CN110628766B - 与羊骨骼肌发育相关的lncRNA编码基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种与羊骨骼肌发育相关的lncRNA编码基因及其应用。本发明利用转录组测序鉴定分析多浪绵羊骨骼肌不同发育阶段相关lncRNA并在细胞水平对其功能进行研究，筛选显著影响骨骼肌发育的lncRNA。本发明首次发现过表达lncRNA TCONS 00544451具有抑制骨骼肌卫星细胞增殖，促进细胞成肌分化的功能，为提高绵羊产肉性能的分子育种及品种改良提供科学依据和技术支持。

Description

与羊骨骼肌发育相关的lncRNA编码基因及其应用

技术领域

本发明涉及生物学技术领域，具体地说，涉及一种与羊骨骼肌发育相关的lncRNA编码基因及其应用。

背景技术

中国是世界上最大的羊肉生产国和消费国。然而与新西兰、澳大利亚等世界发达国家养羊业相比，我国肉羊产肉量小是制约肉羊生产的重要因素之一。绵羊骨胳肌生长发育决定了肉用羊高产、优质性状的形成,深入分析骨胳肌生长发育的分子机制，对提高我国绵羊产肉性能具有重要意义。

骨骼肌卫星细胞是一种称体肌源性干细胞，负责动物骨骼肌损伤后的再生,是一种研究骨骼肌生发育的体外模型。在发育生物学中，骨骼肌损伤后的再生过程被认为类似于骨骼肌的发育过程(Relaix et al.,2006)，而骨骼肌卫星细胞负责动物骨骼肌损伤后的再生，因此，骨骼肌卫星细胞的成肌分化和增殖可作为体外模拟骨骼肌生长发育的模型，进而更加深入研究骨骼肌的生长发育过程。

长链非编码RNA(Long noncoding RNA，lncRNA)作为一种转录本长度大于200nt的非编码RNA，与mRNA相似，大多数lncRNA都由RNA聚合酶II转录并具有某些共同的特点如5’帽子，3’polyA尾巴和剪接位点产生不同的转录本，但lncRNA的表达水平较低，并具有较高的组织特异性和时空特异性(Guttman et al,2009)。根据其在基因组位置和遗传背景，lncRNA可以分为正义lncRNA、反义lncRNA、双向lncRNA、内含子lncRNA和基因间lncRNA(丁红等，2018；占思远等，2016；Knoll et al,2015)。基因间lncRNA是位于基因间区具有较低蛋白编码潜能的长非编码RNA，通常与邻近的蛋白质编码基因非常接近。内含子lncRNA与基因的内含子区域重叠，其转录可以是有义方向或反义方向。lncRNA参与转录水平和转录后水平基因表达调控，表观遗传调控，基因组印迹，X染色体失活，RNA剪接，在细胞增殖、细胞周期、细胞代谢、细胞凋亡、细胞分化和多能性维持等方面均发挥重要功能(Akhade et al,2017)。

lncRNA Malat1(肺腺癌转移相关转录本1)在成肌细胞分化过程中表达上调，是通过结合miR-133、表达转录因子SRF(Serum response factor，血清应答因子)促进成肌细胞的分化，沉默Malat1会释放出miR-133作用于SRF的3’UTR区，抑制SRF的表达进而抑制成肌细胞的增殖和分化(Han et al,2015)。在体内和体外成肌生成过程中，lncRNA Dum(多能发育相关基因2(Dppa2)上游结合肌肉lncRNA)的表达呈动态变化，能通过结合MyoD对成肌细胞分化进行转录诱导，功能分析显示它促进成肌细胞分化和损伤诱导的肌肉再生。

印记基因可编码lncRNA在骨骼肌发育过程中起着关键的调节作用。H19在胚胎发育期高表达，在成肌细胞分化时表达量降低并抑制肌细胞的再生。H19的功能离不开IGF2的作用，在野生型小鼠的母源染色体上，通过H19/IGF2基因印记群共用的核心肌肉增强子(Core muscle enhancer,CME)直接促进H19并抑制远端IGF2的表达。敲低/敲除都会抑制成肌细胞的成肌分化。研究表明有些核内lncRNA可作为增强子相关RNA(Enhancer-associated RNA,eRNA)，具有增强子的功能，可以通过激活邻近蛋白编码基因的表达发挥作用。

lncRNA调控的小肽Myoregulin和DWORF通过调节肌浆网钙泵(SERCA)的功能来控制肌肉松弛。Myoregulin是一种由linc-RAM(Linc-RNA Activator of Myogenesis)编码的保守的跨膜α-螺旋小肽，其仅在骨骼肌中表达。它直接与肌浆网上的肌浆网钙泵相互作用来抑制肌质网中的钙摄取。成纤维细胞生长因子(FGF2)能通过抑制MyoD参与骨骼肌干细胞的自我更新和分化。

随着二代测序技术的快速发展，转录组测序渐渐成为鉴定lncRNA的热门方法。在畜禽中，lncRNA的研究要远远落后于人和小鼠等模式动物中的研究。目前在畜禽骨骼肌发育中lncRNA的鉴定也取得一定的进展，但对其的功能研究尚处于起始阶段(戴梦红等，2016；杨兵等，2018；周瑞等，2018)。西安电子科技大学开发了第一个家畜lncRNA的数据库ALDB(A domestic-animal long noncoding RNA database)，其中包含12103个猪lincRNA，8923个鸡lincRNA和8250个牛lincRNA。除了注释的lncRNA信息，除了注释的lncRNA之外，它还提供了现有的lncRNA数据库(lncRNAdb和NONCODE)中尚未提供的相关数据，例如家畜的全基因组表达谱和动物数量性状基因座(QTL)(Li et al,2015)。

发明内容

本发明的目的是提供一种与羊骨骼肌发育相关的lncRNA编码基因及其应用。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种与羊骨骼肌发育相关的lncRNA(TCONS 00544451)编码基因，所述基因为：

i)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；

ii)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且具有相同功能的核苷酸序列；

iii)在严格条件下与SEQ ID NO:1所示序列杂交且具有相同功能的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或

iv)与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90％以上同源性且具有相同功能的核苷酸序列。

第二方面，本发明提供含有lncRNA TCONS 00544451编码基因的生物材料，所述生物材料包括但不限于重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、噬菌体载体、病毒载体、工程菌或转基因细胞系。

第三方面，本发明提供lncRNA TCONS 00544451编码基因或含有所述基因的生物材料在调控羊骨骼肌卫星细胞增殖分化中的应用。

所述调控是指抑制羊骨骼肌卫星细胞的增殖，促进羊骨骼肌卫星细胞向成肌细胞的分化。

所述应用包括在羊骨骼肌卫星细胞中过表达lncRNA TCONS 00544451编码基因。

lncRNA TCONS 00544451编码基因可以通过质粒导入羊骨骼肌卫星细胞中或通过基因工程手段整合到羊染色体上。

第四方面，本发明提供lncRNA TCONS 00544451编码基因或含有所述基因的生物材料在羊育种及品种改良中的应用。

第五方面，本发明提供lncRNA TCONS 00544451编码基因或含有所述基因的生物材料在羊体内和体外成肌生成中的应用。

第六方面，本发明提供lncRNA TCONS 00544451在影响绵羊骨骼肌卫星细胞增殖分化中的应用。

所述应用包括：构建TCONS_00544451表达载体，转染至羊骨骼肌卫星细胞内使得细胞内TCONS 00544451过量表达。

优选地，出发载体为pcDNA3.1(+)。

第七方面，本发明提供一种体外诱导羊骨骼肌卫星细胞分化为成肌细胞的方法，包括以下步骤：

(1)将羊骨骼肌卫星细胞培养于生长培养基中，待细胞密度达80-90％时，传代一次；

(2)当细胞密度达70％-80％时，将生长培养基更换为诱导成肌分化培养基，使细胞分化为成肌细胞。

其中，步骤(1)使用的生长培养基为含10％马血清和20％胎牛血清的DMEM/F12培养基；步骤(2)使用的诱导成肌分化培养基为含2％马血清的DMEM/F12培养基。

细胞培养条件为：37℃，5％CO₂。

第八方面，本发明提供lncRNA TCONS 00544451在羊骨骼肌卫星细胞内促进肌球蛋白重链(Myosin heavy chain，MHC)的RNA和蛋白水平表达中的应用。

本发明中，所述羊为绵羊，优选多浪绵羊。

进一步地，本发明提供多浪绵羊妊娠90日龄胎儿(F90)、出生后30日龄羔羊(L30)和成年3岁绵羊(A3Y)不同生长发育阶段的多浪绵羊背最长肌组织基因表达序列对比结果及聚类分析，结果表明在出生前后绵羊骨骼肌发育存在显著差异。

本发明提供了针对lncRNA的靶基因与差异表达基因的GO富集分析和KEGG分析。

本发明利用转录组测序鉴定分析多浪绵羊骨骼肌不同发育阶段相关lncRNA并在细胞水平对其功能进行研究，筛选显著影响骨骼肌发育的lncRNA。本发明首次发现过表达lncRNA TCONS 00544451具有抑制骨骼肌卫星细胞增殖，促进细胞成肌分化的功能，为提高绵羊产肉性能的分子育种及品种改良提供科学依据和技术支持。

附图说明

图1A～图1D显示了本发明较佳实施例中绵羊背最长肌lncRNA和mRNA的特征。其中，图1A:CPC、CNCI和Pfam分析筛选非编码RNA的韦恩图；图1B:每条染色体上lncRNA的分布；图1C:绵羊背最长肌lncRNA和mRNA每个转录本的外显子数目；图1D:绵羊背最长肌lncRNA和mRNA转录本长度。

图2显示了本发明较佳实施例中绵羊不同发育时期lncRNA(A)与mRNA(B)整体表达水平。

图3显示了本发明较佳实施例中F90_vs_L30比较中差异表达lncRNA的靶基因的GO富集分析的前20个GO terms。

图4为本发明较佳实施例中F90_vs_A3Y比较中差异表达lncRNA的靶基因的GO富集分析的前20个GO terms。

图5为本发明较佳实施例中L30_vs_A3Y比较中差异表达lncRNA的靶基因的GO富集分析的前20个GO terms。

图6为本发明较佳实施例中F90_vs_L30比较中差异表达lncRNA的靶基因的基因代谢途径数据库(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)分析的前20个信号通路。

图7为本发明较佳实施例中L30_vs_A3Y比较中差异表达lncRNA的靶基因的KEGG分析的前20个信号通路。

图8为本发明较佳实施例中F90_vs_A3Y比较中差异表达lncRNA的靶基因的KEGG分析的前20个信号通路。

图9为本发明较佳实施例中RT-qCR和RNA-seq方法检测表达基因的相对表达量。

图10为本发明较佳实施例中RT-qCR和RNA-seq方法检测lncRNA的相对表达量。

图11为本发明较佳实施例中TCONS_00544451在背最长肌不同发育时期和骨骼肌卫星细胞分化过程中的表达量。其中，A、表示在不同时期背最长肌组织中的表达水平，B表示在SCs分化过程中的表达水平。图中，a、b、c分别表示差异极显著、差异显著、差异不显著。

图12为本发明较佳实施例中绵羊骨骼肌卫星细胞成肌分化显微镜图像。其中，D0、D1、D3、D5、D7分别表示分化第0、1、3、5、7天。

图13为本发明较佳实施例中过表达载体酶切鉴定和效率检测。其中，A：过表达TCONS_00544451载体的酶切鉴定图；B：过表达TCONS_00544451载体的效率检测。图中，**表示差异极显著。

图14为本发明较佳实施例中过表达TCONS_00544451对绵羊骨骼肌卫星细胞增殖的影响。图中，**表示差异极显著。

图15为本发明较佳实施例中细胞过表达TCONS_00544451后分化2天和3天的MHCRNA水平表达情况。图中，**表示差异极显著。

图16为本发明较佳实施例中细胞过表达TCONS_00544451后分化2天和3天的MHC蛋白水平表达情况。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。实施例1不同发育时期多浪绵羊背最长肌组织的转录组测序

1、按

Plus Universal Mini Kit(Qiagen)试剂盒的操作说明进行对样品多浪绵羊背最长肌组织总RNA的提取。用琼脂糖凝胶电泳分析RNA是否有污染和降解，RNA的质量和浓度通过Agilent 2100bioanalyzer(Agilent,CA,USA)测定，将浓度≥100ng/ul，总量≥3ug，RIN≥7.0的总RNA样品用于去核糖体链特异性(dUTP)转录组建库测序。转录组的建库测序平台为Illumina Hiseq 2500V4，测序模式是125PE。用NGSQC Toolkit v2.3.3软件(Patel et al,2012)过滤掉含有接头的reads，过滤掉N含量大于10％的reads，过滤掉低质量的reads，得到clean reads。

2、从NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下载绵羊参考基因组(Oar_v4.0)以及基因组注释GTF文件。将clean reads通过TopHat v2.1.0软件(Trapnell et al,2009)比对到绵羊参考基因组上，用cufflinks v2.2.1软件(Trapnell et al,2010)将比对上的clean reads进行转录本的拼接组装，得到每个样品的转录本并对其表达水平进行定量分析，用FPKM值来评估转录本的丰度。利用cuffcompare软件将组装得到的转录本与参考注释文件进行比较分析去除与已知的非lncRNA以及非mRNA类型的转录本相似或相同的转录本，提取class_code为“i”，“u”，“x”的转录本。

3、根据lncRNA的结构特点以及非编码功能特点，按照下面严格的筛选步骤，将筛选结果作为最终的候选lncRNA进行后续分析。筛选步骤如下：1)提取长度≥200bp，外显子数≥2的转录本；2)提取reads最小覆盖度≥3的转录本；3)利用CPC(Coding PotentialCalculator)，CNCI(Coding-Non-Coding Index)，Pfam蛋白家族数据库三种工具共同筛选去除具有编码潜能的转录本。将候选的lncRNA的信息与GTF文件合并生成新的GTF文件用于lncRNA定量以及差异表达分析。将|Fold Change|≥2且FDR<0.01作为差异表达的筛选标准。

4、差异表达lncRNA的靶基因与差异表达基因的功能分析。lncRNA Cis-作用是将lncRNA上下游100kb的蛋白编码基因筛选出来作为其靶基因，然后选择与Lnctar靶基因预测软件预测的lncRNA重叠的基因作为反式作用靶基因。为了进一步分析差异表达lncRNA的生物学功能，采用g:Profiler(https://biit.cs.ut.ee/gprofiler/)在线软件对差异表达lncRNA的靶基因和差异表达基因进行GO富集分析，通过DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)对差异表达lncRNA的靶基因和差异表达基因进行KEGG注释和分析。

利用g:Profiler和DAVID在线软件对差异表达lncRNA的靶基因进行GO和KEGG富集分析，GO分析表明这些差异基因主要与系统发育(GO：0048731)、解剖学结构发育(GO：0048856)、发育进程(GO：0032502)、动物器官发育(GO：0048513)、细胞骨架蛋白结合(GO：0008092)、发育进程调控等相关。KEGG分析结果表明差异基因显著富集在细胞周期、PPAR信号通路，AMPK信号通路上。三个比较中富集到了AMPK信号通路，说明该通路中的差异基因调控绵羊肌肉发育的整个过程。在胎儿与羔羊、胎儿与成年羊比较中差异基因均显著富集到氧化磷酸化、碳代谢、心肌收缩和脂肪酸代谢，表明这些通路中的基因参与调控绵羊出生前后肌肉的生长发育。

利用g:Profiler和DAVID在线软件对差异表达lncRNA的靶基因进行GO和KEGG富集分析，这些靶基因主要在肌肉系统进程(GO:0003012)、肌肉骨骼运动(GO：0050881)、骨骼肌收缩(GO：0003009)、系统发育(GO：0048731)、解剖学结构发育(GO：0048856)、发育进程(GO：0032502)、动物器官发育(GO：0048513)、多细胞生物发育(GO：0007275)、细胞发育(GO：0048468)、细胞分化(GO：0030154)、横纹肌收缩(GO：0006941)、神经系统发育(GO：0007399)等通路显著富集。对差异表达lncRNA的靶基因KEGG分析结果显示，三组比较中共同富集到胰岛素信号通路，还显著富集在P1K-AKt信号通路、与生长发育相关的甲状腺激素lncRNA与其靶基因在肌肉生长发育调控过程中扮演着重要的调控作用。

为进一步研究lncRNA与其靶基因之间的相互关系，对差异lncRNA的所有靶基因进行差异分析，在三个比较组中均差异表达的靶基因有53个，包括差异基因IGF2,RTL1,YNNC2,TPM3,MYH14等与肌肉发育相关发基因，对着53个基因进行GO分析，极显著富集在丙二酰辅酶A代谢过程中(GO:2001293)和细胞外基质(GO:0031012)上，结合差异基因功能及其对应lncRNA的表达水平，将RTL1对应的lncRNA TCONS_00544451作为后续细胞水平的功能验证。5、荧光定量PCR检测，根据PrimeScript^TM RT reagent kit with gDNA Eraser(Takara)试剂盒说明书进行cDNA反转录，再根据SYBR Premix Ex Taq^TMⅡ(Takara)试剂盒进行荧光定量PCR检测。采用2^-△△Ct方法计算相对表达量，每次试验进行三个生物学重复。

随机选择7个基因与7个lncRNA进行RT-qPCR验证，以GAPDH,HPRT1,ACTB为内参。结果表明转录组测序结果表达趋势与RT-qPCR检测结果的表达趋势一致，可以说明RNA-seq测序的可靠性与准确性。

图1A～图1D显示了绵羊背最长肌lncRNA和mRNA的特征，其中，图1A:CPC、CNCI和Pfam分析筛选非编码RNA的韦恩图；图1B:每条染色体上lncRNA的分布；图1C:绵羊背最长肌lncRNA和mRNA每个转录本的外显子数目；图1D:绵羊背最长肌lncRNA和mRNA转录本长度。

图2显示了绵羊不同发育时期lncRNA与mRNA整体表达水平。

图3显示了F90_vs_L30比较中差异表达lncRNA的靶基因的GO富集分析的前20个GOterms。

图4为F90_vs_A3Y比较中差异表达lncRNA的靶基因的GO富集分析的前20个GOterms。

图5为L30_vs_A3Y比较中差异表达lncRNA的靶基因的GO富集分析的前20个GOterms。

图6为F90_vs_L30比较中差异表达lncRNA的靶基因的基因代谢途径数据库(Kyotoencyclopedia of genes and genomes，KEGG)分析的前20个信号通路。

图7为L30_vs_A3Y比较中差异表达lncRNA的靶基因的KEGG分析的前20个信号通路。

图8为F90_vs_A3Y比较中差异表达lncRNA的靶基因的KEGG分析的前20个信号通路。

图9为RT-qPCR和RNA-seq方法检测表达基因的相对表达量。

图10为RT-qPCR和RNA-seq方法检测lncRNA的相对表达量。

lncRNA TCONS 00544451编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

实施例2lncRNA TCONS_00544451对绵羊骨骼肌卫星细胞增殖分化的影响

1、多浪绵羊骨骼肌卫星细胞的分离培养与诱导分化。绵羊骨骼肌SCs的生长培养基是用含10％马血清和20％胎牛血清的DMEM/F12培养基配制而成，诱导成肌分化培养基是由含2％马血清的DMEM/F12培养基配制而成。分离纯化绵羊骨骼肌SCs采用两步酶消化法和差速贴壁法，步骤如下：

(1)用眼科剪小心剪开包裹有绵羊胎儿的子宫，取下胎儿的腿肌浸泡于含1％双抗(1％青霉素-链霉素)的PBS中。

(2)在灭菌后的超净工作台中分离肌肉，去除血管、纤维、肌膜等组织，用含双抗的PBS反复清洗肌肉组织4-5次直至PBS不再浑浊。

(3)将肌肉组织剪碎成泥状，用含1％双抗的PBS再清洗2-3次。

(4)向泥状肌肉中加入0.1％Ⅰ型胶原酶消化组织，放置于37℃，5％CO₂细胞培养箱中消化1h，期间每隔20min摇晃混匀一次。

(5)将消化后的组织消化液收集在离心管中1200rpm离心8min，弃掉上清，向沉淀中加入0.25％的胰蛋白酶-EDTA，放在细胞培养箱消化半小时，每隔10min晃动一次。

(6)向上述混合液中加入含10％马血清和20％胎牛血清的DMEM/F12培养基终止胰蛋白酶消化过程，然后通过200目细胞筛过滤，收集过滤液，1200rpm离心5min，去掉上清。用新鲜的生长培养基重悬细胞，放在细胞培养箱培养。

(7)培养2-3h后，将培养瓶中上清小心转移至另一新的培养瓶中，2-3h后重复该步骤一次，即可获得较为纯净的绵羊骨骼肌卫星细胞。

绵羊骨骼肌SCs细胞培养传代根据细胞状态进行，细胞密度达到80-90％时即可传代一次。细胞诱导成肌分化是当细胞生长密度达70％-80％时，将生长培养基更换为诱导成肌分化培养基使细胞向成肌方向诱导分化。

2、细胞总RNA的提取

利用Trizol法提取细胞总RNA，步骤如下：

(1)将细胞从培养箱中取出，吸弃培养基，再用PBS洗三遍，按每60mm培养皿加入1ml Trizol裂解液消化细胞，室温静置10min。

(2)收集裂解液至离心管中，然后加入200ul氯仿，剧烈震荡15s后，室温静置5min，将混合液放入预先制冷的4℃离心机中，转速为12000rpm，离心10min。

(3)吸取上清液置于另一新的离心管中，加入等体积的异丙醇，上下颠倒混匀，室温静置10min，然后4℃12000rpm离心10min，会发现离心管底部有白色沉淀析出。

(4)吸弃上清，向沉淀中加入75％乙醇，以4℃12000rpm离心10min。

(5)重复步骤(4)，吸弃上清，将带有白色沉淀的离心管置于超净工作台中晾干。加入适量无RNA酶的水溶解RNA。用Nanodrop 8000检测RNA的质量和浓度。

3、定量PCR检测

根据PrimeScript^TM RT reagent kit with gDNA Eraser(Takara)试剂盒说明书进行cDNA反转录，再根据SYBR Premix Ex Taq^TMⅡ(Takara)试剂盒进行荧光定量PCR检测。采用2^-△△Ct方法计算相对表达量，每次试验进行三个生物学重复以检测过表达效率。实验结果显示转染过表达载体细胞中的TCONS_00544451表达量极显著高于转染空载体细胞中的表达量。

4、Western Blot

(1)细胞总蛋白的提取与测定。根据RIPA裂解液(上海碧云天生物技术有限公司)的说明书进行细胞总蛋白的提取并用BCA蛋白浓度定量试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)进行蛋白浓度测定。

(2)蛋白的变性。将5×加样缓冲液与蛋白样品按照1:4比例混合，将混合液放入PCR仪中，98℃保持10min，结束后置于冰上备用。

(3)电泳。向预制胶孔中加入变性蛋白混合液，90V电压20min左右待蛋白样品电泳到浓缩胶与分离胶分界面，然后以120V电泳至蓝色蛋白条带即将出胶为止。

(4)转膜。将海绵、滤纸、胶、经甲醇激活后的PVDF膜组成“三明治形式”的模型，转膜条件350mA，30～40min，根据蛋白大小调节时间长短。

(5)孵育一抗和二抗。先将转膜后的PVDF膜用含5％奶粉的TBST封闭2h，然后加入一抗，鼠抗GAPDH(1:2000)，鼠抗MHC(1:200)，4℃过夜。TBST洗膜三次，每次10min，然后加入二抗孵育1h，山羊抗鼠IgG(1:1000)，TBST洗膜三次，每次10min。

(6)显影。在膜上加适量显影液，置于全自动化学发光图像分析系统(Tanon5200)仪器中曝光检测。采集图像。

5、过表达载体构建

(1)载体线性化。用NheI和NotI内切酶对pcDNA3.1(+)载体双酶切，37℃，2h，酶切反应体系如下：

(2)根据lncRNA TCONS 00544451序列设计引物进行扩增PCR，PCR反应条件为：95℃5min；95℃30sec，62℃30sec，72℃2min，40个循环；72℃5min。

引物序列如下：

(3)根据EasyGeno快速重组克隆试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)操作说明进行PCR产物与线性化载体的重组。反应体系如下：

将混合液50℃放置15min，然后瞬离将混合液置于冰上冷却，进行后续转化实验。

6、pcDNA3.1(+)-TCONS_00544451过表达载体的转化

(1)将DH5α感受态细胞从-80℃冰箱取出置于冰上。

(2)向感受态细胞中加入5ul重组产物，轻弹混匀，冰浴30min；

(3)将离心管置于42℃水浴中60-90sec，然后快速将离心管转移至冰中，使细胞冷却2-3min；

(4)向离心管中加入350ul不含氨苄青霉素的SOC培养基，混匀后置于摇床中，180rpm，37℃培养45min；

(5)菌液4000rpm离心10min，弃上清，留20ul重悬细胞，吸取重悬液涂布到含有氨苄青霉素的固体琼脂培养基上，37℃倒置培养过夜；

(6)挑取菌落进行PCR检测并将菌液进行测序鉴定克隆结果。

7、质粒提取并进行细胞转染

将经鉴定的阳性菌液置于100ml含氨苄青霉素的液体LB培养基中扩大培养。按EndoFree Plasmid Maxi Kit试剂盒(货号：12362，QIAGEN)操作说明进行质粒大提。

将细胞接种于6孔板中，待细胞生长密度达70-80％时进行转染过表达载体、空载体，操作步骤按照Lipofectamine 3000(invitrogen)说明书进行。转染6-8h后更换新鲜培养基，转染48h和72h收集细胞提取RNA和蛋白。

8、绵羊骨骼肌卫星细胞的增殖检测

将绵羊骨骼肌卫星细胞接种至96孔板中，待细胞贴壁后，转染过表达载体，空载体，设置空白对照孔，分别在转染后24h、48h、72h、96h按照CCK8细胞增殖-毒性检测试剂盒操作说明检测细胞增殖情况。

图11为lncRNA TCONS_00544451在背最长肌不同发育时期和骨骼肌卫星细胞分化过程中的表达量。

图12为绵羊骨骼肌卫星细胞成肌分化显微镜图像。

图13为过表达载体酶切鉴定和效率检测结果，其中，A：过表达lncRNA TCONS_00544451载体的酶切鉴定图；B：过表达lncRNA TCONS_00544451载体的效率检测。

图14为过表达lncRNA TCONS_00544451对绵羊骨骼肌卫星细胞增殖的影响。

图15为细胞过表达lncRNA TCONS_00544451后分化2天和3天的MHC RNA水平表达情况。

图16为细胞过表达lncRNA TCONS_00544451后分化2天和3天的MHC蛋白水平表达情况。

结果显示TCONS_00544451在绵羊妊娠90日龄胎儿时期表达量最高，随着出生后表达量逐渐下降；在诱导骨骼肌微信细胞分化第三天表达水平最高，随后表达量有所下降。转染过表达载体细胞中的TCONS_00544451表达量极显著高于转染空白载体细胞中的表达量。利用CCK8细胞增殖-毒性检测试剂盒对转染过表达载体，空载体分别在转染后24h、48h、72h、96h检测细胞增殖情况，表明过表达TCONS_00544451对绵羊骨骼肌卫星细胞增殖有抑制作用。检测转染过表达载体和空白载体不同时期的成肌标志基因MHC(肌球蛋白重链)的RNA和蛋白表达水平，结果显示转染过表达TCONS_00544451载体后，细胞中MHC的RNA水平和蛋白水平都升高，表明TCONS_00544451促进骨骼肌卫星细胞成肌分化。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

参考文献

1.鲍晶晶，浦亚斌，马月辉等.基因间长链非编码RNA在骨骼肌发育中的研究进展[J].畜牧兽医学报，2019，50(03)：461-473.

2.戴梦红，陆启荣，程古月等.畜禽动物中长链非编码RNA的研究现状[J].畜牧兽医学报，2016，47(05)：864-869.

3.丁红，赵建业，鲍布和.长链非编码RNA Linc00152对肠癌细胞增殖迁移能力的影响[J].海南医学，2018，29(21)：3010-3013.

4.郭家中，陶海溪，李鹏飞等.简州大耳羊早期胎儿到新出生阶段背最长肌中可变剪接的鉴定与分析[J].西北农业学报，2018，27(03)：316-325.

5.杨兵，李晓凤，王昕.长链非编码RNA在畜禽经济性状中的研究进展[J].畜牧兽医学报，2018，49(10)：2063-2069.

6.占思远，李利，王林杰等.骨骼肌发育调控相关lncRNAs研究进展[J].畜牧兽医学报，2016，47(04)：637-644.

7.周瑞，王以鑫，龙科任等.LncRNA调控骨骼肌发育的分子机制及其在家养动物中的研究进展[J].遗传，2018，40(04)：292-304.

8.Akhade V S,Pal D,Kanduri C.Long Noncoding RNA:Genome Organizationand Mechanism of Action[J].Adv Exp Med Biol,2017,1008:47-74.

9.Guttman M,Amit I,Garber M,et al.Chromatin signature reveals over athousand highly conserved large non-coding RNAs in mammals[J].Nature,2009,458(7235):223-227.

10.Han P,Li W,Lin C H,et al.A long noncoding RNA protects the heartfrom pathological hypertrophy[J].Nature,2014,514(7520):102-106.

11.Knoll M,Lodish H F,Sun L.Long non-coding RNAs as regulators of theendocrine system[J].Nat Rev Endocrinol,2015,11(3):151-160.

12.Relaix F,Montarras D,Zaffran S,et al.Pax3 and Pax7 have distinctand overlapping functions in adult muscle progenitor cells[J].J Cell Biol,2006,172(1):91-102.

13.Li Z,Xu Y,Lin Y.Transcriptome analyses reveal genes of alternativesplicing associated with muscle development in chickens[J].Gene,2018,676:146-155.

序列表

<110> 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所

<120> 与羊骨骼肌发育相关的lncRNA编码基因及其应用

<130> KHP191114393.2

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1816

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ccgaggggag ggtgggtcgg gattggatga gttctgtcct aggaattctg ggggcctgag 60

ggtccctggg tcagggtttc tgaaggtctc cagttctggg acgctgggtt tcagcccagg 120

actcccaggg ccgcagaagc caggggtgga aattccacat gggcccttgt ctggttctgt 180

ccgtgcccga cccacgaggt ccaaggttgg gtttcagcgc tcctctctga tcacggcctg 240

tctcaagtgt gtgcttcctc tttccctttt caaagaaaga acaaatcttg tctgttgact 300

ttgacctttt caggcacccc ttgcacaaat ccttcccttg atggtaccag gagccacaag 360

tctccttgga tttctgtatg actcccaact cagggaggtt ggccttgggg ctggcctgcc 420

agagggtgga gggcggaggc tgggtctctg gggcagatgg gccagaggcc ctgctgtgat 480

cttgactgta actggtgtgg atagcacgtg acttggagca gatcacccat catttgacat 540

atcactcatc tttatttctc cccttcagat tctgtttata agcacactgt ttttttaatg 600

gacatctaat tttttaaaat gagcatccat tttttaaacc taattgctat tctccaccac 660

atacactttt ttttttttaa atttttgcat cccacctttt ccatattccg ctgtcaacat 720

ttttctttct tccatatact tcatcacctc actggctgcc ttgtgtctca ctgagtggct 780

gtatcagtca ttcaccacat caacctgcaa tcatcactct ggctatgcat aattcatctt 840

ttttaatgtt acaaattatg ccacagctaa taacttagca cacccccctt tttcattctt 900

atgaattatt ttcccacacc tggaagtgat ctttgctttg tggtatgtca atttctcctg 960

ctaggctgtg aacccttgag ggcaaggagc ttgttgcatt gatctttgta tctctaatgc 1020

ctgaaatgtt gtagatataa atgttagatg agaggatagg aggatggatg aaagtgtgag 1080

tgagtgcctg gttggctgtt ggaggcgagg atgggagaat ggatgaataa attggagtgg 1140

tgaatgaaca aatgaatttt ctggtgttga gtttcttgag gaaaggccag gaatttttgt 1200

atgactacta atttcagaag gcttgtagca ttttatgatg tccagggatg tattagcatt 1260

ttgttaagat gttgctaatt tatctctgtt aaaaagtgtt tttctgtcat tttaacttgc 1320

actgctttga tgactaatga cggttgaaca ttttactgtg tttgttaaaa aaaattacat 1380

cttctgtgaa ctgtttgtcc aagtccgctg ggtcatggct ttgtggtaag actggccaag 1440

ggtggaatga gggtccttgg gatgtagtga gcccttcatc tctggggtca ttcaagggac 1500

aggacaggca gatactcgat gagtgtagct tcaaggagat tcaattagta ggagtggggt 1560

tggcctagat gacccttcag gtctctttga ctcttcctgg aaaatgcaca ttgggatgat 1620

attctccctt tggcagccca gtgacgttta aggctgcttc tcctgggtgg gcttgtgcat 1680

ttatgatcta taaactctca gctcaccctc tgtaactctt gtggtgcaag aatctctttg 1740

accctccaag gtccagacaa ctgtgctgcc atcttgaatg ttagttaagt ggtggccttc 1800

ctgcctccac cccctg 1816

Claims (10)

1.与羊骨骼肌发育相关的lncRNA编码基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQID NO:1所示。

2.含有权利要求1所述基因的生物材料，所述生物材料为重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、噬菌体载体、病毒载体、工程菌或转基因细胞系。

3.权利要求1所述基因或权利要求2所述生物材料在调控羊骨骼肌卫星细胞增殖分化中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述调控是指抑制羊骨骼肌卫星细胞的增殖，促进羊骨骼肌卫星细胞向成肌细胞的分化。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，在羊骨骼肌卫星细胞中过表达权利要求1所述基因。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，权利要求1所述基因通过质粒导入羊骨骼肌卫星细胞中或通过基因工程手段整合到羊染色体上。

7.根据权利要求3-6任一项所述的应用，其特征在于，所述羊为绵羊。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述羊为多浪绵羊。

9.权利要求1所述基因或权利要求2所述生物材料在羊育种及品种改良中的应用。

10.权利要求1所述基因或权利要求2所述生物材料在羊体内和体外成肌生成中的应用。

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