CN110257340A - Dnmt3b基因缺陷型的CHO细胞系及其制备方法、应用，重组蛋白表达系统 - Google Patents

Dnmt3b基因缺陷型的CHO细胞系及其制备方法、应用，重组蛋白表达系统 Download PDF

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Abstract

本发明涉及DNA甲基转移酶Dnmt3b基因缺陷型的CHO细胞系及其制备方法、应用，重组蛋白表达系统，属于基因工程技术领域。本发明中利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除CHO细胞Dnmt3b基因，得到了Dnmt3b基因缺陷型的CHO细胞系，该细胞系能够显著提高CHO细胞中目的基因的表达水平和表达稳定性，克服了目前CHO细胞表达系统存在的表达水平较低、表达不稳定的问题；在利用该细胞系表达重组阿达木单抗时，发现重组阿达木单抗的表达水平明显提高，因此该细胞系可以广泛用于目的蛋白的表达。

Description

Dnmt3b基因缺陷型的CHO细胞系及其制备方法、应用，重组蛋 白表达系统
技术领域
本发明涉及Dnmt3b基因缺陷型的CHO细胞系及其制备方法、应用，重组蛋白表达系统，属于基因工程技术领域。
背景技术
由于具有能够进行重组蛋白的装配和折叠以及翻译后修饰等突出特点，哺乳动物细胞特别是中国仓鼠卵巢（Chinese hamster ovary, CHO）细胞目前常被用于进行重组药物蛋白表达生产。但现阶段在重组CHO细胞长期培养生产中存在表达量较低、表达不稳定甚至表达量明显下降等现象。为此，在哺乳动物细胞中，如何提高表达量和表达稳定性已成为大规模生产重组蛋白亟待解决的主要问题。当前由于缺乏既能实现高产量又能稳定表达的重组CHO细胞系，重组蛋白的生产规模仍然受到极大限制。因此，采用分子克隆和基因工程的方法进行CHO细胞重组表达系统研究，对于提高重组蛋白的表达量和长期表达稳定性，进而建立高产稳产的重组CHO细胞表达系统具有十分重要的理论和实践意义。
造成这种重组蛋白产物表达不稳定性的确切机制尚未确切阐明。转基因表达减少的一个重要原因是持续表达过程中基因拷贝的逐渐丢失而导致转录本减少和转录沉默的发生。通过应用一些表观遗传调节的DNA顺式作用元件如核基质附着区序列（MAR）、普遍存在的染色质开放元件（UCOE）可以显著降低基因沉默以提高重组目的基因的表达。另外，转基因沉默还与生产过程中重组蛋白表达载体上驱动基因表达的启动子CpG位点的甲基化密切相关。如研究发现在单克隆抗体生产表达不稳定的重组CHO细胞中，人巨细胞病毒主要即时早期（hCMV-MIE）启动子的甲基化水平是增加的；利用5-Aza-2-脱氧胞苷（一种DNA甲基化抑制剂）处理这些表达降低的细胞可以部分恢复其单克隆抗体的产率。这表明，表观遗传因素如DNA甲基化在调节基因表达中起重要作用，启动子区域DNA的甲基化异常增加可能是导致重组CHO细胞中目的基因表达下降的重要因素。
DNA甲基化（DNA methylation）是一种在原核和真核生物基因组中常见的表观遗传修饰方式，也是哺乳动物中基因表达的重要调控方式，在基因转录抑制方面起关键作用。目前关于DNA甲基化对CHO细胞转基因表达影响的研究主要集中在启动子的修饰改造上，例如在启动子区域突变胞嘧啶、使用无CpG的或合成的启动子、或将核心CpG岛元件插入启动子。尽管这些经过改造的无CpG二核苷酸的启动子可减少早期的基因沉默，但仍然不能显著改善重组CHO细胞的长期表达稳定性。DNA甲基化主要由DNA甲基转移酶包括从头甲基转移酶Dnmt3a和Dnmt3b以及DNA甲基化维持酶Dnmt1催化完成。特别是Dnmt3a和3b介导的启动子甲基化与转基因的不稳定表达密切相关，这提示二者在调控基因表达稳定性方面起重要作用。
公开号为CN107828738A的中国发明专利申请中公开了一种DNA甲基转移酶缺陷型CHO细胞系，该细胞系能够明显提高重组蛋白EPO的表达水平、同时克服重组蛋白表达不稳定的问题，很大程度提高了重组蛋白表达稳定性。但是在进一步利用该系统进行表达稳定性验证时，发现该系统还存在目的蛋白表达稳定性效果不理想、启动子DNA甲基化仍在一定程度发生的问题；按照生产中长期表达不加压筛选的要求，在无G418筛选压力时，传代30次后重组蛋白的表达维持率尚未达到70%，表达量仍然偏低。
发明内容
本发明的目的是提供一种DNA甲基转移酶Dnmt3b基因缺陷型的CHO细胞系，该细胞系中缺失的DNA甲基转移酶Dnmt3b介导的表观遗传修饰与基因的表达调控关系更加密切，在没有筛选压力时，外源蛋白的表达更稳定，表达量也明显提高。
本发明还提供了上述Dnmt3b基因缺陷型的CHO细胞系的制备方法，该制备方法具有较高的成功率。
本发明还提供了上述Dnmt3b基因缺陷型的CHO细胞系的应用，为目的蛋白的高效表达提供了一种新的途径。
本发明还提供了一种重组蛋白表达系统，能够高效的表达目的蛋白。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一种DNA甲基转移酶Dnmt3b基因缺陷型的CHO细胞系，所述CHO细胞系中的Dnmt3b基因功能丧失，所述Dnmt3b基因序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明中获得了Dnmt3b缺陷型的CHO细胞系，利用该细胞系表达目的蛋白时，能够显著提高CHO细胞中目的基因的表达水平和表达稳定性，克服了目前CHO细胞表达系统存在的表达水平较低、表达不稳定的问题。本发明的细胞系中缺失的DNA甲基转移酶Dnmt3b介导的表观遗传修饰与基因的表达调控关系更加密切，其中目的基因的表达更稳定；在无筛选压力时，与第1代CHO细胞中eGFP表达量相比，第30代细胞中重组蛋白eGFP的表达维持率要高于70%，在无筛选压力条件下目的基因仍然具有较高的表达量。
CHO细胞系选自CHO-K1、CHO-S、CHO-DG44中的任意一种。
市场上常用的CHO细胞系都可以用于制备上述DNA甲基转移酶Dnmt3b基因缺陷型的CHO细胞系。
上述的DNA甲基转移酶Dnmt3b基因缺陷型的CHO细胞系的制备方法，具体是，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除CHO细胞中的Dnmt3b基因，即得。
本发明中利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除CHO细胞DNA甲基转移酶Dnmt3b基因，具有较高的敲除效率。
上述的DNA甲基转移酶Dnmt3b基因缺陷型的CHO细胞系的制备方法，包括如下步骤：
1）确定打靶位点：根据Dnmt3b基因序列设计两个打靶位点sgRNA序列；
2）sgRNA载体的构建：将步骤1）设计的sgRNA序列添加粘性末端并合成2对4条引物，将配对的引物退火获得对应的带有粘性末端的双链DNA片段，将双链DNA片段分别连接到两个带有不同荧光报告基因CRISPR/Cas9系统表达载体中，获得两个CRISPR/Cas9-sgRNA载体；
3）将两个CRISPR/Cas9-sgRNA载体共同转染至CHO细胞中；流式分选挑选包含两种荧光报告基因信号的单克隆细胞进行培养，经过细胞敲除验证，即得。
本发明中通过设计两个sgRNA序列，在Dnmt3b基因敲除时，能够敲除两个靶位点之间的序列，造成大片段的缺失，大片段缺失后的Dnmt3b基因的功能完全丧失。
优选的，步骤1）中所述两个打靶位点sgRNA序列分别为：
D3b-Ex1-31fw：5'-GAGGAATGTCTCATCGTCAATGG-3'；
D3b-Ex1-105fw：5'-CTTGGAGGCAATGTGCACAGAGG-3'。
本发明中所设计的两个打靶位点sgRNA序列，在敲除Dnmt3b基因时具有较高的敲除效率。
步骤2）中设计的4条引物分别为：
D3b-Ex1-31fw-1：5'-CACCGAGGAATGTCTCATCGTCAATGG-3'；
D3b-Ex1-31fw-2：5'-AAACCCATTGACGATGAGACATTCCTC-3'；
D3b-Ex1-105fw-3：5'-CACCGCTTGGAGGCAATGTGCACAGAGG-3'；
D3b-Ex1-105fw-4：5'-AAACCCTCTGTGCACATTGCCTCCAAGC-3'。
上述引物是根据两个打靶位点sgRNA序列所设计。
步骤3）中细胞敲除验证时，所使用的引物为：
Dnmt3b-Ex1PCR-L：5'-GTGCCCCCATTTCTCCTACT-3'；
Dnmt3b-Ex1PCR-R: 5'-AGACCCAATGTGCTGGTCTC-3'。
该段引物扩增的片段大小为288bp，在验证时，如扩增片段明显小于288bp，说明细胞系中的Dnmt3b基因得到了大片段的敲除。
上述的DNA甲基转移酶Dnmt3b基因缺陷型的CHO细胞系在制备目的蛋白等方面的应用。
本发明中的得到的Dnmt3b基因缺陷型的CHO细胞系，能够显著提高CHO细胞中目的基因的表达水平和表达稳定性，克服了目前CHO细胞表达系统存在的表达水平较低、表达不稳定的问题；因此可以利用该细胞系表达目的蛋白。
重组蛋白表达系统，其由包括如下步骤的方法制得：将目的基因插入表达载体中，构建得到重组蛋白表达载体；将该重组蛋白表达载体转染至上述的Dnmt3b缺陷型的CHO细胞系，经筛选得到重组CHO细胞表达系统，所述重组CHO细胞表达系统能够表达目的蛋白。
本发明中的重组蛋白表达系统是基于Dnmt3b缺陷型的CHO细胞系建立，该系统可以显著提高重组CHO细胞中目的基因的表达水平和表达稳定性，克服了目前CHO细胞表达系统存在的表达水平较低、表达不稳定的问题。
所述目的蛋白为重组阿达木单抗。
本发明中的重组蛋白表达系统能够显著提高重组阿达木单抗的表达水平。
附图说明
图1为本发明中CHO细胞Dnmt3b基因敲除单克隆细胞系筛选PCR扩增结果图；
图2为本发明中CCK-8法检测Dnmt3b缺陷型CHO单克隆细胞系3b-2和3b-7及正常CHO-K1细胞增殖结果图；
图3为本发明中流式细胞术检测Dnmt3b缺陷型CHO细胞及正常CHO细胞凋亡结果图；
图4为本发明中由CMV启动子驱动的eGFP基因在Dnmt3b缺陷型CHO细胞、正常CHO-K1细胞中瞬时表达荧光图和白光图；
图5为本发明中CMV启动子驱动表达的eGFP在Dnmt3b缺陷型CHO细胞（3b-7）和正常CHO细胞CHO-K1中表达稳定性实验结果图；
图6为本发明中Dnmt3b缺陷型CHO细胞（3b-7）和正常CHO细胞中重组阿达木单抗Western Blot检测结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明。除特殊说明的之外，各实施例及试验例中所用的设备和试剂均可从商业途径得到。
甲基转移酶Dnmt3b基因缺陷型的CHO细胞系及其制备方法的实施例1
本实施例中DNA甲基转移酶Dnmt3b基因缺陷型的CHO细胞系的制备方法，包括如下步骤：
1、针对候选基因确定打靶位点
1）扩增DNA甲基转移酶基因Dnmt3b基因的部分序列：
根据NCBI的GenBank中国仓鼠DNA甲基转移酶基因Dnmt3b基因组序列（No. NW_006879210）设计扩增引物：
Dnmt3b-Ex1PCR-L：5'-GTGCCCCCATTTCTCCTACT-3'（如SEQ ID NO.3所示）；
Dnmt3b-Ex1PCR-R：5'-AGACCCAATGTGCTGGTCTC-3'（如SEQ ID NO.4所示）；
进行Dnmt3b基因片段PCR扩增，将PCR扩增片段进行克隆测序验证序列的准确性。验证得到的扩增序列如SEQ ID NO.2所示。
2）确定sgRNA打靶位点序列：
应用在线工具（http://crispr.mit.edu/）辅助设计的Dnmt3b基因的sgRNA打靶位点序列如下：
D3b-Ex1-31fw：5'-GAGGAATGTCTCATCGTCAATGG-3'（如SEQ ID NO.5所示）；
D3b-Ex1-105fw：5'-CTTGGAGGCAATGTGCACAGAGG-3'（如SEQ ID NO.6所示）。
2、sgRNA表达载体的构建
1）设计合成引物：根据上述的sgRNA打靶位点序列设计合成2对4条引物，并在引物序列的5'端添加粘性末端。
D3b-Ex1-31fw-1：5'-CACCGAGGAATGTCTCATCGTCAATGG-3'（如SEQ ID NO.7所示）；
D3b-Ex1-31fw-2：5'-AAACCCATTGACGATGAGACATTCCTC-3'（如SEQ ID NO.8所示）；
D3b-Ex1-105fw-3：5'--CACCGCTTGGAGGCAATGTGCACAGAGG-3'（如SEQ ID NO.9所示）；
D3b-Ex1-105fw-4：5'-AAACCCTCTGTGCACATTGCCTCCAAGC-3'（如SEQ ID NO.10所示）。
因sgRNA表达载体使用的是U6启动子，如果在基因转录的起始位点有碱基G存在，则基因的表达量会有显著提高，所以在引物设计过程中，如果上游引物的5‘起始碱基不是G，则需要额外添加一个碱基G，以保证基因维持较高的表达量，此种情形下，其对应的下游引物3’末端需要添加一个碱基C。
2）引物退火配对获得双链DNA片段：将步骤1）中合成的2对引物以D3b- Ex1-31fw-1 + D3b- Ex1-31fw-2和D3b- Ex1-105fw-3+D3b- Ex1-105fw-4的组合方式用于退火配对获得带有粘性末端的双链DNA片段。具体操作如下：先将合成的两对引物分别磷酸化，磷酸化反应体系（10.0μL）为：引物（100μM）各1.0μL、10×T4 Ligation Buffer（NEB）1.0μL、T4Polynucleotide Kinase（NEB M0201S）0.5μL，ddH2O 6.5μL，配制好反应体系并充分混匀，置于37℃孵育30min。将反应产物转移至PCR仪中进行变性和退火，反应程序如下：95℃变性5min，95℃-25℃（降温退火-5℃/min）。
3）线性化CRISPR/Cas9系统表达载体：使用限制性内切酶Bbs I分别将CRISPR/Cas9系统表达载体pX458-ECFP（带有荧光蛋白ECFP基因）和pX458-DsRed2（带有荧光蛋白DsRed2基因）DNA线性化并纯化回收，获得具有粘性末端的载体DNA片段，酶切体系如下：pX458-DsRed2质粒或pX458-ECFP质粒1.0μg、10×NEB Buffer 2.1 3.0μL、Bbs I （NEB）1.0μL、补充ddH2O至总体积30.0μL，置于37℃孵育2h。酶切完成后使用QIAquick PCRPurification Kit纯化酶切产物并用并ddH2O30.0μL溶解回收。
4）构建sgRNA表达载体：通过连接反应、转化和筛选获得含有sgRNA的CRISPR/Cas9表达载体。具体实验操如下，连接反应体系：步骤1）获得的带有粘性末端的双链DNA片段0.5μL和步骤2）中获得的具有相同粘性末端的载体DNA 2.0μL、T4DNA连接酶（NEB M0202S）0.5μL、10×T4 Ligation Buffer（NEB）1.0μL、补充ddH2O至总体积10.0μL，反应1h后转化大肠杆菌DH5α并涂布氨苄青霉素抗性平板，置于37℃培养箱进行过夜培养，次日挑选单菌落进行测序验证，测序结果完全正确的质粒即可得到分别表达有ECFP和的DsRed2表达载体pX458-3b-1和pX458-3b-2。
3、CHO细胞转染、基因敲除单克隆细胞系筛选及验证
将上述构建好的pX458-3b-1和pX458-3b-2表达载体等质量混合，利用脂质体介导的转染方式转染CHO细胞并筛选、验证Dnmt3b基因敲除的单克隆细胞系。
具体实验操作如下：将CHO-K1细胞在含10%灭活胎牛血清的DMEM培养基中于37℃和5%CO2条件下进行生长培养。转染前将2.0×105个CHO-K1细胞接种于24孔培养板中，铺板培养24h后当细胞融合度达到约90%时用于细胞转染。将pX458-3b-1和pX458-3b-2载体DNA各取1.5μg，加入到150.0μL减血清培养基（Opti-MEM）中进行稀释；取0.75μL脂质体Lipofectamine 3000稀释于150.0μL减血清培养基（Opti-MEM）中，然后将脂质体稀释液加入至表达载体DNA稀释液中并充分混匀，置于室温条件下孵育20min。将上述24孔板中接种培养细胞的培养基弃去，并将孵育后的质粒DNA和脂质体混合液按分别按300μL/孔加入CHO-K1细胞中，另加三孔以作平行对照组和未加入转染混合液的细胞作为阴性对照组。所有细胞在37℃和5％浓度CO2培养箱中孵育1.5h后，弃去培养基，更换新鲜的培养基继续培养。
为了获得稳定的基因敲除单克隆细胞，转染72h后，通过流式细胞仪将DsRed2和ECFP荧光双阳性的单细胞分选至已加有150μL新鲜培养基的96孔细胞培养板中，培养14d后，将单克隆转移至48孔细胞培养板中继续扩大培养并做后续PCR扩增验证分析。
单克隆细胞基因组DNA的提取：取少量细胞（约100-1000万即可），离心（350g、5min），弃上清液，保留底部细胞沉淀，加入20.0μL细胞裂解液（100mM KCl、20mM Tris-HClpH 9.0、0.3% Triton X-100、1.0mg/mL 蛋白酶K），使用移液器将细胞轻轻吹打混匀，置于55℃孵育15min，使细胞充分裂解，转移至95℃孵育10min，使蛋白酶K变性，此裂解液即含有细胞基因组DNA可作为PCR模板使用，置于-20℃保存备用。
利用Dnmt3b-Ex1PCR-L和Dnmt3b-Ex1PCR-R进行PCR扩增包含打靶位点的目的片段，并通过测序分析以检测分选得到的单克隆细胞株是否有碱基缺失或是插入。琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物结果如图1所示，PC为阳性质粒对照，NC为空白阴性对照，M为DNA分子量标记；其中1、2、4、7号单细胞克隆为大片段缺失纯合子。进一步的测序结果比对表明1、2、4、7号单细胞克隆即为Dnmt 3b基因敲除细胞株。将已验证的基因敲除单克隆细胞株扩大培养、液氮冻存保种。
4、Dnmt3b缺陷型CHO细胞的生物学特性验证
通过检测细胞增殖和凋亡等细胞生物学特性验证缺陷型细胞系能否进行正常的生长和传代培养。
以野生型CHO-K1细胞作为对照，对获得的Dnmt3b缺陷型CHO细胞单克隆进行细胞生长特性验证，包括细胞形态和生长状态观察、CCK-8法检测细胞增殖情况、流式细胞术（FCM）检测各组细胞凋亡情况，验证Dnmt3b缺陷型CHO细胞系能否进行正常的生长和传代培养。采用CCK-8试剂盒（Cell Counting Kit-8试剂盒，碧云天Beyotime生物公司）检测细胞增殖（结果见图2）和流式细胞术检测细胞凋亡（结果见图3）情况。
实验结果提示，获得的Dnmt3b缺陷型CHO细胞株细胞生长状态、形态、细胞增殖、细胞凋亡等生物学特性与正常CHO细胞无显著性差别，能够正常进行生长增殖和传代培养。
甲基转移酶Dnmt3b基因缺陷型的CHO细胞系的应用的实施例1
目的基因eGFP在重组CHO细胞中的表达分析
1、CHO细胞转染
实验用细胞分为两组：Dnmt3b缺陷型CHO（3b-7）和正常对照CHO细胞（CHO-K1）。培养两个实验组CHO细胞，细胞转染前1天，以2×105细胞密度传代到新鲜的含10%灭活胎牛血清的DMEM培养基，待细胞融合度达90%时即可用Lipofectamine 3000（Invitrogen，USA）进行转染。转染用质粒为CMV启动子驱动表达绿色荧光蛋白（eGFP）的真核表达载体pWTY-02，由本实验室构建。每个质粒平行转染3个复孔。
2、转染细胞株瞬时表达观察
转染48h，倒置荧光显微镜观察瞬时转染两组细胞中eGFP的表达情况。观察结果见图4，其中A为eGFP基因在Dnmt3b缺陷型CHO细胞中瞬时表达荧光图，B为eGFP基因在Dnmt3b缺陷型CHO细胞中瞬时表达白光图，C为eGFP基因在正常CHO-K1细胞中瞬时表达荧光图，D为eGFP基因在正常CHO-K1细胞中瞬时表达白光图。
结果表明，表达载体在Dnmt 3b缺陷型和正常CHO-K1细胞转染效率相当，两者eGFP表达阳性细胞率无明显差别。这说明Dnmt 3b基因敲除对细胞转染效率无显著影响。
3、稳定表达多克隆CHO细胞株筛选及eGFP长期稳定表达分析
加G418筛选，筛选培养两周后获得稳定转化的多克隆细胞池，将细胞池在有筛选压力（加G418）和无筛选压力（不加G418）下传代培养30代，分别将各实验组CHO细胞按照每个样本106个细胞进行流式细胞仪检测分析，测定eGFP平均荧光强度（Mean fluorescenceintensity, MFI）。流式检测结果表明，按照衡量表达量稳定性的判断标准（与第1代CHO细胞中eGFP表达量相比，重组蛋白eGFP的表达维持率要高于70%），无论是否存在G418筛选压力，重组Dnmt3b缺陷型CHO细胞中由CMV启动子驱动表达的eGFP表达稳定性显著高于重组正常CHO细胞（见图5）。
甲基转移酶Dnmt3b基因缺陷型的CHO细胞系的应用的实施例2
重组抗体（阿达木单抗）在重组CHO细胞中的表达分析
为进一步测试Dnmt3b缺陷型CHO细胞对重组蛋白（抗体）表达稳定性的作用，以质粒pWTY-02为基础，构建了由CMV启动子驱动阿达木单抗表达的真核表达载体。将构建的表达载体质粒分别转染Dnmt3b缺陷型（3b-7）和正常CHO细胞（CHO-K1）。转染的细胞在含有G418（800 μg/mL）的培养基中培养15d以筛选稳定转染的重组细胞池（cell pool），每隔3d将重组CHO细胞进行传代培养至30代。随后将重组CHO细胞在125mL培养摇瓶中用30mL无蛋白、无血清、化学成分确定的CD CHO培养基（Life Technologies公司，培养基中含8mM的L-谷氨酰胺）培养6天至细胞数达到1.5×107，每天收集细胞通过Countstar® BioTech细胞计数仪（上海睿钰生物科技有限公司）检测细胞密度和活力，第6天离心收集上清液用于重组阿达木单抗表达检测分析。
采用Western blot检测分析阿达木单抗在重组Dnmt3b缺陷型（3b-7）和正常CHO细胞（CHO-K1）细胞池中的表达。具体地，将含有阿达木单抗的细胞培养上清液加入5×SDS样品缓冲液煮水浴煮10min充分变性。分别取25μL蛋白样品经10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，湿转法转移至硝酸纤维素膜。5% BSA封闭膜2小时，1:6000稀释的山羊抗人二抗室温孵育1.5h，TBST洗膜三次后加化学发光显色液显影，在凝胶成像仪上观察并采集图像结果，分析目的蛋白的灰度值表示待测蛋白的表达水平。
结果表明，重组阿达木单抗在Dnmt3b缺陷型CHO细胞池中的平均表达量（1217.1±49.9 mg/L）显著高于正常CHO细胞池中的平均表达量（392.6±37.3 mg/L）。重组阿达木单抗在稳定培养30代的重组Dnmt3b缺陷型CHO细胞池和正常CHO细胞池中的表达量分别为：985.8±58.5 mg/L和160.9±26.6mg/mL。表达量差异均具有统计学意义（见图6，P<0.05）。结果表明Dnmt3b缺陷型CHO细胞可明显提高重组阿达木单抗的表达水平和表达稳定性。
重组蛋白表达系统的实施例1
本实施例中重组蛋白表达系统由包括如下步骤的方法制得：将目的基因插入表达载体中，构建得到重组蛋白表达载体；将该重组蛋白表达载体转染至如权利要求1所述的所述Dnmt3b缺陷型的CHO细胞系，经筛选得到重组CHO细胞表达系统，所述重组CHO细胞表达系统能够表达目的蛋白。
<110> 新乡医学院
<120> Dnmt3b基因缺陷型的CHO细胞系及其制备方法、应用，重组蛋白表达系统
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<211> 25761
<212> DNA
<213> 中国仓鼠
<221> Dnmt3b基因全长
<400> 1
gaggccatag caggtcagct gtcactcctg gtgactgcca gctctgtcac tgcttttcct 60
ccatccttct tcccttcaga acttgggttt cacccccagc tgatgagggg ggaatgagtg 120
acaggccaac taaccaatgg gccccagagg atgggccgga gtggggctta tgctgccatg 180
gagaagagag aagcctgctt gagaggaggg gcagagggaa ggagacctga agagagagca 240
aacaaagggg tcacaagggg aaagagactg gtttaaggta aacagttgct tactcttcat 300
ttgctgctgc ccagagacag aagggaactt aggctgtccc aagcaggccc aggcaagcat 360
gtcctaaatg gcatcatttg aagggctggc caattgcaga gcagccctag ctttagacct 420
cagccttaac accatcctct ccctctgtcc tggggcctgg tatcagggac ttggagattc 480
acctaattag ccccattgaa ccaaatcctg agcctccaaa tttggtgagc agacaggcta 540
ttggtaggag tctagtggga atacagacag acagtcagct tcagattgag tggggtctct 600
tgggctggag atagagaacc tgtaatatga aacttggaat gtgcagccct tttgtgcccc 660
catttctcct acttatcctg acttttttcc aacaggaaac aatgaaggga gatagcagac 720
atctgaatga ggaggagggt gccagcgggt gtgaggaatg tctcatcgtc aatgggaact 780
gtagtgacca ggcctcagat actaaggatg ctccttcacc cccagtcttg gaggcaatgt 840
gcacagaggc agtcaacaca tcagagagca gaggtgggtg tcaaatctct gacatagcag 900
gttccatggc aggtctcagt ggagaccagc acattgggtc tcttctgttg agttgggctt 960
catgatgatc aggagatgct gccaacttgc ctcttcttag aagttagttc cccgactgcc 1020
tgaaagtccg cccccactgg ttgggggcct ctatggtccc ttctggtcct tgacatctac 1080
catgtctttt aggactttct gaaatggata aaagtggcct attttcctgt tcaccccaag 1140
agctacttgg ccacacaggg acatttgaaa tgaagccagt atcaaccagt ttcatggaat 1200
ggactgtgaa ggaatgggct tcttttcctc cttagatgtt aattaatgct taacgtgtgg 1260
agaggaaggc ataagccagg ccctgtcgct ttgtccagtg agttcatgga ggtgatgagg 1320
acactgattc ctagaatgac agaatgttga ggatgcattt taaagcaagg ccactcccca 1380
ggctggtgat cactgtccta tttcccaaat gcagactccc aaatcttcct tacaggccga 1440
agatcaagct cacggctgtc aaagagggag gtctccaacc tgctgagtta cactcaggta 1500
ccatcatctc ttttcttcat gtggttttat accgttcttt tagttttgat tgcatgagaa 1560
aaaggacaaa tgaaattctt tactccactg caaagtcttt tattcgatcc ttcccgtgta 1620
tttaaagtta tgtctcccta tctgtaatca gtattcaaat agaacaaaag acatttctgg 1680
aatgacttca ccttggttgc ggtatgtctg atttgcttgt ttgagacagt atctggatgg 1740
ctgggatgtc actgtaagca aacccctcgt ctcgtgtcct ctcacatgtg ttgtgaatga 1800
gttgacgatg ccggggaggc agcattctgc attagtctca tttccataat ttgctggtga 1860
cttgggattt atcttttttt tttttttaaa gatttattta ttatgtatag tgttctgtct 1920
gcatgtctgc ctgcaggcca gaagagggca ccagatctca taagggatgg ttgtgagcca 1980
tcatgtggtt tctgggaatt gaactcaggc cctctggaag agcagccagt gctcttaacc 2040
tctgagccat ttatccagat cctgggattt atcttttcaa cccaatttga atttgtgagc 2100
atgtgattag caggagtgaa attttgctag agaaaaacct gatgatcatt ggtgtatttt 2160
ggactcctag ggtaatgtca gtgcagaggt ggtgatgttt ctgtatactg attgcgttag 2220
ttcgtctttt atccttacca taggacctgg caggagatgg agatggagat ggtgaagcag 2280
aggatgggga tggctcagac attctactaa tgccaaagct cacgcgtgag accaaggaga 2340
caaggtcacc ctcggaaagt ccagctgtaa gtccctccca cctggtaact ctggcatctc 2400
ccaccatgcc tggacctgga tagaaaataa ggcttagaca attattcaga aaaaaatgtg 2460
gacacatttg gttttatgtg tgttgggtgt gtgtaggtta tcatcttcca gcatgtagat 2520
tctggggaca aaactcaagg attggcaagg tttggcaagt tccctaattc actggacccc 2580
ttggttaaat tttgatgttg cttagccaca acaggataat tcagatcctt acttgaactt 2640
gaaggtaaaa aaatgagagc tgatagagca gatgagcttt ggacgtttga tacactgagc 2700
acagcaccaa gagcttcatg accactttac ttttgattac attttgactt tctgattaca 2760
gtcccactga ggaaggcttt gcaatcgttt gcttctcctg cttaaaactc caggaaactg 2820
cccacctccc atctttctct ctttctctgt ctgttacttt ccctctctgt ctctctttcc 2880
atctctcttt gcttgtctct ctgtctccct ctcacctctc tctgcctctc tgcctctttt 2940
ctctgctgct cctgtccaca gaggctggtc ttccctcttg cctccctttt cccatcccct 3000
ttgccctaag aaaactctcc acataaactt tgttctatcg tgtctaatcc tctttcgcca 3060
ctttttaaat tacaacaatg aggagctgta ttaaagagtc acagcgttag gagggttgag 3120
aactactggt ttaaggtaaa cagttgctta ctcttcattt gctgctgcca aatcaggtgg 3180
tgaaatcttt gtgacatggg ccagtgtgat tgtccctttc aaagataccc ttgttaaagg 3240
gatccccacc tttatatcca attatcttct ccacttcagg ttgactggag gctatctcag 3300
ggcccaatcc ctttgggcac cttcattgga ccccatgtcc ccagtcacct aaggccctgt 3360
gtttatccct tcttactttc aggttcgaac ccgaaacagc aacattacct ccagcctgga 3420
gaggcaaaga gcctcgccca gaatcaccag aggccgccag ggccgccacc atgtgcagga 3480
ataccccgtg gaattcccag ctaccagggt tggtcctgtc tctgaaagat ctgcttcact 3540
aatctgcaca gcactggcta taacctatgc tttcttcaca cacacctgct tttcagggtc 3600
tggcatcttt ctttcctgac tcatcatact tagaactact ttgaggagtc aagagttcca 3660
gattgcttag gaatctggcc caccttggag ctgagctaaa gccactggtg tctaccacgc 3720
atgtttcttt tgttttttcc tgctgtcttg aggcaacccc agcaggtcca gcacattcta 3780
cttctatttc cagatgcaca ggagccagtt tcctggagac cccactctct ctgagctcac 3840
agctcagagc ctctggttgt tacctgtcat tgctctcaca ctatttattc tgtttccttt 3900
ctgcctttgg gtcaaatggc tgccaggtgc ctgtccctgt aaccctgtct tctggggtgc 3960
tggtttgctc tttcactctt aacatctctg ggaacctgtt ggtagacact gtacgtgtac 4020
ctccttccac tttgcttcac taggtctcag tcttgtcttt ctatctatag tctcggagaa 4080
ggcgagcatc gtcttctaca agcacaccat ggtcgtcccc tgccagccct tatcccagta 4140
tcgacctcat agaagaaggg acacctcaga ggagcagtac cccatcaact gactggagcc 4200
aggacagcca gcaagagagt atggatgcca cacaactgta tgcagagagc aaagatggag 4260
acagcactga gtaccaggta ccactgagaa gggattttgt cccaggtgca caagatccaa 4320
attacgggaa aagaaaacat aaattattta ttctcgatgg gcgtggtggc gcacgccttt 4380
aatcccagga ctgggaggca gaggcaggtg gatttctgag ttcaaggcct gccaggtctc 4440
cagagcgagt accaggatag gctccaaagc tacacagaga agccctgtct caaaaaacaa 4500
aaaacaaaca aaaattattt attctccaaa tgtcccctca cttccttttg tttttttgag 4560
atagcatttc tttgtttaac agccttggct gttgtggaac tcactttgta gaccagcctg 4620
gcctcaaagt cacagaaatc ctcctgtctc tgcctcttcg gtgccacatc caagtggtat 4680
tttatccctg aaaaagatgg tttcatagca tacataatta atcataaaac gcatgaggca 4740
gatctacaga gcctgatcta cagagaagat ccgtgctatg gctgtatagt gagactctgt 4800
ctccaaaccc aaagttttgt gtagccaagg atgacctcca aatccttgtt ctaccgaatg 4860
ctgggaatat atgcatatgc tactagactt tctgttaatt ttactgggta taatccaaga 4920
acttccaaac acaatgtggc cttttctttg ttctaatccc cacctttgtt ctaatcagtt 4980
cagcatttta gtagttccaa ttggacataa tttttttgga taatatttat gaccttagaa 5040
attttgatcc tgttcaggca ttacagtggc ttttatcact taagcaatag tttgctctca 5100
cactgtgtgt attcaggctc tggagtgtat ttaatgaatt gagacttcct tcctgcatgt 5160
ggatgtatgc atctagacaa agcttcagag taccttctga tggagtcctg tatgttgctt 5220
ctttttttgt gaagcagtgt tgtagttaag gttatttagg aggaagccat tagcccaagg 5280
aacatgtgct caagtgtggg catgggcttc tttatgcttt cataatttca ggatggtgag 5340
ctgactcagt ggtaagagac acttggtacc aagcctcacc tgagttcagt ctctgggaga 5400
ggacagactt ctaacatgat gacctccact tgaacataca tgggttcctg catacagcca 5460
aacatggaca cacctctgca tacaaaaagt tgtgaaaaaa atacatatta ttatacaact 5520
tatttttcct tggcaccttt ttgtatgtac cattgagcta tttctcaaac tcatgtatca 5580
cattttatgg ccaacagttt ttttcttgcc ctaggtcagt ggagtttctc agggttcacc 5640
tgccttggtg actgaaattc tttctgttgg ttcttgcagg atgataagga gtttggaata 5700
ggcgaccttg tatggggaaa aatcaagggc ttctcctggt ggcctgccat ggtggtttcc 5760
tggaaagcca cctccaagcg ccaggccatg cctggcatgc gatgggtaca gtggtttggt 5820
gacggcaagt tttctgaggt gagccatggc aaggtggtct cttctcctct tggggtagct 5880
ctgaggtcag ctttctgcat gaggatgcag taagtttggc actgggactg gagtaagaaa 5940
aatatatttc ttggttacct gtcttagatg cctgcttgta ggaccagaaa taagctgctt 6000
attctttttc ttagagtagg gtctctgtgt aaccctctgt acagtaggct ggctttgaac 6060
tctgaaatcg gcctgcctct gcctcctgag gtgggggact caaggtttgt gcagccacac 6120
ctgtgacttg tgtactggag aataaggaag cagtatagca tttagagagg tagctgccat 6180
atctgcctgt cactccaatg ccaaggttct aatgccctgc tatggcctct gtgctccccc 6240
accacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca caagtggtat tgtgaaacat 6300
atcttacata caccttgtct acacagcgga gtccaggaca gccagaggct gtataaagaa 6360
accccatctc attaaaaata agagacagta tgagcttcta atgttaaaca ttttaaatga 6420
gtctttataa tgatggtctt ctcagcataa atgagagagt ttattttctc ccatcccatc 6480
agccccactt tgactcttaa ctttaaacat gtgttctgag atctgcttta agattttttt 6540
aaatatgtat gcatcattct ctatctattt ctgtacacca tggaaggtca gaagagtatt 6600
ggattaaagt ctctttattc caagcacagc cgggtgaaac acaggccaga gctaggttaa 6660
gaacccagcc agcgcagcca gaacaaagag agagcgcggt ccccacgtgc agccttttaa 6720
gaagcccccc ttacgtcatg ccggctttcc ttcaccccgc ccttatgggc gagtccccag 6780
gtccacctgg tacctgcccc aggactattg ggcggggcta gggttactcc ctacagaaga 6840
gtgatttcag atcttgactc tggacgtcat gagctaccat ctgggtactg ggaatctaac 6900
ccaagcctgt ggaggagaaa ccactgtact ctttttgttt gtttgtttgg tttttcgaga 6960
cagggtttct ctgtaggctg tcctggaatt cactctgtag actaggctgg ccttgaactc 7020
acagaaatcc acctgccttt acctcctgag tgctgggatt aaaggcatgg gccaccaata 7080
accagcaacc actgtgctct taaccacttg gaattgtttc tggtttggct ttgagggctg 7140
cagaatggat ttcctggggg tttccttaga aatgttagtc agtgttaggc caattcccag 7200
acacagacag gatggggttt cctgaagtac aacaaacagg tcggagtgaa gtggcatttg 7260
ggacttcgtt ccatttcagg ttttctttcc tatgagttgg atttctatga cttttcctaa 7320
agtatatcct acatttccct gggtgacaac aaataggact tgaagactgt tctgagaggt 7380
tacatgcagt tgccttgtct gaacagcaga gggagcagga ggaatagtga cttgggttta 7440
tgcatcattt gccccatctt cttgccactc ccttctcttt ggtatctctg ccccaagcca 7500
gtcttagaag aagggatatt tgccattgct ttgatccgaa agacaaaata tactcatctc 7560
tggacagggt aagatggcaa taagaggtag catggagatg gtagcattgt gggatagtgt 7620
tagagtgtgc cgtgatcctg gcaaaaggca aagacctgcc cagggcctat atagcaccca 7680
ctgtgttctg ctcatgttgg gtagagcagc tggcagttcc ttgtcaccca gttttatctt 7740
tgcactcact aggaatccca cccataattc atttctgcat cgacagaagg caagttgcct 7800
ttagtgatta ggatataagg tatacaacta ttgcgactat taagaactca agcatgcaaa 7860
tcccagcact tgggaggcag aggcaggtgg atctctgcgt ttgaggcaag cctggtctac 7920
agagcgagtg ccaggccagg gtccaaagct acacggagaa accctgtatc aaaaataaag 7980
aattcaagca tatgttcaac ctgtgcacag tgggaaatcc ttggttggca gtgacaatct 8040
ggaaggtaag gaacatgctc agatagattg tggacagttt caggactgag actcaggtct 8100
gtaccaggga cattcactct gttcatacac atgtatgtgc acatgtgcag ggattttgaa 8160
gacataccta gttttacttg aattatcctc cttacccaca tctggagttt ctcatggcca 8220
aatttgctat atgccatttc tcatttgccc cttatttttc agttctggca tctgtaagtt 8280
gttgcttcgt tgggctctgg gtgaaacagt gcacattaat ctcaagtgtg gttcgatcac 8340
ggccatgttt ttctctccta ggtctctgct gacaaactcg tggcccttgg gctgttcagc 8400
cagcacttta acctggccac cttcaataag ctggtttctt ataggaaggc catgtaccac 8460
actctggagg taacatgggt gtgggtgcta gctagggtgt cagcctatag gcagggcaga 8520
aagaagaaac ctatggagta aaagcgagta gaaggtgtcc ctcaagactg gcttggggca 8580
gagataccaa agagaaggga gtggcaagaa gatggggtct gacctctggt tgggttgaac 8640
tggttacaag gggaatcacc agtaagttgc taatactgat attaggtaag acaggaagat 8700
tcatgacttg tgaggtcacc taatcacatt taagggcctt ttatcaatct gtgaacagga 8760
tttctaagca tagaggatgc aatggctagt tttctcttct catagtttgt agacagttgt 8820
ttatccctgg gaacctttgt gctgtggtgg taagtacata gatgtacaga ttctcttggc 8880
cctggaaata atggttgctt ggctacatcc cttcagaaga catgagtcaa aggtagcctt 8940
cctggataag ctgttggcga tggggatggt cgtctcaata gctcagctta atcaatctct 9000
gtcagggatc tgaacatatc tggtgcctac agggaaaaat gtctgtcacc catgtccctt 9060
actgttgttt ccttacctgt ccctcaaaag cagacccctt gtcacataac accccaagac 9120
agctgtgcag ctgtttcaga caccagtgtt taggtaatgc agtccccagc aggaggaatc 9180
cctgggttca ccctggcaca tacctcattc acctgctccc attcatggat agacttgatc 9240
tttatttgtg tcttggcaga gagccagggt gcgagctggc aagaccttcc ccagcagccc 9300
tggagactca ctggaggaca agctgaagcc catgctggag tgggcccacg ggggcttcaa 9360
gcccactggc atcgagggcc tcaaaccgaa taacaagcaa ccaggtggga atgaatctat 9420
acctctgttg atggtatagg cctcagccac actggtaccc tcagcactct tattgtgcca 9480
actcaagcaa ggcctacttt tactgtggac cccaggctgt taattaaaag cctctgggag 9540
cttgagggcc attacctgcc ttgtctggct tccctggcca tattgctgcc atgggtgtgt 9600
gcagtgcaat taatcttttc cacatatcca aattcatctt ttacctttgt ggccagattt 9660
tctttgaaat gaaaaattaa aataaatttg gctccctgcc attccttccc tgaatatgcg 9720
caggattaac gtaatgaagt gaagggtgtc cctgtacagc cagctcctaa tctaatggaa 9780
tgtttttgtt ttgttttcct gcaaaagtga ttaataagtc gaaggtgcgt cgtgcaggca 9840
gtagcaagtt agaacccagg aaacacggta ttcccttacc atctttgagt gttctgtttt 9900
ctttgctctg ttctgcaatt tcttggcatc tacagtgctc actggagaag aatcaagtct 9960
cctaagctga tatgaatccc tcccctcact ccccgccctc accgaccctc aggctaacca 10020
tgggtgcaca tcccgcctca cacactcttt ggattatctc cttctctctt gtttcttaac 10080
attaatgaca tgtataagca ctggaaattg tcactttgcc atcaaaggat ctttgaattt 10140
tggtaacttt aagtattttt tttttgtgtg tgtgtgttgg tgtttatgtg tggagatgga 10200
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ctgttatttg ggcttttttc cattaattta tgcgtcctac atgcgtgcag gagcccatga 18360
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ccacctgtcc tcttttccag atattttata ttaattattt catgaagatg ttaatatttc 23700
atatttcatt acatgtttct tttctaatct cctggccgag tatggattca ctatagtcta 23760
gacacttctg tgctaaagtt ggccttaaaa atggccttaa aaatttcttt taccaggctg 23820
gagagatggc tcagaggcta agaacactca ttgctcttct aggggtcctg agttcaattc 23880
cacatggtgg ctcacaacca tctggaatga gatctggtgc cccctcttct ggccttcagg 23940
cacacatgta gacagaacac tgtatacata ataaataaat ccaatcaatt agttcttttg 24000
gttttttgag acagggtttc tctgtggctt tggaggctgt cctggaacta gctcttgtag 24060
accaggctgg tctcaaactc acagagatcc gcctgcctct gcctcccgag tgttgggatt 24120
aaaggcgtgc gccaccaacg cccggctcca atgaattctt ttttaaattt gagcatattt 24180
gcctcttccc taatactggg attcttactt ccaccactat atggtgggat cttgcattgg 24240
tctggtgcat accatcacaa tactgtgtgt tcatatgtgc ttaagccctg ttaagtctga 24300
aaacagtttc agtatattat caacttcttc aggctcttag cagtctcagt gccctcttct 24360
gcaaagctcc ctgggccata ggctgaggtc acttattatg tccatgctgt atagcctgtt 24420
ctgaaatttg aaagtttaaa gtggttcttg aggtgtgatt ggtactgtgt agatgccagg 24480
aatagcatgg tctggccttg aggtgttgaa ttcctacagg taactttaga gctgtcaaaa 24540
gccagcgata ctgcggttca gtctttgtcc tcttcagcat cctgatgaag cacattaggc 24600
aagctctgga tttttctctc atattttgag agagagcaag agtactgtgt atgtacatgt 24660
gctcaactgg ctatggaaga actggtatct tgtaagcccc tgtgtttgtc attgaaaatc 24720
ttgtcttttg tttcttcccc tggaaaacaa atgctttgac tgcttattat gttttgaagc 24780
caatgttcac actatgcatt taagaatggt cctggataca tgtctgctga ctggtgatca 24840
ttcatgggtt aatttacact aggcatttaa gaagcatcct tgcatggcat gtaaggagca 24900
cagtcccagt gaagatacac agcactggtt ccctgtcact gtcagctgtt agctgagcta 24960
acaattgaac tggtggtcta gaaggttcct ttgagcccag tggtcctgac tgaagcctca 25020
tggctttcct aggcctggac ttcgaaaaca cagctgttct ggtgtgctgg ggacatgggc 25080
ccttctaacc ttgtgtcttt tcgctctgtt ctctcccagg atcttcggct ttcctgcaca 25140
ctacacggat gtatccaaca tgggccgtgg tgcccgccag aagctgctgg gaaggtcctg 25200
gagtgtgcca gtcatcagac acctctttgc ccccttgaag gactactttg catgtgaata 25260
gttctaccca ggactggggt acttttggtc tgagccaggt ccccagagtc acccctccct 25320
gaaggcacct cacctctccc gtttctcagc tcacctgttt ggggccccaa ctcactgtgt 25380
acctcagctt tctcctgctc agtgggagca gagcctcctg gcccttacag gggagccaag 25440
gtgctcccac catgtgcaca acttagaact ggctgcttag agtagcccaa tatggtgctc 25500
atgttttctt atcctgaaac tttaaaactt gaagtagata gtaagatggc ttttttcccc 25560
tcttgggtta atcagtcaga agtgatggct aagataccaa aacgacggct ctcccagtac 25620
tcagggtaat gctgcaaaat cacttgattt tctttttaaa taacctattt ccacatttgc 25680
tagaggatgc caatggcaat gtgggctcag atgaacaagg tcaaggggcc agaatttttt 25740
caaaaatgtt ttccctaggg a 25761
<211> 288
<212> DNA
<213> 中国仓鼠
<221> Dnmt3b基因片段
<400> 2
gtgcccccat ttctcctact tatcctgact tttttccaac aggaaacaat gaagggagat 60
agcagacatc tgaatgagga ggagggtgcc agcgggtgtg aggaatgtct catcgtcaat 120
gggaactgta gtgaccaggc ctcagatact aaggatgctc cttcaccccc agtcttggag 180
gcaatgtgca cagaggcagt caacacatca gagagcagag gtgggtgtca aatctctgac 240
atagcaggtt ccatggcagg tctcagtgga gaccagcaca ttgggtct 288
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> Dnmt3b-Ex1PCR-L
<400> 3
gtgcccccat ttctcctact 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> Dnmt3b-Ex1PCR-R
<400> 4
agacccaatg tgctggtctc 20
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> D3b-Ex1-31fw
<400> 5
gaggaatgtc tcatcgtcaa tgg 23
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> D3b-Ex1-105fw
<400> 6
cttggaggca atgtgcacag agg 23
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> D3b-Ex1-31fw-1
<400> 7
caccgaggaa tgtctcatcg tcaatgg 27
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> D3b-Ex1-31fw-2
<400> 8
aaacccattg acgatgagac attcctc 27
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> D3b-Ex1-105fw-3
<400> 9
caccgcttgg aggcaatgtg cacagagg 28
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> D3b-Ex1-105fw-4
<400> 10
aaaccctctg tgcacattgc ctccaagc 28

Claims (10)

1.一种DNA甲基转移酶Dnmt3b基因缺陷型的CHO细胞系，其特征在于：所述CHO细胞系中的Dnmt3b基因功能丧失，所述Dnmt3b基因序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的DNA甲基转移酶Dnmt3b基因缺陷型的CHO细胞系，其特征在于：CHO细胞系选自CHO-K1、CHO-S、CHO-DG44中的任意一种。
3.如权利要求1所述的DNA甲基转移酶Dnmt3b基因缺陷型的CHO细胞系的制备方法，其特征在于：利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除CHO细胞中的Dnmt3b基因，即得。
4.根据权利要求3所述的DNA甲基转移酶Dnmt3b基因缺陷型的CHO细胞系的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
1）确定打靶位点：根据Dnmt3b基因序列设计两个打靶位点sgRNA序列；
2）sgRNA载体的构建：将步骤1）设计的sgRNA序列添加粘性末端并合成2对4条引物，将配对的引物退火获得对应的带有粘性末端的双链DNA片段，将双链DNA片段分别连接到两个带有不同荧光报告基因CRISPR/Cas9系统表达载体中，获得两个CRISPR/Cas9-sgRNA载体；
3）将两个CRISPR/Cas9-sgRNA载体共同转染至CHO细胞中；流式分选挑选包含两种荧光报告基因信号的单克隆细胞进行培养，经过细胞敲除验证，即得。
5.根据权利要求4所述的DNA甲基转移酶Dnmt3b基因缺陷型的CHO细胞系的制备方法，其特征在于：步骤1）中所述两个打靶位点sgRNA序列分别为：
D3b-Ex1-31fw：5'-GAGGAATGTCTCATCGTCAATGG-3'；
D3b-Ex1-105fw：5'-CTTGGAGGCAATGTGCACAGAGG-3'。
6.根据权利要求5所述的DNA甲基转移酶Dnmt3b基因缺陷型的CHO细胞系的制备方法，其特征在于：步骤2）中设计的4条引物分别为：
D3b-Ex1-31fw-1：5'-CACCGAGGAATGTCTCATCGTCAATGG-3'；
D3b-Ex1-31fw-2：5'-AAACCCATTGACGATGAGACATTCCTC-3'；
D3b-Ex1-105fw-3：5'--CACCGCTTGGAGGCAATGTGCACAGAGG-3'；
D3b-Ex1-105fw-4：5'-AAACCCTCTGTGCACATTGCCTCCAAGC-3'。
7.根据权利要求5所述的DNA甲基转移酶Dnmt3b基因缺陷型的CHO细胞系的制备方法，其特征在于：步骤3）中细胞敲除验证时，所使用的引物为：
Dnmt3b-Ex1PCR-L：5'-GTGCCCCCATTTCTCCTACT-3'；
Dnmt3b-Ex1PCR-R：5'-AGACCCAATGTGCTGGTCTC-3'。
8.如权利要求1所述的DNA甲基转移酶Dnmt3b基因缺陷型的CHO细胞系在制备目的蛋白等方面的应用。
9.重组蛋白表达系统，其特征在于：其由包括如下步骤的方法制得：将目的基因插入表达载体中，构建得到重组蛋白表达载体；将该重组蛋白表达载体转染至如权利要求1所述的Dnmt3b缺陷型的CHO细胞系，经筛选得到重组CHO细胞表达系统，所述重组CHO细胞表达系统能够表达目的蛋白。
10.根据权利要求9所述的重组蛋白表达系统，其特征在于：所述目的蛋白为重组阿达木单抗。
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