CN114438124A - 一种cho细胞蛋白表达系统用表达载体及cho细胞的筛选方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于重组蛋白筛选系统的构建领域，具体涉及一种CHO细胞蛋白表达系统用表达载体及CHO细胞的筛选方法。本发明的表达载体含有启动子、F2A序列和Poly A序列，在所述F2A序列的上游插入有目的基因，下游插入有荧光标记和筛选标记融合基因；所述F2A序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明的上述表达载体，下游荧光标记基因的表达与上游目的基因的表达呈正相关，可利用荧光显微镜直观观察荧光标记基因的表达量，进而可以通过荧光强度强弱确定生长旺盛、表达量高的细胞株，利用半固体培养基更能方便该类细胞株的克隆筛选。

Description

一种CHO细胞蛋白表达系统用表达载体及CHO细胞的筛选方法

技术领域

本发明属于重组蛋白筛选系统的构建领域，具体涉及一种CHO细胞蛋白表达系统用表达载体及CHO细胞的筛选方法。

背景技术

当前，在庞大的医药市场中，生物制药仍是一个快速增长的领域，其中重组蛋白表现出高增长和庞大的市场占有量，重组蛋白的特异性及高表达量在临床应用中具有重要意义，加上未来良好的应用前景，给早期的药物研发过程带来了巨大压力。中国仓鼠卵巢(CHO)细胞仍然是生产重组蛋白药物的首选哺乳动物系统，如何快速地寻找到能够稳定并大量分泌正确重组蛋白的细胞系变得尤为重要。传统的细胞筛选通常采用有限稀释法或细胞分选法，工作量大、耗时长，比如筛选1000个细胞往往需要8周以上，最终可能获得一个好的克隆；此外，在挑选克隆时，传统的方法容易对细胞造成机械损伤，使得克隆成活率明显下降。目前生产企业通常使用半固体培基法进行单克隆筛选。通过半固体培养法挑取独立的单克隆，不需要进行多次的亚克隆和单克隆，缩短了制备周期，避免了阳性克隆的丢失，从而可以短时间内制备大容量多样性的重组蛋白。

前期有学者利用流式分选法联合半固体培养基的方法，具体方法是细胞生长在半固体培养基中，形成单克隆细胞团，同时将抗体分泌在细胞团周围，半固体培养基中含有荧光标记的二抗，能与抗体的Fc片段发生特异性结合，当用一定波长的光激发时即可发出荧光。接着使用图像分析系统对单克隆细胞团的大小、荧光强度进行测定，从而筛选出生长旺盛、表达量高的单克隆细胞团(Caron AW,Nicolas C,Gaillet B,et al.Fluorescentlabeling in semi-solid medium for selection of mammalian cells secretinghigh-levels of recombinant proteins.BMC Biotechnol,2009,9:42.)。然而，这种筛选策略虽然有一定的效果，但是在筛选过程中，使用了抗体，价格昂贵，不适合普通的实验室或生产企业规模化推广应用。还有学者开发的Clone Pix system筛选方法，是一种基于荧光检测技术但无需表达载体自身产生荧光，可以在短时间内挑选大量克隆，有效避免了人工筛选细胞的弊端，加上细胞处于半固体培养基中，挑选过程较为柔和，增加了细胞存活率，明显提高了工作效率。然而，这种技术开发的半固体培养基，价格极其昂贵，货期较长，配方保密，加上国外的物流成本较高，使得其实际应用时受到诸多限制。

公布号CN106190948A的中国发明专利申请公开了一种CHO-S细胞半固体培养基及其配制方法与应用，该发明公开了半固体培养基的配方，虽然能用于细胞培养，无法基于此种培养基进行筛选，并且仅能适用于CHO-S细胞；此外，CD FortiCHO培养基仍为进口产品，价格不菲，使得该方法的实际应用度不高。目前，基于半固体培养基的CHO细胞重组蛋白筛选方面尚不十分理想。

发明内容

本发明的目的是提供一种CHO细胞蛋白表达系统用表达载体，可以应用到CHO细胞蛋白表达系统中，以荧光强弱来指示上游目的基因的表达，方便克隆细胞株的筛选。

本发明的第二个目的是提供一种蛋白表达系统中CHO细胞的筛选方法，解决现有克隆筛选方法存在的筛选周期长、容易对细胞造成机械伤害等问题。

为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：

一种CHO细胞蛋白表达系统用表达载体，所述表达载体含有启动子、F2A序列和Poly A序列，在所述F2A序列的上游插入有目的基因，下游插入有荧光标记和筛选标记融合基因；所述F2A序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明的上述表达载体，下游荧光标记基因的表达与上游目的基因的表达呈正相关，可利用荧光显微镜直观观察荧光标记基因的表达量，进而可以通过荧光强度强弱确定生长旺盛、表达量高的细胞株，利用半固体培养基更能方便该类细胞株的克隆筛选。

优选地，所述启动子的上游插入有UCOE元件，所述目的基因插入在所述启动子的下游；所述启动子为CMV启动子。

优选地，Poly A序列的下游插入有MAR元件，Poly A序列的上游插入所述荧光标记和筛选标记融合基因。

为进一步实现稳定转染细胞株的筛选，优选地，所述荧光标记为RFP基因。所述筛选标记为杀稻瘟菌素抗性基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

优选地，所述目的基因编码分泌蛋白。进一步优选地，所述目的基因为SEAP基因或EGFP基因；SEAP基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示，EGFP基因的核苷酸序列如SEQ IDNO:5所示。

一种蛋白表达系统中CHO细胞的筛选方法，包括以下步骤：

(1)将上述表达载体转染CHO细胞；

(2)使用半固体培养基对步骤(1)转染后的CHO细胞进行培养，观察荧光标记基因的表达，根据荧光强弱筛选细胞株。

本发明的用于蛋白表达系统中CHO细胞的筛选方法，在F2A序列的上下游分别插入目的基因和荧光标记基因，载体转染CHO细胞后，放置于半固体培养基中培养，根据荧光标记基因(RFP)的荧光强弱，即可在半固体培养基中挑选出生长旺盛、表达量高的细胞株。试验证实，下游标记基因的荧光强弱可用来指示上游目的基因的表达(即下游标记基因的荧光强度与上游目的基因表达量呈正相关)，利用该方法既能缩短细胞克隆的筛选周期，又能减少实验成本，同时也保留了半固体培养基筛选单克隆细胞株的优势。

CHO细胞可以为CHO-S、CHO-K1、DG44细胞或CHO的任何细胞类型。

为更好的促进CHO细胞的生长，降低适用于克隆筛选的半固体培养基成本，优选地，步骤(2)中，所述半固体培养基为添加有甲基纤维素及胎牛血清的DMEM高糖培养基，其中甲基纤维素的质量终浓度为3～7％，胎牛血清的体积终浓度为5～10％。

进一步优选地，甲基纤维素的质量终浓度为5～7％，胎牛血清的体积终浓度为5～10％。

附图说明

图1为本发明实施例中表达载体(pCMV-EGFP-IRES-Luc)的物理图谱；

图2为本发明实施例中表达载体(pCMV-EGFP-F2A-Luc)的物理图谱；

图3为本发明实施例中表达载体(pCMV-EGFP-E2A-Luc)的物理图谱；

图4为本发明实施例中表达载体(pCMV-EGFP-IRES-RFP)的物理图谱；

图5为本发明实施例中表达载体(pCMV-EGFP-F2A-RFP)的物理图谱；

图6为本发明实施例中表达载体(pCMV-EGFP-E2A-RFP)的物理图谱；

图7为本发明实施例中表达载体(pCMV-EGFP-F2A-RFP-Blasticidin)的物理图谱；

图8为本发明实施例中表达载体(pCMV-SEAP-F2A-RFP-Blasticidin)的物理图谱；

图9为本发明中将不同表达载体转染CHO-S细胞后48小时荧光图(100倍)；

图10为本发明中将表达载体(SEAP)转染CHO-S细胞后，克隆在半固体培养基中第五天的生长状态(100倍)，培养基配方中甲基纤维素的质量分数为3％；

图11为本发明中将表达载体(SEAP)转染CHO-S细胞后，克隆在半固体培养基中第五天的生长状态(100倍)，培养基配方中甲基纤维素的质量分数为7％；

图12为本发明中将表达载体(SEAP)转染CHO-S细胞后，克隆在半固体培养基中第五天的生长状态(100倍)，培养基配方中甲基纤维素的质量分数为5％；

图13为本发明中挑选的13个克隆的荧光图；

图14为本发明中RFP的Western blot检测结果；

图15为本发明中SEAP的检测结果。

具体实施方式

克隆筛选是细胞系开发的关键步骤。然而，传统的克隆筛选过程需要利用细胞生长速率、细胞密度和产品质量来评估大量的克隆株，因此，使得克隆筛选既费时又费力。基于上述弊端，本发明利用表达载体自身元件表达水平来进行筛选，在载体设计时，在F2A序列的上游插入目的基因，同时在其下游插入标记基因红色荧光蛋白(RFP)，将载体转染CHO细胞，进而将转染后的细胞铺到半固体培养基中，5～14天后，荧光显微镜下观察RFP的表达，通过下游的RFP表达指示上游目的蛋白(SEAP)的表达，结合半固体培养基，快速高效的筛选出高表达克隆株。试验证明，RFP荧光强弱可以指示上游目的基因的表达水平，即荧光强度与上游目的基因的表达呈正相关。

此外，使用半固体培养基，我们能在较短的时间内(5～14天)从转染池中筛选得到高产的单克隆细胞。因此，本发明采用的这种半固体培养基和含有RFP的表达载体相结合的筛选方法，既能缩短筛选周期，又能减少科研成本，为筛选出稳定、高表达的克隆提供了一种快速方法。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限定本发明的保护范围。若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。下述实施例中的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例及试验例中所用的质粒小提试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司(货号：CW0500S)；无缝克隆试剂盒购自碧云天生物公司(货号：D7010S)，工具酶、培养基等均为市售商品；pCMV-EGFP-IRES-Luc质粒购自河南普诺易生物制品研究院有限公司(货号：FV1010)。实施例及试验例中所用细胞系、试剂、工具酶等均为市售商品。

以下实施例中，初始载体为pCMV-EGFP-IRES-Luc质粒。载体结构为UCOE-启动子-EGFP-WPRE-IRES-Luc-PolyA-MAR。经实施例改造后，获得结构为UCOE-启动子-目的基因-WPRE-F2A-RFP-Blasticidin-PolyA-MAR的重组载体。其中，WPRE、UCOE、MAR、Luc元件的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：10-13所示。

实施例1双顺反子表达载体的构建

本实施例的CHO细胞蛋白表达系统用表达载体，名称为pCMV-EGFP-F2A-RFP-Blasticidin重组质粒，其结构为UCOE-启动子-EGFP-WPRE-F2A-RFP-Blasticidin-PolyA-MAR。F2A基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。EGFP基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。RFP基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。筛选标记基因(Blasticidin)的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

本实施例的重组载体的构建过程如下：

1、pCMV-EGFP-F2A-Luc、pCMV-EGFP-E2A-Luc表达载体的构建

1.1、pCMV-EGFP-F2A-Luc表达载体的构建

1)合成F2A序列

设计并人工合成F2A序列(如SEQ ID NO:1所示)，具体交由通用生物基因(安徽)有限公司完成。

为便于克隆及保证序列完整性，合成F2A序列时，5'端引入AGCATGCAT序列，其中AGC为保护碱基，ATGCAT为NsiI酶切位点；3′端引入CCCGGG ATA，其中ATA为酶切保护碱基，CCCGGG为XmaI酶切位点。

2)构建pCMV-EGFP-F2A-Luc表达载体

用NsiI/XmaI双酶切合成的F2A序列，同时用NsiI/XmaI双酶切pCMV-EGFP-IRES-Luc质粒DNA(pCMV-EGFP-IRES-Luc质粒图谱如图1所示)。琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果，凝胶回收酶切后的F2A序列片段和pCMV-EGFP-IRES-Luc线性质粒DNA。

合成F2A序列的双酶切体系为：合成F2A序列10μL(1μg/μL)，10×NEB Buffer 2.13μL，NsiI/XmaI(10U/μL)各0.5μL，补足水至30μL，酶切条件为：37℃，酶切3min。

pCMV-EGFP-IRES-Luc质粒的双酶切体系为：pCMV-EGFP-IRES-Luc质粒5μL(1μg/μL)，10×NEB Buffer 2.1 2μL，NsiI/I/XmaI(10U/μL)各0.5μL，补足水至20μL；酶切条件为：37℃，酶切3min。

取酶切后的F2A序列片段和pCMV-EGFP-IRES-Luc线性质粒DNA(摩尔比5:1)，使用NEB公司的连接试剂盒，25℃连接5min。将连接产物加入到DH5α感受态细胞悬液中转化，取150μL转化菌液接种到含有氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养过夜，挑取单菌落继代培养。提取重组质粒进行双酶切(NsiI/I/XmaI)验证，验证正确的质粒，进行测序验证，构建正确的质粒命名为pCMV-EGFP-F2A-Luc(质粒图谱如图2所示)。

1.2、pCMV-EGFP-E2A-Luc表达载体的构建

1)合成E2A序列

设计并人工合成E2A序列(如SEQ ID NO:2所示)，具体交由通用生物基因(安徽)有限公司完成。

为便于克隆及保证序列完整性，合成E2A序列时，5'端引入AGC ATGCAT序列，其中AGC为保护碱基，ATGCAT为NsiI酶切位点；3′端引入CCCGGG ATA，其中ATA为酶切保护碱基，CCCGGG为XmaI酶切位点。

2)构建pCMV-EGFP-E2A-Luc表达载体

用NsiI/XmaI双酶切合成的E2A序列，同时用NsiI/XmaI双酶切pCMV-EGFP-IRES-Luc质粒DNA(pCMV-EGFP-IRES-Luc质粒图谱如图1所示)。琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果，凝胶回收酶切后的E2A序列片段和pCMV-EGFP-IRES-Luc线性质粒DNA。

合成E2A序列的双酶切体系为：合成E2A序列10μL(1μg/μL)，10×NEB Buffer 2.13μL，NsiI/XmaI(10U/μL)各0.5μL，补足水至30μL，酶切条件为：37℃，酶切3min。

pCMV-EGFP-IRES-Luc质粒的双酶切体系为：pCMV-EGFP-IRES-Luc质粒5μL(1μg/μL)，10×NEB Buffer 2.1 2μL，NsiI/I/XmaI(10U/μL)各0.5μL，补足水至20μL；酶切条件为：37℃，酶切3min。

取酶切后的E2A序列片段和pCMV-EGFP-IRES-Luc线性质粒DNA(摩尔比5:1)，使用NEB公司的连接试剂盒，25℃连接5min。将连接产物加入到DH5α感受态细胞悬液中转化，取150μL转化菌液接种到含有氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养过夜，挑取单菌落继代培养。提取重组质粒进行双酶切(NsiI/I/XmaI)验证，验证正确的质粒，进行测序验证，构建正确的质粒命名为pCMV-EGFP-E2A-Luc(质粒图谱如图3所示)。

2、含EGFP和RFP的表达载体构建

根据RFP(GenBank登录号为No:TID02864.1)的序列进行基因合成，采用无缝克隆技术，分别将其构建到pCMV-EGFP-IRES-Luc，pCMV-EGFP-F2A-Luc和pCMV-EGFP-E2A-Luc载体中，具体由通用生物基因(安徽)有限公司完成。经质粒提取、酶切鉴定，选取酶切验证正确的质粒，进行测序验证，将目的基因序列完全正确的载体分别命名为pCMV-EGFP-IRES-RFP，pCMV-EGFP-F2A-RFP和pCMV-EGFP-E2A-RFP(质粒图谱如图4-6所示)。

3、含EGFP、RFP和Blasticdin的表达载体构建

根据杀稻瘟菌素(Blasticdin)(GenBank登录号为No:NW_019170238.1)的序列进行基因合成，采用无缝克隆技术将其构建到pCMV-EGFP-F2A-RFP载体中，具体由通用生物基因(安徽)有限公司完成。经质粒提取、酶切鉴定，选取酶切验证正确的质粒，进行测序验证，将目的基因序列完全正确的载体命名为pCMV-EGFP-F2A-RFP-Blasticidin(质粒图谱如图7所示)。

实施例2表达SEAP的表达载体构建

本实施例的CHO细胞蛋白表达系统用表达载体，为重组质粒pCMV-SEAP-F2A-RFP-Blasticidin，结构为UCOE-启动子-SEAP-WPRE-F2A-RFP-Blasticidin-PolyA-MAR。SEAP基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示。

上述重组质粒的构建过程如下：

1、SEAP的PCR扩增

根据SEAP(GenBank登录号为No:KM403567.1)的序列，设计如下引物：

P3:5′-GGTACCATGCTGCTGCTGCTGCTGC-3′；如SEQ ID NO：8所示。

P4:5′-GCTAGCTCATGTCTGCTCGAAGCGGC-3′；如SEQ ID NO：9所示。

引物的5′端分别引入KpnI/NheI酶切位点。以提取的人外周血基因组DNA为模板，PCR扩增得到SEAP。PCR体系如下表1所示。

表1 SEAP的PCR扩增体系

试剂	浓度	体积(μL)	终浓度
				ddH<sub>2</sub>O		17.0
P1	10μmol/L	1.0	0.4μmol/L
				P2	10μmol/L	1.0	0.4μmol/L
10×PCR buffer		2.5	1×
				dNTP	25μmol/L	2.0	200μmol/L
模板DNA	100ng/μL	1.0	4.0ng/μL
				Taq酶	5U/μL	0.5	0.1U/μL

PCR条件如下：95℃3min，94℃40s，60-56℃30s，72℃40s，每个退火温度4个循环，最后55℃，30个循环，72℃3min。琼脂糖凝胶电泳回收扩增产物，送生物公司测序验证，结果表明，扩增出的DNA片段与GenBank公开的SEAP序列完全一致。

2、pCMV-SEAP-F2A-RFP-Blasticdin载体的构建

用KpnI/NheI双酶切SEAP序列的PCR扩增产物(经测序验证正确的序列)，同时用KpnI/NheI双酶切pCMV-EGFP-F2A-RFP-Blasticidin质粒，采用常规的酶切方法，37℃、3h。琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果，凝胶回收SEAP序列片段和pCMV-EGFP-F2A-RFP-Blasticidin线形质粒；酶切回收后的SEAP片段及pCMV-EGFP-F2A-RFP-Blasticidin线性质粒DNA按5：1(摩尔比)进行连接，16℃连接过夜；然后将连接产物加入到DH5α感受态细胞悬液中，进行转化，将200μL菌液接种在含有氨苄青霉素LB平板上，37℃培养过夜，挑取单菌落继代培养，并进行重组质粒的双酶切(KpnI/NheI)验证，选取酶切验证正确的质粒，进行测序验证，将目的基因序列完全正确的载体命名为pCMV-SEAP-F2A-RFP-Blasticidin(质粒图谱如图8所示)。

实施例3

本实施例的蛋白表达系统中CHO细胞的筛选方法，包括以下步骤：

1、含SEAP的表达载体转染CHO-S细胞

选择生长状态良好的CHO-S细胞接种到24孔培养板上，待铺板密度达到约80％时进行转染。具体操作步骤如下：12μL lipofectamine2000添加到300μL无血清DMEM/F12培养基中，在37℃孵箱中静置5min(即lipofectamine2000混合液)；将300μL无血清的DMEM/F12培养基与4.8μg表达载体(pCMV-SEAP-F2A-RFP-Blasticdin)混合，37℃孵箱中静置5min(即表达载体混合液)；将上述lipofectamine2000混合液和表达载体混合液再次混合，37℃孵箱中静置20min；同时用PBS将24孔培养板上的细胞清洗三遍，加入300μL含10％血清的DMEM/F12完全培养基。然后，将脂质体与各组质粒DNA的混合液轻轻滴入孔中，尽快轻轻摇晃培养平板使其混匀；放入5％CO₂的细胞培养箱中，37℃培养4～6小时后，再更换一次完全培养基，放入细胞培养箱内继续培养。

2、半固体培养基培养及荧光筛选

2.1、半固体培养基配制

2×H-DMEM，供应商HyClone，货号SH30045.04。甲基纤维素，供应商Sigma，货号M0512-500G，在20℃下，2％的该甲基纤维素黏度为4000cPs。

称量H-DMEM培养基，加入超纯水，充分搅拌溶解，0.22μM滤膜过滤除菌得到2×H-DMEM培养基。准确称量甲基纤维素加入去离子水中，在52℃的水浴锅中轻轻晃动容器，使甲基纤维素均匀溶解在去离子水中，400rpm磁力搅拌器皿充分搅拌60min使其充分溶解，121℃高压灭菌20min，待降为室温后，放入4℃冰箱保存备用(2×甲基纤维素溶液)。

细胞间超净工作台里，在50mL无菌离心管中，加入40mL的2×H-DMEM培养基，再加入10mL胎牛血清，接着加入400μL的浓度为2.5mg/mL的杀稻瘟菌素溶液。然后加入50mL2×甲基纤维素溶液(按照1:1的体积比)混合，4℃条件下600rpm磁力搅拌器搅拌过夜。将配制好的半固体培养基在-20℃冰箱保存备用。

采用上述方法配制的半固体培养基为含质量终浓度5％甲基纤维素、体积终浓度10％胎牛血清的DMEM高糖培养基。

2.2、基于半固体培养基的CHO细胞中稳定筛选系统的建立

从-20℃冰箱取出配制的半固体培养基，4℃过夜，使其溶解完全。在超净工作台，选择6孔板进行铺板，同时取3个50mL无菌离心管，在50mL无菌离心管中，3种配方的半固体培养基各加15mL，接着分别加入3000～12000个细胞(即每个孔500～2000个细胞)，再次混合均匀，取2mL混合物到每个孔中(避免产生气泡，并且平铺)。最后放入恒温培养箱(36.5℃，5％CO₂)培养5天。

2.3、荧光筛选

将在半固体培养基中生长5天的细胞克隆，根据荧光强弱挑选13个克隆，放置到DMEM/F12完全培养基中继续扩大培养，达到一定数量后(50万/毫升)，使用无血清培养基悬浮培养7天。收取上清液并裂解细胞，分别采用Western blot技术和碱性磷酸酶试剂盒验证RFP和SEAP的表达量。

实施例4

本实施例的蛋白表达系统中CHO细胞的筛选方法，与实施例3基本相同，区别仅在于，半固体培养基中，甲基纤维素的质量分数为7％。

实施例5

本实施例的蛋白表达系统中CHO细胞的筛选方法，与实施例3基本相同，区别仅在于，半固体培养基中，甲基纤维素的质量分数为3％。

试验例1 EGFP和RFP在CHO细胞中瞬时表达的效果检测

选择生长状态良好的CHO-S细胞接种到6孔培养板上，待铺板密度达到约80％时进行转染。具体操作步骤如下：将10μL lipofectamine2000添加到240μL无血清DMEM/F12培养基中，在37℃孵箱中静置5min，将无血清的DMEM/F12培养基分别与250μL(5μg)表达载体(pCMV-EGFP-F2A-RFP，pCMV-EGFP-E2A-RFP，pCMV-EGFP-IRES-RFP)混合，37℃孵箱中静置20min；同时用PBS将6孔培养板上的细胞清洗三遍，加入2mL无血清的DMEM/F12细胞培养基。然后，将脂质体与各组质粒DNA的混合液轻轻滴入孔中，尽快轻轻摇晃培养平板使其混匀；放入5％CO₂的细胞培养箱中，37℃培养6h后，将无血清的DMEM/F12培养基更换成DMEM/F12完全培养基，放入细胞培养箱内继续培养。48h后，倒置荧光显微镜下观察EGFP和RFP的瞬时表达情况。

结果如图9所示，由F2A介导的上下游基因的表达水平明显优于E2A和IRES，即F2A介导的EGFP和RFP的荧光表达水平较高，更适宜在表达重组蛋白方面应用。

试验例2不同半固体培养基的培养效果比较

对比实施例5、4、3，步骤2.2中培养5天后在荧光显微镜下观察RFP的表达，图10、图11、图12分别对应甲基纤维素用量3％、7％、5％。

结果显示，5％甲基纤维素浓度的配方下，细胞存活率高，且荧光更易观察(图12)。

试验例3 SEAP在基于半固体培养基的CHO细胞中稳定筛选中的效果检测

按实施例3的方法，将在半固体培养基中生长5天的细胞克隆，根据荧光强弱挑选13个克隆，放置到DMEM/F12完全培养基中继续扩大培养(图13)，达到一定数量后(50万/毫升)，使用无血清培养基悬浮培养7天。收取上清液并裂解细胞，分别采用Western blot技术和碱性磷酸酶试剂盒验证RFP和SEAP的表达量。

结果如图14和图15所示。结果显示：下游基因RFP的表达可以用来指示上游基因SEAP的表达(图14，图15)。

以上试验数据表明：本发明建立的这种基于半固体培养基的CHO细胞重组蛋白筛选系统有利于在短时间内筛选高效表达的单克隆细胞株，获得了较好的效果，适于重组蛋白筛选系统的快速建立。

<110> 新乡医学院、河南普诺易生物制品研究院有限公司

<120> 一种CHO细胞蛋白表达系统用表达载体及CHO细胞的筛选方法

<160> 11

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 75

<212> DNA

<221> F2A

<400> 1

ggaagcggag tgaaacagac tttgaatttt gaccttctca agttggcggg agacgtggag 60

tccaaccctg gacct 75

<210> 2

<211> 68

<212> DNA

<221> E2A

<400> 2

ggaagcggac agtgtactaa ttatgctctc ttgaaattgg ctggagatgt tgaagcaacc 60

ctggacct 68

<210> 3

<211> 696

<212> DNA

<221> RFP

<400> 3

atgagcgagc tgatcaagga gaacatgcac atgaagctgt acatggaggg caccgtgaac 60

aaccaccact tcaagtgcac atccgagggc gaaggcaagc cctacgaggg cacccagacc 120

atgaagatca aggtggtcga gggcggccct ctccccttcg ccttcgacat cctggctacc 180

agcttcatgt acggcagcaa agccttcatc aaccacaccc agggcatccc cgacttcttt 240

aagcagtcct tccctgaggg cttcacatgg gagagaatca ccacatacga agacgggggc 300

gtgctgaccg ctacccagga caccagcttc cagaacggct gcatcatcta caacgtcaag 360

atcaacgggg tgaacttccc atccaacggc cctgtgatgc agaagaaaac acgcggctgg 420

gaggccaaca ccgagatgct gtaccccgct gacggcggcc tgagaggcca cagccagatg 480

gccctgaagc tcgtgggcgg gggctacctg cactgctcct tcaagaccac atacagatcc 540

aagaaacccg ctaagaacct caagatgccc ggcttccact tcgtggacca cagactggaa 600

agaatcaagg aggccgacaa agagacctac gtcgagcagc acgagatggc tgtggccaag 660

tactgcgacc tccctagcaa actggggcac agatga 696

<210> 4

<211> 399

<212> DNA

<221> Blasticidin

<400> 4

atggccaagc ctttgtctca agaagaatcc accctcattg aaagagcaac ggctacaatc 60

aacagcatcc ccatctctga agactacagc gtcgccagcg cagctctctc tagcgacggc 120

cgcatcttca ctggtgtcaa tgtatatcat tttactgggg gaccttgtgc agaactcgtg 180

gtgctgggca ctgctgctgc tgcggcagct ggcaacctga cttgtatcgt cgcgatcgga 240

aatgagaaca ggggcatctt gagcccctgc ggacggtgcc gacaggtgct tctcgatctg 300

catcctggga tcaaagccat agtgaaggac agtgatggac agccgacggc agttgggatt 360

cgtgaattgc tgccctctgg ttatgtgtgg gagggctaa 399

<210> 5

<211> 717

<212> DNA

<221> EGFP

<400> 5

atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60

ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120

ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180

ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240

cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300

ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360

gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420

aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480

ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540

gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600

tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660

ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaag 717

<210> 6

<211> 586

<212> DNA

<221> IRES

<400> 6

attcgcccct ctccctcccc cccccctaac gttactggcc gaagccgctt ggaataaggc 60

cggtgtgtgt ttgtctatat gtgattttcc accatattgc cgtcttttgg caatgtgagg 120

gcccggaaac ctggccctgt cttcttgacg agcattccta ggggtctttc ccctctcgcc 180

aaaggaatgc aaggtctgtt gaatgtcgtg aaggaagcag ttcctctgga agcttcttga 240

agacaaacaa cgtctgtagc gaccctttgc aggcagcgga accccccacc tggcgacagg 300

tgcctctgcg gccaaaagcc acgtgtataa gatacacctg caaaggcggc acaaccccag 360

tgccacgttg tgagttggat agttgtggaa agagtcaaat ggctctcctc aagcgtagtc 420

aacaaggggc tgaaggatgc ccagaaggta ccccattgta tgggaatctg atctggggcc 480

tcggtgcaca tgctttacat gtgtttagtc gaggttaaaa aagctctagg ccccccgaac 540

cacggggacg tggttttcct ttgaaaaaca cgatgataag cttgcc 586

<210> 7

<211> 1560

<212> DNA

<221> SEAP

<400> 7

atgctgctgc tgctgctgct gctgggcctg aggctacagc tctccctggg catcatccca 60

gttgaggagg agaacccgga cttctggaac cgcgaggcag ccgaggccct gggtgccgcc 120

aagaagctgc agcctgcaca gacagccgcc aagaacctca tcatcttcct gggcgatggg 180

atgggggtgt ctacggtgac agctgccagg atcctaaaag ggcagaagaa ggacaaactg 240

gggcctgaga tacccctggc catggaccgc ttcccatatg tggctctgtc caagacatac 300

aatgtagaca aacatgtgcc agacagtgga gccacagcca cggcctacct gtgcggggtc 360

aagggcaact tccagaccat tggcttgagt gcagccgccc gctttaacca gtgcaacacg 420

acacgcggca acgaggtcat ctccgtgatg aatcgggcca agaaagcagg gaagtcagtg 480

ggagtggtaa ccaccacacg agtgcagcac gcctcgccag ccggcaccta cgcccacacg 540

gtgaaccgca actggtactc ggacgccgac gtgcctgcct cggcccgcca ggaggggtgc 600

caggacatcg ctacgcagct catctccaac atggacattg acgtgatcct aggtggaggc 660

cgaaagtaca tgtttcgcat gggaacccca gaccctgagt acccagatga ctacagccaa 720

ggtgggacca ggctggacgg gaagaatctg gtgcaggaat ggctggcgaa gcgccagggt 780

gcccggtatg tgtggaaccg cactgagctc atgcaggctt ccctggaccc gtctgtgacc 840

catctcatgg gtctctttga gcctggagac atgaaatacg agatccaccg agactccaca 900

ctggacccct ccctgatgga gatgacagag gctgccctgc gcctgctgag caggaacccc 960

cgcggcttct tcctcttcgt ggagggtggt cgcatcgacc atggtcatca tgaaagcagg 1020

gcttaccggg cactgactga gacgatcatg ttcgacgacg ccattgagag ggcgggccag 1080

ctcaccagcg aggaggacac gctgagcctc gtcactgccg accactccca cgtcttctcc 1140

ttcggaggct accccctgcg agggagctcc atcttcgggc tggcccctgg caaggcccgg 1200

gacaggaagg cctacacggt cctcctatac ggaaacggtc caggctatgt gctcaaggac 1260

ggcgcccggc cggatgttac cgagagcgag agcgggagcc ccgagtatcg gcagcagtca 1320

gcagtgcccc tggacgaaga gacccacgca ggcgaggacg tggcggtgtt cgcgcgcggc 1380

ccgcaggcgc acctggttca cggcgtgcag gagcagacct tcatagcgca cgtcatggcc 1440

ttcgccgcct gcctggagcc ctacaccgcc tgcgacctgg cgccccccgc cggcaccacc 1500

gacgccgcgc acccgggtta ctctagagtc ggggcggccg gccgcttcga gcagacatga 1560

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> SEAP上游引物

<400> 8

ggtaccatgc tgctgctgct gctgc 25

<210> 9

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> SEAP下游引物

<400> 9

gctagctcat gtctgctcga agcggc 26

<210> 10

<211> 621

<212> DNA

<213> WPRE

<400> 10

gacctcgagg gaattccgat aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg 60

gtattcttaa ctatgttgct ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt 120

atcatgctat tgcttcccgt atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc 180

tgtctcttta tgaggagttg tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt 240

ttgctgacgc aacccccact ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga 300

ctttcgcttt ccccctccct attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct 360

gctggacagg ggctcggctg ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaagctga 420

cgtcctttcc atggctgctc gcctgtgttg ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct 480

gctacgtccc ttcggccctc aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc 540

tgcggcctct tccgcgtctt cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg 600

cctccccgca tcgggaattc g 621

<210> 11

<211> 674

<212> DNA

<213> UCOE

<400> 11

gggaggtggt ccctgcagtt acgccaatga taacccccgc cagaaaaatc ttagtagcct 60

tccctttttg ttttccgtgc cccaactcgg cggattgact cggccccttc cggaaacacc 120

cgaatcaact tctagtcaaa ttattgttca cgccgcaatg acccacccct ggcccgcgtc 180

tgtggaactg acccctggtg tacaggagag ttcgctgctg aaagtggtcc caaaggggta 240

ctagttttta agctcccaac tccccctccc ccagcgtctg gaggattcca caccctcgca 300

ccgcaggggc gaggaagtgg gcggagtccg gttttggcgc cagccgctga ggctgccaag 360

cagaaaagcc accgctgagg agactccggt cactgtcctc gccccgcctc ccccttccct 420

ccccttgggg accaccgggc gccacgccgc gaacggtaag tgccgcggtc gtcggcgcct 480

ccgccctccc cctagggccc caattcccag cgggcgcggc gcgcggcccc tccccccgcc 540

gcgcgcgcgc ccgctgcccc gcccttcgtg gccgcccggc gtgggcggtg ccacccctcc 600

ccccggcggc cccgcgcgca gctcccggct ccctccccct tcggatgtgg cttgagctgt 660

aggcgcggag ggcc 674

<210> 12

<211> 1080

<212> DNA

<213> MAR

<400> 12

agccaggcat gtgatgtaca cctgtagtcc cagctactca ggaggccgaa ggaaactgga 60

gaaactggga ggagtatcca gatgtcctgt ccctgtaagg gatattatcc tggacaacat 120

agcaagacct cgtctctact taaaaaaaaa gccaggtgtg gtggcatgtg cctgtagtcc 180

tacctactcg ggaggctgag gaatgtggga ggtggaggtt gcagtgacct gagatcgtgc 240

cactgcactc aagaccagcc tgatcaacat ggtgaaaccc tgtctctact aaaaatacaa 300

gctggacgtg gtggcacgtg cctgtagtcc cagctactcg ggaggctgag gaacccagga 360

ggtggaggtt gcagtgagct gagatcgcgc cactgcactc gagaccatcc tgaccaatat 420

ggtgaaaccc catctctact aaagatacaa aaatagtgca gcaatgaaca tgagagtgca 480

actatctctt caatgtactg ggtgtgggtg gagagaaccg cttgtgagct tgtctctgcg 540

gccagctgag aacacaggcc tcaccaagca ggaaaagcca cctctgccct aaaagtaaga 600

gactcctggg cgtggagcct accctggggt atggttgata aacacagtgt gaaaacggca 660

gttgggcact gcactgcccg gtgatggtgc cacggtggct gctgggcgtg gtggtgcctg 720

cctgtaatcc cagctactca gaaggctcag gaaccaggga gtcggtggct agagtgagcc 780

gagattgcat cactgcactc tattcaggta ggtgtagggt ggggggtgtt gaggtttaag 840

taagcaaagt agcaggtggg ggcacttctc cctctaacac tctcccctgt tgaagctctt 900

aagccaagga ggaggagggg ggtgaggtga aagatgagct ggaggaccgc gctgggcatg 960

gtggcacacg cctataatcc cagctactca ggaggctgag gaatccggga ggcagaggtc 1020

acagtgagcc aagatcacgc cactgtactc aagaccagcc tggccaacat ggtgaaatcc 1080

<210> 13

<211> 936

<212> DNA

<213> Luc

<400> 13

atgacaagta aagtttatga tcctgaacaa cgaaaacgta tgattactgg accacaatgg 60

tgggcaagat gtaaacaaat gaatgttctt gattctttta ttaattatta tgatagtgaa 120

aaacatgctg aaaatgcagt tatttttctt catggtaatg ctgcatcatc ttatctttgg 180

cgacatgttg taccacatat tgaacctgtt gcacgttgta ttattcctga tcttattggt 240

atgggaaaat ctggaaaaag tggtaatgga tcttatcgac ttcttgatca ttataaatat 300

ttgactgcat ggtttgaatt gcttaattta ccaaagaaaa ttatttttgt tggtcatgat 360

tggggagctt gccttgcttt tcattattct tatgaacatc aagataaaat taaagctatt 420

gttcatgcag aatcagttgt agatgtaatt gaatcttggg atgaatggcc tgatattgaa 480

gaagatattg cacttattaa atctgaagaa ggtgaaaaaa tggttcttga aaataatttc 540

tttgttgaaa caatgcttcc aagtaaaatt atgcgtaaac ttgaacctga agaatttgct 600

gcatatcttg aaccatttaa agaaaaagga gaagttcgta gacctacttt gtcatggcca 660

agagaaattc ctttagttaa aggtggaaaa ccagatgttg tacaaattgt acgtaattat 720

aatgcttatc ttagagcatc tgatgatctt ccaaaaatgt ttattgaaag tgatcctggt 780

ttcttttcaa atgctattgt tgaaggagct aaaaaatttc caaatactga atttgttaaa 840

gtaaaaggtt tacatttttc tcaagaagat gctccagatg aaatgggtaa atatattaaa 900

agttttgtag aacgagtatt gaaaaatgaa caataa 936

Claims (10)

1.一种CHO细胞蛋白表达系统用表达载体，其特征在于，所述表达载体含有启动子、F2A序列和Poly A序列，在所述F2A序列的上游插入有目的基因，下游插入有荧光标记和筛选标记融合基因；所述F2A序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.如权利要求1所述的CHO细胞蛋白表达系统用表达载体，其特征在于，在所述启动子的上游插入有UCOE元件，所述目的基因插入在所述启动子的下游；所述启动子为CMV启动子。

3.如权利要求1或2所述的CHO细胞蛋白表达系统用表达载体，其特征在于，Poly A序列的下游插入有MAR元件，Poly A序列的上游插入所述荧光标记和筛选标记融合基因。

4.如权利要求3所述的CHO细胞蛋白表达系统用表达载体，其特征在于，所述荧光标记为RFP基因。

5.如权利要求4所述的CHO细胞蛋白表达系统用表达载体，其特征在于，所述筛选标记为杀稻瘟菌素抗性基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

6.如权利要求1所述的CHO细胞蛋白表达系统用表达载体，其特征在于，所述目的基因编码分泌型蛋白。

7.如权利要求1或6所述的CHO细胞蛋白表达系统用表达载体，其特征在于，所述目的基因为SEAP基因或EGFP基因；SEAP基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示，EGFP基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。

8.一种蛋白表达系统中CHO细胞的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将权利要求1～7中任一项所述的表达载体转染CHO细胞；

(2)使用半固体培养基对步骤(1)转染后的CHO细胞进行培养，观察荧光标记基因的表达，根据荧光强弱筛选细胞株。

9.如权利要求8所述的蛋白表达系统中CHO细胞的筛选方法，其特征在于，步骤(2)中，所述半固体培养基为添加有甲基纤维素及胎牛血清的DMEM高糖培养基，其中甲基纤维素的质量终浓度为3～7％，胎牛血清的体积终浓度为5～10％。

10.如权利要求9所述的蛋白表达系统中CHO细胞的筛选方法，其特征在于，甲基纤维素的质量终浓度为5～7％，胎牛血清的体积终浓度为5～10％。

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