CN110747230B - 一种促进牛骨骼肌卫星细胞成肌分化的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种促进牛骨骼肌卫星细胞成肌分化的方法，其特征在于：所述方法是通过增加lncRNA‑23的表达来实现促进牛骨骼肌卫星细胞的成肌分化，其中，所述lncRNA‑23的基因组碱基序列为：SEQ NO.1。本方法可以为肌肉发育分化的长非编码RNA研究提供启示，可以为进一步开展肌肉发育过程中关键lncRNA的作用机理研究打下良好的基础，对探索肌肉生长发育机制，改善牛肉的产量与品质提供启示。

Description

一种促进牛骨骼肌卫星细胞成肌分化的方法

技术领域

本发明属于生物、细胞、组织工程技术技术领域，尤其是一种促进牛骨骼肌卫星细胞成肌分化的方法。

背景技术

骨骼肌卫星细胞(skeletal muscle satellite cell)是骨骼肌中具有分化增殖潜能的肌源性干细胞，通常以静息状态存在于肌纤维肌膜与基底膜之间，在一定的条件下可以被激活，发生增殖和成肌分化，形成骨骼肌细胞，肌卫星细胞在动物出生后肌肉的生长发育和再生过程中发挥着十分重要的作用。肌卫星细胞的体外成肌分化过程很好地模拟了体内的肌肉发育过程，是研究细胞分化和肌肉发育的良好细胞模型。肌卫星细胞的激活、增殖与成肌分化过程受多种因素的调控，了解骨骼肌卫星细胞的成肌分化调控模式，可以增加人为控制肌细胞形成的可能性。

肌肉的分化和生长发育过程是内在遗传、表观遗传和外在的各种信号互作的结果，骨骼肌发育分化过程涉及多基因的表达、信号途径及网络式调控，过程极其复杂，其中，非编码RNA的调控作用受到越来越多的重视。已有研究表明长非编码RNA(long non-codingRNA,lncRNA)在肌肉发育的过程中发挥了重要的调控作用。lncRNA是一类转录本长度超过200nt的RNA分子，它不编码蛋白，以RNA的形式在多种层面上(表观遗传调控、转录调控以及转录后调控等)调控基因的表达。1ncRNA起初被认为是基因组转录的“噪音”，是RNA聚合酶II转录的副产物，不具有生物学功能。然而，越来越多的证据表明lncRNAs生物学功能丰富，可以通过转录调控、转录后调控和表观遗传调控等多种方式调控靶基因的表达而广泛参与生物体的各项生理过程。骨骼肌卫星细胞经激活、增殖、分化并融合形成可收缩并跳动的肌管，这一过程对肌肉的生成至关重要。已有研究表明，在人和小鼠骨骼肌生长发育过程中，肌特异性lncRNAlinc-MD1可促进成肌细胞的分化，此外还有一些lncRNAMalat1、lncMD、lnc-mg等均可以通过影响相关基因的表达，从而促进成肌细胞的分化。虽然这其中已有部分的lncRNA的功能被研究，但研究多见于人或鼠。目前，在牛肌卫星细胞成肌分化中lncRNA的相关研究鲜见报道。

通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术环境胁迫问题的不足之处，提供一种促进牛骨骼肌卫星细胞成肌分化的方法，该方法可以为肌肉发育分化的长非编码RNA研究提供启示，可以为进一步开展肌肉发育过程中关键lncRNA的作用机理研究打下良好的基础，对探索肌肉生长发育机制，改善牛肉的产量与品质提供启示。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种促进牛骨骼肌卫星细胞成肌分化的方法，其特征在于：所述方法是通过增加lncRNA-23的表达来实现促进牛骨骼肌卫星细胞的成肌分化，其中，所述lncRNA-23的基因组碱基序列为：SEQ NO.1。

而且，具体步骤为：

构建lncRNA-23的过表达载体pcDNA-lnc23，将pcDNA-lnc23转染至牛骨骼肌卫星细胞，增加lncRNA-23的表达水平，实现促进牛骨骼肌卫星细胞的成肌分化。

而且，所述增加lncRNA-23的表达的方法包括：采用过表达lncRNA-23表达的质粒、病毒载体或电转的方法。

本发明取得的优点和积极效果为：

1、本发明方法利用改变lncRNA表达对牛肌卫星细胞的成肌分化过程进行调控，可以为肌肉发育分化的长非编码RNA研究提供启示，可以为进一步开展肌肉发育过程中关键lncRNA的作用机理研究打下良好的基础，对探索肌肉生长发育机制，改善牛肉的产量与品质提供启示。

2、本发明方法利用改变lncRNA表达对牛肌卫星细胞的成肌分化进行调控，lncRNA作为非编码RNA，其表达改变对细胞的其它生物学特性影响较小，有利于研究其它调控因子在肌卫星细胞增殖与分化过程中的功能和影响。

3、利用本发明建立的通过改变lncRNA表达来促进牛骨骼肌卫星细胞的成肌分化过程的方法，可以有效地调控肌肉发育分化过程，借助此方法可以为肌肉发育分化的lncRNA调控研究提供新的思路和方法。也可为肌肉相关疾病的研究及改善牛肉的产量和品质等方面提供新的思路和参考。

4、鉴于目前lncRNA对牛骨骼肌卫星细胞是否具有一定的调节作用，以及具体的作用效果还不清楚，本发明构建lncRNA-23的过表达载体，然后采用脂质体试剂转染牛骨骼肌卫星细胞，过表达牛骨骼肌卫星细胞中lncRNA-23的表达水平，通过改变牛骨骼肌卫星细胞中lncRNA-23的表达，从而促进牛骨骼肌卫星细胞的成肌分化过程。本发明的目的在于提供一种通过改变牛骨骼肌卫星细胞中lncRNA的表达，从而促进牛骨骼肌卫星细胞的成肌分化过程的方法，借助此方法可以对探索肌肉发育分化的关键lncRNA的作用机理，改善牛肉的产量和品质提供新的思路和方法。

附图说明

图1为本发明中lncRNA-23在牛基因组中的位置信息图；

图2为本发明中pcDNA-lnc23重组质粒图谱；

图3为本发明中3、6、9月龄胎牛及成年牛不同组织中lncRNA-23的相对表达情况的定量PCR结果图，其中，A为3月龄胎牛不同组织中lncRNA-23的相对表达情况的定量PCR结果图，B为6月龄胎牛不同组织中lncRNA-23的相对表达情况的定量PCR结果图，C为9月龄胎牛不同组织中lncRNA-23的相对表达情况的定量PCR结果图，D为成年牛不同组织中lncRNA-23的相对表达情况的定量PCR结果图；

图4为本发明中lncRNA-23在牛骨骼肌卫星细胞增殖期及分化1-3天不同时期的相对表达情况图；

图5为本发明中过表达lncRNA-23后在牛骨骼肌卫星细胞中对lncRNA-23表达水平影响的定量PCR检测结果图；

图6为本发明中过表达lncRNA-23对牛骨骼肌卫星细胞成肌分化过程的影响结果图；

图7为本发明中过表达lncRNA-23后细胞分化标志因子蛋白印迹结果图。

具体实施方式

下面详细叙述本发明的实施例，需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。

一种促进牛骨骼肌卫星细胞成肌分化的方法，其特征在于：所述方法是通过增加lncRNA-23的表达来实现促进牛骨骼肌卫星细胞的成肌分化，其中，所述lncRNA-23的基因组碱基序列为：SEQ NO.1。

较优地，具体步骤为：

构建lncRNA-23的过表达载体pcDNA-lnc23，将pcDNA-lnc23转染至牛骨骼肌卫星细胞，增加lncRNA-23的表达水平，实现促进牛骨骼肌卫星细胞的成肌分化。

较优地，所述增加lncRNA-23的表达的方法包括：采用过表达lncRNA-23表达的质粒、病毒载体或电转的方法。

本发明的一种设计思路是：

设计并构建lncRNA-23的过表达载体，然后采用脂质体试剂转染牛骨骼肌卫星细胞，过表达牛骨骼肌卫星细胞中lncRNA-23的表达水平，通过改变牛骨骼肌卫星细胞中lncRNA-23的表达，从而促进牛骨骼肌卫星细胞的成肌分化过程。

更为具体地：

一种促进牛骨骼肌卫星细胞成肌分化的方法，包括以下步骤：

第一步、牛骨骼肌卫星细胞分离培养、体外成肌诱导分化模型的建立及肌卫星细胞成肌分化前后lncRNA-23表达的检测：

采用胰酶和胶原酶联合消化的方法分离牛骨骼肌卫星细胞，建立牛骨骼肌卫星细胞体外成肌诱导分化模型。对lncRNA-23的碱基序列和染色体定位进行分析，然后采用定量PCR方法检测牛骨骼肌卫星细胞及成肌分化后肌管中lncRNA-23的表达量；

具体步骤是：

(1)牛骨骼肌卫星细胞分离培养、体外成肌诱导分化模型的建立。

采用胰酶和胶原酶联合消化的方法分离牛骨骼肌卫星细胞。无菌条件下采集牛胎儿后肢肌肉，剪成合适大小，置于PBS缓冲液中清洗数次，在培养皿中用眼科剪充分剪碎，用预热的PBS缓冲液冲洗一次后在离心机中以1000r/min的转速离心5min，弃去上清液，加入5ml的0.2％胶原酶II在37℃水浴中消化1h，期间每隔10min涡旋振荡10s，然后加入含有EDTA的0.25％胰酶消化30min，期间每隔10min涡旋振荡10s，最后加入含20％的胎牛血清培养基终止消化，将上述混合液依次过100目、200目和400目细胞筛，将滤液收集到50ml离心管中，在离心机中以1000r/min的转速离心10min，用培养基重悬，接种到合适的培养皿中，37℃、5％CO₂培养箱中培养。在含有20％胎牛血清的DMEM生长培养基中进行培养，待细胞生长至80％融合时，加入含有2％马血清的DMEM分化培养基进行体外成肌诱导分化，观察肌卫星细胞分化情况及肌管形成状态，建立牛骨骼肌卫星细胞体外成肌诱导分化模型。

(2)lncRNA-23的筛选及基本特征分析。

利用超数排卵和胚胎移植技术获得了遗传背景高度一致的和牛样品，分别采集3月龄牛胎儿、6月龄牛胎儿和9月龄出生个体的肌肉样品进行lncRNAs高通量测序，筛选牛肌肉发育中3个不同时期差异表达的lncRNA，共获得180条3个时期肌肉组织共表达的lncRNAs，根据各个时期RPKM值大于5进行初步筛选，再对所筛选出的lncRNAs的各组织表达谱及时序表达谱等综合分析，结果均表明所选lncRNAs均于胚胎发育的初期高表达，待肌肉形成后表达量均下降，甚至几乎不表达，提示所选lncRNA均可能参与调控牛骨骼肌发育与肌肉形成。因此选择肌肉组织表达谱和时序表达谱较高的LncRNA-23进行后续成肌分化调控研究，以期建立通过改变牛骨骼肌卫星细胞中lncRNA的表达，从而影响牛骨骼肌卫星细胞的成肌分化过程的方法，为肌肉发育分化的lncRNA调控研究供新的思路和方法。挑选有潜在调控骨骼肌卫星细胞分化的lncRNA-23作为目标lncRNA。进一步对该lncRNA的基本特征进行分析，通过RACE实验扩增到4001bp长度的lncRNA-23。编码潜能分析显示lncRNA-23无编码潜力，为非编码RNA。基因组定位显示，其位于牛基因组的23号染色体上(24561793-24565791)。检索结果见附图1。

lncRNA-23的基因组碱基序列(4001bp)：SEQ NO.1

GGGAGGAGAGACAGAGCGACCAATGAGAAGTTGTAGCTGTGCCTTTGAGATCAAAATGTCTCATCTCTTCCACTGAACCAGAGAACTCAGAGTTGAGTACAGGTTCATTTTAACTGGTTAAATCCTTCACATCTAGATCTGAAATGCCATGCATGGCACATGCTTTTCAGGAATGAGAATTTGCATAAGTGAGAGAGACTGAGGTTTTTGGTCCTGAGAACTAGAAAGAGCCAGTTTTAAGGGACCTGTCCTTCATAAACCAGCTGAGAGCCAGAAGTGATTAATTCATGTAAGGATACAAAAAAAAAAAAAATAATAATAAATTTCCAAAGAAATGATGCCAGAAAACCAAGACCATGCTAACCATCGCTGGGGTGAGACTGTCTCTAGCATTTGGATGTGAATTATTTTGTCTTTTGGTCAAGCCCAACCTCATATGGTCAAAAGATTATTTAAAAGTTCCTTTCAACATTTCAGACAAAACCAACAATAAACTTTGAAGAACCAAATACTTGATTGTTTTGAGTCTCATTTTCCTTTTCCACGTCATCTAACTTAAAATATCAGGAAGGAAATTCATGGCAATTCATGGAACAGATGTGGAAATGAAGGGAAAGGTAGGCTGGAAAAACAAAACAAAGCAAACAGCTGTAATAAAATCAGAATCTTTCAGACCAGCATAAATGGGAGGAAAAATTCTAGGAAAGGACTATAAAAACATGTTTCTGAGTTTTGTACAGGCCAATGGACATTGATACAGCAATTGGCTTTAGGTCTTTTTCCCAGATTATTTTTTTAGCTTCTTACCTGCCCAAATCTCCTGATTTTGGCTGGTGGTGTTAGTAGGAAGGATGGGGAGGGATGTTGTGTCACATGGCCACAAGTGTGCTCTATGGTGTTGGTGAAATCACTACCCTTTCTCTTTCATTCCTGTAATAGTTGTATAACTCCATCTGCCCACCACAGAGTGGGTTAAAGATTAATGAGATAACACATGTGGAGGGTCTTGAGTTTCATAGAACAGGCTGATGGCCGTATAAAATGTCACTCAACATGGTATTGAAAACAAGATTTATTTTCCCCTCCTTCTGCCCTGTAGTCAGTGGATCACAAGACTTAAATTTCGCTTGTTCTTGAGAAACTCCATTTAAAAGCATTCAGAACTTAAGTAACAGTCAAGGTAGCATGAAAAGCATAAGCAGAAATTACAGTTCTTTCCTATTTCTTTCAGCAATCAGGGCAGTACTTGAATATAAGTGTCTCAGAAACAACATGAGAAGGAAGGATGGTGGTTTCCCATGAATGGCCTCAGAAAGACTCTTGCATTTGGGCAAAATCAAGGATGAGCTAAAACAAGGAGAGGTCTGAATGATAGACAATGGAAGCTTCAAGATTACTGCTGGCAGAGGGGTGTAGGTAGGAAGGACCTGGCTTGGGCATCTGTGCATTCTGGCTCTGTGACTCTGAGCAAGCTACTTAACCTCTCTGAACCTGTTTCCTCATCTGTAAAGTGATTGTAATGCTACTGATCCAACAGAAGGCTTCAGTGAAATAGATGGATGTACAGTGCCATGAACCCAGTATTAGAAGTCTAATAAATGGTCACTATCACTCTTGTTACTACTATTCAATATATTCTTTATTAATTAATATTAATATGGCAGCAGAGACTACCCACTCCATGGAAGTCCTTATGTCTGACCCATTTTAAAGTTTCATCCACATGACAGTTGTACAAGGGGTGGTTCTAAGATATTTGGGAAAGCTTAAATATTTTTAAAAAATACATCTTTCACAATTTTGGTTTCCCTTATTTAAAAAAATCACATTTGTAATCATTTCGTATGTCTGAAAAAGATTTGTTAAGGAAGGGAATTCATCAGTATCATATCTGACAAGGATCAACAGAGGTTCTGAATATCCAGAGCTCTAGTCTCATTTTCAGGACTTTTAGGAAAAGACATGAACGGTGAGACACTCAGACTGTCCCCTTATCCATCTTAAAGCCTTGCCCTCTGACGACAGAGCTGACCCTACCTAGTCAGCCCTGTGCTGGATGAAGAGAAAGCAAGACTGCGGGAAAATCGCCCCCATTTCACTCTCTGAATTTCAAGTAGAAGCATCTTAGTTTTCTCTCTCCCTTCTCTGCCCCATAGAAAGGCCTGATAAAAGTTTCTTACAATAGAACCCAAAAGTTGATGCTTTTATGGGGATTAGGATCCTTCTGGTGTCTGCAGGAGGAACAGTCCACACAGATGCATCTACCCTGGGAGTCTGAGCTCTTGTGACCTGTACTGGAGTCACTGCCGGTGTGCTCGGTGGCTGCCATGAAACAGAAGCTATTCTGGAGTTCACCGAGGCTCAGGCCAAATTATTTGGGGCTTACCATCATCTGGCTGAGGGGGTAGGAAATAAAACAGTGGTCCCTCCTTTTAAGGCAAGCCTAGGTTAATGTGTGGAGACAGAACCTTATTTTTCCAAAGGCTCAGCCAGACATCTTGCTATTTTTAGAGGACTGGCCAGTCCTGAATGTTGATTCCATCATGGGCATGAGCCTGATTTTAACTTCCCAGGGCCAGCCAAGAGCAAGGGCAGCTCCCAAACCCATCTTCTCTCCCTGCAGGCACCCTGCCACTTCTCTCAATGGTATTTCACCATCACTGCCATGCTTACCCTGTTTCTCATCAGAGCTGGAGGGCTGAACTGATACTTAGGAGGAGGCTGGGGCAAGGGGATGAGCAGAGAGAGCTGGCATGATACTAAGTCACTTACTTCTTTATGCTTCCAGCCATTCTGTGAAGTACCTTTCATTACACAGGATGAAACTCACTCCAGCAGGTTAGATAACCTGGAGGCAAGGAGTGGTTAGGAAACACCCACATCACACAGCTGATAAATAACTAACCTAGGATTTGAAGGACCTCTTTGATCCAAAGCACACATTCATTTCATGTGCTGTATATCCCAACCTCATCTGAGCCTAGAGCCATAGAGGCACCTATTAAAACCCCTATTCCCAACAACCCAGAGCCACAGAATCAGAATCTCCGTGGGACTGGCCCGACATTCACATTTTAAACAAGATTCTTCTAGGGGATTTCTAGGCTCTGCAAATTGGGGAAGAACAGCTCTGGGAGAGCTGCTTTCAAACATAGAGAGAACATTAGAATCATAAGGGAGCTTGTTAAAAATGCAGGTTCTTCTGTCTTGCCCGCCAAAGCTCCTGAGAAGCCAGGGAGCCTGGACTCAGGAATCTGCATTCTCAATTATTCTGCTGAAAGTGGGCAGAAGCCTTTGAAAAACAGGGACCTAATAATAAATAAGAAAGAGAGAAGTAGATACTAAAGTAATGAAATCATTTAATACTGGAAAGGACTCATTTGACAGCAGTCCAGGGAAAATTATTTAGTTTGGATTTAAGGAAGAATTTCTTGCAGACATGACGACAAATGGGTGATCTCTTTCTACTATGTGAACAGTGAACATATTAGTAGCAGAAAGGGGAGCAGGCACTGTGGTCTGTACCTGGCCACTGACATCTTATCTTTTCCATGTTCCTGAATCTCAGCTTCTACCTGGAATGTTCTTTTCCCTTTGCTTATCTTCACTAGTTAAAATTTCTCTCAAATCTTAGTTCAAAAGATACTTGCTCCACGAAGTTTTCTCCCAGTTTCCCCTCTTCTTCTTCTTTGTTTCTATTGTTTGCACCTGTCATTGGGCATGCATCACATCTCACCCTGCTGTTGGATTCCCTGGGTACCTGTAATGCACACGTTTCCTCACAAAAAGGGCTAGGACCTGACAGCTTTGTTTTTGATTCCCCACACTGCTGCTCAGTGAAGGCCTTTTGCTCAATAAGGGTGGAGGAGATAAAGCCATCACCGCTGTTACTCTTACTATGTAAGTTTCTCAGCACTGTAACAGGCAACTTTTATTAAATATTCCTATTTTGCTGATGAAGGACACAAGGCACTGATTGAGAGATTGCTGTTTGTGGAGGG

(3)胎牛不同月龄、不同组织及分离纯化骨骼肌卫星细胞中lncRNA-23表达变化检测将50-100mg组织块在液氮中研磨至粉末或提取未分化牛骨骼肌卫星细胞及分化后肌管的RNA，均采用Trizol法提取组织和细胞各时期的总RNA。提取步骤：向研磨好的组织粉末或细胞培养皿中加入1ml Trizol细胞裂解液，反复吹打使其充分裂解。显微镜下观察细胞完全裂解后，将上述Trizol裂解液收集至1.5ml的无RNA酶管中。氯仿抽提：按Trizol和氯仿体积比为5:1的比例加入200μl氯仿，剧烈震荡15s，室温放置3min。在4℃离心机中，以12000r/min的转速离心15min。重复氯仿抽提步骤一次。在4℃离心机中，以12000r/min的转速离心15min后吸取上部的透明水相，并加入2倍体积的异丙醇，涡旋震荡混匀。在4℃离心机中，以12000r/min的转速离心15min。小心吸弃上清液，将70％乙醇(使用无酶水配制)1ml加入管中。在4℃离心机中，以12000r/min的转速离心15min。小心吸弃乙醇，将无酶管横放至大部分乙醇挥发。将50μL无RNA酶水加入无酶管中充分溶解RNA，涡旋混匀后离心数秒使液体置于管底。使用Nano-Drop ND 2000c仪器检测RNA的质量和浓度。

通过定量PCR检测牛不同月龄组织中及骨骼肌卫星细胞不同时期lncRNA-23的表达变化，RNA的反转录及定量PCR操作按照试剂盒说明书进行。所用引物序列见表1，GAPDH作为内参。RNA的反转录及定量PCR操作条件如下：

①RNA反转录体系及条件：

配制成12μL的混合液。

在PCR仪上70℃保温10min后，迅速在冰上急冷2min以上，急冷后将混合液甩至PCR管底。

随后，向混合液中加入：

共20μL体积。

将配好的混合液放置于PCR仪上，并设定程序：先于30℃条件下保温10min，然后在42℃条件下保温1h，最后在70℃条件下保温15min。上述程序结束后，将反转录后的cDNA混合液取出在冰上冷却。

②定量PCR检测体系：

反应液的配置：在冰上配置反应液，每个样品中的检测指标都要进行复孔实验，并进行单孔NTC实验，采用白色8连管进行定量PCR检测。

8连管中每个单管中反应液配置如下：

共20μL反应体积

qPCR的反应条件：

充分混匀反应液后，离心，使反应液到反应管底部，置于定量PCR仪上。具体反映程序如下：

预变性：95℃条件下10min

变性：95℃条件下10s

退火：60℃条件下20s

延伸：72℃条件下15s

重复变性至退火步骤40次

反应结束后，绘制溶解曲线，本实验中检测荧光温度范围为：65℃-95℃，升温速率为0.5℃/次循环，恒温时间为10s/次循环。

所有反应结束后，于30℃条件下保温30s，防止反应结束后取出反应管时被烫。

表1 lncRNA-23实时定量PCR引物序列

定量PCR检测结果见图3和图4，实验结果表明，lnc23在3月龄和6月龄胎牛肌肉组织中表达量相对较高，但在9月龄初生犊牛和成年牛肌肉组织中表达量较低。组织表达谱结果表明，其主要在牛肌肉发育的初期表达，提示该lncRNA-23可能参与牛骨骼肌发育与肌肉形成。

第二步、lncRNA-23过表达载体构建及过表达效果检测：

具体步骤是：

(1)lnc23过表达载体构建

A.设计并合成带有酶切位点和保护碱基的lnc23引物，序列详见表2，重组质粒信息详见图2。

表2基因克隆引物

B.PCR扩增lnc23目的片段，反应体系与反应条件如下：

①lnc23片段扩增反应体系

②lnc23片段扩增PCR反应程序

98℃，3min，1个循环；98℃，10s，59℃，30s，72℃，3min，30个循环；72℃，8min，1个循环

③PCR结束进行电泳检测，片段大小正确后进行胶回收。

④双酶切：采用EcoR V和Xho I对纯化后的PCR产物和pcDNA3.1(+)载体进行双酶切，酶切反应条件为45℃30min，80℃5min，酶切反应体系如下：

⑤连接：于22℃过夜连接，连接体系如下：

注：体系中x与y的物质的量之比为3:1。

⑥转化步骤，于冰上操作，100μLDH5α感受态中加入10μL连接产物，轻轻混匀，冰浴30min。然后42℃水浴45s，冰浴1min，重复2次。冰浴3-5min，加LB液体培养基补足体积至1mL，37℃220rpm摇菌1h。取100-200μL菌液涂于含100mg/LAmp的LB平板上，正面培养1h后，倒置37℃过夜。次日，挑取单克隆于500μL含Amp的液体培养基中37℃220rpm震荡培养4-6h，取1μL菌液进行菌液PCR。

⑦挑选阳性单克隆菌液进行测序，测序结果与数据库进行blast比对。

(2)过表达lncRNA-23表达的效果检测

将lncRNA-23的上述过表达载体和空载体分别采用脂质体试剂转染牛骨骼肌卫星细胞，待牛骨骼肌卫星细胞密度达80％汇合度时开始转染，以24孔板1个孔为例，其余规格的培养板按24孔板比例计算，每组设置3个生物学重复。细胞转染按lipofectamine 3000说明书进行，转染过程如下：

用opti-MEM培养基稀释lipofectamine 3000和质粒DNA，具体比例如下：

①25μL opti-MEM+1.5μL lipofectamine 3000

②25μL opti-MEM+1.0μg DNA/Vector+2.0μL P3000

按上述比例稀释完后室温孵育5min，然后将②加入①中，吹吸混匀后室温孵育15min。从24孔板吸出50μL培养基，然后加入50μL脂质体-DNA复合物，置37℃5％CO2培养箱培养，按实验需要对转染细胞进行分析，以转染后24h作为增殖期的检测点，同时诱导分化后48h(DM2)作为分化期的检测点。采用Trizol法提取转染细胞的总RNA，采用定量PCR方法检测lncRNA-23的表达，总RNA提取、RNA的反转录及定量PCR操作与第一步中方法相同，所用引物序列见表1，检测结果见图5，实验结果表明转染lncRNA-23的过表达载体后显著增加了lncRNA-23的表达水平(*，与对照NC相比p<0.05)，可以用于lncRNA-23的表达调控研究。

第三步、过表达lncRNA-23表达对牛肌卫星细胞成肌分化的影响：

构建过表达载体转染牛骨骼肌卫星细胞增加lncRNA-23的表达，然后将肌卫星细胞进行成肌诱导分化，通过肌管的形成状态判断过表达lncRNA-23后对牛肌卫星细胞成肌分化的影响，并分析细胞分化标志基因的蛋白表达水平；

具体步骤是：

将lncRNA-23的过表达载体采用脂质体试剂转染牛骨骼肌卫星细胞，具体操作与第二步中质粒的转染方法相同。转染24h后，将培养基更换为成肌诱导分化培养基继续培养，对肌卫星细胞进行诱导分化48h。通过肌管的形成状态判断过表达lncRNA-23对牛肌卫星细胞成肌分化的影响，结果见图6，与对照组(pcDNA3.1+)相比，转染了pcDNA-lnc23的肌卫星细胞经诱导分化48h后形成的肌管多而粗壮，表明上调lncRNA-23能够促进肌卫星细胞的成肌分化，实验结果说明lncRNA-23可能正调控牛骨骼肌卫星细胞的分化过程。

细胞总蛋白提取与Westernblot

(1)细胞总蛋白提取

吸弃培养基，加预冷PBS清洗细胞1-2次，以6孔板为例，牛骨骼肌卫星细胞每孔加入200μL含1％PMSF的RIPA裂解液，冰上裂解10min，转移至1.5mL无酶离心管。4℃12000×g离心10min，转移上清至新的1.5mL无酶离心管，蛋白样品于-20℃保存。

(2)Western blot

采用BCA试剂盒进行蛋白浓度测定。用4×蛋白上样缓冲液稀释蛋白，使所有样品蛋白上样量相同，于100℃变性10min。再进行SDS-PAGE电泳检测(根据PAGE凝胶快速制备试剂盒说明书进行)首先80V恒定电压下电泳30-40min，待蛋白到达分离胶后，120V恒定电压下电泳90min后。再以300mA恒定电流转膜2h，转膜结束用5％脱脂奶粉封闭2h，TBS T清洗膜3次，每次10min。按抗体说明书稀释一抗，将膜与一抗封至杂交袋，4℃过夜孵育。用TBST清洗膜3次，每次10min。按1:20000稀释与一抗来源同种属的二抗，并将PVDF于二抗稀释液中室温孵育1h，TBST清洗膜3次，每次10min。向PVDF膜加200μLECL超敏发光液，采用ChemiDoc^TMImaging System成像存图，结果如图7显示。上述研究结果提示，改变牛骨骼肌卫星细胞中肌肉发育分化相关lncRNA-23的表达，可以影响牛骨骼肌卫星细胞的成肌分化过程。

当然，lncRNA-23表达水平改变的方法包括构建lncRNA-23的过表达质粒、病毒载体或电转等其它能够改变lncRNA-23表达水平的手段。

尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例和附图所公开的内容。

序列表

<110> 天津农学院

<120> 一种促进牛骨骼肌卫星细胞成肌分化的方法

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 4001

<212> DNA/RNA

<213> lncRNA-23的基因组碱基序列(Unknown)

<400> 1

gggaggagag acagagcgac caatgagaag ttgtagctgt gcctttgaga tcaaaatgtc 60

tcatctcttc cactgaacca gagaactcag agttgagtac aggttcattt taactggtta 120

aatccttcac atctagatct gaaatgccat gcatggcaca tgcttttcag gaatgagaat 180

ttgcataagt gagagagact gaggtttttg gtcctgagaa ctagaaagag ccagttttaa 240

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tcaagcccaa cctcatatgg tcaaaagatt atttaaaagt tcctttcaac atttcagaca 480

aaaccaacaa taaactttga agaaccaaat acttgattgt tttgagtctc attttccttt 540

tccacgtcat ctaacttaaa atatcaggaa ggaaattcat ggcaattcat ggaacagatg 600

tggaaatgaa gggaaaggta ggctggaaaa acaaaacaaa gcaaacagct gtaataaaat 660

cagaatcttt cagaccagca taaatgggag gaaaaattct aggaaaggac tataaaaaca 720

tgtttctgag ttttgtacag gccaatggac attgatacag caattggctt taggtctttt 780

tcccagatta tttttttagc ttcttacctg cccaaatctc ctgattttgg ctggtggtgt 840

tagtaggaag gatggggagg gatgttgtgt cacatggcca caagtgtgct ctatggtgtt 900

ggtgaaatca ctaccctttc tctttcattc ctgtaatagt tgtataactc catctgccca 960

ccacagagtg ggttaaagat taatgagata acacatgtgg agggtcttga gtttcataga 1020

acaggctgat ggccgtataa aatgtcactc aacatggtat tgaaaacaag atttattttc 1080

ccctccttct gccctgtagt cagtggatca caagacttaa atttcgcttg ttcttgagaa 1140

actccattta aaagcattca gaacttaagt aacagtcaag gtagcatgaa aagcataagc 1200

agaaattaca gttctttcct atttctttca gcaatcaggg cagtacttga atataagtgt 1260

ctcagaaaca acatgagaag gaaggatggt ggtttcccat gaatggcctc agaaagactc 1320

ttgcatttgg gcaaaatcaa ggatgagcta aaacaaggag aggtctgaat gatagacaat 1380

ggaagcttca agattactgc tggcagaggg gtgtaggtag gaaggacctg gcttgggcat 1440

ctgtgcattc tggctctgtg actctgagca agctacttaa cctctctgaa cctgtttcct 1500

catctgtaaa gtgattgtaa tgctactgat ccaacagaag gcttcagtga aatagatgga 1560

tgtacagtgc catgaaccca gtattagaag tctaataaat ggtcactatc actcttgtta 1620

ctactattca atatattctt tattaattaa tattaatatg gcagcagaga ctacccactc 1680

catggaagtc cttatgtctg acccatttta aagtttcatc cacatgacag ttgtacaagg 1740

ggtggttcta agatatttgg gaaagcttaa atatttttaa aaaatacatc tttcacaatt 1800

ttggtttccc ttatttaaaa aaatcacatt tgtaatcatt tcgtatgtct gaaaaagatt 1860

tgttaaggaa gggaattcat cagtatcata tctgacaagg atcaacagag gttctgaata 1920

tccagagctc tagtctcatt ttcaggactt ttaggaaaag acatgaacgg tgagacactc 1980

agactgtccc cttatccatc ttaaagcctt gccctctgac gacagagctg accctaccta 2040

gtcagccctg tgctggatga agagaaagca agactgcggg aaaatcgccc ccatttcact 2100

ctctgaattt caagtagaag catcttagtt ttctctctcc cttctctgcc ccatagaaag 2160

gcctgataaa agtttcttac aatagaaccc aaaagttgat gcttttatgg ggattaggat 2220

ccttctggtg tctgcaggag gaacagtcca cacagatgca tctaccctgg gagtctgagc 2280

tcttgtgacc tgtactggag tcactgccgg tgtgctcggt ggctgccatg aaacagaagc 2340

tattctggag ttcaccgagg ctcaggccaa attatttggg gcttaccatc atctggctga 2400

gggggtagga aataaaacag tggtccctcc ttttaaggca agcctaggtt aatgtgtgga 2460

gacagaacct tatttttcca aaggctcagc cagacatctt gctattttta gaggactggc 2520

cagtcctgaa tgttgattcc atcatgggca tgagcctgat tttaacttcc cagggccagc 2580

caagagcaag ggcagctccc aaacccatct tctctccctg caggcaccct gccacttctc 2640

tcaatggtat ttcaccatca ctgccatgct taccctgttt ctcatcagag ctggagggct 2700

gaactgatac ttaggaggag gctggggcaa ggggatgagc agagagagct ggcatgatac 2760

taagtcactt acttctttat gcttccagcc attctgtgaa gtacctttca ttacacagga 2820

tgaaactcac tccagcaggt tagataacct ggaggcaagg agtggttagg aaacacccac 2880

atcacacagc tgataaataa ctaacctagg atttgaagga cctctttgat ccaaagcaca 2940

cattcatttc atgtgctgta tatcccaacc tcatctgagc ctagagccat agaggcacct 3000

attaaaaccc ctattcccaa caacccagag ccacagaatc agaatctccg tgggactggc 3060

ccgacattca cattttaaac aagattcttc taggggattt ctaggctctg caaattgggg 3120

aagaacagct ctgggagagc tgctttcaaa catagagaga acattagaat cataagggag 3180

cttgttaaaa atgcaggttc ttctgtcttg cccgccaaag ctcctgagaa gccagggagc 3240

ctggactcag gaatctgcat tctcaattat tctgctgaaa gtgggcagaa gcctttgaaa 3300

aacagggacc taataataaa taagaaagag agaagtagat actaaagtaa tgaaatcatt 3360

taatactgga aaggactcat ttgacagcag tccagggaaa attatttagt ttggatttaa 3420

ggaagaattt cttgcagaca tgacgacaaa tgggtgatct ctttctacta tgtgaacagt 3480

gaacatatta gtagcagaaa ggggagcagg cactgtggtc tgtacctggc cactgacatc 3540

ttatcttttc catgttcctg aatctcagct tctacctgga atgttctttt ccctttgctt 3600

atcttcacta gttaaaattt ctctcaaatc ttagttcaaa agatacttgc tccacgaagt 3660

tttctcccag tttcccctct tcttcttctt tgtttctatt gtttgcacct gtcattgggc 3720

atgcatcaca tctcaccctg ctgttggatt ccctgggtac ctgtaatgca cacgtttcct 3780

cacaaaaagg gctaggacct gacagctttg tttttgattc cccacactgc tgctcagtga 3840

aggccttttg ctcaataagg gtggaggaga taaagccatc accgctgtta ctcttactat 3900

gtaagtttct cagcactgta acaggcaact tttattaaat attcctattt tgctgatgaa 3960

ggacacaagg cactgattga gagattgctg tttgtggagg g 4001

<210> 2

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> lncRNA-23-F(Unknown)

<400> 2

ctccttctgc cctgtagtca 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> lncRNA-23-R(Unknown)

<400> 3

agtactgccc tgattgctga 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> GAPDH-F(Unknown)

<400> 4

acagtcaagg cagagaacgg 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> GAPDH-R(Unknown)

<400> 5

ccagcatcac cccacttgat 20

<210> 6

<211> 28

<212> DNA/RNA

<213> Bta-EcoRV-F(Unknown)

<400> 6

ccgatatcgg gaggagagac agagcgac 28

<210> 7

<211> 30

<212> DNA/RNA

<213> Bta-XhoI-R(Unknown)

<400> 7

ccgctcgagc cctccacaaa cagcaatctc 30

Claims (3)

1.一种促进牛骨骼肌卫星细胞成肌分化的方法，其特征在于：所述方法是通过增加lncRNA-23的表达来实现促进牛骨骼肌卫星细胞的成肌分化，其中，所述lncRNA-23的基因组碱基序列为：SEQ NO.1。

2.根据权利要求1所述的促进牛骨骼肌卫星细胞成肌分化的方法，其特征在于：具体步骤为：

构建lncRNA-23的过表达载体pcDNA-lnc23，将pcDNA-lnc23转染至牛骨骼肌卫星细胞，增加lncRNA-23的表达水平，实现促进牛骨骼肌卫星细胞的成肌分化。

3.根据权利要求1所述的促进牛骨骼肌卫星细胞成肌分化的方法，其特征在于：所述增加lncRNA-23的表达的方法包括：采用过表达lncRNA-23表达的质粒、病毒载体或电转的方法。

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