CN109402269B

CN109402269B - 一种检测miRNA-217-5p的试剂在制备鸭肠道应激检测试剂中的用途

Info

Publication number: CN109402269B
Application number: CN201811495313.3A
Authority: CN
Inventors: 张昊; 陈芳; 吴艳; 梁振华; 皮劲松; 申杰; 潘爱銮; 杜金平; 孙静; 卢立志; 曾涛
Original assignee: Institute of Animal Science and Veterinary of Hubei Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Animal Science and Veterinary of Hubei Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2018-12-07
Filing date: 2018-12-07
Publication date: 2022-04-01
Anticipated expiration: 2038-12-07
Also published as: CN109402269A

Abstract

本发明提出一种检测miRNA‑217‑5p的试剂在制备鸭肠道应激检测试剂中的用途，包括miRNA，所述miRNA为miRNA(miRNA‑217‑5p)，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述miRNA的靶基因为样腱蛋白1(CHRDL1)，所述miRNA在氧化应激过程中高表达，通过下调的样腱蛋白1(CHRDL1)基因的表达，参与小肠上皮的氧化应激应答。本发明提出的miRNA(miR‑217‑5p)与鸭肠道氧化应激有很好的相关性，通过有效性和分子生物学验证，miR‑217‑5p的表达量在应激组和对照组样本间的差异极显著，且可以调节靶基因的表达，应用于抗逆蛋(肉)鸭的辅助遗传育种中，可实现早期辅助选择。

Description

一种检测miRNA-217-5p的试剂在制备鸭肠道应激检测试剂中的用途

技术领域

本发明涉及分子标记领域，尤其涉及一种检测miRNA-217-5p的试剂在制备鸭肠道应激检测试剂中的用途。

背景技术

鸭是一种胆小、易惊的家禽。随着鸭规模化、设施化养殖的发展，蛋鸭笼养成为一种重要的生产方式，逐渐在蛋鸭生产中推广应用，在标准化笼养流程中，免疫、运输、上笼、环境温度变化等各种有害刺激，可使鸭生产性能降低，极大的影响养殖效率，有害刺激易诱发氧化应激反应。应激发生时，血液流向肌肉、脑等组织，小肠组织发生缺血，又最迟得到恢复，肠道持续缺氧造成氧化应激，不仅会影响肠道屏障和吸收功能，还可导致消化道黏膜的损伤，引发肠细菌异位，诱发多种疾病。

microRNA(miRNA)是一类长度约20-24nt的非编码单链小分子RNA，可以通过与靶基因mRNA的3’UTR互补结合对靶基因进行转录后调控，在细胞增殖、分化和凋亡、细胞氧化应激应答、肿瘤形成等生理过程中发挥重要的调控作用。

miRNA参与动物应激应答是通过结合靶基因mRNA的3’UTR进行负调控实现的。如果仅通过生物信息学分析预测，将得到大量互作基因，对其筛选和验证难度巨大。而通过同一组织，特定生理时期RNA-seq和miRNA-seq测序，并进行关联分析，会更加准确获得相应生理过程的功能miRNA及其靶向基因。因此，本发明提出一种检测miRNA-217-5p的试剂在制备鸭肠道应激检测试剂中的用途，以解决现有技术中的不足之处。

发明内容

针对上述问题，本发明提出的miRNA(miR-217-5p)与鸭肠道氧化应激有很好的相关性，通过有效性和分子生物学验证，miR-217-5p在应激组和对照组样本间的差异极显著，在应用于抗逆蛋(肉)鸭的辅助遗传育种中，可实现早期辅助选择，同时本发明提供的检测miR-217-5p表达水平的荧光定量PCR试剂盒包含了从RNA提取到荧光定量实验所需的整套试剂，即方便使用，又保证了结果的一致性。

本发明提出一种检测miRNA-217-5p的试剂在制备鸭肠道应激检测试剂中的用途，包括miRNA，所述miRNA为应激过程中上调的miRNA(miRNA-217-5p)，其核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示，所述miRNA的靶基因为样腱蛋白1(CHRDL1)，所述miRNA通过下调的样腱蛋白1(CHRDL1)基因的表达，参与小肠上皮的氧化应激应答。

进一步改进在于：所述miRNA通过下调的样腱蛋白1(CHRDL1)基因的表达，在小肠上皮的氧化应激过程中发挥促进细胞增殖作用。

进一步改进在于：所述miRNA表达水平及其下调的样腱蛋白1(CHRDL1)基因的表达是通过RT-qPCR检测，根据鸭小肠组织中的所述miRNA的表达水平，判断鸭小肠抗氧化能力并进行筛选。

进一步改进在于：检测鸭小肠组织中的所述miRNA的表达水平，包括如下步骤：

步骤一：提取待测鸭小肠组织中含有miRNA的总RNA；

步骤二：设计目标miRNA和内参miRNA(U6)的特异性茎环引物，利用反转录酶进行miRNA反转录；

步骤三：采用miRNA特异的正向引物，以及通用下游引物，利用荧光定量PCR试剂盒进行miRNA(miRNA-217-5p)和内参miRNA的扩增；

步骤四：扩增后利用2-△△Ct法计算获得miRNA(miRNA-217-5p)的表达水平。

进一步改进在于：所述荧光定量PCR试剂盒包括反转录试剂、miRNA(miRNA-217-5p)的茎环引物，miRNA(miRNA-217-5p)上游引物和下游引物；内参miRNA(U6)的特异性茎环引物，U6上游引物和下游引物；荧光定量PCR反应试剂；

miRNA(miRNA-217-5p)茎环引物为：

CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGATCCAATC；

miRNA(miRNA-217-5p)上游引物为：

CTGGTAGGTACTGCATCAGGAACTG；

miRNA(miRNA-217-5p)下游引物为：

TCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGC；

内参miRNA(U6)的特异性茎环引物为：

GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAAAAATATG；

U6上游引物为：CTCGCTTCGGCAGCACA；

U6下游引物为：AACGCTTCACGAATTTGCGT。

本发明的有益效果为：本发明提出的miRNA(miR-217-5p)与鸭肠道氧化应激有很好的相关性，通过有效性和分子生物学验证，miR-217-5p表达水平在应激组和对照组样本间的差异极显著，在应用于抗逆蛋(肉)鸭的辅助遗传育种中，可实现早期辅助选择，同时本发明提供的检测miR-217-5p表达水平的荧光定量PCR试剂盒包含了从RNA提取到荧光定量实验所需的整套试剂，即方便使用，又保证了结果的一致性，利用筛选获得的分子标记辅助选择抗应激能力这一复杂性状，并对育种群体进行选择提高，可降低应激影响，节省饲养成本，提高鸭养殖效率。

附图说明

图1为本发明中CHRDL1的3’UTR与miR-217-5p的结合位点示意图。

图2为本发明miR-217-5p在应激组/对照组中的相对表达量结果示意图。

图3本发明中CHRDL1在氧化应激组/对照组中的相对表达量结果示意图。

图4为本发明miR-217-5p靶向CHRDL1基因的双荧光素酶验证结果示意图。

图5为本发明中转染miR-217-5p mimic后进行小肠上皮细胞氧化应激处理miR-217-5p的表达和CHRDL1表达情况示意图。

图6为本发明中转染miR-217-5p mimic后进行小肠上皮细胞氧化应激处理小肠上皮细胞增殖情况示意图。

具体实施方式

为了加深对本发明的理解，下面将结合实施例对本发明做进一步详述，本实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明保护范围的限定。

实施例一

根据图1所示，本实施例提出基于NGS技术的miRNA和mRNA联合分析获得肠道氧化应激关键基因(CHRDL1)及其调控miRNA(miR-217-5p)。

(1)实验动物和样本准备

以出雏的荆江鸭雏鸭为实验素材来源，对其进行高温运输应激处理，处理时长为8h，处理后立即屠宰，采集血液样本和小肠样本，然后将采集的小肠样本部分迅速放入液氮中冻存；

将应激组和对照组小肠样本采样后，每组各选取3只雏鸭样本作为实验组小肠样本和对照组小肠样本，将选出的实验组和对照组小肠样本利用商用试剂盒提取总RNA，分别构建用于miRNA和mRNA测序的cDNA文库再将构建好的文库送测序公司进行测序。

(2)基于高通量测序结果分析表达差异miRNA和mRNA

将获得的测序结果进行分析，将两组实验鸭小肠miRNA测序结果中fold-change＜0.5或＞2且FPKM≥10，p＜0.05的miRNA定义为差异表达miRNA；将fold-change＜0.5或＞2且两组中各基因的FPKM≥10，p＜0.05的mRNA定义为差异表达mRNA。

(3)差异表达miRNA和mRNA联合分析进行关键miRNA筛选

利用Targetscan算法，基于UCSC数据库的鸡的全基因数据，通过测序结果基因组比对，miRNA与3’UTR的匹配，对所有差异表达miRNA与差异表达mRNA进行联合分析，通过进一步分析发现，差异表达miRNA的靶基因CHRDL1能够作为BMP信号通路抑制剂发挥作用，参与细胞增殖与凋亡；

靶基因预测结果表明，CHRDL1的3’UTR区与miRNA-217-5p的转录调控区有8个碱基互补结合，如图1所示，在氧化应激过程中，CHRDL1为下调基因，miRNA-217-5p表达量上调，为上调miRNA，符合miRNA具有负调控功能的特点，即miRNA对能够负调控靶基因转录，因此，在小肠氧化应激过程中，miR-217-5p表达上调，通过下调CHRDL1的表达，激活BMP信号通路，促进细胞增殖。

实施例二

根据图2、3所示，本实施例提出群体验证miR-217-5p标记与肠道应激的相关性的方法，用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)对测序获得的关键miRNA(miR-217-5p)及基因(CHRDL1)的表达进行样本鉴定。

(1)实验样本准备

取40只初生荆江鸭雏鸭，半数进行运输应激处理，半数作为对照组，然后经长途运输8h后进行屠宰，采集血样和小肠组织样本，并将小肠组织样本采集后迅速放入液氮中冻存，根据血液中氧化应激指标，每组选择出6只具有极端表型值的个体。

(2)miRNA-217-5p差异表达验证

提取小肠总RNA：利用Trizol法提取小肠中的总RNA。其中，CHRDL1mRNA反转录及定量的条件为：利用ReverTra Ace qPCR RT Kit(Toyobo，日本)试剂盒进行反转录；THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix Kit(Toyobo，日本)进行qRT-PCR，引物为(F：AATGTGCCACGGTTTCC；R：TCCTTCTACTTTCTGAGGGTAT)检测每次设置3个平行管反应，以β-actin作为内参，引物序列为(F：ATGTCGCCCTGGATTTCG；R：CACAGGACTCCATACCCAAGAA)，PCR程序为：98℃、10s；(94℃、15s,60℃、30s)40个循环；

miR-217-5p定量的条件为：利用试剂盒进行反转录ReverTra Ace qPCR RT Kit(Toyobo，日本)试剂盒进行反转录，使用茎环引物进行miRNA的反转录；miR-217-5p的茎环引物为：CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGATCCAATC；

内参miRNA(U6)的特异性茎环引物为：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAAAAATATG；

THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix Kit(Toyobo，日本)进行qRT-PCR，检测每次设置3个平行，以U6作为内参。

miR-217-5p上游引物为：CTGGTAGGTACTGCATCAGGAACTG；

miR-217-5p下游引物为：TCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGC；

U6的上游引物为：CTCGCTTCGGCAGCACA；

U6的下游引物为：AACGCTTCACGAATTTGCGT；

PCR反应程序为：98℃10s；(94℃15s,60℃30s)40个循环。

miRNA和基因的表达量利用2-△△Ct法进行计算，统计采用t检验，P＜0.05和P＜0.01定义为有统计学意义，分析各组之间的表达差异。

qPCR结果表明，miR-217-5p表达量在应激组和对照组间差异极显著，如图2所示；同时CHRDL1基因表达量在两组间差异极显著如图3所示。

实施例三

根据图4、5、6所示，本实施例提出miRNA miR-217-5p对小肠上皮细胞CHRDL1基因表达及氧化应激应答的调控。

(1)质粒的构建及miR-217-5p mimics的合成

CHRDL1载体构建：根据ensemble上鸭CHRDL1的3’UTR序列设计引物，然后提取鸭小肠中的RNA，并反转录为cDNA，利用PCR方法，扩增CHRDL1的3’UTR序列，其中包括miR-217-5p结合位点，再经过回收、纯化等步骤，将目的片段克隆到pmirGLO载体中，具体的实验步骤包括对CHRDL1的3’UTR序列进行酶切位点分析，并根据载体序列信息，选择PmeI和XhoI两个酶切位点，对PCR产物进行酶切；利用试剂盒进行目的片段的纯化、酶切和回收；将PCR产物与pmirGLO载体连接和进行菌落PCR测序后获得CHRDL1载体。

(2)双荧光素酶实验验证CHRDL1与miR-217-5p的靶向结合

以原代分离的鸭小肠上皮细胞为实验载体，采用脂质体3000将CHRDL1双荧光素酶表达载体和miR-217-5p的mimics转染细胞；

试验分为对照组和处理组，具体分组如下：a.处理组(miR-217-5p mimic)：miR-217-5p的mimics和CHRDL1表达载体共转染；b.对照组(NC)：Negative control和CHRDL1表达载体共转染；c.空白对照组(BC)：CHRDL1表达载体转染；

在转染前一天，将细胞接种至24孔板，当细胞融合度达80％时，即可进行转染，转染体系为50μl，每孔具体转染体系如下：处理组：50μl opti-MEM+1.5μlLipofectamine3000+1μl miR-217-5p mimics(20μM)+0.5μg CHRDL13’UTR表达载体；对照组：50μl opti-MEM+1.5μl Lipofectamine 3000+1.5μl NC(20μM)+0.5μg CHRDL13’UTR表达载体；空白对照组：50μl opti-MEM+1.5μl Lipofectamine 3000+0.5μg CHRDL13’UTR表达载体；

转染后24h，采用双荧光素酶报告系统检测过处理组和对照组的荧光活性，如图4所示结果表明，与对照组相比，共转染miR-217-5p mimics和CHRDL1表达载体的处理组，荧光素酶活性极显著下降；

结果表明，miR-217-5p能够特异性结合CHRDL1的3’UTR，CHRDL1是miR-217-5p的靶基因之一。

(3)miR-217-5p mimics转染后，原代培养的鸭小肠上皮细胞氧化应激模型CHRDL1表达和细胞增殖变化。

通过在小肠上皮细胞中转染20nM浓度的miR-217-5p mimics，使miR-217-5p过表达，转染12h后，对细胞进行氧化应激处理(150μM过氧化氢处理)，结果表明，miR-217-5pmimics转染具能够下调CHRDL1表达；

通过在小肠上皮细胞中转染20nM浓度的miR-217-5p mimics，使miR-217-5p过表达，转染12h后，对细胞进行氧化应激处理(150μM过氧化氢处理)，处理4h后，通过CKK-8法检测细胞增殖情况，结果表明，在氧化应激处理后，miR-217-5p mimics转染组小肠上皮细胞活力强。

实施例四

检测鸭小肠组织中miR-217-5p表达水平的荧光定量PCR试剂盒。

所述试剂盒包括：反转录试剂、miR-217-5p和U6的茎环引物、miR-217-5p和U6的上下游引物、荧光定量PCR反应液；

反转录试剂：购自Toyobo公司的反转录试剂盒ReverTra Ace qPCR RT Kit；具体成分为：miR-217-5p茎环引物：CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGATCCAATC；U6茎环引物：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAAAAATATG；

荧光定量PCR反应液：购自Toyobo公司的THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix Kit，具体成分为buffer，ddH 2 O；

miR-217-5p上游引物为：CTGGTAGGTACTGCATCAGGAACTG；

miR-217-5p下游引物为：TCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGC；

U6的上游引物为：CTCGCTTCGGCAGCACA；

U6的下游引物为：AACGCTTCACGAATTTGCGT；

所述试剂盒的工作程序为：98℃、10s(step1)；94℃、15s，60℃、30s(step2，45个循环)；37℃、30s(step3)。

本发明提出的miRNA(miR-217-5p)与鸭肠道氧化应激有很好的相关性，通过有效性和分子生物学验证，miR-217-5p在应激组和对照组样本间的差异极显著，在应用于抗逆蛋(肉)鸭的辅助遗传育种中，可实现早期辅助选择，同时本发明提供的检测miR-217-5p表达水平的荧光定量PCR试剂盒包含了从RNA提取到荧光定量实验所需的整套试剂，即方便使用，又保证了结果的一致性。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

序列表

序列表

<110> 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所

<120> 一种与鸭肠道氧化应激相关的miRNA及其应用

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> RNA

<213> 鸭miRNA(anhimidae)

<400> 1

uugugcuuga ucuaaccaug u 21

<210> 2

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ctcaactggt gtcgtggagt cggcaattca gttgagacat ggtt 44

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctggtaggtt gtgcttgatc ta 22

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tcaactggtg tcgtggagtc ggc 23

<210> 5

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgacaaaaat atg 53

<210> 6

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ctcgcttcgg cagcaca 17

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

aacgcttcac gaatttgcgt 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tgggtgatgc caactgtcta 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gtgggtttgc gagtgtcttt 20

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

atgtcgccct ggatttcg 18

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

cacaggactc catacccaag aa 22

Claims

1.一种检测miRNA-217-5p的试剂在制备鸭肠道应激检测试剂中的用途，其特征在于：所述miRNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述miRNA的靶基因为样腱蛋白1，所述miRNA通过下调样腱蛋白1基因的表达，参与小肠上皮的氧化应激应答。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述miRNA通过下调样腱蛋白1基因的表达，在小肠上皮的氧化应激过程中发挥促进细胞增殖作用。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述miRNA及样腱蛋白1基因的表达水平是通过RT-qPCR检测，根据鸭小肠组织中的所述miRNA的表达水平，判断鸭小肠抗氧化能力并进行筛选。

4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于：RT-qPCR检测试剂盒包括反转录试剂、miRNA-217-5p茎环引物，miRNA-217-5p上游引物和下游引物；内参U6特异性茎环引物，U6上游引物和下游引物；荧光定量PCR反应试剂；

miRNA-217-5p茎环引物为：CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGATCCAATC；

miRNA-217-5p上游引物为：CTGGTAGGTACTGCATCAGGAACTG；

miRNA-217-5p下游引物为：TCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGC；

内参U6特异性茎环引物为：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAAAAATATG；

U6上游引物为：CTCGCTTCGGCAGCACA；

U6下游引物为：AACGCTTCACGAATTTGCGT。