CN113444726A - 一种与仔猪细菌性腹泻相关的lncRNA ALDB-898及其应用 - Google Patents

一种与仔猪细菌性腹泻相关的lncRNA ALDB-898及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及基因工程和猪抗病遗传育种领域，提供了一种与仔猪细菌性腹泻相关的lncRNA ALDB‑898序列及其应用，所述的lncRNA ALDB‑898的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明提供了所述lncRNA ALDB‑898的荧光定量PCR检测引物对，如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示），并通过PCR证实lncRNA ALDB‑898的客观存在，且在C型产气荚膜梭菌感染的仔猪回肠和CPB2毒素处理的肠上皮细胞（IPEC‑J2）中均显著下调。本发明构建了lncRNA ALDB‑898过表达载体，并发现超表达lncRNA ALDB‑898可以显著抑制CPB2毒素诱导的IPEC‑J2细胞毒性及炎症，为仔猪细菌性腹泻新型防控药物研发提供了设计靶点，并为仔猪C型产气荚膜梭菌的抗病育种奠定了技术基础。

Description

一种与仔猪细菌性腹泻相关的lncRNA ALDB-898及其应用
技术领域
本发明涉及基因工程和猪抗病遗传育种领域，尤其涉及一种与仔猪细菌性腹泻相关的lncRNA ALDB-898及其应用。
背景技术
仔猪细菌性腹泻是集约化养猪生产中普遍存在的肠道疾病，严重影响养猪业的健康发展和经济效益。C型产气荚膜梭菌作为常见病原体，是引起仔猪腹泻的主要病原菌之一，该菌引起的腹泻由于发病迅速、传染力强等特点更容易造成较为严重的疫病。CPB2是C型产气荚膜梭菌产生的关键致病毒素之一，该毒素可促进腹泻发生，并通过血液循环，加快全身系统性感染。目前，仅从疫苗和抗生素的角度防治仔猪细菌性腹泻具有局限性，从遗传基础上提高仔猪对病原菌及毒素的抗性，是解决仔猪腹泻的有效途径。因此，开发腹泻相关的分子标记，培育抗病新品种是当务之急。
LncRNA在细菌感染性疾病中发挥重要调控作用，lncRNA是一类长度大于200 nt的非编码RNA分子，占非编码RNA的80～90%，在动物、植物、酵母甚至病毒中广泛存在。LncRNA虽不编码蛋白，但可在多个水平对基因的表达进行调控，参与细胞增殖、凋亡、分化及疾病的发生。由于lncRNA的表达具有较强的细胞、组织特异性以及发育阶段特异性等，因此常常作为疾病诊断的生物标志物或被利用开发为精准药物，在畜禽中常被作为分子靶标用于分子育种工作。目前已通过高通量测序技术，鉴定和筛选出多个lncRNAs参与调控畜禽的感染性疾病，尤其在肠道免疫炎症反应中发挥重要功能。然而，lncRNA在C型产气荚膜梭菌感染引起的仔猪腹泻中的作用机制的相关研究较少。
发明内容
本发明提供了一种与仔猪细菌性腹泻相关的lncRNA ALDB-898及其应用，利用高通量测序技术分析了仔猪回肠在感染C型产气荚膜梭菌前后全转录组变化差异，发现一种lncRNA（ALDBSSCG0000000898）ALDB-898，探索其在仔猪腹泻过程中的功能机制，进而为仔猪腹泻防控药物研发提供了新的设计靶点，并为C型产气荚膜梭菌抗病育种奠定了技术基础。
为实现上述目的，本发明通过以下方案实现：
本发明的第一方面，提供了一种lncRNA，其为lncRNA ALDB-898，所述的lncRNAALDB-898的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明的第二方面，提供了lncRNA ALDB-898的荧光定量PCR特异性引物对，包括：
上游引物lncRNA ALDB-898-F，如SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列。
下游引物lncRNA ALDB-898-R，如SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列。
结果证实，lncRNA ALDB-898在C型产气荚膜梭菌感染的回肠组织以及CPB2诱导的IPEC-J2中均显著下调表达，表明该lncRNA参与调控仔猪的细菌性腹泻。
本发明的第三方面，提供了一种检测lncRNA ALDB-898亚细胞定位方法，具体步骤为：
（1）首先设计lncRNA ALDB-898的RNA-FISH探针，其序列如SEQ ID NO. 4所示；
（2）待IPEC-J2细胞长至70%时，PBS清洗细胞2～3次，然后使用4%多聚甲醛室温固定10 min，清洗后再使用通透液通透5 min，再次清洗；
（3）每孔加入200μL预杂交液，37℃封闭30 min；弃去预杂交液，加入预热的含ALDB-898探针的杂交液，37℃孵育过夜；在42℃，避光条件下，使用试剂盒中的洗液Ⅰ洗涤3次，每次5 min；洗液Ⅱ洗涤1次，5 min；洗液Ⅲ洗涤1次，5 min；避光，室温条件下，PBS洗涤2～3次，每次5 min；
（4）用DAPI染色液在室温染色IPEC-J2细胞核5 min，PBS洗涤2～3次，每次5 min，即刻使用荧光显微镜检测（×400）。
本发明的第四方面，提供所述的lncRNA ALDB-898其超表达在仔猪细菌性腹泻的抗病育种药物制备中的应用。具体为提供了一种减轻CPB2诱导IPEC-J2细胞炎性损伤的方法，包括以下步骤：
步骤1、pcDNA3.1-lncRNA ALDB-898的过表达载体的构建，以IPEC-J2细胞cDNA为模板，如SEQ ID NO.5-6所示的引物，进行PCR扩增；将PCR产物和pcDNA3.1表达载体进行Hind III和Xba I双酶切，回收纯化，连接转化大肠杆菌获得。
步骤2、将步骤1中的过表达载体转染至IPEC-J2细胞中，使lncRNA ALDB-898的表达量增加，进而显著抑制了CPB2诱导的IPEC-J2细胞损伤。
结果证实，lncRNA ALDB-898具有抑制C型产气荚膜梭菌感染的作用，可以作为猪C型产气荚膜梭菌感染性腹泻的抑制物应用，例如可以制备成试剂盒或药物等的应用。另外，可作为分子靶标用于仔猪细菌性腹泻的抗病育种。
本发明具有的有益效果：
本发明首次发现了一种与仔猪细菌性腹泻相关的lncRNA ALDB-898，其在C型产气荚膜梭菌感染的回肠组织以及CPB2诱导的IPEC-J2中均显著下调表达，并进一步发现lncRNA ALDB-898超表达可以显著抑制CPB2诱导的IPEC-J2细胞炎性损伤，为猪细菌性腹泻新型防控药物研发提供了新的设计靶点，并为仔猪细菌性腹泻的抗病育种提供分子靶点，具有广泛的应用价值。
附图说明
图1为本发明实施例1中腹泻仔猪回肠组织中lncRNA ALDB-898的荧光定量检测结果；
图2为本发明实施例1中CPB2毒素处理的IPEC-J2细胞中lncRNA ALDB-898的荧光定量检测结果；
图3为本发明实施例1中IPEC-J2细胞中lncRNA ALDB-898的亚细胞定位检测结果；
图4为本发明实施例2中构建的lncRNA ALDB-898超表达载体pcDNA3.1-ALDB-898双酶切鉴定胶图；
图中泳道M为5Kb DNA Ladder，泳道1为pcDNA3.1-ALDB-898载体经Hind III和XbaI双酶切后，线性化的pcDNA3.1（+）（5428 bp）空载体片段与lncRNA ALDB-898（501 bp）序列片段；
图5为本发明实施例2中qRT-PCR检测lncRNA ALDB-898过表达效率；
pcDNA3.1组：转染pcDNA3.1（+）空载体组，pcDNA3.1-ALDB-898组：转染pcDNA3.1-ALDB-898超表达载体组；*P<0.05，差异显著；**P<0.01，差异极显著；
图6为本发明实施例2中lncRNA ALDB-898超表达对CPB2诱导的IPEC-J2细胞活力的影响；Control组：未转染任何载体且未用CPB2处理的空白对照；CPB2组：未转染任何载体且CPB2处理的阴性对照；pcDNA3.1+CPB2组：转染pcDNA3.1（+）空载体且CPB2处理组，pcDNA3.1-ALDB-898+CPB2组：转染pcDNA3.1-ALDB-898超表达载体且CPB2处理组，*P<0.05，差异显著；**P<0.01，差异极显著；
图7为本发明实施例2中lncRNA ALDB-898超表达对CPB2诱导的IPEC-J2细胞毒性的影响。*P<0.05，差异显著；**P<0.01，差异极显著；
图8为本发明实施例2中lncRNA ALDB-898超表达对CPB2诱导的IPEC-J2细胞产生炎性因子的影响；*P<0.05，差异显著；**P<0.01，差异极显著。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。正如背景技术所介绍，lncRNA参与多种生物学过程，但在C型产气荚膜梭菌感染引起的仔猪腹泻中相关lncRNA的研究还未见报道。基于此，本发明的目的是提供一种与仔猪细菌性腹泻相关的lncRNA，并将其用于仔猪腹泻的分子抗病育种中。
实施例1 ，lncRNA ALDB-898的表达及亚细胞定位
一、LncRNA ALDB-898的表达
1. LncRNA转录组测序
本研究选取30头7日龄仔猪（长×大），随机选取5头仔猪作为对照组（IC），灌服同等剂量未接种菌株的培养液，剩余25头仔猪进行 C型产气荚膜梭菌口服攻毒试验，每头仔猪灌服C型产气荚膜梭菌C59-2菌株培养液1 mL，试验期为5d。试验结束后，将试验期内每头仔猪每次排粪评分相加作为该仔猪的总腹泻评分值，并按照总腹泻评分值从高到底进行排序，选取总腹泻评分最高的前5名仔猪作为易感组（IS），总腹泻评分最低的前5名仔猪作为耐受组（IR）。采集IC、IS和IR组的回肠组织样品进行RNA-seq。RNA-seq由北京诺禾致源生物信息科技有限公司完成，根据lnc RNA的特点筛选出样品中具有差异表达的lncRNA，采用KEGG分析挑选出与C型产气荚膜梭菌有密切关系的lncRNA，通过筛选得出lncRNA ALDB-898，全长483 bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1。
2. LncRNA ALDB-898在回肠组织中表达检测
（1）回肠组织总RNA提取
步骤1、称取约0.1 g组织样本，用研钵研成粉末，置于1.5 mL离心管中，加入1 mLTransZol Up，充分震荡混匀，室温静置5 min。
步骤2、向上述离心管中加入200 μL氯仿，剧烈震荡15 s后，室温静置10 min，然后4 ℃，12000 rmp/min离心15 min。离心后吸取上层无色水相液至新的1.5 mL离心管中，加入预冷的异丙醇500 μL，上下颠倒混匀，室温静置10 min，4 ℃，12000 rmp/min离心10min。
步骤3、吸弃上清，加入1 mL预冷的75%乙醇（DEPC水配制），涡旋混匀，4 ℃，7500rmp/min离心5 min；重复1次。弃去上清，将RNA静置3～5 min，待干燥后加入30 μL RNAfree water。
步骤4、取上述2 μL RNA利用核酸蛋白检测仪检测，并计算A260/A280比值，最后置于-80℃保存。
（2）qRT-PCR检测
步骤1、取1 μg的RNA样本，使用PrimeScript TM reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒进行反转录，第一步为去除基因组DNA。其体系为5×gDNA Eraser Buffer 2 μL，gDNA Eraser 1 μL，Total RNA 1 μL，ddH2O 6 μL。反应程序为42℃，2 min；第二步为逆转录为cDNA，其体系为第一步反应液 10μL，5×Primer Script Buffer 4 μL，Prime Script® RT Enzyme Mix I 1 μL，RT Primer Mix 1 μL，ddH2O 4 μL。然后37℃，15min，85℃，5s。最后保存于-20 ℃。
步骤2、使用TB Green™ Premix Ex Taq™ II 试剂盒在Roche 480 LightCycler荧光定量仪进行qPCR。利用本发明设计的lncRNA ALDB-898荧光定量引物对SEQ IDNO.2和SEQ ID NO.3，qPCR反应体系为（20 μL）TB Green™ Premix Ex Taq™ II 10 μL，上游引物（10 μmol/L）0.8 μL，下游引物（10 μmol/L）0.8 μL，cDNA 2 μL，RNA free water6.4 μL。引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成（表2-12）。PCR反应程序：94 ℃预变性 2min，94 ℃变性 15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸10 s（40个循环）；72 ℃延伸 10 min，4℃保存。
步骤3、使用Light Cycler® 480 Software 1.5获得各孔Ct值，参照 2-△△Ct方法，以GAPDH作为内参基因计算待检测基因的表达。每组试验做3个平行，每个试验重复三次。
试验结果表明（图1），lncRNA ALDB-898表达量在C型产气荚膜梭菌感染的仔猪回肠组织（IR和IS组）显著低于对照组（IC）（P<0.05），其lncRNA ALDB-898序列通过qRT-PCR验证了其客观存在，同时也验证了RNA-seq结果的可靠性。
3. LncRNA ALDB-898在CPB2处理的IPEC-J2细胞中的表达检测
（1）IPEC-J2细胞培养
步骤1、猪肠上皮细胞系（IPEC-J2）获自北京北纳创联生物技术研究院。从液氮罐中取出IPEC-J2细胞，放入37 ℃水浴锅中轻轻晃动，使其迅速解冻，加入适量DMEM培养液后，1000 rpm/min离心5 min，吸除上清，然后加入新的DMEM完全培养液（不加双抗）吹打细胞，接种于细胞培养瓶中，于37 ℃，5% CO2的培养箱中培养。
步骤2、当细胞培养至密度为70%～80%时，吸除培养基，用37 ℃预热的PBS清洗2～3次，加入适量胰蛋白酶，放置于培养箱中消化2～3 min，显微镜观察待细胞形态回缩、变圆、即将脱落时加入等体积的完全培养基终止消化，使用移液枪轻轻吹打培养瓶底部，使细胞脱落，然后将细胞悬液移至离心管中，1000 rpm/min，离心3 min，弃去上清液，再加入适量完全培养基，随后调整细胞密度，接种于所需的细胞培养板中，培养备用。
（2）CPB2毒素侵染及对照处理
IPEC-J2细胞分为两组，一组使用CPB2毒素处理，另一组为对照，每个组设置3个重复。首先将IPEC-J2细胞接种于所需的细胞培养板中，待细胞密度达到70%时，去除培养基，用预热PBS清洗2次。CPB2处理组：配制含20 μg/mL的CPB2完全培养基（无双抗）加到对应的孔中，置于培养箱中培养24 h。对照组：无双抗的完全培养基加到对应的孔中，置于培养箱中培养24 h。
（3）细胞总RNA提取
吸弃细胞培养液，PBS清洗2次，然后在培养瓶中加入1 mL TransZol Up裂解细胞，反复吹打至细胞脱落，再将裂解液移至1.5 mL离心管中，室温静置5 min。后续步骤同上。
（4）qRT-PCR检测
具体步骤同2-（2）。
结果表明（图2），在CPB2处理组与未处理组均检测到lncRNA ALDB-898的表达，且在CPB2毒素处理的IPEC-J2细胞中lncRNA ALDB-898的表达水平极显著低于未感染细胞（P<0.01）。
二、lncRNA ALDB-898基因的亚细胞定位
步骤1、使用FISH试验盒进行RNA-荧光原位杂交试验，首先设计并合成lncRNAALDB-898的FISH探针，其核苷酸序列为SEQ ID NO.4。
步骤2、待IPEC-J2细胞长至约70%时，PBS清洗细胞2～3次。4%多聚甲醛室温固定10min，清洗后再使用通透液通透5 min，再次清洗。
步骤3、每孔加入200 μL预杂交液，37 ℃封闭30 min。弃去预杂交液，加入预热的含ALDB-898探针的杂交液，37 ℃孵育过夜。在42 ℃，避光条件下，洗液Ⅰ洗涤3次，每次5min。洗液Ⅱ洗涤1次，5 min。洗液Ⅲ洗涤1次，5 min。避光，室温条件下，PBS洗涤2～3次，每次5 min。
步骤4、用DAPI染色液在室温染色IPEC-J2细胞核5 min，PBS洗涤2～3次，每次5min，即刻使用荧光显微镜检测（×400）。
实施例2，超表达 lncRNA ALDB-898减轻CPB2诱导IPEC-J2细胞炎性损伤
一、LncRNA ALDB-898过表达载体构建
步骤1、参照猪lncRNA的ALDB数据库，以IPEC-J2的cDNA为模板，用于扩增ALDB-898全长序列，PCR的反应体系（20 μL）：2×Taq PCR Master Mix 10 μL，上游引物（10 μmol/L）1 μL，下游引物（10 μmol/L）1 μL，cDNA模板2 μL，RNA free water 6 μL。PCR反应程序：95℃预变性 5 min，94 ℃变性 30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s（31个循环）；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。
上游引物加入Hind Ⅲ（CAAGCTT）酶切位点，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5序列。
下游引物加入Xba I（CTCTAGA）酶切位点，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6序列。
步骤2、PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，切下目的条带并参照琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明书进行胶回收。将得到的目的片段连接到pMDTM19T载体（购自宝生物工程（大连）有限公司）上，然后将连接产物转化至DH5α感受态细胞中，然后涂布至含氨苄的LB固体平板上，倒置37 ℃培养过夜。挑出单一菌落于含氨苄的LB液体培养基中，37 ℃过夜培养，将鉴定正确的阳性菌液扩大培养并提取质粒pMDTM19T-ALDB-898。
（3）使用Hind III和Xba I进行双酶切，酶切体系为pcDNA3.1（+）（（购自宝生物工程（大连）有限公司））和pMDTM19T-ALDB-898各约1 μL（≤ 1.0 μg），Hind III和Xba I快切酶各1 μL，10 × QuickCut Green Buffer 2 μL，RNA free water 14 μL。将酶切体系置于37 ℃热机5～10 min。将双酶切的产物纯化后，用T4 DNA连接酶连接ALDB-898片段和pcDNA3.1（+）载体，最终构建过表达质粒pcDNA3.1-ALDB-898。然后再进行转化，培养，并使用无内毒素质粒小提中量试剂盒(天根生化科技（北京）有限公司)提取质粒并测定浓度，具体步骤参见试剂盒说明书。同时，用Hind III和Xba I限制性内切酶进行双酶切该载体，再次验证插入片段正确性。
结果表明（图4），经限制性内切酶Hind III和Xba I酶切鉴定，发现酶切后产生两条带，且载体片段（5428 bp）和lncRNA ALDB-898片段（501 bp）条带大小与预期相符，说明lncRNA ALDB-898与pcDNA3.1（+）载体连接成功。
二、IPEC-J2细胞培养
同实施例1。
三、细胞转染
步骤1、将IPEC-J2细胞接种到24孔的细胞培养板中，待细胞密度达70%时，用PBS清洗2次。然后用OPTI-MEM清洗1次，最后加入400 μL OPTI-MEM培养基。
步骤2、将pcDNA3.1-ALDB-898过表达载体（DNA≈0.8 μg）和Lipofectamine 2000（1.5 μL）分别稀释于OPTI-MEM培养基中，混匀，室温孵育5 min。将稀释好的DNA与Lipofectamine 2000混在一起，轻轻吹打混匀，室温孵育25 min。
步骤3、将混合物加到对应的孔中，置于培养箱中孵育4～6 h后更换完全培养基（无双抗），培养24 h备用。转染细胞组共分为两组，各组设置3个重复孔，pcDNA3.1组：表示转染pc DNA3.1（+）空载体组，pcDNA3.1-ALDB-898组：表示转染pcDNA3.1-ALDB-898超表达载体组。
四、qRT-PCR检测过表达效率
同实施例1。
结果表明（图5），与pcDNA3.1组相比，pcDNA3.1-ALDB-898转染可显著增强ALDB-898的表达（p < 0.01）。
五、CPB2毒素处理
同实施例1。
各试验组设置3个重复孔，共分为四组：Control组：表示未转染任何载体且未用CPB2处理的空白对照，CPB2组：表示未转染任何载体且CPB2处理的阴性对照；pcDNA3.1+CPB2组：表示转染pc DNA3.1（+）空载体且CPB2处理组，pcDNA3.1-ALDB-898+CPB2组：表示转染pcDNA3.1-ALDB-898超表达载体且CPB2处理组。
六、CCK8检测
根据试验要求，对其进行转染和CPB2处理，然后每孔加入10 µL CCK8溶剂，孵育4h。随后放置在酶标检测仪中，450 nm处测量吸光度，计算细胞活力。细胞活力（%）=（试验组-空白组）/（对照组-空白组）× 100。
CCK8结果表明（图6），与pcDNA3.1组相比，lncRNA ALDB-898过表达显著增加了CPB2处理的IPEC-J2细胞活力，尤其在CPB2处理24 h，pc-ALDB-898组的细胞活力明显高于pcDNA3.1组（P < 0.05）。
七、LDH检测
步骤1、根据试验要求，将各培养孔分成：空白孔（无细胞孔），对照孔（未处理的对照细胞孔），最大酶活性对照孔（未处理的用于后续裂解的细胞孔），以及样品孔（处理细胞孔），并做好标记。然后给予不同转染和CPB2毒素处理，继续常规培养。到预定的检测时间点前1 h，取出培养板，在“样品最大酶活性对照孔”中加入10 μL LDH释放试剂，反复吹打混匀，继续培养。
步骤2、到达预定时间后，收集细胞上清液于离心管中，500 rpm/min离心5 min。分别取各孔的上清液120 μL，加到新的96孔板中。
步骤3、参考说明书配制LDH检测液。每孔加入60 μL LDH检测液，混匀，置于摇床室温避光孵育30 min。然后在490 nm处测定吸光度。细胞毒性率（%）=（处理样品吸光度－样品对照孔吸光度）/（细胞最大酶活性的吸光度－样品对照孔吸光度）×100。
结果表明（图7），lncRNA ALDB-898超表达显著抑制了CPB2诱导的LDH活性的升高（P < 0.05）。
八、ElISA检测
步骤1、先将试剂盒和样本置于室温平衡1 h，将收集的细胞培养上清液，2000rpm/min，离心20 min。
步骤2、设空白孔、待测样品孔和标准品孔。分别使用样品稀释液将样品稀释为5倍和10倍，并分别加到酶标板孔底部，每孔加酶标试剂100 µL（除空白孔），随后用封板膜封板，37 ℃温育30 min。
步骤3、揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30 s弃去，重复洗涤5次，拍干。
步骤4、每孔先加入显色剂A 50 µL，再加入显色剂B 50 µL，震荡混匀，37 ℃避光显色15 min，加终止液50 µL终止反应。最后使用酶标仪测量450 nm处吸光度值。通过标准曲线计算炎性因子含量。
ELISA结果显示（图8），CPB2显著诱导IPEC-J2细胞分泌促炎因子IL-6、IL-8、IL-1β和TNF-α（P < 0.01），lncRNA ALDB-898的超表达显著抑制IL-6、IL-8、IL-1β和TNF-α的产生（P < 0.01）。综上，lncRNA ALDB-898可显著抑制CPB2诱导IPEC-J2细胞的炎性损伤。
<110> 甘肃农业大学
<120> 一种与仔猪细菌性腹泻相关的lncRNA ALDB-898及其应用
<160> 6
<170> SIPO SequenceListing 1 .0
<210> 1
<211> 483
<212> RNA
<213> 猪长链非编码RNA
<400> 1
aagtaaatgg caccgctgga atccaaaccc taatgaagca gagtctcttc ttaaccactg tctatactaa 70
agggtgcaga caacaggaaa gcaacaactc tggtttggtc accgtggtgg tcttgcccgg cacatggtgg 140
gagtccagcc agagctgatg gcctcctctt ccctcctgac tattcatctg cttccactcc aggagcacca 210
caggcatctc ccctgatgca gggtaaattg cagaagccat ggtaccagcc cgcatccatg accccacaga 280
tattcccctt ctccaagtgg actgacccag gccttttaca aacacagaag gatcttgtgc aagatgaatt 350
ctagtactag ctactaaaag atctcttcac acaaaaggca atattcctga atttgtattg gtccaggcat 420
tcgagaatca aggtgcatcc gtaggaagaa agagagagag accagttctg aagagtatct gct 483
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aaagggtgca gacaacagga a 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aggggaatat ctgtggggtc a 21
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tggat+tccagcggtg ccat+ttactt 25
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cccaagctta agtaaatggc accgc 25
<210> 6
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tgctctagaa gcagatactc ttcagaa 27

Claims (5)

1.一种与仔猪细菌性腹泻相关的lncRNA ALDB-898，其特征在于，所述lncRNA ALDB-898的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
2.用于扩增权利要求1所述的lncRNA ALDB-898的荧光定量PCR特异性引物对，其特征在于，包括：
上游引物lncRNA ALDB-898-F，核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示；
下游引物lncRNA ALDB-898-R，核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示。
3.一种如权利要求1所述的lncRNA ALDB-898的亚细胞定位方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）首先设计lncRNA ALDB-898的RNA-FISH探针，其序列如SEQ ID NO. 4所示；
（2）待IPEC-J2细胞长至70%时，PBS清洗细胞2～3次，然后使用4%多聚甲醛室温固定10min，清洗后再使用通透液通透5 min，再次清洗；
（3）每孔加入200μL预杂交液，37℃封闭30 min；弃去预杂交液，加入预热的含ALDB-898探针的杂交液，37℃孵育过夜；在42℃，避光条件下，使用试剂盒中的洗液Ⅰ洗涤3次，每次5min；洗液Ⅱ洗涤1次，5 min；洗液Ⅲ洗涤1次，5 min；避光，室温条件下，PBS洗涤2～3次，每次5 min；
（4）用DAPI染色液在室温染色IPEC-J2细胞核5 min，PBS洗涤2～3次，每次5 min，即刻使用荧光显微镜检测（×400）。
4.一种权利要求1所述的lncRNA ALDB-898其超表达在仔猪细菌性腹泻的抗病育种药物制备中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，具体方法如下：
步骤1、构建pcDNA3.1-ALDB-898过表达载体，以IPEC-J2细胞cDNA为模板，如SEQ IDNO.5-6所示的引物，进行PCR扩增；将PCR产物和pcDNA3.1表达载体进行Hind III和Xba I双酶切，回收纯化，连接转化大肠杆菌获得；
步骤2、将步骤（1）中的过表达载体转染至IPEC-J2细胞中，使lncRNA ALDB-898的表达量增加，进而减弱CPB2诱导的IPEC-J2细胞损伤。
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