CN116426573A - 重编程因子抗衰老表达系统、生物材料及用途 - Google Patents
重编程因子抗衰老表达系统、生物材料及用途 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116426573A CN116426573A CN202310401321.1A CN202310401321A CN116426573A CN 116426573 A CN116426573 A CN 116426573A CN 202310401321 A CN202310401321 A CN 202310401321A CN 116426573 A CN116426573 A CN 116426573A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- transcription factor
- nucleic acid
- acid molecule
- encoding
- molecule encoding
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title claims abstract description 58
- 230000008672 reprogramming Effects 0.000 title claims abstract description 47
- 230000003712 anti-aging effect Effects 0.000 title claims abstract description 30
- 239000012620 biological material Substances 0.000 title claims abstract description 14
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 claims abstract description 92
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 claims abstract description 92
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 79
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 79
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 79
- 102000002584 Octamer Transcription Factor-3 Human genes 0.000 claims abstract description 44
- 108010068425 Octamer Transcription Factor-3 Proteins 0.000 claims abstract description 44
- 102000005635 SOXB1 Transcription Factors Human genes 0.000 claims abstract description 42
- 108010045179 SOXB1 Transcription Factors Proteins 0.000 claims abstract description 42
- 101150111214 lin-28 gene Proteins 0.000 claims abstract description 37
- 108700021430 Kruppel-Like Factor 4 Proteins 0.000 claims abstract description 34
- 101150037203 Sox2 gene Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 120
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 claims description 28
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 23
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 16
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 15
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 14
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 claims description 14
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 7
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 claims description 6
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 101150108076 lin28a gene Proteins 0.000 claims description 6
- 108010042634 F2A4-K-NS peptide Proteins 0.000 claims description 5
- 101800001494 Protease 2A Proteins 0.000 claims description 5
- 101800001066 Protein 2A Proteins 0.000 claims description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 5
- XBCXJKGHPABGSD-UHFFFAOYSA-N 1-methyluracil Chemical compound CN1C=CC(=O)NC1=O XBCXJKGHPABGSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 4
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 claims description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 3
- -1 pseudouracil Chemical compound 0.000 claims description 3
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 claims description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000008816 organ damage Effects 0.000 claims description 2
- 102200157658 rs1555229948 Human genes 0.000 claims 1
- 230000001973 epigenetic effect Effects 0.000 abstract description 20
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 abstract description 11
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 abstract description 11
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 abstract description 5
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 abstract description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 5
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 abstract description 4
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 abstract description 4
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 abstract description 4
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 abstract description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 54
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 45
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 43
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 25
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 23
- 108010026228 mRNA guanylyltransferase Proteins 0.000 description 12
- 210000002503 granulosa cell Anatomy 0.000 description 11
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 10
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 10
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 10
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- 229960003722 doxycycline Drugs 0.000 description 9
- XQTWDDCIUJNLTR-CVHRZJFOSA-N doxycycline monohydrate Chemical compound O.O=C1C2=C(O)C=CC=C2[C@H](C)[C@@H]2C1=C(O)[C@]1(O)C(=O)C(C(N)=O)=C(O)[C@@H](N(C)C)[C@@H]1[C@H]2O XQTWDDCIUJNLTR-CVHRZJFOSA-N 0.000 description 9
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 210000001612 chondrocyte Anatomy 0.000 description 8
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 8
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 7
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 6
- 241000710929 Alphavirus Species 0.000 description 6
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M Bisulfite Chemical compound OS([O-])=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 6
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 6
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 6
- 238000001369 bisulfite sequencing Methods 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 6
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 5
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 5
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 5
- RYVNIFSIEDRLSJ-UHFFFAOYSA-N 5-(hydroxymethyl)cytosine Chemical compound NC=1NC(=O)N=CC=1CO RYVNIFSIEDRLSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 4
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 4
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 4
- 102100038313 Transcription factor E2-alpha Human genes 0.000 description 4
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 4
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 4
- 238000013461 design Methods 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 238000000034 method Methods 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 229910052754 neon Inorganic materials 0.000 description 4
- GKAOGPIIYCISHV-UHFFFAOYSA-N neon atom Chemical compound [Ne] GKAOGPIIYCISHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 241001164825 Adeno-associated virus - 8 Species 0.000 description 3
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 3
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 3
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101800000980 Protease nsP2 Proteins 0.000 description 3
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 3
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 3
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 3
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 3
- UVBYMVOUBXYSFV-XUTVFYLZSA-N 1-methylpseudouridine Chemical compound O=C1NC(=O)N(C)C=C1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 UVBYMVOUBXYSFV-XUTVFYLZSA-N 0.000 description 2
- 108020005345 3' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 2
- 108020003589 5' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 2
- LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 5-methylcytosine Chemical compound CC1=CNC(=O)N=C1N LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N Mytomycin Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(N)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N 0.000 description 2
- 101710126211 POU domain, class 5, transcription factor 1 Proteins 0.000 description 2
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 2
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000012165 high-throughput sequencing Methods 0.000 description 2
- 210000004263 induced pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 201000008482 osteoarthritis Diseases 0.000 description 2
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 2
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 2
- 238000012372 quality testing Methods 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 231100000027 toxicology Toxicity 0.000 description 2
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 108091029430 CpG site Proteins 0.000 description 1
- 101100239628 Danio rerio myca gene Proteins 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 102100038895 Myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 description 1
- 101710135898 Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 description 1
- 101800000515 Non-structural protein 3 Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 208000001132 Osteoporosis Diseases 0.000 description 1
- 208000002500 Primary Ovarian Insufficiency Diseases 0.000 description 1
- 101800001758 RNA-directed RNA polymerase nsP4 Proteins 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710150448 Transcriptional regulator Myc Proteins 0.000 description 1
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 1
- 210000003321 cartilage cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 102000038379 digestive enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108091007734 digestive enzymes Proteins 0.000 description 1
- 238000000635 electron micrograph Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000002431 foraging effect Effects 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 210000002064 heart cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 229960004857 mitomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000007781 pre-processing Methods 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 206010036601 premature menopause Diseases 0.000 description 1
- 208000017942 premature ovarian failure 1 Diseases 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000009758 senescence Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 210000004927 skin cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 230000002381 testicular Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
- A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
- A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P39/00—General protective or antinoxious agents
- A61P39/06—Free radical scavengers or antioxidants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
- C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/14011—Parvoviridae
- C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
- C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Marine Sciences & Fisheries (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Virology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本申请实施例提供的重编程因子抗衰老表达系统、生物材料及用途,包括编码Oct4转录因子的核酸分子、编码Sox2转录因子的核酸分子、编码Klf4转录因子的核酸分子、编码Glis1转录因子的核酸分子以及编码Lin28转录因子的核酸分子;通过上述方式,形成的OSKGL体系(Oct4、Sox2、Klf4、Glis1及Lin28)具有较好的表观遗传学重编程效果,能够推动皮肤、软骨、心脏、卵巢、睾丸及肾脏细胞启动表观遗传学重编程,并且,不会产生细胞毒性。
Description
技术领域
本申请涉及生物医药技术领域,尤其涉及一种重编程因子抗衰老表达系统、生物材料及用途。
背景技术
表观遗传学的信息丢失是衰老发生、发展和转归的主要驱动力量之一,研究证明细胞中的重编程因子可以通过表观遗传学重编程,恢复丢失的表观遗传信息,从而部分逆转皮肤、心脏、肾脏、大脑、骨质疏松、卵巢以及睾丸等器官衰老,提高器官损伤修复的能力,延长实验动物寿命,是生物学的重大概念突破。
背景技术中,体内、体外瞬时表达维持多潜能转录因子可以通过表观遗传学部分重编程,恢复丢失的表观遗传信息,从而延长实验动物寿命。但是,背景技术中瞬时表达维持多潜能转录因子还存在细胞毒性问题以及无法推动心脏或软骨细胞启动表观遗传学重编程的问题。
发明内容
鉴于以上问题,本申请实施例提供一种重编程因子抗衰老表达系统、生物材料及用途,以解决上述技术问题。
第一方面,本申请实施例提供一种重编程因子抗衰老表达系统,所述表达系统包括编码Oct4转录因子的核酸分子、编码Sox2转录因子的核酸分子、编码Klf4转录因子的核酸分子、编码Glis1转录因子的核酸分子以及编码Lin28转录因子的核酸分子。
可选地,所述表达系统为具有嘌呤霉素抗性的重组载体。
可选地,所述重组载体包括依次连接的编码Oct4转录因子的核酸分子、编码P2A肽的核酸分子、编码Glis1转录因子的核酸分子、编码F2A肽的核酸分子、编码Klf4转录因子的核酸分子、编码T2A肽的核酸分子、编码Lin28转录因子的核酸分子、编码E2A肽的核酸分子以及编码Sox2转录因子的核酸分子。
可选地,所述重组载体包括piggybac转座子。
可选地,所述重组载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
可选地,所述表达系统为腺相关病毒表达载体或慢病毒表达载体。
可选地,所述表达系统包括含有表达盒,所述表达盒含有编码Oct4转录因子的核酸分子、编码Sox2转录因子的核酸分子、编码Klf4转录因子的核酸分子、编码Glis1转录因子的核酸分子以及编码Lin28转录因子的核酸分子。
可选地,所述表达系统包括编码Oct4转录因子的mRNA、编码Sox2转录因子的mRNA、编码Klf4转录因子的mRNA、编码Glis1转录因子的mRNA以及编码Lin28转录因子的mRNA;所述编码Oct4转录因子的mRNA、所述编码Sox2转录因子的mRNA、所述编码Klf4转录因子的mRNA、所述编码Glis1转录因子的mRNA以及所述编码Lin28转录因子的mRNA中部分或全部的核苷酸进行了能够提高所述mRNA在生物体内稳定性的化学修饰;所述编码Oct4转录因子的mRNA的摩尔量与所述编码Sox2转录因子的mRNA、所述编码Klf4转录因子的mRNA、所述编码Glis1转录因子的mRNA以及所述编码Lin28转录因子的mRNA的摩尔量之和的比例为1~8:1。
可选地,所述化学修饰包括利用N1-甲基假尿苷、假尿嘧啶或甲基尿嘧啶置换所述编码Oct4转录因子的mRNA、所述编码Sox2转录因子的mRNA、所述编码Klf4转录因子的mRNA、所述编码Glis1转录因子的mRNA以及所述编码Lin28转录因子的mRNA中的100%的尿嘧啶以及利用5-甲基胞嘧啶或5-羟甲基胞嘧啶置换所述编码Oct4转录因子的mRNA、所述编码Sox2转录因子的mRNA、所述编码Klf4转录因子的mRNA、所述编码Glis1转录因子的mRNA以及所述编码Lin28转录因子的mRNA中的100%的胞嘧啶。
第二方面,本申请实施例提供一种生物材料,所述生物材料为包括上述的重编程因子抗衰老表达系统的宿主细胞。
第三方面,本申请实施例提供一种上述的重编程因子抗衰老表达系统或上述的生物材料在制备细胞重编辑试剂中的用途、在制备器官损伤后修复剂中的用途或在制备抗衰老药物中的用途。
本申请实施例提供的重编程因子抗衰老表达系统、生物材料及用途,包括编码Oct4转录因子的核酸分子、编码Sox2转录因子的核酸分子、编码Klf4转录因子的核酸分子、编码Glis1转录因子的核酸分子以及编码Lin28转录因子的核酸分子;通过上述方式,形成的OSKGL体系(Oct4、Sox2、Klf4、Glis1及Lin28)具有较好的表观遗传学重编程效果,能够推动皮肤、软骨、心脏、卵巢、睾丸及肾脏细胞启动表观遗传学重编程,并且,不会产生细胞毒性。
本申请的这些方面或其他方面在以下实施例的描述中会更加简明易懂。
附图说明
图1示出了本申请实施例提供的重编程因子抗衰老表达系统的结构示意图。
图2示出了本申请应用例1中转染后的人成纤维细胞的电镜图。
图3示出了本申请应用例2、对比例1和对比例2的结果对比图。
图4示出了本申请应用例3、对比例5和对比例6的结果对比图。
具体实施方式
下面将结合本申请实施例中的附图,对发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅是本申请的一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本申请保护的范围。
在本文中提及“实施例”意味着,结合实施例描述的特定特征、结构或特性可以包含在本申请的至少一个实施例中。在说明书中的各个位置出现该短语并不一定均是指相同的实施例,也不是与其它实施例互斥的独立的或备选的实施例。本领域技术人员显式地和隐式地理解的是,本文所描述的实施例可以与其它实施例相结合。
下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
本申请一实施例提供了一种重编程因子抗衰老表达系统,该表达系统包括编码Oct4转录因子的核酸分子、编码Sox2转录因子的核酸分子、编码Klf4转录因子的核酸分子、编码Glis1转录因子的核酸分子以及编码Lin28转录因子的核酸分子。
在本实施例中,形成的OSKGL体系(Oct4、Sox2、Klf4、Glis1及Lin28)具有较好的表观遗传学重编程效果,能够推动皮肤、软骨、心脏、卵巢、睾丸及肾脏细胞启动表观遗传学重编程,并且,不会产生细胞毒性。
作为一种实施方式,上述的各核酸分子可以为DNA。该表达系统包括编码Oct4转录因子的DNA核酸分子、编码Sox2转录因子的DNA核酸分子、编码Klf4转录因子的DNA核酸分子、编码Glis1转录因子的DNA核酸分子以及编码Lin28转录因子的DNA核酸分子。
作为一种实施方式,上述的各核酸分子可以为RNA。该表达系统包括编码Oct4转录因子的RNA核酸分子、编码Sox2转录因子的RNA核酸分子、编码Klf4转录因子的RNA核酸分子、编码Glis1转录因子的RNA核酸分子以及编码Lin28转录因子的RNA核酸分子。
作为一种实施方式,表达系统可以为表达盒。在本实施方式中,该表达盒含有编码Oct4转录因子的核酸分子、编码Sox2转录因子的核酸分子、编码Klf4转录因子的核酸分子、编码Glis1转录因子的核酸分子以及编码Lin28转录因子的核酸分子。
作为一种实施方式,表达系统可以为腺相关病毒表达载体或慢病毒表达载体。
作为一种实施方式,表达系统可以为重组载体。
在一些实施方式中,表达系统为具有嘌呤霉素抗性的重组载体。
在一些实施方式中,该重组载体包括依次连接的编码Oct4转录因子的核酸分子、编码P2A肽的核酸分子、编码Glis1转录因子的核酸分子、编码F2A肽的核酸分子、编码Klf4转录因子的核酸分子、编码T2A肽的核酸分子、编码Lin28转录因子的核酸分子、编码E2A肽的核酸分子以及编码Sox2转录因子的核酸分子。其中,P2A肽,T2A肽,E2A肽和F2A肽分别为2A肽,具体地,2A肽是来源于病毒的短肽(一般18~25个氨基酸),它们通常被称为“自我剪切”肽,能使一条转录产物产生多种蛋白。2A肽并不是完全的“自我剪切”,而是通过使核糖体跳过2A元件C-末端的甘氨酸和脯氨酸肽键的合成而发挥作用,最终导致2A序列末端和下游产物分离。其中,上游蛋白的C端将会添加一些额外的2A残基,而下游蛋白的N端将会有额外的脯氨酸。P2A肽,T2A肽,E2A肽和F2A肽分别来源于四种不同的病毒。
在一些实施方式中,该重组载体为强力霉素诱导转座子,例如,该重组载体可以为对piggybac转座子进行优化得到。
在一些实施方式中,该重组载体的结构参见图1所示,该重组载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,该重组载体可以为重组质粒。
在本实施方式中,重组载体可以按Gibson方法进行构建,用Gibson酶进行连接形成图1所示目标载体序列,该目标载体序列的特点为本身带有嘌呤霉素抗性,在强力霉素的诱导下能够同时表达Oct4转录因子,Sox2转录因子,Klf4转录因子,Glis1转录因子和lin28转录因子。
作为一种实施方式,所述表达系统包括编码Oct4转录因子的mRNA、编码Sox2转录因子的mRNA、编码Klf4转录因子的mRNA、编码Glis1转录因子的mRNA以及编码Lin28转录因子的mRNA;所述编码Oct4转录因子的mRNA、所述编码Sox2转录因子的mRNA、所述编码Klf4转录因子的mRNA、所述编码Glis1转录因子的mRNA以及所述编码Lin28转录因子的mRNA中部分或全部的核苷酸进行了能够提高所述mRNA在生物体内稳定性的化学修饰;所述编码Oct4转录因子的mRNA的摩尔量与所述编码Sox2转录因子的mRNA、所述编码Klf4转录因子的mRNA、所述编码Glis1转录因子的mRNA以及所述编码Lin28转录因子的mRNA的摩尔量之和的比例为1~8:1。
在一些实施方式中,所述化学修饰包括利用N1-甲基假尿苷、假尿嘧啶或甲基尿嘧啶置换所述编码Oct4转录因子的mRNA、所述编码Sox2转录因子的mRNA、所述编码Klf4转录因子的mRNA、所述编码Glis1转录因子的mRNA以及所述编码Lin28转录因子的mRNA中的100%的尿嘧啶以及利用5-甲基胞嘧啶或5-羟甲基胞嘧啶置换所述编码Oct4转录因子的mRNA、所述编码Sox2转录因子的mRNA、所述编码Klf4转录因子的mRNA、所述编码Glis1转录因子的mRNA以及所述编码Lin28转录因子的mRNA中的100%的胞嘧啶。
在一些实施方式中,本实施例的重编程因子抗衰老表达系统还包括:第三mRNA,第三mRNA编码RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp),其中,所述第三mRNA的摩尔量为编码Oct4转录因子的mRNA、编码Sox2转录因子的mRNA、编码Klf4转录因子的mRNA、编码Glis1转录因子的mRNA以及编码Lin28转录因子的mRNA的摩尔量之和的1~8倍。
在本实施方式中,可以通过第三mRNA编码的RNA依赖性RNA聚合酶实现上述各转录因子的复制。
在一些实施方式中,第三mRNA编码的RNA依赖性RNA聚合酶为甲病毒属突变型复制酶,所述突变型复制酶产生nsP2区域的第259位的突变以及nsP2区域的第650位的突变。具体地,所述突变型复制酶包括依次连接的nsP1区域(537个氨基酸)、nsP2区域(799个氨基酸)、nsP3区域(482个氨基酸)以及nsP4区域(1254个氨基酸),所述突变型复制酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示,所述突变型复制酶的两个突变点分别产生在SEQ ID NO.2所示的796位点(丝氨酸S突变为脯氨酸P)以及在SEQ ID NO.2所示的1187位点(精氨酸R突变为天冬氨酸D)。
在本实施方式中,通过对甲病毒属复制酶产生特异性的突变,降低甲病毒属复制酶的活性,可以通过第三mRNA编码的RNA依赖性RNA聚合酶实现各转录因子的有限自我复制,避免产生细胞毒性。
本申请一实施例提供了一种生物材料,该生物材料为包括上述的重编程因子抗衰老表达系统的宿主细胞。
作为一种实施方式,该宿主细胞可以为皮肤细胞、软骨细胞、心脏细胞、卵巢细胞、睾丸细胞或肾脏细胞中的一种,该表达系统可以实现部分逆转宿主细胞衰老。
本申请一实施例提供了上述的重编程因子抗衰老表达系统或上述的生物材料在制备细胞重编辑试剂中的用途、在制备器官损伤后修复剂中的用途或在制备抗衰老药物中的用途。
实施例1:目标质粒的制备
在本实施例中,该重组载体为目标质粒,该目标质粒为强力霉素诱导转座子型质粒;制备出的目标质粒具有嘌呤霉素抗性,在强力霉素的诱导下能够同时表达转录因子Oct4转录因子,Sox2转录因子,Klf4转录因子,Glis1转录因子和lin28转录因子。该目标质粒可以按照如下步骤制备:
S11,获得目标DNA片段:可以从质粒产物或其他来源中获取目标DNA片段序列,即按照图1所示和具体序列分解为不同DNA序列,直接从商业公司订购(例如IDT公司)。
S12,设计引物:为目标DNA片段设计引物,引物的末端需要加入与目标质粒相匹配的序列,引物长度一般为30~40bp。
S13,PCR扩增:使用设计好的引物进行PCR扩增目标DNA片段,PCR条件根据目标DNA片段大小和引物设计进行调整。
S14,纯化PCR产物:使用商业PCR纯化试剂盒对PCR产物进行纯化,去除其他组分。
S15,测量DNA浓度:使用Nanodrop等工具测量PCR产物的DNA浓度。
S16,质粒线性化:将空目标质粒进行限制性酶切,使其线性化。
S17,加入Gibson同源重组酶:将包含线性的空目标质粒以及各目标DNA片段的混合物加入同源重组酶,同源重组酶可以自动将各目标DNA片段在体外重组成完整质粒。
S18,反应条件:Gibson组装反应酶反应温度为50℃,反应时间为1~2小时。
S19,转化态细胞:将Gibson组装的反应产物转化到适当的细胞中,如大肠杆菌等,进行培养。
S110,筛选阳性克隆:将转化后的菌落进行筛选,找出含有目标质粒的阳性克隆。
在本实施方式中,该目标质粒即为图1所示重组载体,该目标质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
实施例2:目标腺病毒表达载体的制备
制备编码Oct4转录因子、Sox2转录因子、Klf4转录因子、Glis1转录因子以及Lin28转录因子的AAV(adeno-associated virus,腺病毒相关)病毒载体,作为目标腺病毒表达载体。
实施例3:目标mRNA表达系统的制备
制备目标mRNA表达系统
在本实施例中,目标mRNA表达系统包括编码Oct4转录因子的第一mRNA、编码Sox2转录因子的第二mRNA、编码Klf4转录因子的第二mRNA、编码Lin28转录因子的第二mRNA、编码Glis1转录因子的第二mRNA以及编码甲病毒属突变型复制酶的第三mRNA。
其中,五种第二mRNA的摩尔量相同,第一mRNA的摩尔量与五种第二mRNA的摩尔量和之比为2~6。
其中,第三mRNA的摩尔量为编码Oct4转录因子的mRNA、编码Sox2转录因子的mRNA、编码Klf4转录因子的mRNA、编码Glis1转录因子的mRNA以及编码Lin28转录因子的mRNA的摩尔量之和的1~8倍。
第一mRNA按照5’→3’方向依次包括如下元件:5’UTR序列、信号肽序列、Oct4转录因子编码序列和3’UTR序列;各第二mRNA按照5’→3’方向依次包括如下元件:5’UTR序列、目标重编程因子编码序列和3’UTR序列,每个第二mRNA还包括信号肽序列。
第三mRNA可以按照如下步骤进行制备:
i.引物设计:DNA模板构建的第一步是设计引物。引物应该包含一个启动子、转录起始位点和T7RNA聚合酶结合序列。这些引物的设计需要考虑以下因素:启动子:启动子应位于DNA模板的5'端,并且能够被RNA聚合酶识别和结合。
ii.转录起始位点:转录起始位点是RNA聚合酶开始转录的位置,它位于启动子的下游,通常是20-30个碱基的长度。
iii.T7聚合酶结合序列即5’或者3’非翻译区(UTR):T7 RNA聚合酶结合序列是RNA聚合酶结合并开始转录的位置。这个序列通常位于转录起始位点的下游,长度为20-30个碱基。
iv.PCR扩增:使用设计好的引物进行PCR扩增。PCR反应中应包含所需的模板DNA、引物、聚合酶和核苷酸。PCR反应条件根据引物和模板DNA的特性进行优化。
v.PCR产物纯化:将PCR产物用于琼脂糖凝胶电泳或其他方法进行分离和纯化。此步骤可以去除PCR反应中的杂质和未扩增的DNA。
vi.突变型mRNA复制酶mRNA体外合成:将线性扩增的DNA模板用于体外转录反应,使用T7 RNA聚合酶。
vii.去除DNA:通过DNase等酶去除反应混合物中的DNA,以避免其干扰下游应用。
viii.纯化mRNA:使用HPLC纯化方法纯化mRNA。
应用例1:实施例1的目标质粒转染人成纤维细胞实验
第一阶段I:使用赛默飞NeonTM转染系统完成上述目标质粒转染人成纤维细胞
1.细胞培养:选择需要转染的细胞系,并在合适的培养条件下培养,使其在转染前达到合适的生长状态。
2.质粒DNA准备:将需要转染的目标质粒用无菌PBS缓冲液溶解,并在室温下保存。
3.细胞收集:用适当的方式将细胞收集到离心管中。例如,使用消化酶将细胞从培养板中解离,收集后使用无菌PBS缓冲液洗涤一次,去除细胞中的酶。
4.细胞计数:使用显微镜和细胞计数板对细胞进行计数,以确定转染所需的细胞数量。
5.细胞沉淀:将细胞沉淀在离心管底部,去除PBS缓冲液,加入适量的无菌PBS缓冲液使细胞悬浮。
6.转染参数设置:打开NeonTM转染系统软件,在菜单中选择转染参数,按照细胞成纤维细胞类型和所需转染的DNA数量设置转染参数。
7.转染:将细胞和质粒DNA混合,按照转染参数在NeonTM转染系统上进行电转染。将转染混合物转移至预先准备好的电转染管中,使用NeonTM转染系统进行电转染。
8.细胞恢复:将电转染管放回到含有细胞培养基的培养皿中,并在37℃的CO2培养箱中培养所需时间。细胞将在几小时到几天之间开始表达转染的基因。
9.细胞培养:稳定转染的细胞系在适宜的培养条件下培养至80%到90%的密度。
10.嘌呤霉素处理:将嘌呤霉素溶液加入培养基中,使其最终浓度达到适当的浓度,一般为0.5~5μg/ml。
11.细胞处理:将细胞移至含有嘌呤霉素的培养基中,使其与嘌呤霉素充分接触,以便未转染质粒的细胞被选择性地杀死。
12.细胞培养:将处理后的细胞放回培养箱中,继续在适宜的培养条件下培养。嘌呤霉素处理后的细胞将逐渐死亡,而转染了质粒的细胞则能够继续存活并生长。
第二阶段II:强力霉素诱导完成细胞重编程:
上述嘌呤霉素抵抗细胞形成后,取适量细胞置于丝裂霉素C处理小鼠胚胎纤维细胞(MEF)为饲养细胞的人多潜能干细胞培养液(15%KOSR+DMEF/F12+10ng/mlbFGF)中,培养7~21天,每天换液,直到出现典型人多潜能干细胞克隆。例如,可以培养7~10天、14~21天或7~21天。
实验结果:实施例1制备的目标质粒在人成纤维细胞中形成Oct4转录因子,Sox2转录因子,Klf4转录因子,Glis1转录因子和lin28转录因子,强力霉素诱导7~21天,成功形成诱导性多潜能干细胞(iPS),如图2所示。
应用例2:实施例1的目标质粒转染人软骨细胞实验
第一阶段I:将上述目标质粒用电穿孔法转染致人软骨细胞(采用骨关节人软骨原代细胞,购自Promocell公司,货号C-12710),并用Puromycin 1mg/ml选择三天后,加入强力霉素7~10天后,提取细胞DNA,全基因组亚硫酸氢盐测序(Whole-Genome BisulfiteSequencing,WGBS)。
第二阶段II:WGBS将亚硫酸氢盐(bisulfite)化学处理DNA,之后通过PCR扩增和测序,可以获得甲基化和未甲基化的C的信息。以下是WGBS的详细步骤:
1.亚硫酸氢盐处理:将DNA加入含有亚硫酸氢盐的反应体系中,反应体系中的亚硫酸氢盐会将未甲基化的C转化为U,甲基化的C则不受影响。这个步骤会破坏DNA的完整性,需要在此后的步骤中对DNA进行修复和纯化。
2.端粘修复和A尾化:将DNA片段的5'端和3'端进行修复和A尾化,以便于在下一步骤中进行接头连接。
3.接头连接:将DNA片段连接到测序接头上,接头中包含序列标记和定向序列,用于后续的测序。
4.PCR扩增:对接头连接后的DNA进行PCR扩增,扩增得到的片段即为待测DNA的亚硫酸氢盐处理后的DNA。
5.纯化和质检:对PCR扩增产物进行纯化和质检,确认扩增产物的大小和浓度。
6.高通量测序:将PCR扩增产物进行高通量测序,使用Illumina高通量测序仪。测序得到的数据包含了基因组中所有的C位点,以及它们的甲基化状态。
7.数据分析:使用生物信息学工具对测序得到的数据进行分析,包括去除接头序列、质量控制、比对到基因组、甲基化位点的识别和注释等步骤。最终可以获得基因组DNA中所有C位点的甲基化状态信息。
对比例1
制备OSK质粒:
OSK质粒与实施例1的目标质粒的区别在于:OSK质粒包括编码Oct4转录因子的核酸分子、编码Sox2转录因子的核酸分子以及编码Klf4转录因子的核酸分子,OSK质粒不包括编码Glis1转录因子的核酸分子以及编码Lin28转录因子的核酸分子,OSK质粒的其他部分与目标质粒相同,OSK质粒能够同时表达Oct4转录因子,Sox2转录因子,Klf4转录因子。
OSK质粒转染人软骨细胞:
第一阶段I:将上述OSK质粒用电穿孔法转染致人软骨细胞(采用骨关节人软骨原代细胞,购自Promocell公司,货号C-12710),并用Puromycin 1mg/ml选择三天后,加入强力霉素7~10天后,提取细胞DNA,全基因组亚硫酸氢盐测序(Whole-Genome BisulfiteSequencing,WGBS)。
第二阶段II:WGBS将亚硫酸氢盐(bisulfite)化学处理DNA,之后通过PCR扩增和测序,可以获得甲基化和未甲基化的C的信息。第二阶段II具体参见应用例1所述,在此不进行一一赘述。
对比例2
制备空质粒:
空质粒与实施例1的目标质粒的区别在于:空质粒不包括编码Oct4转录因子的核酸分子、编码Sox2转录因子的核酸分子、编码Klf4转录因子的核酸分子、编码Glis1转录因子的核酸分子以及编码Lin28转录因子的核酸分子,空质粒无法形成上述任何转录因子,空质粒的其他部分与目标质粒相同。
空质粒转染人软骨细胞:
第一阶段I:将上述空质粒用电穿孔法转染致人软骨细胞(采用骨关节人软骨原代细胞,购自Promocell公司,货号C-12710),并用Puromycin 1mg/ml选择三天后,加入强力霉素7~10天后,提取细胞DNA,全基因组亚硫酸氢盐测序(Whole-Genome BisulfiteSequencing,WGBS)。
第二阶段II:WGBS将亚硫酸氢盐(bisulfite)化学处理DNA,之后通过PCR扩增和测序,可以获得甲基化和未甲基化的C的信息。第二阶段II具体参见应用例1所述,在此不进行一一赘述。
应用例1、对比例1及对比例2实验结果:
请参阅图3所示,实施例1制备的目标质粒在人软骨细胞中形成Oct4转录因子,Sox2转录因子,Klf4转录因子,Glis1转录因子和lin28转录因子,强力霉素诱导7~10天,明显增加软骨甲基化CpG位点数,降低软骨表观遗传学年龄,增强其损伤修复的能力,从而防治骨关节炎,相比之下对比例1中3个编码细胞多潜能Oct4转录因子,Sox2转录因子,Klf4转录因子对软骨表观遗传学年龄没有逆转;对比例2无法形成上述转录因子,对软骨表观遗传学年龄亦没有逆转。
对比例3:OSKM腺病毒表达载体的制备
制备编码Oct4转录因子、Sox2转录因子、Klf4转录因子以及c-Myc转录因子的AAV(adeno-associated virus,腺病毒相关)病毒载体,作为OSKM。
对比例4:OSK腺病毒表达载体的制备
制备编码Oct4转录因子、Sox2转录因子以及Klf4转录因子的AAV(adeno-associated virus,腺病毒相关)病毒载体,作为OSK腺病毒表达载体。
毒理学实验
将实施例2制备的目标腺病毒表达载体、对比例3制备的OSKM腺病毒表达载体以及对比例4制备的OSK腺病毒表达载体分别静脉注射至小鼠中,进行4周的观察,结果如表1所示。
表1毒理学实验结果表
转录因子组合 | 动物及数量 | 载体 | 给药路径 | 表达时间 | 结果 |
OSKM(对比例3) | 小鼠4只 | AAV8 | 静脉注射 | 4周 | 全部死亡 |
OSK(对比例4) | 小鼠4只 | AAV8 | 静脉注射 | 4周 | 全部存活 |
OSKGL(实施例2) | 小鼠4只 | AAV8 | 静脉注射 | 4周 | 全部存活 |
如表1所示,cMyc同其他多潜能转录因子一起表达(对应对比例3)会引起明显毒性,造成小鼠死亡,OSKGL(对应实施例2)以及OSK(对应对比例4)则无明显毒性。
应用例3:实施例3的目标mRNA转染人卵巢颗粒细胞实验
人卵巢颗粒细胞培养:选择Creatvie Bioarray公司货号CSC-I9239L人卵巢颗粒细胞,按说明进行培养。
mRNA转染:将纯化好的目标mRNA(包括突变复制酶mRNA,OSKGL),加入到细胞中,利用合适的转染试剂(如脂质体、聚合物等)将mRNA引入细胞,每1~2天转染1次,共计转染7~10次。
随后进行转染后的人卵巢颗粒细胞部分重编程后甲基化分析和表观遗传学年龄计算。
1,甲基化分析步骤:
a.样品准备:收集OSKMGLmRNA处理细胞。
b.DNA提取:使用商业化的DNA提取试剂盒提取样品中的DNA。
c.甲基化酶处理:使用商业化的甲基化酶试剂将DNA进行处理,以区分甲基化的Cytosine和未甲基化的Cytosine。
d.甲基化检测:采用上述WGBS测序方法,测序。
e.数据分析:将数据输入到生物信息学软件中R包中。数据分析包括质量控制,数据清洗,数据预处理,特征提取和统计分析。
2,表观遗传学年龄计算
a.将上述甲基化数据输入线上表观遗传学年龄计算器https://dnamage.genetics.ucla.edu/home。
b.选择Horvath时钟和Hannum时钟。
c.运行分析后,产生表观遗传学年龄。
对比例5:OSK-mRNA表达系统
OSK-mRNA表达系统包括编码Oct4转录因子的第一mRNA、编码Sox2转录因子的第二mRNA、编码Klf4转录因子的第二mRNA以及编码甲病毒属突变型复制酶的第三mRNA。
其中,两种第二mRNA的摩尔量相同,第一mRNA的摩尔量与两种第二mRNA的摩尔量和之比为2~6。
其中,第三mRNA的摩尔量为编码Oct4转录因子的mRNA、编码Sox2转录因子的mRNA以及编码Klf4转录因子的mRNA的摩尔量之和的1~8倍。
第一mRNA按照5’→3’方向依次包括如下元件:5’UTR序列、信号肽序列、Oct4转录因子编码序列和3’UTR序列;各第二mRNA按照5’→3’方向依次包括如下元件:5’UTR序列、目标重编程因子编码序列和3’UTR序列,每个第二mRNA还包括信号肽序列。
人卵巢颗粒细胞培养:选择Creatvie Bioarray公司货号CSC-I9239L人卵巢颗粒细胞,按说明进行培养。
mRNA转染:将纯化好的OSK-mRNA(包括突变复制酶mRNA,OSK),加入到细胞中,利用合适的转染试剂(如脂质体、聚合物等)将mRNA引入细胞,每1~2天转染1次,共计转染7~10次。
随后进行转染后的人卵巢颗粒细胞部分重编程后甲基化分析和表观遗传学年龄计算,具体参见应用例3。
对比例6:空-mRNA表达系统
空-mRNA表达系统包括编码甲病毒属突变型复制酶的第三mRNA。
人卵巢颗粒细胞培养:选择Creatvie Bioarray公司货号CSC-I9239L人卵巢颗粒细胞,按说明进行培养。
mRNA转染:将纯化好的空-mRNA(包括突变复制酶mRNA),加入到细胞中,利用合适的转染试剂(如脂质体、聚合物等)将mRNA引入细胞,每1~2天转染1次,共计转染7~10次。
随后进行转染后的人卵巢颗粒细胞部分重编程后甲基化分析和表观遗传学年龄计算,具体参见应用例3。
应用例3、对比例5和对比例6实验结果
请参阅图4所示,在人卵巢颗粒细胞中用目标mRNA表达系统编码细胞多潜能转录因子Oct4,Sox2,Klf4,Glis1和Lin28处理7~10天,明显降低卵巢表观遗传学年龄,增强其损伤修复的能力,从而防治卵巢早衰,相比之下对比例5中3个编码细胞多潜能转录因子Oct4,Sox2,Klf4对卵巢表观遗传学年龄没有逆转;对比例6中空-mRNA表达系统对卵巢表观遗传学年龄没有逆转。
以上所述的仅是本申请的实施方式,在此应当指出,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本申请创造构思的前提下,还可以做出改进,但这些均属于本申请的保护范围。
Claims (11)
1.一种重编程因子抗衰老表达系统,其特征在于,所述表达系统包括编码Oct4转录因子的核酸分子、编码Sox2转录因子的核酸分子、编码Klf4转录因子的核酸分子、编码Glis1转录因子的核酸分子以及编码Lin28转录因子的核酸分子。
2.根据权利要求1所述的重编程因子抗衰老表达系统,其特征在于,所述表达系统为具有嘌呤霉素抗性的重组载体。
3.根据权利要求2所述的重编程因子抗衰老表达系统,其特征在于,所述重组载体包括依次连接的编码Oct4转录因子的核酸分子、编码P2A肽的核酸分子、编码Glis1转录因子的核酸分子、编码F2A肽的核酸分子、编码Klf4转录因子的核酸分子、编码T2A肽的核酸分子、编码Lin28转录因子的核酸分子、编码E2A肽的核酸分子以及编码Sox2转录因子的核酸分子。
4.根据权利要求3所述的重编程因子抗衰老表达系统,其特征在于,所述重组载体包括piggybac转座子。
5.根据权利要求3所述的重编程因子抗衰老表达系统,其特征在于,所述重组载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
6.根据权利要求1所述的重编程因子抗衰老表达系统,其特征在于,所述表达系统为腺相关病毒表达载体或慢病毒表达载体。
7.根据权利要求1所述的重编程因子抗衰老表达系统,其特征在于,所述表达系统包括含有表达盒,所述表达盒含有编码Oct4转录因子的核酸分子、编码Sox2转录因子的核酸分子、编码Klf4转录因子的核酸分子、编码Glis1转录因子的核酸分子以及编码Lin28转录因子的核酸分子。
8.根据权利要求1所述的重编程因子抗衰老表达系统,其特征在于,所述表达系统包括编码Oct4转录因子的mRNA、编码Sox2转录因子的mRNA、编码Klf4转录因子的mRNA、编码Glis1转录因子的mRNA以及编码Lin28转录因子的mRNA;所述编码Oct4转录因子的mRNA、所述编码Sox2转录因子的mRNA、所述编码Klf4转录因子的mRNA、所述编码Glis1转录因子的mRNA以及所述编码Lin28转录因子的mRNA中部分或全部的核苷酸进行了能够提高所述mRNA在生物体内稳定性的化学修饰;所述编码Oct4转录因子的mRNA的摩尔量与所述编码Sox2转录因子的mRNA、所述编码Klf4转录因子的mRNA、所述编码Glis1转录因子的mRNA以及所述编码Lin28转录因子的mRNA的摩尔量之和的比例为1~8:1。
9.根据权利要求8所述的重编程因子抗衰老表达系统,其特征在于,所述化学修饰包括利用N1-甲基假尿苷、假尿嘧啶或甲基尿嘧啶置换所述编码Oct4转录因子的mRNA、所述编码Sox2转录因子的mRNA、所述编码Klf4转录因子的mRNA、所述编码Glis1转录因子的mRNA以及所述编码Lin28转录因子的mRNA中的100%的尿嘧啶以及利用5-甲基胞嘧啶或5-羟甲基胞嘧啶置换所述编码Oct4转录因子的mRNA、所述编码Sox2转录因子的mRNA、所述编码Klf4转录因子的mRNA、所述编码Glis1转录因子的mRNA以及所述编码Lin28转录因子的mRNA中的100%的胞嘧啶。
10.一种生物材料,其特征在于,所述生物材料为包括权利要求1~9任一项所述的重编程因子抗衰老表达系统的宿主细胞。
11.如权利要求1~9中任一项所述的重编程因子抗衰老表达系统或如权利要求10所述的生物材料在制备细胞重编辑试剂中的用途、在制备器官损伤后修复剂中的用途或在制备抗衰老药物中的用途。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202310401321.1A CN116426573A (zh) | 2023-04-14 | 2023-04-14 | 重编程因子抗衰老表达系统、生物材料及用途 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202310401321.1A CN116426573A (zh) | 2023-04-14 | 2023-04-14 | 重编程因子抗衰老表达系统、生物材料及用途 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN116426573A true CN116426573A (zh) | 2023-07-14 |
Family
ID=87082854
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202310401321.1A Pending CN116426573A (zh) | 2023-04-14 | 2023-04-14 | 重编程因子抗衰老表达系统、生物材料及用途 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN116426573A (zh) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN116870197A (zh) * | 2023-08-15 | 2023-10-13 | 臻赫医药(杭州)有限公司 | 促组织细胞增生重编程因子制剂及用途 |
CN116898988A (zh) * | 2023-08-15 | 2023-10-20 | 臻赫医药(杭州)有限公司 | 皮肤重编程因子制剂、生物材料及用途 |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102782122A (zh) * | 2010-02-16 | 2012-11-14 | 国立大学法人京都大学 | 有效建立经诱导的多能干细胞的方法 |
JP2019162054A (ja) * | 2018-03-19 | 2019-09-26 | 国立大学法人京都大学 | 効率的な人工多能性幹細胞の樹立方法 |
CN113692442A (zh) * | 2019-04-17 | 2021-11-23 | 学校法人庆应义塾 | 诱导多能干细胞的制造方法以及试剂盒 |
CN113846113A (zh) * | 2021-09-09 | 2021-12-28 | 臻赫医药(杭州)有限公司 | 一种有限自我复制mRNA分子系统、制备方法及应用 |
CN114717183A (zh) * | 2015-08-31 | 2022-07-08 | 爱平世股份有限公司 | 多能干细胞制造系统和生产诱导多能干细胞的方法 |
-
2023
- 2023-04-14 CN CN202310401321.1A patent/CN116426573A/zh active Pending
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102782122A (zh) * | 2010-02-16 | 2012-11-14 | 国立大学法人京都大学 | 有效建立经诱导的多能干细胞的方法 |
CN114717183A (zh) * | 2015-08-31 | 2022-07-08 | 爱平世股份有限公司 | 多能干细胞制造系统和生产诱导多能干细胞的方法 |
JP2019162054A (ja) * | 2018-03-19 | 2019-09-26 | 国立大学法人京都大学 | 効率的な人工多能性幹細胞の樹立方法 |
CN113692442A (zh) * | 2019-04-17 | 2021-11-23 | 学校法人庆应义塾 | 诱导多能干细胞的制造方法以及试剂盒 |
CN113846113A (zh) * | 2021-09-09 | 2021-12-28 | 臻赫医药(杭州)有限公司 | 一种有限自我复制mRNA分子系统、制备方法及应用 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
MOMOKO MAEKAWA ET AL.: "Direct reprogramming of somatic cells is promoted by maternal transcription factor Glis1", NATURE, vol. 474, 9 June 2011 (2011-06-09), pages 226 * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN116870197A (zh) * | 2023-08-15 | 2023-10-13 | 臻赫医药(杭州)有限公司 | 促组织细胞增生重编程因子制剂及用途 |
CN116898988A (zh) * | 2023-08-15 | 2023-10-20 | 臻赫医药(杭州)有限公司 | 皮肤重编程因子制剂、生物材料及用途 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN113631708B (zh) | 编辑rna的方法和组合物 | |
CN116426573A (zh) | 重编程因子抗衰老表达系统、生物材料及用途 | |
US9371544B2 (en) | Compositions and methods for reprogramming eukaryotic cells | |
CN113939591A (zh) | 编辑rna的方法和组合物 | |
CN113286880A (zh) | 调控基因组的方法和组合物 | |
CN110628766B (zh) | 与羊骨骼肌发育相关的lncRNA编码基因及其应用 | |
EP3730616A1 (en) | Split single-base gene editing systems and application thereof | |
WO2022156378A1 (zh) | 基因转录框架、载体系统、基因组序列编辑方法及应用 | |
KR20230129230A (ko) | Bcl11a의 표적화를 위한 조성물 및 방법 | |
CA3106738A1 (en) | Method for modulating rna splicing by inducing base mutation at splice site or base substitution in polypyrimidine region | |
US20230416747A1 (en) | Safe harbor loci | |
CN111607613A (zh) | 一种表达细胞免疫疫苗mRNA的质粒载体及其构建方法和应用 | |
WO2023097316A1 (en) | Engineered crispr/cas12a effector proteins, and uses thereof | |
CN106520829B (zh) | 一种终止双等位基因转录的方法 | |
CN113249362B (zh) | 经改造的胞嘧啶碱基编辑器及其应用 | |
CN112574992A (zh) | 一种circRNA过表达成环载体DNA序列及其构建方法与应用 | |
CN110551762B (zh) | CRISPR/ShaCas9基因编辑系统及其应用 | |
CN112979823A (zh) | 一种用于治疗和/或预防β血红蛋白病的产品及融合蛋白 | |
CN114990093B (zh) | 氨基酸序列小的蛋白序列mini rfx-cas13d | |
CN115927331A (zh) | 一种用于促进circRNA成环和过表达的DNA框架及其构建方法和用途 | |
CN115806984A (zh) | 环状rna及载体和载体的应用 | |
US20210389303A1 (en) | Transient reporters and methods for base editing enrichment | |
WO2022225978A1 (en) | Use of a split dcas fusion protein system for epigenetic editing | |
CN115044583A (zh) | 用于基因编辑的rna框架和基因编辑方法 | |
CN110551763B (zh) | CRISPR/SlutCas9基因编辑系统及其应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20230714 |