CN108342362A - 一种用于扩增重组犬腺病毒cav2的稳定细胞系mdck及其构建方法 - Google Patents

一种用于扩增重组犬腺病毒cav2的稳定细胞系mdck及其构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种表达犬腺病毒E1A基因和E1B基因的稳定细胞系、其构建方法和应用，通过将E1区的两个基因E1A和E1B分别构建到慢病毒载体中，然后让MDCK细胞分别稳定的表达E1A和E1B基因，构建了MDCK‑E1A‑E1B的稳定细胞系。本发明将片段较长不易构建的E1基因拆成了两段片段较短易于构建的E1A和E1B基因，提高了构建稳定细胞的成功率；E1A和E1B基因分别带有不同颜色的荧光蛋白，便于实时监控稳定细胞的稳定性。实验证明MDCK‑E1A‑E1B稳定细胞系比MDCK‑E1稳定细胞系扩增犬腺病毒滴度更高，为犬腺病毒在病毒活载体疫苗、基因治疗、癌症治疗等领域的应用上奠定了很好的基础。

Description

一种用于扩增重组犬腺病毒CAV2的稳定细胞系MDCK及其构建 方法
技术领域
本发明属于稳定细胞系的构建领域，更具体地，涉及一种用于扩增重组犬腺病毒CAV2的稳定细胞系MDCK及其构建方法。
背景技术
腺病毒载体自上世纪八十年代以来以其良好的发展前景，成为了人们研究的热点。目前腺病毒载体被广泛的应用于生产病毒活载体疫苗、基因治疗、癌症治疗等领域。然而腺病毒本身的安全性以及免疫原性等也限制了腺病毒载体的临床应用，人们通过不断地研究和学习发现犬腺病毒CAV2只能在犬科动物的细胞中复制生长不能在人，猴等细胞中生长，即使在293，Hela细胞中有低水平的复制但却不能包装成病毒颗粒或扩散，安全性高，同时人体内不存在CAV2的免疫答应，因此犬2型腺病毒CAV2的研究引起了国内外学者兴趣。随着研究的深入，腺病毒载体的缺失也越来越多，这样也导致在腺病毒载体的包装上也变得越来越困难，因此，包装辅助细胞系的建立就变得尤为重要。
据文献报道对腺病毒包装其关键作用的部分为腺病毒E1区的基因，因此目前主要通过把E1基因构建到MDCK上来建立犬腺病毒复制生长的辅助细胞系。然而直接将E1基因构建到MDCK中存在细胞系稳定性不高，犬腺病毒增殖率不高的问题。
发明内容
针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种用于扩增重组犬腺病毒CAV2的稳定细胞系MDCK及其构建方法，其充分结合犬腺病毒CAV2扩增的特点和需求，针对性地对其包装辅助细胞系进行重新设计和构建，相应获得了一种细胞稳定性高、犬腺病毒增殖率高的MDCK稳定细胞系。
为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种用于表达犬腺病毒E1A基因和E1B基因的稳定细胞系，所述稳定细胞系为MDCK细胞，其以慢病毒作为载体，在所述MDCK细胞的基因组中先后随机插入E1A基因和E1B基因，所述E1A基因和E1B基因均来源于犬腺病毒CAV2；该稳定细胞系能够分别表达所述E1A基因和所述E1B基因。
按照本发明的另一个方面，提供了一种用于表达犬腺病毒E1A基因和E1B基因的稳定细胞系的构建方法，将犬E1A基因和犬E1B基因分别构建到慢病毒载体中，分别得到表达E1A基因的慢病毒和表达E1B基因的慢病毒；用所述表达E1A基因的慢病毒感染MDCK细胞，得到MDCK-E1A细胞系；再用所述表达E1B基因的慢病毒感染所述MDCK-E1A细胞系，获得能稳定表达所述E1A基因和所述E1B基因的稳定细胞系MDCK-E1A-E1B。
优选地，所述的构建方法，包括如下步骤：
(1)从载体pCAV2上分别扩增E1A和E1B基因，先将E1A片段用同源重组的方法克隆到含有报告基因mCherry的慢病毒载体pFUGW上，构建重组质粒pFUGW-his-mCherry-2a-E1A；再用同样的方法将E1B片段克隆到含有报告基因GFP和筛选基因puro的慢病毒载体pCDH上，构建重组质粒pCDH-his-GFP-2A-E1B-puro；
(2)在培养皿中接种HEK293T细胞；采用慢病毒转染体系，将步骤(1)获得的重组质粒pFUGW-his-mCherry-2a-E1A与慢病毒的包装质粒g/p、PMD2G和RSV-REV按照8:3:2:1质量比例添加到无菌水中混匀，以磷酸钙转染法转染细胞，将该细胞放入培养箱中培养；转染后48-72小时收获含LV-mCherry-E1A病毒的细胞培养液，无菌过滤并收集含有LV-mCherry-E1A病毒的滤出液；
(3)在培养皿中接种HEK293T细胞；采用慢病毒转染体系，将步骤(1)获得的重组质粒pCDH-his-GFP-2A-E1B-puro与慢病毒的包装质粒g/p、PMD2G、RSV-REV按照8:3:2:1质量比例添加到无菌水中混匀，以磷酸钙转染法转染细胞，将该细胞放入培养箱中培养；转染后48-72小时收获含LV-GFP-puro-E1B病毒的细胞培养液，无菌过滤并收集含有LV-GFP-puro-E1B病毒的滤出液；
(4)测定重组慢病毒的滴度，将LV-mCherry-E1A病毒的滤出液以病毒感染复数(MOI)等于10～20添加到预先接种MDCK细胞的培养皿中共培养，通过观察荧光表达情况连续传代培养，直到最后视野中的细胞90％以上都是红色荧光，表示筛选出能稳定表达E1A基因的MDCK-E1A细胞系；
(5)将LV-GFP-puro-E1B病毒的滤出液以病毒感染复数(MOI)等于10～20添加到预先接种MDCK-E1A细胞系的培养皿中共培养；最后添加Puromycin抗生素筛选阳性细胞系，最终获得MDCK稳定表达E1A和E1B基因的MDCK-E1A-E1B细胞系。
优选地，所述pFUGW-his-mCherry-2a-E1A重组质粒构建过程包括如下步骤：
(1)以pCAV2为模板，采用PCR方法扩增E1A片段，随后在E1A上加上融合序列和酶切位点；以H2B-mCherry-P2A-N2c(G)质粒为模板，采用PCR方法扩增得到含有融合序列的his-mCherry-2A片段；用同源重组PCR的方法将E1A和his-mCherry-2A片段融合，得到PCR片段；
(2)将步骤(1)所得的PCR片段电泳检测、纯化，测定OD值；
(3)采用Xba1和EcoR1酶对慢病毒载体pFUGW进行双酶切，切胶回收线性载体；
(4)利用T4 DNA连接酶将步骤(2)中PCR片段与步骤(3)中线性载体于16℃过夜连接；
(5)采用热转化方法，将上述连接产物转化DH10B感受态细胞，于37℃过夜培养16小时以上；次日挑单克隆摇菌、提质粒，使用Xba1和EcoR1双酶切验证正确，送测序。
优选地，所述pCDH-his-GFP-2A-E1B-puro重组质粒构建过程包括如下步骤：
(1)以pCAV2为模板，采用PCR方法扩增E1B片段，随后在E1B上加上融合序列和酶切位点；以H2B-GFP-P2A-N2c(G)质粒为模板，采用PCR方法扩增得到含有融合序列的his-GFP-2A片段；用同源重组PCR的方法将E1B和his-GFP-2A片段融合，得到PCR片段；
(2)将步骤(1)所得的PCR片段电泳检测、纯化，测定OD值；
(3)用Xba1和Not1酶对慢病毒载体pCDH-puro载体进行双酶切，切胶回收线性载体；
(4)利用T4 DNA连接酶将步骤(2)中PCR片段与步骤(3)中线性载体于16℃过夜连接；
(5)采用热转化方法，将上述连接产物转化DH10B感受态细胞，于37℃过夜培养16小时以上；次日挑单克隆摇菌、提质粒，使用Xba1和Not1双酶切验证正确，送测序。
按照本发明的另一个方面，提供了一种所述的稳定细胞系的应用，用于制备犬腺病毒CAV2。
优选地，将犬腺病毒CAV2病毒株接种于所述的稳定细胞系上，病毒株的培养条件为35℃～37℃，3％～5％CO2。
优选地，将犬腺病毒CAV2病毒株接种于所述稳定细胞系上，48-72小时收获细胞沉淀纯化病毒株。
按照本发明的另一个方面，提供了一种提高犬腺病毒CAV2滴度的方法，将犬腺病毒CAV2病毒株接种于所述的稳定细胞系上，在35℃～37℃，3％～5％CO2条件下进行培养，48-72小时收获细胞沉淀纯化病毒株。
总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，能够取得下列有益效果：
(1)本发明提供了一种能够稳定表达犬腺病毒E1A基因和E1B基因的稳定细胞系，该稳定细胞系为MDCK细胞，其以慢病毒作为载体，在基因组中先后随机插入E1A基因和E1B基因，所述E1A基因和E1B基因均来源于犬腺病毒CAV2。
(2)本发明提供了用于稳定表达犬腺病毒E1A基因和E1B基因的稳定细胞系的构建方法，将犬E1A基因和犬E1B基因分别构建到慢病毒载体中，再用表达E1A和E1B基因的慢病毒感染MDCK细胞，获得能稳定表达E1A和E1B基因的稳定细胞系MDCK-E1A-E1B。将犬腺病毒复制的必需区基因E1中的两个片段E1A和E1B分别构建到慢病毒载体中，这样就解决了E1基因片段较长不易构建，且构建的慢病毒载体不易表达的问题。
(3)在本发明稳定细胞系的构建的过程中在E1A和E1B中分别加入了荧光蛋白基因mCherry和GFP，这就有利于我们比较直观的通过观察荧光而实时检测稳定细胞系的稳定性和相应蛋白的表达情况，从而解决了稳定细胞系在长时间或多次传代后出现基因丢失或不表达而无法检测的问题，这对于我们稳定的扩增出犬腺病毒CAV2将会有很大的裨益。
(4)通过实验证明，本发明构建的稳定细胞系MDCK-E1A-E1B可以扩增出稳定性较高，滴度较高的犬腺病毒CAV2，这将会为CAV2载体的规模化生产和在病毒活载体疫苗、基因治疗、癌症治疗等领域的应用和发展奠定了很好的基础。
附图说明
图1：重组质粒pFUGW-his-mCherry-2a-E1A酶切鉴定图，其中M表示DNA marker，第一条带5kb、第二条带4kb、第三带3kb，1表示重组质粒酶切图。
图2：重组质粒pCDH-his-GFP-2A-E1B-puro酶切鉴定图，其中M表示DNA marker，第一条带5kb、第二条带4kb、第三带3kb，1表示重组质粒酶切图。
图3：稳定表达犬E1A基因的MDCK-E1A细胞系在倒置荧光显微镜的细胞荧光鉴定图(100倍)。
图4：稳定表达犬E1A基因和E1B基因的MDCK-E1A-E1B细胞系在倒置显微镜的细胞荧光鉴定图(100倍)。左图E1A-mCherry为红色荧光，中间图E1B-GFP为绿色荧光，右图为白光。
图5：PCR验证MDCK-E1A-E1B稳转细胞系外源基因E1A和E1B表达正确DNA凝胶图。
图6：不同细胞系MDCK、MDCK-E1、MDCK-E1A、MDCK-E1A-E1B感染CAV2-CRE-GFP病毒48小时后细胞病变图。在倒置荧光显微镜下拍照(100倍)，第一列为白光，第二列绿色荧光，第三列红色荧光。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
针对目前复制生产CAV2的稳定细胞系稳定性和扩增效率不高的问题，本发明提供一种新的将E1基因构建到MDCK细胞中制备犬腺病毒复制辅助稳定细胞系的思路和方法。本发明提供了一种用于稳定表达犬腺病毒E1A基因和E1B基因的稳定细胞系，该稳定细胞系为MDCK细胞，其以慢病毒作为载体，在基因组中先后随机插入E1A基因和E1B基因，E1A基因和E1B基因均来源于犬腺病毒CAV2。本研究主要是通过将基因片段较大的E1基因的两个区E1A和E1B分别构建到慢病毒载体中，然后让MDCK细胞分别稳定的表达E1A和E1B的基因，从而构建了MDCK-E1A-E1B的稳定细胞系。此稳定细胞系的亮点就在于：1.将片段较长不易构建的E1基因拆成了两段片段较短易于构建的E1A和E1B基因，这样就提高了构建稳定细胞的成功率；2.E1A和E1B基因分别带有不同颜色的荧光蛋白，这样就便于我们实时监控稳定细胞的稳定性，解决了稳定细胞系在长时间或多次传代后出现基因丢失或不表达而无法检测的问题。此外，通过实验研究MDCK-E1A-E1B稳定细胞系在扩增腺病毒上比MDCK-E1稳定细胞系扩增的犬腺病毒滴度更高，这就为犬腺病毒在病毒活载体疫苗、基因治疗、癌症治疗等领域的应用上奠定了很好的基础。
该细胞系的构建方法具体包括如下步骤：
(1)从载体pCAV2上分别扩增E1A和E1B基因，先将E1A片段用同源重组的方法克隆到含有报告基因mCherry的慢病毒载体pFUGW上，构建重组质粒pFUGW-his-mCherry-2a-E1A；再用同样的方法将E1B片段克隆到含有报告基因GFP和筛选基因puro的慢病毒载体pCDH上，构建重组质粒pCDH-his-GFP-2A-E1B-puro；
(2)在100mm培养皿中接种HEK293T细胞；采用慢病毒转染体系，将步骤(1)获得的重组质粒pFUGW-his-mCherry-2a-E1A与慢病毒的包装质粒g/p、PMD2G和RSV-REV按照8:3:2:1质量比例添加到无菌水中混匀，以磷酸钙转染法转染细胞，将该细胞放入培养箱中培养；转染后48-72小时收获含LV-mCherry-E1A病毒的细胞培养液，无菌过滤并收集含有LV-mCherry-E1A病毒的滤出液；
(3)在100mm培养皿中接种HEK293T细胞；采用慢病毒转染体系，将步骤(1)获得的重组质粒pCDH-his-GFP-2A-E1B-puro与慢病毒的包装质粒g/p、PMD2G、RSV-REV按照8:3:2:1质量比例添加到无菌水中混匀，以磷酸钙转染法转染细胞，将该细胞放入培养箱中培养；转染后48-72小时收获含LV-GFP-puro-E1B病毒的细胞培养液，无菌过滤并收集含有LV-GFP-puro-E1B病毒的滤出液；
(4)测定重组慢病毒的滴度，将LV-mCherry-E1A病毒的滤出液以病毒感染复数(MOI)等于10～20添加到预先接种MDCK细胞的培养皿中共培养，通过观察荧光表达情况连续传代培养，直到最后视野中的细胞90％以上都是红色荧光，表示筛选出能稳定表达E1A基因的MDCK-E1A细胞系；
(5)将LV-GFP-puro-E1B病毒的滤出液以病毒感染复数(MOI)等于10～20添加到预先接种MDCK-E1A细胞系的培养皿中共培养；最后添加Puromycin抗生素筛选阳性细胞系，最终获得MDCK稳定表达E1A和E1B基因的MDCK-E1A-E1B细胞系。
其中pFUGW-his-mCherry-2a-E1A和pCDH-his-GFP-2A-E1B-puro重组质粒构建过程如下步骤：
(1)以pCAV2为模板，采用PCR方法扩增E1A和E1B片段，随后在E1A和E1B上加上融合序列和酶切位点；同时，分别以H2B-mCherry-P2A-N2c(G)质粒和H2B-GFP-P2A-N2c(G)质粒为模板，采用PCR方法扩增得到含有融合序列的his-mCherry-2A和his-GFP-2A片段；用同源重组PCR的方法将E1A和his-mCherry-2A片段融合，同法融合E1B和his-GFP-2A片段；
(2)将步骤(1)所得的PCR产物电泳检测、纯化，测定OD值；
(3)采用Xba1和EcoR1酶对慢病毒载体pFUGW进行双酶切，用Xba1和Not1酶对慢病毒载体pCDH-puro载体进行双酶切，切胶回收线性载体；
(4)利用T4 DNA连接酶将步骤(2)中PCR片段与步骤(3)中线性载体于16℃过夜连接；
(5)采用热转化方法，将上述连接产物转化DH10B感受态细胞，于37℃过夜培养16小时以上；次日挑单克隆测序。
本发明稳定表达犬腺病毒E1A和E1B的稳定细胞系为MDCK-E1A-E1B。所述的稳定细胞系同时含有编码E1A蛋白和E1B蛋白的基因。所述编码E1A蛋白的基因序列如SEQ ID No：1所显示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID No：3所示；所述编码E1B蛋白的基因序列如SEQ IDNo：2所显示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID No：4所示；所述编码E1A基因序列和E1B基因序列都来源于犬。
本发明提供的上述稳定细胞系的应用，可用于制备犬腺病毒CAV2，将犬腺病毒CAV2病毒株接种于所述稳定细胞系上，病毒株的培养条件为35℃～37℃，3％～5％CO2，48-72小时收获细胞沉淀纯化病毒株。
本发明的另一方面提供了一种提高犬腺病毒CAV2滴度的方法。该方法是将犬腺病毒CAV2病毒株接种于本发明构建的稳定细胞系上，病毒株的培养条件为35℃～37℃，3％～5％CO2。CAV2在此细胞系上病毒滴度的提高为CAV2载体的规模化生产和在病毒活载体疫苗、基因治疗、癌症治疗等领域的应用和发展奠定了很好的基础。
以下为实施例：
实施例1
MDCK-E1A和MDCK-E1A-E1B稳定细胞系的构建
(1)试剂和仪器
pfu polymerase，dNTPs和5×Fast pfu buffer购自全式金生物技术有限公司；pFUGW载体购自Addgene；pCDH-puro质粒是中国科学院武汉病毒研究所神经病毒学实验室馈赠；引物由上海生工合成；DMEM培养基和血清Opti-MEM购自Invitrogen公司；胎牛血清购自Hyclone公司；质粒小量提取试剂盒Plasmid Miniprep Kit购自Qiagen公司；RNA提取试剂盒购自TaKaRa公司；FuGene6转染试剂购自Promega公司；Puromycin(10mg/mL)溶液购自上海生工生物工程有限公司。
MDCK细胞是中国科学院武汉病毒研究所流感实验室馈赠；倒置显微镜购自OLYMPUS；PCR仪购自Bio-rad。
(2)引物设计
用于扩增E1A片段的引物：
E1A-F：ATGAAATATACTATTGTGCCGG
E1A-R：AGTTCGGGCGTGGCTTCA
用于扩增E1B片段的引物：
E1B-F：ATGGACCCTCTTAAGATTTGT
E1B-R：AAAATTATCTTCATCACTGC
用于扩增含有融合序列的his-GFP-2A片段引物：
his-mCherry-2a-E1A(out)-F:
TGCTCTAGAGCACATCATCATCATCATCATCC
his-mCherry-2a-E1A(in)-R:
CACAATAGTATATTTCATTGGGCCAGGATTCTCCTC
His-GFP-2A-E1B(out)-F:
TGTTAGACAGGATCCGCCACCATGCCAGAGCC
His-GFP-2A-E1B(in)-R:
CACAAATCTTAAGAGGGTCCATAGGTCCAGGGTTCTCCTCC
用于扩增含有融合序列的E1A片段引物：
his-mCherry-2a-E1A(in)-F:
GAGGAGAATCCTGGCCCAATGAAATATACTATTGTG
his-mCherry-2a-E1A(out)-R:
CCGGAATTCCGGTTAGTTCGGGCGTGGCTTC
用于扩增含有融合序列的E1B片段引物：
His-GFP-2A-E1B(in)-F:
GGAGGAGAACCCTGGACCTATGGACCCTCTTAAGATTTGTG
His-GFP-2A-E1B(out)-R:
CTTGATATCGAATTCCTAAAAATTATCTTCATCACTGCTAA
用于融合his-GFP-2A和E1B引物：
His-GFP-2A-E1B(out)-F1:
TTGTTAGACAGGATCCGCCACCATGCCAGAGCC
His-GFP-2A-E1B(out)-R1:
GCTTGATATCGAATTCCTAAAAATTATCTTCATCACTGCTAA
用于更换融合his-GFP-2A和E1B片段酶切位点引物：
Xba1-GFP-E1B-F：TGCTCTAGAGCCACCATGCCAGAGCC
Not1-GFP-E1B-R：
TTGCGGCCGCCTAAAAATTATCTTCATCACTGCTAA
(3)PCR反应体系和条件
PCR反应体系：
PCR反应条件：
预变性98℃10min
变性98℃30s
退火55℃30s
延伸72℃50s for E1A，100s for E1B andhis-GFP-2A，200s for infusion
30cycles
总延伸72℃10min
保温16℃30min
(4)pFUGW-his-mCherry-2a-E1A质粒和pCDH-his-GFP-2A-E1B-puro质粒的构建
a.pFUGW-his-mCherry-2a-E1A质粒构建：
E1A片段PCR：使用E1A-F和E1A-R按照上述PCR体系和条件以pcav2基因组质粒为模板克隆得到E1A片段。
含有融合序列的E1A片段和his-mCherry-2A片段PCR：使用his-mCherry-2a-E1A(in)-F和his-mCherry-2a-E1A(out)-R按照上述PCR体系和条件以E1A片段为模板扩增得到含有融合序列的E1A片段；使用his-mCherry-2a-E1A(out)-F+his-mCherry-2a-E1A(in)-R按照上述PCR体系和条件，以H2B-mCherry-P2A-N2c(G)质粒为模板，扩增得到含有融合序列的his-mCherry-2A片段。
his-mCherry-2a片段和E1A片段融合：使用his-mCherry-2a-E1A(out)-F+his-mCherry-2a-E1A(out)-R按照上述PCR体系和条件，以E1A片段回收产物和his-mCherry-2A片段回收产物混合物为模板，克隆得到E1A片段和his-mCherry-2A融合片段。
his-mCherry-2a-E1A融合片段和pFUGW载体酶切连接：使用Xba1和EcoR1对pFUGW质粒进行双酶切，切胶回收线性载体。使用T4 DNA ligase对酶切回收产物和上步PCR回收产物his-mCherry-2a-E1A于16℃过夜连接。酶切验证的图见图1。
转化及验证：采用热转化方法，将上述连接产物转入DH10B感受态细胞，于37℃过夜培养16小时以上，次日挑单克隆测序，使用Xba1和EcoR1双酶切鉴定。
b.pCDH-his-GFP-2A-E1B质粒构建：
E1B片段PCR：使用E1B-F和E1B-R按照上述PCR体系和条件以pcav2基因组质粒为模板克隆得到E1B片段。
含有融合序列的E1B片段和his-GFP-2A片段PCR：使用His-GFP-2A-E1B(in)-F和His-GFP-2A-E1B(out)-R按照上述PCR体系和条件以E1B片段为模板扩增得到含有融合序列的E1B片段；使用His-GFP-2A-E1B(out)-F+His-GFP-2A-E1B(in)-R按照上述PCR体系和条件，以H2B-GFP-P2A-N2c(G)质粒为模板，扩增得到含有融合序列的his-GFP-2A片段。
E1B片段和his-GFP-2A片段融合：使用His-GFP-2A-E1B(out)-F1+His-GFP-2A-E1B(out)-R1按照上述PCR体系和条件，以E1B片段回收产物和his-GFP-2A片段回收产物混合物为模板，克隆得到E1B片段和his-GFP-2A融合片段。
更换酶切位点：使用Xba1-GFP-E1B-F和Not1-GFP-E1B-R按照上述PCR体系和条件，以E1B和his-GFP-2A融合片段回收产物为模板，进行PCR。
酶切连接：使用Xba1和Not1对pCDH-puro质粒进行双酶切，切胶回收线性载体。使用T4 DNA ligase对酶切回收产物和上步PCR回收产物His-GFP-2A-E1B于16℃过夜连接。酶切验证的图见见图2。
转化及验证：采用热转化方法，将上述连接产物转入DH10B感受态细胞，于37℃过夜培养16小时以上，次日挑单克隆测序，使用Xba1和Not1双酶切鉴定。
(5)重组慢病毒LV-mCherry-E1A和LV-GFP-E1B的包装
细胞铺板：通过胰酶消化收集HEK293T细胞，用适当的完全培养基以1×105至4×105细胞/cm2的密度平铺细胞于100mm组织培养皿上，使细胞贴壁后所占面积达到培养皿总面积的40－70％。将细胞置于含5％CO2的37℃温箱中孵育8-24h,当细胞贴壁完全后即可开始转染。转染前2h换液(用10ml新鲜的完全培养基置换旧的培养基)。
制备磷酸钙－DNA沉淀：以100mm组织培养皿用500μl反应总体积为例。在灭菌水中加入质粒DNA(包装质粒和表达质粒的混合，总量4－10μg为佳)，再加入31μl 2M CaCl2，使三者总体积达到250μl，混匀静置10min。将等体积2×HBS盐溶液逐滴加入，同时轻弹管壁，使每滴加入后及时混匀。静置30min后，立即将这500μl的磷酸钙－DNA悬液逐滴加入上述单层细胞的细胞培养基中，轻轻摇动平皿混匀。
注：可以观察到滴入的部位培养基瞬间会出现浑浊的橘黄色，应尽快将其混匀，避免形成过大的颗粒，影响转染效率。
转染后的293T细胞置于含5％CO2的37℃温箱孵育。8h后吸去培养基与DNA沉淀，加入10ml 37℃预热的完全培养基(DMEM+10％FBS+1％P/S)，继续将细胞放置温箱孵育。转染后48-72h收获含病毒的上清。1 000×g离心5min，弃去细胞碎片，0.45um PVDF滤器过滤后使用超速离心机4℃、50 000×g离心2h后弃去上清。使用Opti-MEM重悬病毒颗粒，室温静置2h，按照使用量分装到EP管中并保存于80℃冰箱备用。
(6)重组慢病毒滴度测定
使用有限稀释法测定病毒滴度，以1×104cells/孔的密度接种293T细胞与96孔板。用完全培养基根据有限稀释法稀释病毒，稀释方法：每种病毒准备8个1.5ml Eppendorf管，每管加入297ul完全培养液，向第一个管中加入33ul病毒原液，混匀后，吸取30ul加入第二个管中混匀。以此类推，做6个稀释度(10-1-10-6)。弃去96孔板中原有的培养液，每个稀释度重复3个孔，每孔加入稀释好的病毒液100ul。并做好标记。感染24小时后更换新鲜完全培养基。感染48-72小时在荧光显微镜下观察各孔中荧光细胞数量，数出最后两个能观察到荧光的孔内荧光细胞数，计算3个重复孔内的总数之和并计算出平均数，假设为A(倒数第二个能观察到荧光细胞的平均数)和B(倒数第一个能见荧光孔的荧光细胞平均数)。慢病毒的计算公式：慢病毒滴度(TU/mL)＝(A+B×10)×1000×10n/2，其中n代表A孔慢病毒的稀释倍数。
(7)重组慢病毒LV-mCherry-E1A感染MDCK细胞及其稳定细胞系的筛选
重组慢病毒LV-mCherry-E1A以病毒感染复数(MOI)等于10感染MDCK细胞，通过观察荧光的表达情况进行连续培养，每3天以1:4进行传代，直到最后视野中的细胞90％以上都是红色荧光，代表MDCK-E1A稳定细胞系建立，如图3所示。
(8)确定MDCK细胞培养基中Puromycin的筛选浓度
Puromycin(嘌呤霉素)是一种蛋白质合成抑制剂，是稳定转染最常用的抗性筛选试剂。哺乳动物细胞的推荐使用浓度为1-10μg/mL，由于每种细胞对Puromycin的敏感性不同，而且不同的厂家生产的相同浓度的Puromycin的活性不尽相同，所以在筛选稳定细胞系之前，一定要确定Puromycin的最佳筛选浓度。具体如下：(1)将MDCK细胞稀释到5×104cells/mL，24孔板内以5～8×104cells/孔的密度铺板，细胞孵育过夜；(2)准备筛选培养基：分别含1μg/mL、3μg/mL、5μg/mL的Puromycin的新鲜培养基；(3)细胞孵育过夜后加入筛选培养基，孵育细胞；(4)约2-3天更换新鲜的筛选培养基；(5)每日监测细胞观察存活细胞比例。Puromycin的最佳作用时间一般在1-4天之间。(6)最小的Puromycin使用浓度就是指从Puromycin筛选开始3-5天内杀死所用细胞的最低筛选浓度。最终确定Puromycin最佳的筛选浓度为3μg/mL。
(9)重组慢病毒LV-E1B-puro-GFP感染MDCK-E1A细胞及其稳定细胞系的筛选
以1～2×105cells/mL接种MDCK-E1A细胞到24孔细胞培养板，使用不含抗生素的添加10％FBS的DMEM培养基培养24h后细胞会合度达到70～80％。同时设立实验组(LV-mCherry-E1A)、阳性慢病毒对照组(LV-puro)和空白对照组(PBS)。用Opti-MEM清洗细胞1次，然后以病毒感染复数(MOI)等于10感染MDCK细胞，空白对照加入等体积的PBS。37℃、5％CO2培养6h后加10％FBS+DMEM完全培养基孵育过夜。实验组、阳性慢病毒对照组和空白对照组感染MDCK细胞后48h使用含3μg/mL的Puromycin筛选培养基，孵育。约每2-3天替换新鲜配制的筛选培养基。每天检测细胞并观察活细胞生长比例，以及GFP表达的水平及所占比例。在某一个时间点几乎所有存活细胞都可以表达GFP，能够存活下来的细胞克隆即为稳定表达目标基因E1B细胞株MDCK-E1A-E1B，如图4所示。提取MDCK-E1A-E1B稳转细胞系的DNA，以其为模板扩增E1A和E1B片段，同时以CAV2的基因组为模板扩增E1A和E1B片段，验证MDCK-E1A-E1B稳转细胞系外源基因E1A和E1B表达正确，见图5。
实施例2
犬腺病毒CAV2在MDCK、MDCK-E1、MDCK-E1A、MDCK-E1A-E1B细胞系上的扩增
(1)试剂和仪器
引物由上海生工合成；DMEM培养基购自Invitrogen公司；胎牛血清购自Hyclone公司；质粒小量提取试剂盒Plasmid Miniprep Kit购自Qiagen公司；RNA提取试剂盒购自TaKaRa公司；倒置显微镜购自OLYMPUS；PCR仪购自Bio-rad；2×T5 Fast qPCR Mix(SYBRGreenI)购至擎科生物。
(2)细胞培养
所用于CAV2扩增的细胞分别为MDCK、MDCK-E1、MDCK-E1A和MDCK-E1A-E1B。其中MDCK为狗肾细胞，MDCK-E1为导入E1 region的细胞系，是现在最常用的扩增CAV2的细胞系，该细胞系的构建在此不详细描叙，细胞系不带荧光。MDCK-E1A为导入E1 region的E1Aregions到MDCK细胞所构建的稳转细胞系，该细胞系发红色荧光(E1A)，为核定位。而MDCK-E1A-E1B为分别先后导入E1 region的E1A和E1B到MDCK细胞所构建的稳转细胞系，该细胞系发红色荧光(E1A)和绿色荧光(E1B)，均为核定位。细胞培养条件为DMEM+5％FBS，37℃，5％CO2。由于细胞增殖速度较快，一般在细胞长满时，以1:12，三天传一次。
(3)接种和收获病毒
当4种细胞系生长状态为较密时，按1:6分别消化四种细胞，细胞传代至100mm细胞培养皿中，接种细胞比例为70％-80％，细胞铺好后于培养箱中培养5-6小时。随后将上清弃去，加入2-3ml CAV-CRE-GFP病毒毒种(病毒细胞冻融液)，将细胞放置细胞培养箱中1小时，再补加8ml DMEM+3％FBS培养基，35℃3％CO2培养或者37℃5％CO2培养。
接毒后48h(第二天)出现病变，典型的病变为细胞变圆，肿大，聚集。比较4种细胞系的细胞病变进程和荧光强度，见图6。从图中可以看出，在CAV2感染细胞48小时后，MDCK-E1A-E1B细胞系的细胞病比其他3种细胞系的细胞病变厉害，绿色荧光的强度明显高于其他3种细胞系。虽然CAV2-CRE-GFP和E1B均发绿色荧光，但是E1B为核定位，本底表达强度不高，从表观上说明MDCK-E1A-E1B细胞系具有更强的产毒能力。
接毒后60h-72h收样，视病变程度决定，若存在大量细胞飘起，则尽早收获病毒。收病毒主要通过细胞刮将细胞刮起到培养基，收集到离心管并且离心，离心转速为400g，6-8min，弃上清，将细胞收集一起，PBS混匀，放在15ml离心管，-80度冻存。
(4)病毒纯化
病毒纯化主要是通过氯化铯密度梯度离心，分为两步，分别为不连续密度梯度离心和连续梯度离心。将收集的接毒细胞进行-80℃-37℃反复冻融三次，2500g×10min离心，收集上清。然后将上清进行氯化铯密度梯度离心，收集病毒带。
(5)病毒滴度的测定
CAV2滴度测定采用荧光定量法，用于扩增CRE片段的引物：CRE-QF：GTTCGTTCACTCATGGAA，CRE-QR：TGGCAATTTCGGCTATAC。
荧光定量法主要为绝对荧光定量，检测病毒的拷贝数，本实验通过使用CRE的引物进行扩增，片段大小约为150bp，绝对定量使用的标准物浓度分别为10-3,10-4,10-5,10-6,10-7,10-8对应的拷贝数为3E+08，3E+07，3E+06，3E+05，3E+04，3E+03。取病毒悬液1μl+119μl无菌水，按1:120倍稀释，作为模板，在此荧光定量加样方式不详述。最后根据结果计算原始滴度：拷贝数×稀释倍数×103vg/ml。测定MDCK-E1A-E1B细胞系的病毒滴度为1.42E+11vg/ml。MDCK-E1A细胞系的病毒滴度为2.92E+10vg/ml。MDCK-E1和MDCK细胞系没有检测到扩增曲线，说明此两种细胞系的产毒能力较弱，这与图6的细胞病变结果一致，MDCK-E1A-E1B细胞系的产毒能力确实优于MDCK-E1和MDCK细胞系。
序列表
<120> 一种用于扩增重组犬腺病毒CAV2的稳定细胞系MDCK及其构建方法
<141> 2018-01-24
<160> 20
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
atgaaatata ctattgtgcc gg 22
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
agttcgggcg tggcttca 18
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
atggaccctc ttaagatttg t 21
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
aaaattatct tcatcactgc 20
<210> 5
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
tgctctagag cacatcatca tcatcatcat cc 32
<210> 6
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
cacaatagta tatttcattg ggccaggatt ctcctc 36
<210> 7
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
tgttagacag gatccgccac catgccagag cc 32
<210> 8
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
cacaaatctt aagagggtcc ataggtccag ggttctcctc c 41
<210> 9
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
gaggagaatc ctggcccaat gaaatatact attgtg 36
<210> 10
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
ccggaattcc ggttagttcg ggcgtggctt c 31
<210> 11
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 11
ggaggagaac cctggaccta tggaccctct taagatttgt g 41
<210> 12
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 12
cttgatatcg aattcctaaa aattatcttc atcactgcta a 41
<210> 13
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 13
ttgttagaca ggatccgcca ccatgccaga gcc 33
<210> 14
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 14
gcttgatatc gaattcctaa aaattatctt catcactgct aa 42
<210> 15
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 15
tgctctagag ccaccatgcc agagcc 26
<210> 16
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 16
ttgcggccgc ctaaaaatta tcttcatcac tgctaa 36
<210> 17
<211> 816
<212> DNA
<213> Canine adenovirus
<400> 17
atgaaatata ctattgtgcc ggcgccgcgc aatctccatg attatgtttt agagctactg 60
gaagagtggc agccggactg ccttgactgt gagtattctc atggcagccc ctcgccgcct 120
actctgcacg atctttttga tgttgagctg gagacttctc acagcccttt tgtgggcctg 180
tgtgattcct gtgcggaggc tgacactgat tcgagtgcga gcactgaggc tgattctggg 240
tttagtcctt tatccactcc gccggtttca cctattccac cgcatcccac ctctcctgct 300
agcatttctg acgacatgtt gctgtgctta gaggaaatgc ccacctttga tgacgaggac 360
gaggttcgaa gcgcggcgac cacctttgag cggtgggaaa acacttttga cccccatgtg 420
ggtcctattt ttggctgttt gcgctgtgct ttttatcaag agcaggatga taatgcactt 480
tgtgggcttt gctatctaaa ggcccttgcc gaaggtaagt tttaatttaa atgtttgggc 540
aggttaaatg tttgggcagg ttaaatgttt taggtgtgta ttgattttta attttgcttt 600
ttagtgcctt ttgctatgcc tgtacgttca gaacccgctt cggctggagc tgaggaggaa 660
gatgatgaag ttatttttgt gtctgccaaa cctgggggca gaaagaggtc agcagctact 720
ccctgtgagc cagatggggt cagcaaacgc ccttgcgtgc cagagcctga gcaaacagaa 780
cctttggatt tgtctttgaa gccacgcccg aactaa 816
<210> 18
<211> 1696
<212> DNA
<213> Canine adenovirus
<400> 18
atggaccctc ttaagatttg tgaaaactac cttactttta gagctataat taggggaagt 60
actttgtcgc ctggattttt taggcggtgg tgttttcctg ccttggctga tgtggtgggc 120
aatatagtgg aacaggagga aggcaggttt tggcaaattt tacctgaaaa ccacgctttt 180
tggggtcttt tgcgcagggg ctttactgtt gcttctttta ctgaaattat tacagcagct 240
cagctggaaa atagaggtag acagttggcc tttttagctt ttatatcatt tttgctacgc 300
aactggcctt ctgactctgt agtgcctgaa gctgacagac ttgacctggt ctgtgcgccg 360
gcatggagca gaatgagata tggagccaga ccgccaggtt aatcaacgac ctccaagatt 420
ccgtgctcga ggagcagggg tccgcggaag aggaagagtg cgaagaagcg cttttagcag 480
gggacagcga cgacccatta ttcgggtaga tgacttgcag ctgcccgacc ccctgtatgt 540
tatgcaagct ttgcaacggg accacacttt agaaatgccc agagggcagg tagattttag 600
ctggattgag gctgaagaga ggcgggtagg tcccacagac gagtggtact ttgaggctgt 660
gaagacttac aaagctaagc cgggagatga cttgcaaact ataatcaaaa actatgccaa 720
gatttcctta gaatgtgggg ccgtgtatga aattaattct aagattaggg ttacgggggc 780
ttgctacatt attggtaatt gtgccgtgct taggcctaac ctgcctgctg gagaagcaat 840
gtttgaggtt ttgaatgttg attttattcc ttctattggt tttatggaaa ggatagtgtt 900
ttccaatgtt atttttgatt gcaggaccac cgcaactgta gtgtgttgca ttagtgaaag 960
aaacaccttg tttcacaatt gtgttttttc tggccctcac atgttatgtt tggaccttag 1020
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ggggctgtac agtattcgag tcaaaaatag catttttgaa aagtgtgctt ttggggtggt 1140
gaccgggtca aaggcttcta ttagccattg catgtttaag gattgtacct gctctattat 1200
gctggggggt cagggcacta ttgcccatag tcagtttatt gtaactactt ctgctgaggc 1260
ccccatgaac ctgcaactgt gcacttgcga gggtaatgga agtcatgtag ttccattggg 1320
gaatattcac tttgcttctc accgggaagc ttcgtggcct acgttttatg caaacacctt 1380
ggttcgggtg cgcttgtata tgggccggcg ccggggagtt tttcacccca agcagtctac 1440
tttgtcaatg tgtgtaattg cagcccctcg gggggttgtg cagagaattt atttgtttgg 1500
tgtgtatgat gctacttgtg ccattatgca actgggcgag gcaggcaatg ctgctagtga 1560
aagactgtgt acttgcgggt tcagacacag caccccttcc ctgcgggcca cctatgtaac 1620
tgacaccagg attgaccggg agctgaactc tcaagacacg gctgagttct ttagcagtga 1680
tgaagataat ttttag 1696
<210> 20
<211> 241
<212> PRT
<213> Canine adenovirus
<400> 20
Met Lys Tyr Thr Ile Val Pro Ala Pro Arg Asn Leu His Asp Tyr Val
1 5 10 15
Leu Glu Leu Leu Glu Glu Trp Gln Pro Asp Cys Leu Asp Cys Glu Tyr
20 25 30
Ser His Gly Ser Pro Ser Pro Pro Thr Leu His Asp Leu Phe Asp Val
35 40 45
Glu Leu Glu Thr Ser His Ser Pro Phe Val Gly Leu Cys Asp Ser Cys
50 55 60
Ala Glu Ala Asp Thr Asp Ser Ser Ala Ser Thr Glu Ala Asp Ser Gly
65 70 75 80
Phe Ser Pro Leu Ser Thr Pro Pro Val Ser Pro Ile Pro Pro His Pro
85 90 95
Thr Ser Pro Ala Ser Ile Ser Asp Asp Met Leu Leu Cys Leu Glu Glu
100 105 110
Met Pro Thr Phe Asp Asp Glu Asp Glu Val Arg Ser Ala Ala Thr Thr
115 120 125
Phe Glu Arg Trp Glu Asn Thr Phe Asp Pro His Val Gly Pro Ile Phe
130 135 140
Gly Cys Leu Arg Cys Ala Phe Tyr Gln Glu Gln Asp Asp Asn Ala Leu
145 150 155 160
Cys Gly Leu Cys Tyr Leu Lys Ala Leu Ala Glu Val Pro Phe Ala Met
165 170 175
Pro Val Arg Ser Glu Pro Ala Ser Ala Gly Ala Glu Glu Glu Asp Asp
180 185 190
Glu Val Ile Phe Val Ser Ala Lys Pro Gly Gly Arg Lys Arg Ser Ala
195 200 205
Ala Thr Pro Cys Glu Pro Asp Gly Val Ser Lys Arg Pro Cys Val Pro
210 215 220
Glu Pro Glu Gln Thr Glu Pro Leu Asp Leu Ser Leu Lys Pro Arg Pro
225 230 235 240
Asn
<210> 21
<211> 444
<212> PRT
<213> Canine adenovirus
<400> 21
Met Glu Gln Asn Ala Asp Met Glu Pro Asp Arg Gln Val Asn Gln Arg
1 5 10 15
Pro Pro Arg Phe Arg Ala Arg Gly Ala Gly Val Arg Gly Arg Gly Arg
20 25 30
Val Arg Arg Ser Ala Phe Ser Arg Gly Gln Arg Arg Pro Ile Ile Arg
35 40 45
Val Asp Asp Leu Gln Leu Pro Asp Pro Leu Tyr Val Met Gln Ala Leu
50 55 60
Gln Arg Asp His Thr Leu Glu Met Pro Arg Gly Gln Val Asp Phe Ser
65 70 75 80
Trp Ile Glu Ala Glu Glu Arg Arg Val Gly Pro Thr Asp Glu Trp Tyr
85 90 95
Phe Glu Ala Val Lys Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Gly Asp Asp Leu Gln
100 105 110
Thr Ile Ile Lys Asn Tyr Ala Lys Ile Ser Leu Glu Cys Gly Ala Val
115 120 125
Tyr Glu Ile Asn Ser Lys Ile Arg Val Thr Gly Ala Cys Tyr Ile Ile
130 135 140
Gly Asn Cys Ala Val Leu Arg Pro Asn Leu Pro Ala Gly Glu Ala Met
145 150 155 160
Phe Glu Val Leu Asn Val Asp Phe Ile Pro Ser Ile Gly Phe Met Glu
165 170 175
Arg Ile Val Phe Ser Asn Val Ile Phe Asp Cys Arg Thr Thr Ala Thr
180 185 190
Val Val Cys Cys Ile Ser Glu Arg Asn Thr Leu Phe His Asn Cys Val
195 200 205
Phe Ser Gly Pro His Met Leu Cys Leu Asp Leu Arg Ala Gly Ala Glu
210 215 220
Val Arg Gly Cys His Phe Val Gly Ala Val Cys Ala Leu Arg Ser Lys
225 230 235 240
Gly Leu Tyr Ser Ile Arg Val Lys Asn Ser Ile Phe Glu Lys Cys Ala
245 250 255
Phe Gly Val Val Thr Gly Ser Lys Ala Ser Ile Ser His Cys Met Phe
260 265 270
Lys Asp Cys Thr Cys Ser Ile Met Leu Gly Gly Gln Gly Thr Ile Ala
275 280 285
His Ser Gln Phe Ile Val Thr Thr Ser Ala Glu Ala Pro Met Asn Leu
290 295 300
Gln Leu Cys Thr Cys Glu Gly Asn Gly Ser His Val Val Pro Leu Gly
305 310 315 320
Asn Ile His Phe Ala Ser His Arg Glu Ala Ser Trp Pro Thr Phe Tyr
325 330 335
Ala Asn Thr Leu Val Arg Val Arg Leu Tyr Met Gly Arg Arg Arg Gly
340 345 350
Val Phe His Pro Lys Gln Ser Thr Leu Ser Met Cys Val Ile Ala Ala
355 360 365
Pro Arg Gly Val Val Gln Arg Ile Tyr Leu Phe Gly Val Tyr Asp Ala
370 375 380
Thr Cys Ala Ile Met Gln Leu Gly Glu Ala Gly Asn Ala Ala Ser Glu
385 390 395 400
Arg Leu Cys Thr Cys Gly Phe Arg His Ser Thr Pro Ser Leu Arg Ala
405 410 415
Thr Tyr Val Thr Asp Thr Arg Ile Asp Arg Glu Leu Asn Ser Gln Asp
420 425 430
Thr Ala Glu Phe Phe Ser Ser Asp Glu Asp Asn Phe
435 440

Claims (9)

1.一种用于表达犬腺病毒E1A基因和E1B基因的稳定细胞系，其特征在于，所述稳定细胞系为MDCK细胞，其以慢病毒作为载体，在所述MDCK细胞的基因组中先后随机插入E1A基因和E1B基因，所述E1A基因和E1B基因均来源于犬腺病毒CAV2；该稳定细胞系能够分别表达所述E1A基因和所述E1B基因。
2.一种用于表达犬腺病毒E1A基因和E1B基因的稳定细胞系的构建方法，其特征在于，将犬E1A基因和犬E1B基因分别构建到慢病毒载体中，分别得到表达E1A基因的慢病毒和表达E1B基因的慢病毒；用所述表达E1A基因的慢病毒感染MDCK细胞，得到MDCK-E1A细胞系；再用所述表达E1B基因的慢病毒感染所述MDCK-E1A细胞系，获得能稳定表达所述E1A基因和所述E1B基因的稳定细胞系MDCK-E1A-E1B。
3.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)从载体pCAV2上分别扩增E1A和E1B基因，先将E1A片段用同源重组的方法克隆到含有报告基因mCherry的慢病毒载体pFUGW上，构建重组质粒pFUGW-his-mCherry-2a-E1A；再用同样的方法将E1B片段克隆到含有报告基因GFP和筛选基因puro的慢病毒载体pCDH上，构建重组质粒pCDH-his-GFP-2A-E1B-puro；
(2)在培养皿中接种HEK293T细胞；采用慢病毒转染体系，将步骤(1)获得的重组质粒pFUGW-his-mCherry-2a-E1A与慢病毒的包装质粒g/p、PMD2G和RSV-REV按照8:3:2:1质量比例添加到无菌水中混匀，以磷酸钙转染法转染细胞，将该细胞放入培养箱中培养；转染后48-72小时收获含LV-mCherry-E1A病毒的细胞培养液，无菌过滤并收集含有LV-mCherry-E1A病毒的滤出液；
(3)在培养皿中接种HEK293T细胞；采用慢病毒转染体系，将步骤(1)获得的重组质粒pCDH-his-GFP-2A-E1B-puro与慢病毒的包装质粒g/p、PMD2G、RSV-REV按照8:3:2:1质量比例添加到无菌水中混匀，以磷酸钙转染法转染细胞，将该细胞放入培养箱中培养；转染后48-72小时收获含LV-GFP-puro-E1B病毒的细胞培养液，无菌过滤并收集含有LV-GFP-puro-E1B病毒的滤出液；
(4)测定重组慢病毒的滴度，将LV-mCherry-E1A病毒的滤出液以病毒感染复数(MOI)等于10～20添加到预先接种MDCK细胞的培养皿中共培养，通过观察荧光表达情况连续传代培养，直到最后视野中的细胞90％以上都是红色荧光，表示筛选出能稳定表达E1A基因的MDCK-E1A细胞系；
(5)将LV-GFP-puro-E1B病毒的滤出液以病毒感染复数(MOI)等于10～20添加到预先接种MDCK-E1A细胞系的培养皿中共培养；最后添加Puromycin抗生素筛选阳性细胞系，最终获得MDCK稳定表达E1A和E1B基因的MDCK-E1A-E1B细胞系。
4.如权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述pFUGW-his-mCherry-2a-E1A重组质粒构建过程包括如下步骤：
(1)以pCAV2为模板，采用PCR方法扩增E1A片段，随后在E1A上加上融合序列和酶切位点；以H2B-mCherry-P2A-N2c(G)质粒为模板，采用PCR方法扩增得到含有融合序列的his-mCherry-2A片段；用同源重组PCR的方法将E1A和his-mCherry-2A片段融合，得到PCR片段；
(2)将步骤(1)所得的PCR片段电泳检测、纯化，测定OD值；
(3)采用Xba1和EcoR1酶对慢病毒载体pFUGW进行双酶切，切胶回收线性载体；
(4)利用T4DNA连接酶将步骤(2)中PCR片段与步骤(3)中线性载体于16℃过夜连接；
(5)采用热转化方法，将上述连接产物转化DH10B感受态细胞，于37℃过夜培养16小时以上；次日挑单克隆摇菌、提质粒，使用Xba1和EcoR1双酶切验证正确，送测序。
5.如权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述pCDH-his-GFP-2A-E1B-puro重组质粒构建过程包括如下步骤：
(1)以pCAV2为模板，采用PCR方法扩增E1B片段，随后在E1B上加上融合序列和酶切位点；以H2B-GFP-P2A-N2c(G)质粒为模板，采用PCR方法扩增得到含有融合序列的his-GFP-2A片段；用同源重组PCR的方法将E1B和his-GFP-2A片段融合，得到PCR片段；
(2)将步骤(1)所得的PCR片段电泳检测、纯化，测定OD值；
(3)用Xba1和Not1酶对慢病毒载体pCDH-puro载体进行双酶切，切胶回收线性载体；
(4)利用T4DNA连接酶将步骤(2)中PCR片段与步骤(3)中线性载体于16℃过夜连接；
(5)采用热转化方法，将上述连接产物转化DH10B感受态细胞，于37℃过夜培养16小时以上；次日挑单克隆摇菌、提质粒，使用Xba1和EcoR1双酶切验证正确，送测序。
6.一种如权利要求1所述的稳定细胞系的应用，其特征在于，用于制备犬腺病毒CAV2。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，将犬腺病毒CAV2病毒株接种于如权利要求1所述的稳定细胞系上，病毒株的培养条件为35℃～37℃，3％～5％CO2。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，将犬腺病毒CAV2病毒株接种于所述稳定细胞系上，48-72小时收获细胞沉淀纯化病毒株。
9.一种提高犬腺病毒CAV2滴度的方法，其特征在于，将犬腺病毒CAV2病毒株接种于如权利要求1所述的稳定细胞系上，在35℃～37℃，3％～5％CO2条件下进行培养，48-72小时收获细胞沉淀纯化病毒株。
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