CN115927331A - 一种用于促进circRNA成环和过表达的DNA框架及其构建方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于促进circRNA成环和过表达的DNA框架及其构建方法和用途，所述DNA框架包含上游环化驱动序列‑目的circRNA基因序列‑下游环化驱动序列，所述上游环化驱动序列的序列如SEQ ID NO：1所示，所述下游环化驱动序列如SEQ ID NO：2所示。本发明所述的内含子侧翼互补序列是circUACA环化所必需的，并且该互补序列可以有效促进circUACA的过表达，过表达效率可高达到500倍。

Description

一种用于促进circRNA成环和过表达的DNA框架及其构建方法和用途

技术领域

本发明创造属于基因工程领域，尤其是涉及一种用于促进circRNA成环和过表达的DNA框架及其构建方法和用途。

背景技术

环状RNA(circular RNA，circRNA)是一类具有共价闭环结构的非编码RNA，具有调控生理及病理过程的重要作用。近年来，研究者利用深度RNA测序及生物信息技术，发现生物体内存在大量的circRNA。circRNA是由前体RNA通过反向剪接形成。RNA结合蛋白或者位于外显子两侧的侧翼内含子序列是circRNA环化的关键元素。circRNA是闭合的环状结构，耐受核酸外切酶RNaseR的切割，相对于线性的RNA分子，circRNA可比较稳定的存在于生物体内，具有作为疾病发生、发展的生物标志物的潜力。环状RNA具有以下生物学功能，如在细胞核内调控基因的转录和剪接；作为“sponge”海绵吸附miRNA，抑制其功能；circRNA能与蛋白质结合,调控蛋白质的活性和功能；作为翻译的模板编码蛋白质或多肽。研究表明，circRNA参与诸多生理及病理过程包括肿瘤、神经系统疾病及病毒性肝炎等。环状RNA由于其独特的构型和被日益发现的重要生物学功能，已经成为生物医学领域新的前沿和热点。

探究circRNA的分子机制及其作为生物标记物的可行性的研究，需要借助分子实验手段。在体外表达出特定的环状RNA分子，是研究circRNA分子机制的重要环节。目前还存在circRNA过表达效率低、不稳定的问题，还缺乏用于促进成环和过表达的侧翼互补序列组合和载体DNA框架，从而导致环状circRNA功能实验受阻。侧翼互补序列可以促进circRNA成环，并且合成DNA载体序列相较于合成RNA结合蛋白更便于操作。截止到目前，并未有技术提示我们提供的侧翼互补序列在促进circRNA成环和过表达中的应用，也没有技术提示由该侧翼互补序列合成的载体骨架以及构建该载体的方法。

因此，开发一种普遍适用于各种circRNA的成环，且能稳定高效地表达circRNA的侧翼互补序列及过表达载体是亟待解决的科学问题。

发明内容

有鉴于此，本发明创造旨在克服现有技术中的缺陷，提出一种用于促进circRNA成环和过表达的DNA框架及其构建方法和用途。

为达到上述目的，本发明创造的技术方案是这样实现的：

本发明的第一方面提供了一种用于促进circRNA成环和过表达的序列组合，所述序列组合包含SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

本发明的第二方面提供了一种用于促进circRNA成环和过表达的DNA框架，包含上游环化驱动序列-目的circRNA基因序列-下游环化驱动序列，所述上游环化驱动序列的序列如SEQ ID NO：1所示，所述下游环化驱动序列如SEQ ID NO：2所示。

TTTTTTTTATTTTTTTATTTTTTTGAGACAGAGTTTCGCTCTTGTTGCCCAGGCTGGTTGTGCAATGGCACAATCTTGGCTCACTGCAACCTCTGTCTCCCGGGTTCAAGCGATTCTCCTGCCTCAGCCTCCTGAGTAGCTGGGATTGCAGGAATGCACCACCACCCCTGGCTAATTTTGTATTTTTAGCAGAAACGGGGTTTCTTCATGTTGGTCAGGCTGGTCTTGGACTCCCGACCTCTGGTGATGTGCCCACCTCAGCCTCCCAAAGTACTGGGATTACAGGCGTGAGCCACTGTGCCCGGCC(SEQ ID NO：1)。

GGCTGGGCGCGGATCACTTGAGGTCAGGAGTTCAAGACCAGCCTGGCCAACATGGCGAAACCACATCTCTACCAAAAATACAAAAATTAGCTAGGTGTGGTGGTGCGTGCCTGTAATCCCAGCTACTCAGGAGGCTGAGGCAGGAGAATTCCTTGAACCCAGGAGGCGGAGGTTGCAGTGAGCTGAGATCATGCCACTGCGCTGGCAACAGAGCGAGACTCTTGTCTCAAAAAAAAAAAA(SEQ ID NO：2)。

本发明的第三方面提供了一种用于促进circRNA成环和过表达的载体，所述载体携带上述DNA框架或其互补序列。

优选地，所述载体为真核表达载体、慢病毒载体、腺病毒载体或腺相关病毒载体。

更优选地，所述载体为pcDNA3.1+载体。

本发明的第四方面提供了上述用于促进circRNA成环和过表达的载体的构建方法，所述构建方法包括将上述用于促进circRNA成环和过表达的序列组合或用于促进circRNA成环和过表达的DNA框架连入骨架载体的多克隆位点的步骤。

优选地，所述多克隆位点为HindIII5'酶切位点和EcoRI3'酶切位点。

本发明的第五方面提供了上述用于促进circRNA成环和过表达的方法，所述方法包括将上述用于促进circRNA成环和过表达的序列组合或用于促进circRNA成环和过表达的DNA框架连入骨架载体的多克隆位点的步骤。

本发明的第六方面提供了上述序列组合、DNA框架或载体在制备环状RNA过表达产品中的用途。

相对于现有技术，本发明创造具有以下优势：

本发明首次发现的内含子侧翼互补序列是circUACA环化所必需的，并且该互补序列可以有效促进circUACA的过表达，过表达效率可高达到500倍。更重要的是，本发明还首次发现该侧翼互补序列可以促进其它circRNA成环和过表达，表明该侧翼互补序列对过表达circRNA具有普适性。此外本发明还提供能过表达多种circRNA的载体骨架以及构建该载体的方法。本发明为circRNA功能和机制的研究提供了一个有力的研究工具，为进一步确定circRNA分子作为新型标志物及疾病治疗靶标的研究和开发提供理论支持。此外，该载体能过表达多种circRNA，具有重要的商用转化价值。

附图说明

图1为circUACA的成环模式图；

图2为侧翼互补序列的互补性分析；

图3为质粒构建模式图；

图4为通用型质粒载体DNA框架模式图；

图5为质粒的凝胶电泳图和测序检测图(A:质粒#1和质粒#3的凝胶电泳检测；B:质粒#1的Sanger测序检测)；

图6为circUACA表达检测图和测序检测图(A:circUACA表达检测；B:circUACA的RT-qPCR产物的Sanger测序检测)；

图7为质粒#6和质粒#7的测序检测图；

图8为质粒#8和质粒#9对circFAM126A和circMYLK的表达促进图。

具体实施方式

除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明创造所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下面结合实施例来详细说明本发明创造。

实施例1侧翼互补序列

本实施例提供一组促进circRNA成环的侧翼互补序列。根据circRNA权威数据库circBase(http://circrna.org/)收录的circRNA信息，circUACA的circRNA ID为hsa_circ_0036103，成熟circRNA序列为524nt，命名为circUACA。circUACA的成环模式图如图1所示，通过UCSC(http://genome.ucsc.edu/)在线网站分析发现circUACA基因定位于人的第15号染色体chr15:70,979,878-70,991,999(strand:-)，基因组跨越12121bp，由UACA基因第2-7号外显子环化而成。通过对UACA基因的序列进行分析，我们确定了UACA基因内的两段保守序列。

上游侧翼互补序列为：

TTTTTTTTATTTTTTTATTTTTTTGAGACAGAGTTTCGCTCTTGTTGCCCAGGCTGGTTGTGCAATGGCACAATCTTGGCTCACTGCAACCTCTGTCTCCCGGGTTCAAGCGATTCTCCTGCCTCAGCCTCCTGAGTAGCTGGGATTGCAGGAATGCACCACCACCCCTGGCTAATTTTGTATTTTTAGCAGAAACGGGGTTTCTTCATGTTGGTCAGGCTGGTCTTGGACTCCCGACCTCTGGTGATGTGCCCACCTCAGCCTCCCAAAGTACTGGGATTACAGGCGTGAGCCACTGTGCCCGGCC(SEQ ID NO：1)。

下游侧翼互补序列为：

GGCTGGGCGCGGATCACTTGAGGTCAGGAGTTCAAGACCAGCCTGGCCAACATGGCGAAACCACATCTCTACCAAAAATACAAAAATTAGCTAGGTGTGGTGGTGCGTGCCTGTAATCCCAGCTACTCAGGAGGCTGAGGCAGGAGAATTCCTTGAACCCAGGAGGCGGAGGTTGCAGTGAGCTGAGATCATGCCACTGCGCTGGCAACAGAGCGAGACTCTTGTCTCAAAAAAAAAAAA(SEQ ID NO：2)。

如图2所示，比对分析发现，该互补序列的互补性达到67.31％。

实施例2质粒的构建

质粒载体由本课题组设计，委托金唯智(苏州)公司通过基因合成方法构建。骨架质粒均为商用的pcDNA3.1(+)(Ampicillin)。circRNA过表达质粒载体DNA框架：上游侧翼互补序列+(5'KpnI酶切位点，GGTACC)目的circRNA基因序列+下游侧翼互补序列，命名为cR-pcDNA3.1(+)，其结构示意图如图4所示。具体来说，常规合成基因序列，添加5'HindIII和3'EcoRI，将上述载体DNA框架通过5'HindIII和3'EcoRI(使用重组的方法)克隆至骨架质粒pcDNA3.1(+)，上下游侧翼互补序列之间添加5'KpnI酶切位点，以便后续circRNA序列的插入组装。构建的质粒模式图如图3所示，具体如下：

质粒#1：构建通用型的circRNA过表达载体DNA框架：上游侧翼互补序列+GGTACC+下游侧翼互补序列；其中，利用酶切(5'KpnI酶切位点，GGTACC)连接的方式剪切掉GGTACC，然后将目标circRNA序列插入上下游侧翼互补序列之间即可构建circRNA过表达质粒。载体DNA框架见如下序列1：

GACGGATCGGGAGATCTCCCGATCCCCTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGTATCTGCTCCCTGCTTGTGTGTTGGAGGTCGCTGAGTAGTGCGCGAGCAAAATTTAAGCTACAACAAGGCAAGGCTTGACCGACAATTGCATGAAGAATCTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGATGTACGGGCCAGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGCGTTTAAACTTAAGCTTTTTTTTTTATTTTTTTATTTTTTTGAGACAGAGTTTCGCTCTTGTTGCCCAGGCTGGTTGTGCAATGGCACAATCTTGGCTCACTGCAACCTCTGTCTCCCGGGTTCAAGCGATTCTCCTGCCTCAGCCTCCTGAGTAGCTGGGATTGCAGGAATGCACCACCACCCCTGGCTAATTTTGTATTTTTAGCAGAAACGGGGTTTCTTCATGTTGGTCAGGCTGGTCTTGGACTCCCGACCTCTGGTGATGTGCCCACCTCAGCCTCCCAAAGTACTGGGATTACAGGCGTGAGCCACTGTGCCCGGCCGGTACCGGCTGGGCGCGGATCACTTGAGGTCAGGAGTTCAAGACCAGCCTGGCCAACATGGCGAAACCACATCTCTACCAAAAATACAAAAATTAGCTAGGTGTGGTGGTGCGTGCCTGTAATCCCAGCTACTCAGGAGGCTGAGGCAGGAGAATTCCTTGAACCCAGGAGGCGGAGGTTGCAGTGAGCTGAGATCATGCCACTGCGCTGGCAACAGAGCGAGACTCTTGTCTCAAAAAAAAAAAAGAATTCTGCAGATATCCAGCACAGTGGCGGCCGCTCGAGTCTAGAGGGCCCGTTTAAACCCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGGGGCTCTAGGGGGTATCCCCACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTAATTCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCTGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTCCCGGGAGCTTGTATATCCATTTTCGGATCTGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGCATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAGGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGCGCATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACCCATGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGGCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGAGCGGGACTCTGGGGTTCGAAATGACCGACCAAGCGACGCCCAACCTGCCATCACGAGATTTCGATTCCACCGCCGCCTTCTATGAAAGGTTGGGCTTCGGAATCGTTTTCCGGGACGCCGGCTGGATGATCCTCCAGCGCGGGGATCTCATGCTGGAGTTCTTCGCCCACCCCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGTATACCGTCGACCTCTAGCTAGAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTC(SEQ ID NO：3)

质粒#2：circUACA序列；

质粒#3：上游侧翼互补序列+circUACA序列+下游侧翼互补序列；

质粒#4：上游侧翼互补序列+circUACA序列；

质粒#5：circUACA序列+下游侧翼互补序列；

插入位点均为5'HindIII和3'EcoRI。

金唯智(苏州)公司对通用型circRNA过表达载体质粒的凝胶电泳和测序验证图片如图5所示，由图可以看出，扩增产物大小与预期相符，测序验证正确，证明质粒构建成功。对所有质粒均进行琼脂糖和测序验证，证明其构建成功。

实施例3circUACA的侧翼互补序列促进其成环和高效过表达

本课题组设计了circUACA的引物并验证其特异性。首先提取收集细胞的总RNA，然后逆转录成cDNA。设计跨circUACA剪接位点的特异性引物。序列如下：

Forward:5’-GGAGCGGATGTTAATTCCAG-3’；

Reverse:5’-CCCCCTTTTTAGCAAGGATT-3’；

扩增产物大小为132bp，将PCR产物进行琼脂糖核酸电泳，验证其条带单一性，经过Sanger DNA测序的方法，验证扩增产物中的环化位点序列，证明该引物是circUACA的特异性引物。

选用GAPDH为内参矫正基因，引物序列如下：

GAPDH-F:5’GGTGGTCTCCTCTGACTTCAACA3’

GAPDH-R:5’GTTGCTGTAGCCAAATTCGTTGT 3’

引物的扩增产物大小为127bp；

质粒转染：将25万个293T细胞接种于6孔板培养板中，24h细胞贴壁后进行转染。转染前，将125微升无血清培养基DMEM，2.5微克质粒和5微升的P300制备成混合液；将125微升无血清培养基DMEM和7.5微升lipo3000脂质体均匀混合，做成脂质体混合液；将上述两种混合液等比例混合，室温放置10min；按照转染试剂(Lipofectamine^TM 3000TransfectionReagent，Thermo Fisher Scientific，#2367427)操作说明书操作；最终6孔板中的液体终体积为2毫升，转染8小时，换成正常培养基(10％胎牛血清加90％DMEM培养基)2毫升，细胞培养条件37度，5％二氧化碳。细胞转染共分为5组，分别是空载质粒(Vector)、质粒#2、质粒#3、质粒#4、质粒#5。

提取总RNA：严格按照RNAiso Plus(TAKARA,Cat#9109)说明书操作，6孔板每孔加入1ml Trizol，用1ml枪头反复吹打10次，收集到EP管内；加入200μl氯仿，剧烈振荡15s，室温静置15min，4℃离心机10000rpm离心15min,取上清至另一个新的无酶EP管。加入0.6ml异丙醇，涡旋充分混匀，-20℃冰箱静置1小时。4℃下，12000rpm离心10min，管底为RNA沉淀，弃去上清。加入1ml 75％乙醇，用手轻轻颠倒，12000rpm离心10min，弃去上清。室温晾干，加入20μl DEPC水，用枪头吹打至RNA充分溶解，随后检测RNA浓度。

RT-qPCR：按Promega(A5001，USA)说明书，配置表一逆转录反应溶液A，置于200ul无酶EP管中。

表一：逆转录反应溶液A

将逆转录反应溶液A进行70℃、5min预变性，完成后取出置于冰上。

按照表二配置逆转录反应溶液B。

表二：逆转录反应溶液B

按以下条件进行反转录反应：退火25℃5min、延伸42℃60min、逆转录酶失活70℃15min。。将反应得到的cDNA立刻进行实验或者置于4℃保存。

实时荧光定量PCR反应。按表三配置荧光定量PCR反应体系。

表三：荧光定量PCR反应体系

反应条件为：95℃3min预变性，循环内95℃40s变性，60℃60s退火，72℃延伸1min30s，共40个循环，PCR反应循环后72℃继续延伸5min，然后16℃保存。

荧光定量PCR结果如图6所示，与转染未添加侧翼互补序列和仅添加上游或下游侧翼互补序列的质粒组相比，转染含有侧翼互补序列质粒组的circUACA明显过表达，过表达效率达到500倍，而侧翼互补序列的缺失使circUACA不能过表达。PCR产物经过纯化后做Sanger DNA序列测定，鉴定了circUACA的准确剪接位点。只有同时具备circUACA侧翼互补序列时，circUACA才能够有效成环，表明该侧翼互补序列对circUACA的成环不可或缺。说明该侧翼互补序列及构建的circUACA表达载体DNA框架可以有效促进circUACA成环和过表达。

实施例4侧翼互补序列可以促进其它circRNA成环和过表达

为验证该侧翼互补序列对促进其他circRNA的成环和过表达是否具有普适性，我们课题组利用cR-pcDNA3.1(+)载体骨架构建了以下质粒：

质粒#6：上游侧翼互补序列+序列2+下游侧翼互补序列

质粒#7：上游侧翼互补序列+序列3+下游侧翼互补序列

质粒#8：上游侧翼互补序列+circFAM126A序列+下游侧翼互补序列

质粒#9：上游侧翼互补序列+circMYLK序列+下游侧翼互补序列

序列2：

ATGACATCGACTACAAGGATGACGATGACAAGTGATGTTGATGGGACAATGACAGTGGACTGGAATGAATGGAGAGACTACTTCTTATTTAATCCTGTTACAGACATTGAGGAAATTATCCGTTTCTGGAAACATTCTACAGGAATTGACATAGGGGATAGCTTAACTATTCCAGATGAATTCACGGAAGACGAAAAAAAATCCGGACAATGGTGGAGGCAGCTTTTGGCAGGAGGCATTGCTGGTGCTGTCTCTCGAACAAGCACTGCCCCTTTGGACCGTCTGAAAATCATGATGCAGGTTCACGGTTCAAAATCAGACAAAATGAACATATTTGGTGGCTTTCGACAGATGGTAAAAGAAGGAGGTATCCGCTCGCTTTGGAGGGGAAATGGTACAAACGTCATCAAAATTGCTCCTGAGACAGCTGTTAAATTCTGGGCATATGAACAGTACAAGAAGTTACTTACTGAAGAAGGACAAAAAATAGGAACATTTGAGAGATTTATTTCTGGTTCCATGGCTGGAGCAACTGCACAGACTTTTATATATCCAATGGAGCATGACTACAAAGACCATGACGGTGATTATAAAGATC(SEQ ID NO：4)

序列3：

GACGATGACAAGTGAAGTGTTGACTGCCCAACTTAATCATGACTGTGATTCAAAAATGTTAATAAATAAACCAAGGTGTAGATCATGGGGAATTCATATGCTGGGCAACTGAAATCTGCTCGATTTGAGGAAGCTCTCCACAACTCCATAGAAGCCTCCCTCAGATGTAGTAGTGTGGTACCACGGCCAATTTTTTCCCAGCTATACCTGGACCCTGACCAGCATCCTTTCTCATCTGCAGATGTCAAACCCAAGGTGGAGGATCTGGACAAAGATTTGGTAAACCGCTACACTCAAAATGGAAGTCTGGATTTTTCTAACAATCTAACAGTTAATGAAATGGAAGATGATGAAGACGATGAAGAAATGTCTGATTCAAACAGCCCACCAATTCCCTATTCACAAAAACCTGCCCCAGAAGGATCTTGCACTACAGATGGTTTTTGTCAAGCAGGAAAGGATTTGCGTTTGGTATCACTGTGTATGGAACAAATTGACATCCCAGCAGGATTCCTCCTGGTGGGGGCCAAGTCTCCCAATCTGCCTGAACACATCCTAGTTTGTGCTGTGGACAAGCGATTTCTACCAGATGATCATGGAAAAAATGCACTTTTAGGGTTTTCTGGAAATTGTATCGGCTGTGGAGAAAGAGGATTTCGATATTTCACGGAATTTTCCAACCACATTAACTTGAAGCTCACCACTCAGCCAAAGAAGCAGAAGCACTTAAAGTACTACCTAGTCAGAAGCTCCCAGGGTGTACTGTCTAAAGGACCTCTTATCTGCTGGAAAGAATGTAGAAGCCGACAATCCTCTGCTTCTTGCCACTCTATTAAGCCAAGCTCTTCAGTGTCGTCAACTGTGACCCCAGAAAATGGGACAACTAATGGATACAAATCAGGATTCACTCAGACAGGTGCACAAAAAGCTTTAAACAAGTTAAAATCTAGGCAACAGACTCCCGATTACAAGGAC(SEQID NO：5)

按照实施例3方法转染质粒，提取RNA进行RT-qPCR，并将PCR产物经过纯化后做Sanger DNA序列测定。通过Sanger DNA测序的方法鉴定了circRNA的准确剪接位点。如图7和图8所示，实验证实，该侧翼互补序列及构建的DNA框架可以有效的促进其他circRNA的成环和过表达。表明该侧翼互补序列及构建的DNA框架对其他circRNA成环作用和过表达具有普适性的特点。

以上所述仅为本发明创造的较佳实施例而已，并不用以限制本发明创造，凡在本发明创造的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明创造的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种用于促进circRNA成环和过表达的序列组合，其特征在于：所述序列组合包含SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

2.一种用于促进circRNA成环和过表达的DNA框架，其特征在于：所述DNA框架包含上游环化驱动序列-目的circRNA基因序列-下游环化驱动序列，所述上游环化驱动序列的序列如SEQ ID NO：1所示，所述下游环化驱动序列如SEQ ID NO：2所示。

3.一种用于促进circRNA成环和过表达的载体，所述载体携带权利要求2所述的DNA框架或其互补序列。

4.根据权利要求3所述的载体，其特征在于：所述载体为真核表达载体、慢病毒载体、腺病毒载体或腺相关病毒载体。

5.根据权利要求3所述的载体，其特征在于：所述载体为pcDNA3.1+载体。

6.用于促进circRNA成环和过表达的载体的构建方法，其特征在于：所述构建方法包括将权利要求1所述的用于促进circRNA成环和过表达的序列组合或权利要求2所述的用于促进circRNA成环和过表达的DNA框架连入骨架载体的多克隆位点的步骤。

7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于：所述多克隆位点为HindIII5'酶切位点和EcoRI3'酶切位点。

8.用于促进circRNA成环和过表达的方法，所述方法包括将权利要求1所述的用于促进circRNA成环和过表达的序列组合或权利要求2所述的用于促进circRNA成环和过表达的序列组合或用于促进circRNA成环和过表达的DNA框架连入骨架载体的多克隆位点的步骤。

9.权利要求1所述的序列组合、权利要求2所述的DNA框架或权利要求3-5任一所述的载体在制备环状RNA过表达产品中的用途。

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