CN110408616B - GLUT4基因敲除的sgRNA、A549细胞系及其构建方法 - Google Patents

GLUT4基因敲除的sgRNA、A549细胞系及其构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种GLUT4基因敲除的sgRNA、A549细胞系及其构建方法。本发明提供的GLUT4基因敲除的sgRNA，在GLUT4基因上的靶序列位于其3号外显子上，靶序列如SEQ ID NO：1所示；本发明还提供了GLUT4基因敲除的A549细胞系以及构建方法，以表达载体pX458‑GLUT4作为GLUT4基因的打靶载体，转染A549细胞，获得GLUT4基因敲除的单克隆细胞株；本发明利用CRISPR/Cas9系统从A549细胞中敲除GLUT4基因，从基因和蛋白水平的检测都证实，GLUT4已被成功敲除，为研究GLUT4基因表达缺失对A549细胞葡糖糖摄取及细胞功能上的提供了理想的细胞模型。

Description

GLUT4基因敲除的sgRNA、A549细胞系及其构建方法
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及GLUT4基因敲除的sgRNA、A549细胞系及其构建方法及其应用。
背景技术
A549细胞是一种人肺腺癌上皮细胞系。它在形态、结构及代谢产物组成上与二型肺泡细胞极为相似，后者是一类与直径约9微米的球形肺泡细胞，主要功能为合成和分泌一些脂蛋白类活性物质，降低肺泡气液界面的表面张力，从而增加肺泡稳定性，防止水肿。因此，A549细胞已被用作研究二型肺泡细胞反应的模型。另一方面，它作为非小细胞肺癌中的一种，在肺癌研究中具有一定的意义。众所周知，癌细胞拥有着不受控的无限增殖及持续的侵袭与迁移的能力，而这些过程势必需要其发生倍比于正常细胞的能量代谢及糖代谢。
GLUT4是一种膜蛋白，分子量约45-55KD，基本结果有12个跨膜片段(M1-M12)组成。人类与大鼠GLUT4约有95％以上的核苷酸序列是相同的。GLUT4仅存在于胰岛素敏感的骨骼肌、心肌和脂肪细胞中。在没有胰岛素刺激时主要位于细胞内的贮存囊泡内。当胰岛素与受体结合后，激发一系列级联效应，导致富含GLUT4的囊泡向细胞外膜移动，囊泡膜与细胞外膜融合，GLUT4转位至细胞外膜且活性最佳，与葡萄糖结合并发生结构改变，将葡萄糖转运至细胞内后恢复原来的结构。这一过程很容易被逆转，当循环胰岛素水平下降时，GLUT4通过吞饮作用从细胞外膜清除并回到贮存囊泡中。由此胰岛素敏感组织可迅速对循环胰岛素水平做出反应，保持血糖平衡。啮齿类动物及人类在胰岛素抵抗状态下，GLU4的表达显示的组织特异性调节，即在脂肪细胞中表达下降，但在骨骼肌中则被保护。
然而GLUT4基因表达缺失是否会对A549细胞葡糖糖摄取及细胞功能上产生影响，目前还未有相关报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的研究空白，提供GLUT4基因敲除的sgRNA、A549细胞系及其构建方法。
为实现上述目的，本发明通过以下方案实现：
在本发明的第一方面，提供了一种GLUT4基因敲除的sgRNA，所述sgRNA基于CRISPR/CAS9系统，且所述sgRNA在GLUT4基因上的靶序列位于其3号外显子上，靶序列如SEQID NO：1所示。
在本发明的第二方面，提供了包含所述的sgRNA的表达载体。
优选地，所述表达载体为pX458-GLUT4。
具体地，所述表达载体pX458-GLUT4的构建方法为：
在GLUT4基因的3号外显子上的靶序列的5’端加上BbsI的酶切位点caccg，构成序列SEQ ID NO：2，并人工合成其互补序列SEQ ID NO：3，将互补序列SEQ ID NO.2和SEQ IDNO：3所形成的双链DNA，与经过BbsI酶切的pX458载体连接，从而制得表达载体pX458-GLUT4。
在本发明的第三方面，提供了所述的表达载体在制备GLUT4基因敲除的A549细胞系中的应用。
在本发明的第四方面，提供了GLUT4基因敲除的A549细胞系。
在本发明的第五方面，提供了所述的GLUT4基因敲除的A549细胞系的构建方法，以表达载体pX458-GLUT4作为GLUT4基因的打靶载体，转染A549细胞，获得GLUT4基因敲除的单克隆细胞株，命名为G3-6。
优选地，所述构建方法具体包括如下步骤：
S1、培养A549细胞至70～90％汇合度时，将含有表达载体pX458-GLUT4的混合液转染进A549细胞中并培养；
S2、待细胞数目长满后提取细胞基因组并进行PCR鉴定；
S3、将PCR产物测序，测序结果与野生型PCR序列比对，确定G3-6为突变体；
S4、用蛋白质免疫印迹进一步验证确定G3-6是GLUT4基因缺陷型。
优选地，所述步骤S2中PCR鉴定所用的上游引物、下游引物分别为SEQ ID NO.4和SEQ ID NO：5所示。
在本发明的第六方面，提供了所述的GLUT4基因敲除的A549细胞系在研究GLUT4基因表达缺失对A549细胞葡糖糖摄取及细胞功能上的应用。
本发明具有的有益效果是：
1、本发明首次得到GLUT4基因敲除的A549细胞系，利用CRISPR/Cas9系统从A549细胞中敲除GLUT4基因，从基因和蛋白水平的检测都证实，GLUT4已被成功敲除，与沉默、敲低、干扰等方法相比，敲除效果更加彻底，适于对GLUT4缺失的A549细胞进行更加深入的研究。
2、本发明发现A549细胞系在敲除GLUT4基因后，葡萄糖摄取量减少。表明GLUT4基因敲除的A549细胞系在为研究GLUT4基因表达缺失对A549细胞葡糖糖摄取及细胞功能上的提供了理想的细胞模型，可用于研究癌细胞代谢及功能变化。
附图说明
图1是突变型细胞基因型鉴定后的序列比对图；
图2是突变株与野生株的GLUT4mRNA水平含量差异图；
图3是突变株与野生株的GLUT4蛋白表达水平含量差异图；
图4是突变株与野生株的葡萄糖摄取量差异的细胞图；
图5是突变株与野生株的葡萄糖摄取量差异图。
具体实施方式
实施例1 GLUT4基因敲除的A549细胞系及其构建方法
1、GLUT4基因sgRNA的序列设计
在NCBI网站上搜索人源GLUT4基因序列找到外显子序列将外显子序列发送至网站http://crispr.mit.edu/，再从网站上获取GLUT4基因的外显子信息，从EXON 1-EXON 6挑选出EXON 3--GAGCTACAATGAGACGTGGC(如SEQ ID NO：1所示)作为sgRNA的靶序列，根据bBSI限制性内切酶在sgRNA的两端设计酶切位点，在sgRNA5'端加上CACCG构成序列SEQ ID NO：2；反向互补序列5'端加上AAAC。3'端加上核苷酸C构成序列SEQ ID NO：3，最后将设计好的质粒送至生物公司合成。
表1-sgRNA引物序列
Figure BDA0002123530820000041
2、pX458质粒表达载体的构建：
(1)配制100mM DTT(II硫苏糖醇)：精确称量0.01542g DTT溶于1μL ddH2O中于37℃水浴锅中直至完全融化。
(2)配制酶切体系如表2所示，按照表2配制酶切体系配置完成以后将体系置于37℃的水浴锅中30min。
表2-pX458酶切体系试剂配制表
Figure BDA0002123530820000051
(3)配制新鲜的1×TAE：取490mL ddH2O，10mL 50×TAE充分混匀。
(4)配制1％的琼脂糖凝胶两块：精确称取1g琼脂糖然后加入100mL TAE微波炉加热至完全没有颗粒为止。
(5)将加热过后的琼脂糖凝胶倒入配胶板中检测胶40mL，回收胶60mL。
(6)点样：点样时样品与Loading Buffer的比例4:1按照上述比例加入LoadingBuffer检测胶中每个孔点5μL样品，回收胶则点入所有剩余样品，开始电泳。
(7)电泳结束以后使用照胶仪器观察电泳结果。
(8)切胶回收DNA。
(9)按照表3的实际用量配置oligo退火体系，置于PCR仪中。设置PCR仪程序，首先37℃，30min，然后升温至95℃，维持5min，最后以每分钟温度下降5℃逐渐降到25℃。即可得到退火体系。
表3-oligo退火体系
Figure BDA0002123530820000052
Figure BDA0002123530820000061
(10)取1μL退火产物，加入199μL ddH2O，摇匀。
(11)配置oligo引物与酶切后的pX458质粒的连接体系，按照表4配置连接体系，25℃，10min。
表4-连接体系
Figure BDA0002123530820000062
(12)将重组载体转化进stb13感受态细胞中。
(13)测序：将每个菌落挑选出一部分，150rpm摇菌，送往测序公司。
(14)保存：将测序正确的菌落挑选出来，扩大培养，然后加入40％的等体积硝酸甘油，在-80℃冰箱中保存。
3、敲除细胞系的构建及基因组鉴定
(1)待A549细胞状态生长良好，准备进行转染实验，使用Lip 3000进行转染，按说明书进行操作。
(2)将细胞传代至六孔板中，待细胞生长达到90％的汇合率进行实验。
(3)首先使用opti-MEM培养基饥饿细胞，
(4)配制125μL opti-MEM、2.5μg质粒和5μL P3000的混合液，以及125μL opti-MEM、3.75μL Lipo-3000的混合液，分别静置5min后，轻轻混匀。
(5)静置5min，加入细胞中，3h后换RPMI培养基，24h后在荧光显微镜下观察细胞发出荧光的状态。
(6)使用分选型流式细胞仪筛选出带有EGFP标记的单克隆细胞在96孔板中培养。
(7)待细胞数目足够多后，转至24孔板培养，再长满后提取细胞基因组并PCR鉴定。PCR鉴定所用的上游引物、下游引物分别为SEQ ID NO.4和SEQ ID NO：5所示。PCR反应条件：95℃预变性5分钟；35个循环：95℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸1分钟；最后72℃终延伸7分钟。
将PCR产物测序，测序结果与野生型PCR序列比对，确定EXON3上的sgRNA所编辑的第6株细胞编辑情况最好，命名为G3-6，序列分析如图1所示。
4、mRNA及蛋白水平验证：
在基因水平验证突变细胞株后，用Real-time PCR及蛋白质免疫印迹(Westernblotting)进一步验证G3-6是GLUT4缺陷型，结果如图2和图3所示。
由图2可知，野生型A549细胞系中检测到GLUT4 mRNA的表达；而GLUT4基因敲除的A549细胞系中未检测到GLUT4 mRNA的表达。
由图3可知，野生型A549细胞系中检测到GLUT4蛋白；而GLUT4基因敲除的A549细胞系中未检测到GLUT4蛋白。
综上表明，通过以上DNA水平、mRNA水平以及蛋白水平的验证，证明GLUT4基因敲除的A549细胞系构建成功。
实施例2野生型A549细胞系和GLUT4基因敲除的A549细胞系对葡萄糖摄取的影响
本实施例将细胞贴片培养后利用Confocal技术检测葡萄糖摄取，具体包括以下步骤：
1、分组：实验组和对照组；实验组为GLUT4基因敲除的A549细胞系；对照组为野生型A549细胞系。将实验组和对照组细胞分别培养，待细胞长满皿底时，消化细胞，用1mL培养液富集消化的细胞，然后弃去850mL的细胞悬液，留150mL的细胞悬液备用。在剩余的150mL溶液中加入3mL的培养液进行稀释。
2、用镊子将浸泡在酒精中备用的载玻片取出，放在酒精灯上烘干，放置在玻璃培养皿的中，取1mL的稀释过后的培养液，在载玻片的中央缓慢的将培养液加入到载玻片上，每一株细胞做三组平行。
3、待细胞生长至16h时，用5mL PBS冲洗载玻片，再用10mL PSS溶液饥饿细胞2h。
4、配制100mM的2-NBDG荧光染料(2-NBDG荧光染料是葡萄糖荧光探针)
5、将载玻片安装到Confocal的专用chamber上，加入200μL的2-NBDG荧光染料，暗处孵育1h。
6、使用Confocal显微镜观察细胞所发射荧光，记录并分析。结果如图4和图5所示。
由图4可知，野生型A549细胞系中有较亮的绿色荧光；GLUT4基因敲除的A549细胞系中几乎无绿色荧光；由图5可知，相对于野生型A549细胞系，GLUT4基因敲除的A549细胞系的2-NBDG荧光荧光表达量减少；而2-NBDG荧光染料是葡萄糖荧光探针，表明相对于野生型A549细胞系，GLUT4基因敲除的A549细胞系的葡萄糖摄取量减少。
综上所述，本发明首次得到GLUT4基因敲除的A549细胞系，利用CRISPR/Cas9系统从A549细胞中敲除GLUT4基因，从基因和蛋白水平的检测都证实，GLUT4已被成功敲除，与沉默、敲低、干扰等方法相比，敲除效果更加彻底，适于对GLUT4缺失的A549细胞进行更加深入的研究。A549细胞系在敲除GLUT4基因后，葡萄糖摄取量减少。表明GLUT4基因敲除的A549细胞系在为研究GLUT4基因表达缺失对A549细胞葡糖糖摄取及细胞功能上的提供了理想的细胞模型，可用于研究癌细胞代谢及功能变化。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Figure BDA0002123530820000091
Figure BDA0002123530820000101
序列表
<110> 中南民族大学
<120> GLUT4基因敲除的sgRNA、A549细胞系及其构建方法
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gagctacaat gagacgtggc 20
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
caccggagct acaatgagac gtggc 25
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aaacgccacg tctcattgta gctcc 25
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gaaacaggaa gggagcca 18
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cgatcagaat gccgataaca 20

Claims (8)

1.一种GLUT4基因敲除的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA基于CRISPR/CAS9系统，且所述sgRNA在GLUT4基因上的靶序列位于其3号外显子上，靶序列如SEQ ID NO：1所示，所述sgRNA对应的双链gDNA序列如SEQ ID NO:2-3所示。
2.一种包含权利要求1所述的sgRNA的表达载体。
3.如权利要求2所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为pX458-GLUT4，所述表达载体pX458-GLUT4的构建方法为：
在GLUT4基因的3号外显子上的靶序列的5’端加上BbsI的酶切位点caccg，构成序列SEQID NO：2，并人工合成其互补序列SEQ ID NO：3，将互补序列SEQ ID NO： 2和SEQ ID NO：3所形成的双链DNA，与经过BbsI酶切的pX458载体连接，从而制得表达载体pX458-GLUT4。
4.权利要求3所述的表达载体在制备GLUT4基因敲除的A549细胞系中的应用。
5.一种GLUT4基因敲除的A549细胞系，其特征在于，其构建方法为：以权利要求3中所述的表达载体pX458-GLUT4作为GLUT4基因的打靶载体，转染A549细胞，获得GLUT4基因敲除的单克隆细胞株，命名为G3-6。
6.如权利要求5所述的一种GLUT4基因敲除的A549细胞系，其特征在于，所述构建方法具体包括如下步骤：
S1、培养A549细胞至70～90％汇合度时，将含有表达载体pX458-GLUT4的混合液转染进A549细胞中并培养；
S2、待细胞数目长满后提取细胞基因组并进行PCR鉴定；
S3、将PCR产物测序，测序结果与野生型PCR序列比对，确定G3-6为突变体；
S4、用蛋白质免疫印迹进一步验证确定G3-6是GLUT4基因缺陷型。
7.如权利要求6所述的一种GLUT4基因敲除的A549细胞系，其特征在于，所述步骤S2中PCR鉴定所用的上游引物、下游引物分别为SEQ ID NO： 4和SEQ ID NO：5所示。
8.权利要求5所述的GLUT4基因敲除的A549细胞系在研究GLUT4基因表达缺失对A549细胞葡萄糖摄取及细胞功能上的应用。
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