CN108795983A - 一种RXRα蛋白稳定高表达细胞系及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物制备技术领域，特别涉及一种RXRα蛋白稳定高表达的RXRα基因稳定转染细胞系及其制备方法。所述细胞系为RXRα基因随机整合至SK‑N‑SH细胞染色体的细胞克隆，细胞系基因型稳定，可随细胞增殖稳定遗传，子代细胞内稳定高表达RXRα蛋白，大大提升了RXRα蛋白高表达的稳定性，以保证RXRα基因功能性和受试材料的可靠性。本发明提供了一种所述细胞系的制备方法，设计制备真核表达载体，经细胞核转染技术以真核表达载体转染SK‑N‑SH细胞，经G418药物筛选得到RXRα基因稳定转染成功的细胞克隆，PCR、基因测序鉴定其是否为RXRα基因稳定转染阳性的细胞克隆，采用Westernblot技术鉴定阳性克隆细胞内RXRα蛋白表达水平，从而得到基因型可稳定传代的RXRα蛋白稳定高表达细胞系。

Description

一种RXRα蛋白稳定高表达细胞系及其制备方法
技术领域
本发明属于生物制备技术领域，特别涉及一种RXRα蛋白稳定高表达细胞系及其制备方法。
背景技术
RXR(Homo sapiens retinoid X receptor，人类视黄醇X受体)基因的mRNA主要有三种剪接体，分别为RXRα(NM_002957.5)，RXRβ(NM_001291920.1)，RXRγ(NM_001291921.1)。
细胞内RXRα受体可与多种药物相结合，与人类多数疾病包括但不限于肿瘤、糖尿病、神经退行性疾病、脂肪性肝炎密切相关。构建RXRα蛋白高表达与低表达细胞系，将有利于研究RXRα受体功能，并有助于探讨与RXRα受体相关疾病的发病机理以及开发针对疾病靶点的有效药物。
细胞转染技术是将外源遗传物质导入目的细胞，使其在目的细胞内表达，获得新的遗传标志的过程，是基因表达与基因功能研究的常用技术。细胞转染可分为两大类，一类是瞬时转染，另一类是稳定转染。前者外源遗传物质不整合到宿主染色体，细胞中存在多个外源基因拷贝数，产生高水平的表达，该表达通常仅持续几天，直到外源基因在细胞分裂过程中因各种因素丢失为止。稳定转染可通过核转技术将外源目的基因整合到细胞染色体，成为细胞基因组的一部分，使目的基因在细胞内稳定表达，稳定转染细胞的子代细胞也同样表达外源基因，由此形成稳定转染的细胞系。基因整合到染色体的概率很小，需要选择性标记基因(抗生素抗性基因)对转染细胞进行筛选。将目的基因与抗生素抗性基因连接共转染目的细胞，随后采用相应的抗生素对转染后的细胞进行筛选。只有稳定转染的细胞才会获得对抗生素的抗性，在长期培养中存活下来，由此实现对目标细胞的筛选和扩增，得到稳定转染的同源细胞系。
诸如前述，有效的构建一种RXRα蛋白稳定高表达细胞系对于RXRα蛋白在生物体内的生物学效应的研究及其相关疾病的药物的开发至关重要，本发明拟解决这一问题。
发明内容
鉴于现有技术存在的问题，本发明的首要目的在于提供一种RXRα蛋白稳定高表达细胞系，其特征在于，该细胞系分别为RXR/TG-SK-N-SH-97#、RXR/TG-SK-N-SH-202#，所述细胞系通过以下制备方法制备得到。
本发明的另一目的在于提供一种RXRα蛋白稳定高表达细胞系的制备方法：
(1)制备RXRα高表达的真核表达载体，该载体包含有CMV启动子、pcD NA3.1序列、EGFP示踪基因以及目的基因RXRα，终载体为pcDNA3.1-RXRα-2A-EGFP真核表达载体；
(2)将终载体通过核转的方式将目的基因插入人神经母细胞瘤的永生化细胞SK-N-SH细胞，采用G418药物筛选得到稳定的细胞克隆；
(3)筛选得到的细胞克隆采用PCR扩增RXRα特异性序列，经琼脂糖凝胶电泳初步挑选转基因阳性细胞克隆，将疑似阳性克隆细胞送检核心序列；
(4)采用qPCR、Western blot检测技术鉴定核心序列测序无误的阳性克隆细胞RXRα基因mRNA及蛋白表达水平，最终得到RXRα蛋白稳定高表达的细胞系。
进一步的优选方案为，所述制备方法包括以下制备步骤：
(1)构建真核表达载体：
(1.1)引物设计；
(1.2)EGFP-PA片段获取；
(1.3)pcDNA3.1(+)经BamHI单酶切获得载体骨架；
(1.4)将EGFP-PA片段与pcDNA3.1骨架连接成pcDNA3.1-EGFP；
(1.5)RXRα片段获取；
(1.6)pcDNA3.1-EGFP经BamHI单酶切获得载体骨架；
(1.7)RXRα-2A扩增产物Infusion连接pcDNA3.1-EGFP骨架获得pcDNA3.1-RXRα-2A-EGFP；
(1.8)酶切验证pcDNA3.1-RXRα-2A-EGFP质粒是否构建成功；
(2)、细胞转染；
(3)、阳性细胞筛选及克隆培养；
(4)、阳性克隆细胞的鉴定：
(4.1)真核表达载体阳性克隆鉴定；
(4.2)阳性克隆RXRαmRNA表达水平鉴定；
(4.3)阳性克隆细胞RXRα蛋白高表达水平鉴定。
本发明相对于现有技术的技术效果包括：
(1)本发明有效的构建一种RXRα蛋白稳定高表达细胞系该细胞系，RXRα高表达型97号细胞系(RXR/TG-SK-N-SH-97#)和202号细胞系(RXR/TG-SK-N-SH-202#)RXRα蛋白的相对表达量与野生型(SK-N-SH)细胞组比，RXR/TG-SK-N-SH-97#和RXR/TG-SK-N-SH-202#的RXRα蛋白表达量明显升高，差异具有统计学意义(P<0.01)。
其中，RXR/TG-SK-N-SH-97#细胞系RXRα蛋白表达量为野生型细胞RXRα蛋白表达量的1.87倍(P<0.01)，RXR/TG-SK-N-SH-202#细胞系RXRα蛋白表达量为野生型细胞RXRα蛋白表达量的1.90倍(P<0.01)。
(2)该细胞系基因型稳定，可稳定高表达RXRα，不需要定期进行药物筛选与蛋白表达水平鉴定，从而大大提高了RXRα蛋白相关功能研究实验受试材料的可靠性与研究效率，降低RXRα蛋白高表达细胞增殖培养难度。
(3)该制备方法简化了细胞构建的程序，重现性好，利于产业化应用。
附图说明
图1 EGFP-SV40polyA扩增产物示意图。
图2 pcDNA3.1(+)经BamHI单酶切产物示意图。
图3 EGFP+SV40polyA扩增产物连接骨架后挑克隆菌液PCR结果示意图。
图4 pcDNA3.1-EGFP的中间载体图谱。
图5 pcDNA3.1-EGFP双酶切验证示意图。
图6 RXRα-2A扩增产物示意图。
图7 pcDNA3.1-EGFP经BamHI单酶切产物示意图。
图8 infusion连接反应体系与反应程序示意图。
图9 RXRα-2A扩增产物连接骨架后挑克隆菌液PCR结果。
图10 pcDNA3.1-RXRα-2A-EGFP真核表达载体终载体质粒图谱。
图11 pcDNA3.1-RXRα-2A-EGFP质粒酶切验证示意图。
图12 SK-N-SH野生型细胞形态示意图。
图13核转前细胞形态示意图。
图14转染后细胞EGFP荧光蛋白表达示意图。
图15细胞克隆形成过程与细胞克隆的形态。
图16挑取的细胞克隆PCR鉴定结果图。
图17疑似阳性克隆细胞RNA琼脂糖凝胶电泳图。
图18 qPCR三步法扩增程序示意图。
图19 qPCR扩增曲线示意图。
图20疑似阳性细胞克隆细胞内RXRαmRNA相对表达量数据分析结果示意图。
图21 RXRα蛋白在SK-N-SH野生型与RXRα基因高表达型细胞中的表达鉴定示意图。
图22 RXRα蛋白在SK-N-SH野生型与RXRα基因高表达型细胞中的相对表达量测定示意图。
注：SK-N-SH为野生型细胞；RXR/TG-SK-N-SH-97#RXRα基因高表达型97号细胞；RXR/TG-SK-N-SH-202#为RXRα基因高表达型202号细胞。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但发明的实施方式不限于此。
实施例1
一种RXRα蛋白稳定高表达细胞系及其制备方法，
(1)制备pcDNA3.1-RXRα-2A-EGFP真核表达载体
(1.1)引物设计：
设计引物从EGFP-N1载体质粒上扩增EGFP-SV40polyA片段；
设计引物从SK-N-SH细胞cDNA扩增RXRα的CDS序列(设计时需要去掉终止密码子TAG)，以扩增目的基因RXRα并在后端添加2A序列及IN-Fusion连接所需的约15bp的载体骨架片段。
设计引物引物信息如表1。
表1引物信息表
注：引物RXRα-2A-infusion-F/RXRα-clone-R以SK-N-SH细胞cDNA增模板为，扩增得到目的基因RXRα；引物RXRα-2A-infusion-F/RXRα-2A-infusion-R所用扩增模板为第一步的PCR产物，目的是在第一步的PCR产物后面加上2A序列和3’端所需的15bp同源序列。
(1.2)EGFP-PA片段获取:
采用PCR扩增技术从EGFP-N1质粒上扩增EGFP-SV40polyA片段，反应体系如表2。
反应程序：(98℃/10s,55℃/30s,72℃/1min)X35cycles，反应结束后EGFP-PA琼脂糖凝脂电泳结果如图1.
表2PCR反应体系
(1.3)pcDNA3.1(+)经BamHI单酶切获得载体骨架：
采用内切酶BamHI酶切获取骨架片段pcDNA3.1(+)，BamHI酶切反应体系如表3，琼脂糖凝胶电泳鉴定线性化pcDNA3.1(+)片段大小如图2，胶回收获取酶切骨架片段。
反应程序为：37℃，3h。
表3BamHI酶切体系
(1.4)将EGFP-PA片段与pcDNA3.1骨架连接成pcDNA3.1-EGFP：
纯化EGFP-PA片段扩增产物，Infusion连接(In-Fusion HD Cloning Kits,Clontech)，转化，涂板，挑菌，菌液PCR，结果如图3，挑选两个阳性菌落扩大摇菌，保菌，提质粒。
连接和转化步骤如下：
①连接为冰上加样：5μl In-Fusion+1.5μl载体骨架+2.5μl PCR产物+1μl水，16℃反应2h或4℃过夜，取出后冰上放置。
②取感受态细胞，置于冰上溶解，并用移液枪轻轻吹打混匀感受态细胞；
③取1.5ml离心管，加入5μl载体连接产物，加入50μl感受态细胞，轻轻混匀，并马上置于冰上；
④冰上孵育30min，42℃水浴锅中热激90s，马上置于冰上冷却1～2min；
⑤加上150μl无抗LB培养基，37℃摇床200rpm活化1h，同时取相应数量的Amp抗性平板于烘箱中预热；
⑥取活化后的菌液30～50μl于预热的Amp抗性平板中，均匀凃布，正向放置2～3min后倒置于37℃培养箱培养过夜。
挑克隆菌液PCR步骤如下：
①观察平板上的菌落形态，肉眼可见且能和其他菌落区分开时即可挑克隆；
②确定每个平板需要挑的克隆数。如果是短片段的T载体连接，每板挑取6～8个克隆即可；对于较难连的片段，则需要挑取16～48个克隆不等；
③超净工作台中，取相应数量的1.5ml无菌离心管于试管架上，标号后，每个离心管中加入6μl抗性培养基，待用；
④用移液枪小心的从平板中挑取较大的菌落，并在有6μl培养基的离心管中吹打混匀(对于克隆长得较小的菌落，可挑出来混匀后置摇床中摇1h后再PCR鉴定)；
⑤取1μl上述菌液用于PCR鉴定，剩余5μl菌液置于37℃烘箱或摇床；
⑥PCR鉴定结果出来后，选出阳性菌株，送测序。
其中，EGFP+SV40polyA扩增产物连接骨架后挑克隆菌液PCR结果如图3所示。pcDNA3.1-EGFP的中间载体图谱如图4；质粒做BamHI酶、EcoRI酶双酶切验证，和50μl体系EcoRI单酶切，双酶切结果应为：6301bp＝948bp+5353bp，结果如图5。
(1.5)RXRα片段获取：
RXRα片段扩增的反应体系如表4。
反应程序：(98℃/10s,55℃/30s,72℃/1.5min)X35cycles，琼脂糖凝胶电泳RXRα-2A片段如图6。
表4 PCR反应体系
注：RXRα-2A片段的扩增分两步：第一步扩增所用引物为RXRα-2A-infusion-F/RXRα-clone-R，所用扩增模板为SK-N-SH细胞cDNA，目的是先将RXRα扩增出来；第二步扩增所用引物为RXRα-2A-infusion-F/RXRα-2A-infusion-R，所用扩增模板为第一步的PCR产物，目的是在第一步的PCR产物后面加上2A序列和3’端所需的15bp同源序列。
(1.6)pcDNA3.1-EGFP经BamHI单酶切获得载体骨架：
将pcDNA3.1-EGFP(infusion连接EGFP时同源序列将BamBI酶切位点补齐)用限制性内切酶BamHI酶切，获得具有粘性末端的载体骨架，反应体系如表5。
反应程序为：37℃，3h。琼脂糖凝胶电泳切胶回收酶切骨架片段如图7。
表5 BamHI酶切单酶切体系
(1.7)获得pcDNA3.1-RXRα-2A-EGFP：
纯化RXRα-2A扩增产物与pcDNA3.1-EGFP单酶切骨架片段，两片段经Infusion连接，转化，涂板，挑菌，做菌液PCR，挑选阳性菌落，扩大摇菌培养，保菌以提质粒。PCR鉴定结果见图9，真核表达载体终载体质粒图谱见图9。
操作流程：
a.Infusion连接：将以上制备好的有双酶切粘性末端的载体、两端有15bp同源序列的DNA片段采用Clontech公司的InfusionHD cloningkit进行连接，infusion连接反应体系与反应程序如下图8.。
b.转化涂板:连接产物转化涂板的步骤如下
①用冰盒取适量冰，从-80℃冰箱取出感受态细胞后置于冰上；
②在超净工作台中，用烧过并冷却的镊子取1.5ml离心管，加入3～10μl连接产物，再混入35μl感受态细胞(TAKARA的感受态一般100μl一管，每管可转三次)，轻缓的吹打混匀，快速置于冰上，孵育30min；
③将恒温孵育器温度调至42℃，温度达到后，将上述混合物于42℃孵育90s，取出冰上放置1～3min；
④在超净工作台中，在上述混合物中加入500μl无抗LB培养基，37℃/200rpm摇床中活化1h，同时从冰箱中取相应数量的抗性平板置于37℃烘箱中预热；
⑤活化1h后，取出箘液，6000rpm离心5min以收集沉淀；
⑥箘液离心时，于超净工作台中将涂布棒在75％酒精中搅拌洗涤几次并在酒精灯上过火消毒，直立于试管架上冷却。
⑦箘液离心好后，超净工作台中吸弃上层400μl培养基，并将剩余的培养基与箘液沉淀轻轻吹打混匀。涂布棒冷却后，将剩余箘液加在预热好的抗性平板中，用涂布棒轻轻将箘液涂匀。
⑧涂好的平板正向放置2min待固体培养基充分吸收箘液后，再倒置放于37℃烘箱中培养过夜。
注：对于感受态及箘液的操作一定在超净工作台中完成，以免染上杂菌，导致涂布平板后长出的克隆有很多“背景”。
c.挑克隆箘液PCR鉴定及提质粒酶切鉴定
挑克隆箘液PCR的步骤如下：
①观察平板上的菌落形态，肉眼可见且能和其他菌落区分开时即可挑克隆；
②确定每个平板需要挑的克隆数。如果是短片段的T载体连接，每板挑取6～8个克隆即可；对于较难连的片段，则需要挑取16～48个克隆不等；
③超净工作台中，取相应数量的1.5ml无菌离心管于试管架上，标号后，每个离心管中加入5μl无菌水或抗性培养基，待用；
④用移液枪小心的从平板中挑取较大的菌落，并在有5μl无菌水或培养基的离心管中吹打混匀；
⑤取1μl上述箘液用于PCR鉴定，剩余4μl箘液置于37℃烘箱温育即可。
⑥PCR鉴定结果出来后，选出阳性菌株，将4μl箘液全部加入5ml抗性培养基中摇菌过夜。
提质粒酶切鉴定的步骤如下：
①第二天，上述5ml的箘液，在超净工作台中，取1ml箘液，分两个离心管保种：每管500μl箘液加入500μl 60％的甘油混匀，暂时置于4℃冰箱保存；
②剩余4ml箘液，于8000rpm离心5min，弃掉上清，按质粒小提试剂盒的说明书提取质粒；
③提取出的质粒双酶切鉴定(至少两组)。电泳符合预期结果的菌株，从甘油菌中取500μl送测序，剩下的转移到-80℃保存。
其中，RXRα-2A扩增产物连接骨架后挑克隆菌液PCR结果如图9所示。构建好的终载体图谱如图10所示。
(8)酶切验证pcDNA3.1-RXRα-2A-EGFP质粒是否构建成功：
酶切结果如图11所示。双酶切验证SpeI+XhoI＝3339bp+4455bp(图中未酶切完全，最上层条带大小等于线性化质粒大小)；单酶切SpeI＝7794bp。大小完全符合，说明质粒构建大小无误，并回收SpeI线性化的质粒。
(2)细胞转染
将SK-N-SH传代到培养板中稳定培养。待6孔板细胞汇合度达到80-90％时进行核转。转染体系为：
核转步骤如下：
a)将 Supplement全部加入 Solution中(4℃稳定保存3个月)。
b)从冰箱拿出一管完全培养基，37℃预热，然后取1.5ml加到6孔板中，放入37℃培养箱。
c)将6孔板细胞消化离心后去培养基，PBS洗一次。
d)用100μl的Supplement Solution(提前从冰箱取出恢复至室温后使用)重悬细胞，并混入总量2μg的质粒(按试剂盒说明书)。
e)用试剂盒提供的滴管将细胞与质粒的混合液小心加入提供的核转杯中，避免产生气泡，用相应的程序核转后，加入500μl预热的培养基，将细胞转移至预热好的12孔板中，摇匀后静置培养至少24h。
f)次日观察，拍照片记录转染细胞贴壁情况，更换新鲜的培养基后观察细胞状况并拍照。
(3)阳性细胞筛选及克隆培养
转染后细胞继续培养，待增长至80％-90％时分盘至10cm皿中，根据细胞培养的状况及转染效率进行分盘。(若细胞状态好、转染效率高分盘时细胞密度可稍低一点；若细胞状态不好、转染效率低，加药之后会大量死亡，故细胞密度应稍高一点。)密度控制在显微视野内可观察到7～15个细胞为宜。
当多数单个细胞分裂至4～8个细胞时，开始加药，用预实验的最佳筛选浓度进行药筛(经预实验后，本实验设定为300μg/ml)，期间有部分细胞死亡，每两天更换一次加药的新鲜培养基。加药第一天记为Day0。
加药到Day6-Day7时细胞会开始大量死亡，同时观察到一些成形的单克隆细胞团，在Day8-Day12间，根据情况挑选细胞状态以及克隆形态较好的，用枪头轻轻刮下并吸出至96孔板，挑克隆前换新鲜的培养基。
注意：吸取到96孔板时可带上100～120μl的培养基，同时至96孔板中轻轻的吹散细胞团，此过程注意要轻柔，且尽量不产生气泡(气泡对细胞有较大剪切力)。
克隆挑选完后每天观察，细胞在96孔板中长至90％以上时，可传至48孔板，再依次传代到12孔板。
(4)阳性克隆细胞的鉴定
(4.1)真核表达载体阳性克隆鉴定：
收集12孔板的一半细胞进行裂解提取细胞DNA，根据之前设计的引物进行扩增(表8)。
待12孔板中至90％以上汇合度时，将细胞消化一半下来(剩余一半原孔培养，并编号)，5000rpm离心10min，弃掉上清，裂解液裂解后做鉴定，裂解步骤操作如下：
a)1.5ml离心管中，5000rpm离心10min后，尽量将细胞培养基吸除干净，如果有残余，建议将EP管盖打开，于70℃烘箱中干燥10min；
b)裂解液配方：15μl DirectPCR reagent+1μl proteinaseK+4μl H2O＝20μl；其中DirectPCRreagent(Viagen Biotech,Cat#101-T或#301-C)，proteinase K(天根的DNA提取kit中自带)；
c)将配好的20μl裂解液加至细胞沉淀中，混合均匀后转移至200μl的PCR管，做好编号。55℃/2h，85℃/45min，取1μl做PCR鉴定(20μl体系不超过1.5μl)。
d)在批量细胞克隆裂解鉴定前，最好做好裂解液引物条件摸索。部分引物可能不适合裂解液环境。
e)24孔板细胞同样适合该方法步骤鉴定。
f)裂解及鉴定最好在1-2天内完成，得到阳性的克隆后可对目标细胞进行重点培养，阴性细胞则可舍弃。省去大量细胞的培养操作过程。
扩增的反应体系如表6；扩增鉴定引物如表7。
反应程序：(98℃/10s,55℃/30s,72℃/1.5min)X35cycles。
表6 PCR反应体系
表7鉴定引物信息表
通过G418加药筛选本实验共得到89个细胞克隆，传代后进行PCR阳性鉴定的共有41个克隆，最终鉴定出阳性的克隆共11个。鉴定PCR结果如图16：
(4.2)阳性克隆RXRαmRNA表达水平鉴定：
选取6个阳性细胞及1个野生型细胞培养、RNA提取及反转录。RNA纯度与完整性检测结果如图17与表8。
复苏细胞至12孔板，待细胞长满后分别将细胞消化下来用PBS清洗后离心去上清，细胞提RNA,后进行反转录，步骤如下：
a)胰酶消化细胞后(培养基终止消化)，将细胞吸出置于1.5ml离心管(进口离心管)中，拿出细胞间，后续步骤在分子间操作。
b)1000rpm离心5min，吸除上清液。加入500μl TRIZOL试剂，上下吸打混匀几次，室温静置5min(核蛋白复合物裂解)；
c)加100μl氯仿于Trizol-细胞匀浆液中(0.2ml氯仿每1ml Trizol)，盖好盖子用力摇晃15s，室温静置3min；
d)4℃下12000rpm离心15min，小心吸取上层水相层于新的离心管中(注意不能吸到中间层的蛋白层)，加入250μl异丙醇(0.5ml异丙醇每1ml Trizol)，颠倒混匀数次，室温静置10min；
e)4℃下12000rpm离心10min，弃上清；
f)用500μl 75％乙醇(DEPC水配制)洗涤沉淀(小心颠倒几次)，4℃下7500rpm离心5min，弃上清；
g)超净工作台里干燥沉淀5min，20μl无酶水溶解沉淀，测浓度后，将RNA取一部分稀释为250ng/μl，-80℃保存或直接逆转录。
其中，RNA电泳鉴定结果如图17。
表8 RNA浓度及OD值信息
样品编号 RNA浓度 260/280 260/230
SK-N-SH 480ng/μl 1.96 2.10
38 523ng/μl 1.93 2.03
56 563ng/μl 1.90 2.04
97 494ng/μl 1.83 1.96
137 512ng/μl 2.03 1.99
160 479ng/μl 1.94 1.89
202 533ng/μl 2.01 1.92
RNA提取完成，之后进行逆转录，按表9、表10配制反应体系：
表9反应体系
上述体系65℃反应5min,冰上急冷；
表10反应体系
42℃×60min，70℃×15min，反应完成后PCR鉴定或-20℃保存待用。
之后进行qPCR鉴定：
六个样品(细胞cDNA)，每个样本用两对引物(RXRα和GAPDH)，体系如表11：
表11反应体系
本qPCR实验采用ABI 7500型号qPCR仪，上机程序如下，采用三步法扩增程序，见图18：
qPCR结果分析见图19、图20与表12。
表12.qPCR原始CT值数据整理及分析
qPCR分析结果:
本研究采用qPCR对PCR鉴定为阳性SK-N-SH细胞系中RXRα的表达进行检测，结果显示，3个阳性克隆RXRαmRNA显著高于SK-N-SH野生型细胞，分别为：97#是野生型的17倍，202#是野生型的8倍，38#是野生型的6倍，因此将97#和202#两个表达量较高的细胞克隆扩大培养。
得到细胞系分别为RXR/TG-SK-N-SH-97#、RXR/TG-SK-N-SH-202#。
(4.3)阳性克隆细胞株RXRα蛋白表达水平鉴定
将实施例1的细胞，提取细胞总蛋白采用BCA蛋白定量法进行蛋白定量。经SDS-PAGE凝胶电泳，半干转膜仪转印蛋白至PVDF膜，5％脱脂奶粉封闭2h，分别加入RXRα及内参GAPDH一抗稀释液，室温孵育2h，TBST缓冲液洗膜3次每次10min，1：4000比例稀释HPR标记的羊抗兔、羊抗鼠二抗，室温孵育1h，TBST洗膜3次每次10min，ECL化学发光试剂盒显色，冷CCD成像系统显影，Image J 2.0软件对蛋白条带灰度值进行定量分析。
(4.4)阳性克隆细胞株RXRα蛋白表达水平鉴定结果
RXRα蛋白表达Western Blot鉴定结果如图21、图22所示，RXRα基因高表达型97号细胞系(RXR/TG-SK-N-SH-97#)和202号细胞系(RXR/TG-SK-N-SH-202#)RXRα蛋白的相对表达量与野生型细胞组比，RXR/TG-SK-N-SH-97#和RXR/TG-SK-N-SH-202#的RXRα蛋白表达水平明显升高，差异具有统计学意义(P<0.01)。其中，RXR/TG-SK-N-SH-97#细胞系RXRα蛋白表达量为野生型细胞RXRα蛋白表达量的1.87倍(P<0.01)，RXR/TG-SK-N-SH-202#细胞系RXRα蛋白表达量为野生型细胞RXRα蛋白表达量的1.90倍(P<0.01)。
综合以上鉴定结果，通过该部分研究，本实验室成功构建了RXRα高表达真核载体pcDNA3.1-RXRα-2A-EGFP及两株RXRα蛋白高表达细胞系，RXRα蛋白高表达细胞系分别为RXR/TG-SK-N-SH-97#、RXR/TG-SK-N-SH-202#，为后续实验提供受试材料。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种RXRα蛋白稳定高表达细胞系的制备方法，其特征在于，
(1)制备RXRα基因高表达的真核表达载体，该载体包含有CMV启动子、pcDNA3.1序列、EGFP示踪基因以及目的基因RXRα，终载体为pcDNA3.1-RX Rα-2A-EGFP真核表达载体；
(2)将终载体通过核转的方式将目的基因插入人神经母细胞瘤的永生化细胞即SK-N-SH细胞，采用G418药物筛选得到稳定的细胞克隆；
(3)筛选得到的细胞克隆，采用PCR扩增RXRα特异性序列，经琼脂糖凝胶电泳初步挑选转基因阳性细胞克隆，将疑似阳性的细胞克隆送检，检测核心序列；
(4)采用qPCR、Western blot检测技术鉴定核心序列测序无误的阳性克隆细胞mRNA及蛋白表达水平，最终得到RXRα蛋白稳定高表达的细胞系。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，包括以下制备步骤：
(1)构建真核表达载体：
(1.1)引物设计；
(1.2)EGFP-PA片段获取；
(1.3)pcDNA3.1(+)经BamHI单酶切获得载体骨架；
(1.4)将EGFP-PA片段与pcDNA3.1骨架连接成pcDNA3.1-EGFP；
(1.5)RXRα片段获取；
(1.6)pcDNA3.1-EGFP经BamHI单酶切获得载体骨架；
(1.7)RXRα-2A扩增产物Infusion连接pcDNA3.1-EGFP骨架获得pcDNA3.1-RXRα-2A-EGFP；
(1.8)酶切验证pcDNA3.1-RXRα-2A-EGFP质粒是否构建成功；
(2)细胞转染；
(3)阳性细胞筛选及克隆培养；
(4)阳性克隆细胞的鉴定：
(4.1)真核表达载体阳性克隆鉴定；
(4.2)阳性克隆RXRαmRNA表达水平鉴定；
(4.3)阳性克隆细胞RXRα蛋白表达水平鉴定。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，
所述步骤(1.1)为设计引物从EGFP-N1载体质粒上扩增EGFP-SV40polyA片段；设计引物从SK-N-SH细胞cDNA扩增RXRα的CDS序列，设计时需要去掉终止密码子TAG，以扩增目的基因RXRα并在后端添加2A序列及IN-Fusion连接所需的约15bp的载体骨架片段；
所述步骤(1.2)为采用PCR扩增技术从EGFP-N1质粒上扩增EGFP-SV40 polyA片段；反应程序：(98℃/10s,55℃/30s,72℃/1min)×35cycles；
所述步骤(1.3)为采用内切酶BamHI酶切获取骨架片段pcDNA3.1(+)，BamHI酶切反应体系酶切，经琼脂糖凝胶电泳分离鉴定线性化pcDNA3.1(+)片段大小，切胶回收获取酶切骨架片段，反应程序：37℃，3h。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1.4)为纯化EGFP-PA片段扩增产物，Infusion连接(In-Fusion HD Cloning Kits,Clontech)，转化，涂板，挑菌，菌液PCR，结果如图3，挑选两个阳性菌落扩大摇菌，保菌，提质粒；
连接和转化步骤如下：
a)连接为冰上加样：5μl In-Fusion+1.5μl载体骨架+2.5μlPCR产物+1μl水，16℃反应2h或4℃过夜，取出后冰上放置；
b)取感受态细胞，置于冰上溶解，并用移液枪轻轻吹打混匀感受态细胞；
c)取1.5ml离心管，加入5μl载体连接产物，加入50μl感受态细胞，轻轻混匀，并马上置于冰上；
d)冰上孵育30min，42℃水浴锅中热激90s，马上置于冰上冷却1～2min；
e)加上150μl无抗LB培养基，37℃摇床200rpm活化1h，同时取相应数量的Amp抗性平板于烘箱中预热；
f)取活化后的菌液30-50μl于预热的Amp抗性平板中，均匀凃布，正向放置2～3min后倒置于37℃培养箱培养过夜；
挑克隆菌液PCR步骤如下：
a)观察平板上的菌落形态，肉眼可见且能和其他菌落区分开时即可挑克隆；
b)超净工作台中，取相应数量的1.5ml无菌离心管于试管架上，标号后每个离心管中加入6μl抗性培养基，待用；
c)用移液枪小心的从平板中挑取较大的菌落，并在有6μl培养基的离心管中吹打混匀(对于克隆长得较小的菌落，可挑出来混匀后置摇床中摇1h后再PCR鉴定)；
d)取1μl上述菌液用于PCR鉴定，剩余5μl菌液置于37℃烘箱或摇床；
PCR鉴定结果出来后，选出阳性菌株，送检测序。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，
所述步骤(1.5)为:
RXRα片段扩增的反应体系如下表：
反应程序：(98℃/10s,55℃/30s,72℃/1.5min)×35cycles，琼脂糖凝胶电泳切胶回收RXRα-2A片段；
所述步骤(1.6)为:
将pcDNA3.1-EGFP(infusion连接EGFP时同源序列将BamBI酶切位点补齐)用限制性内切酶BamHI酶切，反应体系如下表；
反应程序为：37℃，3h，琼脂糖凝胶电泳切胶回收酶切骨架片段；
所述步骤(1.7)为:
纯化RXRα-2A扩增产物与pcDNA3.1-EGFP单酶切骨架片段，两片段经Infusion连接，转化，涂板，挑菌，做菌液PCR，挑选阳性菌落，扩大摇菌培养，保菌以提质粒；
所述步骤(1.8)为:
双酶切验证SpeI+XhoI＝3339bp+4455bp；单酶切SpeI＝7794bp。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)为:将SK-N-SH传代到培养板中稳定培养；待6孔板细胞汇合度达到80-90％时进行核转；转染体系为：
核转步骤如下：
a)将 Supplement全部加入 Solution中，4℃稳定保存3个月；
b)从冰箱拿出一管完全培养基，37℃预热，然后取1.5ml加到6孔板中，放入37℃培养箱；
c)将6孔板细胞消化离心后去培养基，PBS洗一次；
d)用100μl的Supplement Solution重悬细胞，并混入总量2μg的质粒；
e)用试剂盒提供的滴管将细胞与质粒的混合液小心加入提供的核转杯中，避免产生气泡，用相应的程序核转后，加入500μl预热的培养基，将细胞转移至预热好的12孔板中，摇匀后静置培养至少24h；
f)次日观察，拍照片记录转染细胞贴壁情况，更换新鲜的培养基后观察细胞状况并拍照。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)为:
转染后细胞继续培养，待增长至80％-90％时分盘至10cm皿中，根据细胞培养的状况及转染效率进行分盘，密度控制在显微视野内可观察到7～15个细胞为宜；
当多数单个细胞分裂至4～8个细胞时，开始加药，用预实验的最佳筛选浓度300μg/ml进行药筛，期间有部分细胞死亡，每两天更换一次加药的新鲜培养基；加药第一天记为Day0；
加药到Day6-Day7时细胞会开始大量死亡，同时观察到一些成形的单克隆细胞团，在Day8-Day12间，根据情况挑选细胞状态以及克隆形态较好的，用枪头轻轻刮下并吸出至96孔板，挑克隆前换新鲜的培养基；
克隆挑选完后每天观察，细胞在96孔板中长至90％以上时，可传至48孔板，再依次传代到12孔板。
8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，
所述步骤(4.1)为:
收集12孔板的一半细胞进行裂解提取细胞DNA，根据之前设计的引物进行扩增；待12孔板中至90％以上汇合度时，将细胞消化一半下来，剩余一半原孔培养，并编号，5000rpm离心10min，弃掉上清，裂解液裂解后做鉴定，裂解步骤操作如下：
a)1.5ml离心管5000rpm离心10min，吸干培养基，如有残余，将EP管盖打开，于70℃烘箱中干燥10min；
b)裂解液配方：15μl DirectPCR reagent+1μl proteinaseK+4μl H2O＝20μl；其中DirectPCR reagent(Viagen Biotech,Cat#101-T或#301-C)，proteinase K(天根的DNA提取kit中自带)；
c)将配好的20μl裂解液加至细胞沉淀中，混合均匀转移至200μl的PCR管，做好编号。55℃/2h，85℃/45min，取1μl做PCR鉴定；
d)鉴定完成，将阳性的克隆进行重点培养；
PCR扩增的反应体系如下表：
反应程序：(98℃/10s,55℃/30s,72℃/1.5min)×35cycles；
所述步骤(4.2)为：
选取6个阳性细胞及1个野生型细胞培养、RNA提取及反转录；
复苏细胞至12孔板，待细胞长满后分别将细胞消化下来用PBS清洗后离心去上清，细胞提RNA，后进行反转录，步骤如下：
a)胰酶消化细胞后，将细胞吸出置于1.5ml离心管中，拿出细胞间，后续步骤在分子间操作；
b)1000rpm离心5min，吸除上清液。加入500μl TRIZOL试剂，上下吸打混匀几次，室温静置5min；
c)加100μl氯仿于Trizol-细胞匀浆液中，盖好盖子用力摇晃15s，室温静置3min；
d)4℃下12000rpm离心15min，小心吸取上层水相层于新的离心管中，加入250μl异丙醇，0.5ml异丙醇每1ml Trizol，颠倒混匀数次，室温静置10min；
e)4℃下12000rpm离心10min，弃上清；
f)用500μl 75％乙醇洗涤沉淀，4℃下7500rpm离心5min，弃上清；
g)超净工作台里干燥沉淀5min，20μl无酶水溶解沉淀，测浓度后，将RNA取一部分稀释为250ng/μl，-80℃保存或直接逆转录。
9.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，
所述步骤(4.3)为:
提取细胞总蛋白，采用BCA蛋白定量法进行蛋白定量；经SDS-PAGE凝胶电泳，半干转膜仪转印蛋白至PVDF膜，5％脱脂奶粉封闭2h，分别加入RXRα及内参GAPDH一抗稀释液，室温孵育2h，TBST缓冲液洗膜3次每次10min，1：4000比例稀释HPR标记的羊抗兔、羊抗鼠二抗，室温孵育1h，TBST洗膜3次每次10min，ECL化学发光试剂盒显色，冷CCD成像系统显影，Image J2.0软件对蛋白条带灰度值进行定量分析。
10.一种RXRα蛋白稳定高表达细胞系，其特征在于，该细胞系分别为RXR/TG-SK-N-SH-97#、RXR/TG-SK-N-SH-202#，通过权利要求1-9任一项所述的制备方法制备得到。
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