagt ag 22
<210> 15
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ggtaggtacc cacctcagcc tcctgagtag ctg 33
<210> 16
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
tagtggatcc cttgcagagg gcacatatga aag 33
<210> 17
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ctcccaggtt ctcagcaaga cccactcggc ag 32
<210> 18
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ctgccgagtg ggtcttgctg agaacctggg ag 32

Claims (10)

1.一种pcMINI载体，其特征在于，所述pcMINI载体是由载体pcDNA3.1+改造而成，所述pcMINI载体包含CMV增强子、PCMV启动子、多克隆位点(MCS)、外显子-内含子基因片段和BGH_PA_terminator终止子，所述多克隆位点(MCS)用于插入外显子-内含子结合处存在突变的基因片段。
2.如权利要求1所述的pcMINI载体，其特征在于，所述多克隆位点(MCS)位于所述外显子-内含子基因片段之间，并且按“外显子A-内含子A-MCS-内含子B-外显子B”顺序排列，所述内含子A带有mRNA剪切供体(donor)GT，所述内含子B带有mRNA剪切受体(acceptor)AG。
3.如权利要求2所述的pcMINI载体，其特征在于，所述外显子A的核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示；所述内含子A的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述内含子B的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；所述外显子B的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
4.权利要求1～3任一项所述的pcMINI载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、以人基因组DNA为模板，设计扩增引物，经PCR扩增获得“外显子A+内含子A”DNA片段，然后经HindIII/KpnI双酶切插入载体pcDNA3.1+多克隆位点区域，获得重组中间载体pcDNA3.1-A；
S2、以人基因组DNA为模板，设计扩增引物，经PCR扩增获得“内含子B+外显子B”DNA片段，然后经XhoI/XbaI双酶切后插入步骤S1中得到的pcDNA3.1-A载体多克隆位点区域，获得pcMINI重组载体；
S3、将步骤S2中得到的pcMINI重组载体转化至大肠杆菌DH5α感受态细菌，培养后提取重组质粒，即为pcMINI载体。
5.如权利要求4所述的pcMINI载体的构建方法，其特征在于，步骤S1中，PCR扩增“外显子A+内含子A”DNA片段的引物为pcMINI-HindIII-F和pcMINI-KpnI-R，其序列分别如SEQ IDNO:5和SEQ ID NO:6所示。
6.如权利要求4所述的pcMINI载体的构建方法，其特征在于，步骤S2中，PCR扩增“内含子B+外显子B”DNA片段的引物为pcMINI-XhoI-F和pcMINI-XbaI-R，其序列分别如SEQ IDNO:7和SEQ ID NO:8所示。
7.如权利要求4所述的pcMINI载体的构建方法，其特征在于，步骤S3中具体方法如下：将得到的pcMINI重组载体通过热激法转化至大肠杆菌DH5α感受态细菌，并通过氨苄青霉素抗性筛选获得阳性重组质粒。
8.如权利要求7所述的pcMINI载体的构建方法，其特征在于，所述抗性筛选的具体方法如下：挑取单菌落接种于含氨苄青霉素的LB液体培养基中，在37℃、200rpm的条件下培养过夜，使用商品化质粒小提试剂盒提取重组pcMINI载体质粒DNA。
9.权利要求1～3任一项所述的pcMINI载体在体外验证真核生物mRNA异常剪切中的应用。
10.如权利要求10所述的pcMINI载体在体外验证真核生物mRNA异常剪切中的应用，其特征在于，所述应用方法包括如下步骤：
S101、分别将含有突变位点的野生型DNA片段和突变型DNA片段插入pcMINI载体的多克隆位点区域，构建表达野生型和突变型基因的重组表达载体；
S102、将步骤S101中构建的野生型和突变型基因的重组表达载体转染真核细胞，转染24小时后收集细胞；
S103、提取步骤S102中收集的细胞总RNA，然后逆转录合成cDNA；
S104、以步骤S103中合成的cDNA为模板，使用引物扩增目标基因的转录产物；所述引物为pcMINI-F和pcMINI-R，其序列分别如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示；
S105、琼脂糖凝胶电泳检测野生型和突变型基因片段的转录产物，并观察上述基因片段的差异；
S106、将步骤S105中得到的野生型和突变型基因的转录产物进行sanger测序，比对测序结果，分析此突变的影响。
CN202111038155.0A 2021-09-06 2021-09-06 一种pcMINI载体及其构建方法与应用 Pending CN113736812A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111038155.0A CN113736812A (zh) 2021-09-06 2021-09-06 一种pcMINI载体及其构建方法与应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111038155.0A CN113736812A (zh) 2021-09-06 2021-09-06 一种pcMINI载体及其构建方法与应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN113736812A true CN113736812A (zh) 2021-12-03

Family

ID=78735981

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202111038155.0A Pending CN113736812A (zh) 2021-09-06 2021-09-06 一种pcMINI载体及其构建方法与应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113736812A (zh)

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1277636A (zh) * 1998-06-26 2000-12-20 维络麦德公司 不含有病毒编码序列的高效逆病毒载体
CN101633926A (zh) * 2008-12-02 2010-01-27 白海花 一种与牙本质发育不全ⅱ型相关的突变基因及其检测方法
CN103757105A (zh) * 2014-01-07 2014-04-30 山东省农业科学院奶牛研究中心 筛选乳腺炎抗性奶牛的引物、试剂盒及其应用
CN105441405A (zh) * 2014-08-28 2016-03-30 中国科学院上海生命科学研究院 Bmx剪切体及其在肺癌耐药性中的应用
CN107406852A (zh) * 2015-02-27 2017-11-28 ProQR治疗上市公司Ⅱ 用于莱伯氏先天性黑蒙的寡核苷酸疗法
CN111770933A (zh) * 2017-12-22 2020-10-13 癌症研究科技有限公司 融合蛋白

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1277636A (zh) * 1998-06-26 2000-12-20 维络麦德公司 不含有病毒编码序列的高效逆病毒载体
CN101633926A (zh) * 2008-12-02 2010-01-27 白海花 一种与牙本质发育不全ⅱ型相关的突变基因及其检测方法
CN103757105A (zh) * 2014-01-07 2014-04-30 山东省农业科学院奶牛研究中心 筛选乳腺炎抗性奶牛的引物、试剂盒及其应用
CN105441405A (zh) * 2014-08-28 2016-03-30 中国科学院上海生命科学研究院 Bmx剪切体及其在肺癌耐药性中的应用
CN107406852A (zh) * 2015-02-27 2017-11-28 ProQR治疗上市公司Ⅱ 用于莱伯氏先天性黑蒙的寡核苷酸疗法
CN111770933A (zh) * 2017-12-22 2020-10-13 癌症研究科技有限公司 融合蛋白

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Homo sapiens argininosuccinate lyase (ASL), RefSeqGene on chromosome 7", GENBANK DATABASE, pages 009288 *
"鉴定 9 个新的 RHD 基因 mRNA 可变剪接体", 遗传, vol. 28, no. 10, pages 1213 - 1218 *
CONG QIU等: "A novel TSC1 frameshift mutation c.1550_1551del causes tuberous sclerosis complex by aberrant splicing and nonsense-mediated mRNA degradation (NMD) simultaneously in a Chinese family", MOL GENET GENOMIC MED, vol. 8, no. 10, pages 2 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20210388435A1 (en) Compositions and methods for accurately identifying mutations
CN105518135B (zh) CRISPR-Cas9特异性敲除猪CMAH基因的方法及用于特异性靶向CMAH基因的sgRNA
CN103429743B (zh) 构建特异性启动子的方法
US5652128A (en) Method for producing tagged genes, transcripts, and proteins
CN109207515A (zh) 一种设计和构建猪全基因组CRISPR/Cas9敲除文库的方法
Lin et al. Structural and functional divergence of a 1-Mb duplicated region in the soybean (Glycine max) genome and comparison to an orthologous region from Phaseolus vulgaris
CN104087610B (zh) 穿梭质粒载体及其构建方法和应用
WO2019227640A1 (zh) 利用碱基编辑修复fbn1t7498c突变的试剂和方法
WO2022156378A1 (zh) 基因转录框架、载体系统、基因组序列编辑方法及应用
CN112384620A (zh) 用于筛选和鉴定功能性lncRNA的方法
CN110835635A (zh) 不同启动子启动多个串联sgRNA表达的质粒构建方法
Chen et al. Systematic evaluation of the effect of polyadenylation signal variants on the expression of disease-associated genes
De Conti et al. Complexities of 5'splice site definition: implications in clinical analyses
CN113736812A (zh) 一种pcMINI载体及其构建方法与应用
CN115927331A (zh) 一种用于促进circRNA成环和过表达的DNA框架及其构建方法和用途
US20240011055A1 (en) Precise genome deletion and replacement method based on prime editing
Papamichos et al. Adaptive evolution coupled with retrotransposon exaptation allowed for the generation of a human-protein-specific coding gene that promotes cancer cell proliferation and metastasis in both haematological malignancies and solid tumours: the extraordinary case of MYEOV gene
CN110551763B (zh) CRISPR/SlutCas9基因编辑系统及其应用
CN113817772A (zh) 一种用于验证人类基因内含子变异对基因剪接影响的质粒及其构建方法和应用
CN108753732B (zh) 一种RXRα蛋白稳定低表达的RXRα基因敲除细胞系及其制备方法
CN113151277A (zh) 鸡DF-1细胞IHH基因敲除稳定细胞株的构建方法及其特异性sgRNA
CN114317685B (zh) 用于检测mRNA可变剪切变异的试剂盒、建库方法和测序方法
CN112877360B (zh) 一种检测ires活性的环rna荧光素酶报告质粒构建方法
US20230104375A1 (en) Method for multiplexable strand-specific 3&#39; end sequencing of mrna transcriptome primer set, kit and application thereof
KR20230073600A (ko) 마이크로엑손의 고효율 엑손 정의를 함유한 엑손 아일랜드 고안과 이를 사용한 스플라이싱 제어

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20230423

Address after: 430000 E108, 5 / F, building B7, biological innovation park, No. 666, Gaoxin Avenue, Donghu New Technology Development Zone, Wuhan, Hubei

Applicant after: Wuhan Yikang Gene Technology Co.,Ltd.

Applicant after: WUHAN University

Address before: 430000 E108, 5 / F, building B7, biological innovation park, No. 666, Gaoxin Avenue, Donghu New Technology Development Zone, Wuhan, Hubei

Applicant before: Wuhan Yikang Gene Technology Co.,Ltd.

TA01 Transfer of patent application right