CN114107380B - 一种CHO-S.attp重组细胞株及其构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种CHO‑S.attp重组细胞株的构建方法和应用，构建方法主要包括以下步骤：将attp位点序列和GFP报告基因构建到含有PCDNA3.3载体，将带有attB位点序列和目的蛋白基因构建到pcDNA5载体，Bxb1重组酶基因构建到POG44载体；将所得的含有attp质粒转染CHO‑S细胞，抗生素筛选，FACS检测，获得CHO‑S.attp细胞池；利用所得细胞池，进行有限稀释，加压筛选单克隆，通过FACS检测，获得CHO‑S.attp细胞株；将attb和目的基因质粒与Bxb1重组酶共转染CHO‑S.attp细胞株，加压筛选，FACS检测，获得阳性率高，表达量高，稳定性好的细胞系。本发明具有耗时短，表达量高，阳性率高，稳定性好等优点，可直接用于抗体筛选，并可以提高抗体筛选的质量，加速后续的抗体体外研发进程。
Description
技术领域
本发明涉及质粒构建、细胞系构建领域，尤其涉及一种CHO-S.attp重组细胞株及其构建方法和应用。
背景技术
CHO细胞作为宿主细胞构建细胞系一直是新药临床前筛选和研究的重要工具。目前细胞系的构建多数采用目的基因随机整合到细胞基因组中的方法，此方法构建过程比较繁琐，周期较长。为了继续推动生物药物产品的开发，提高细胞系开发过程的效率至关重要。
利用噬菌体Bxb1特异性位点重组酶系统进行细胞系构建，可大大减少细胞系开发时间。先利用随机整合的方法把定点整合的位点attP随机整合到CHO-S细胞基因组中，通过抗生素筛选，获得CHO-S.attP重组细胞模型，以CHO-S.attp重组细胞株作为宿主细胞，借助Bxb1重组酶，将带有attB位点和目的蛋白基因的DNA定点整合到CHO-S.attp细胞株中，经抗生素加压筛选，实现目的蛋白的稳定高表达。
attP、attB是一对位点特异性重组序列，并共同含有一段核心序列，Bxb1重组酶可以识别核心序列进行剪切，attP、attB发生重组后会形成新的序列attL、attR，且发生重组后反向剪切需要IHF(integration host factor)，因此attP、attB位点特异性重组是定向的，不可逆的。
中国发明专利(授权公告号CN 100381573 C)公开了一种基因组中含有可扩增的高转录活性位点的细胞株的构建方法，用整合标记载体，将标记插入哺乳动物基因组可扩增性的转录活性位点，接着用靶向表达载体和重组酶表达载体双质粒共转染哺乳动物细胞，使目标基因在位点特异性重组系统的作用下整合至基因组的标记处，通过扩增基因的扩增作用，快速增加基因拷贝数，实现基因高表达。其中应用重组酶识别和切割一对重组信号序列，例如AttP、AttB，选择细胞株为CHO-dhfr-。该专利与本发明的不同之处在于，本发明使用CHO-S细胞株，借助Bxb1重组酶，将带有attB位点和目的蛋白基因的DNA定点整合到CHO-S.attp细胞株中，与该对比文件中的细胞株构建方法不同。
中国发明专利(申请公布号CN 113136400 A)公开了一种高效表达外源蛋白的CHO细胞株的构建方法及其应用，方法包括在外援蛋白序列N端添加信号肽序列，将添加信号肽序列的外援蛋白与Fc融合连接，构建表达质粒，用表达质粒转染CHO细胞，收获外源蛋白。该发明与本发明的不同之处在于，该发明所述方法得到的产物主要应用于制备疫苗组合物，该方法主要用于提高CHO表达外源蛋白的表达量，主要采用在蛋白序列端添加信号肽的方式，获得的产物是一种分泌型蛋白。本发明构建CHO-S.attp靶蛋白细胞系产物是一种膜蛋白，用于新药研发筛选，从细胞株的构建方法和用途两者均有不同。
发明内容
有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明要解决的技术问题之一是提供一种CHO-S.attp重组细胞株的构建方法，与传统构建细胞系方法相比较，本发明方法具有耗时短，表达量高，阳性率高，稳定性好等优点，可直接用于抗体筛选，并可以提高抗体筛选的质量，加速后续的抗体体外研发进程，同时推进抗体药物研发阶段项目进度。
本发明要解决的技术问题之二是提供一种采用上述方法构建的CHO-S.attp重组细胞株。本发明要解决的技术问题之三是提供上述CHO-S.attp重组细胞株的应用。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
在本发明的一方面，提供一种CHO-S.attp重组细胞株的构建方法，包括以下步骤：
(1)构建质粒：将attp位点序列和GFP报告基因构建到含有PCDNA3.3载体；
(2)培养CHO细胞；
(3)电穿孔转染，细胞计数，离心后弃掉上清；
(4)重悬细胞后，加入attp质粒至细胞悬液中，对细胞悬液进行电穿孔，然后转入摇床培养；
(5)FACS检测细胞转染效率，同时对细胞进行加压筛选；
(6)继续培养细胞至细胞活性恢复，进行FACS检测；
(7)对筛选后的细胞池进行静置培养；
(8)挑选单克隆进行FACS检测，筛选后进行扩大培养和稳定性检测。
具体的，所述步骤(2)中，所述细胞为CHO-S细胞或CHO-K1细胞。
具体的，所述步骤(3)中，所述细胞活率为95％以上，所述离心方式为800rpm离心5min。
具体的，所述步骤(3)中选用5×106细胞，所述步骤(4)中将10ug attp质粒加入所述细胞悬液，所述5×106细胞对应所述10ug质粒。
具体的，所述步骤(5)中，所述对细胞进行加压筛选的方式具体为：分别加入终浓度为10ug/ml，20ug/ml，30ug/ml的抗生素进行筛选。
具体的，所述步骤(6)中，所述细胞活率恢复至90％时，进行FACS检测。
具体的，所述步骤(7)中，所述筛选方法为：选择GFP阳性率最高的抗生素浓度筛选；所述静置培养条件为：37℃下，5％CO2的培养箱中静置培养10-15天。
具体的，所述步骤(8)中，所述筛选方法为：选出阳性率高，峰型对称的阳性克隆。
在本发明的第二方面，提供采用上述方法构建的CHO-S.attp重组细胞株。
在本发明的第三方面，还提供一种将CHO-S.attp作为宿主细胞进行目的基因细胞系构建的应用，该方法包括以下步骤：
(1)质粒构建：将带有attB位点序列和目的蛋白基因构建到pcDNA5载体，Bxb1重组酶基因构建到POG44载体；
(2)培养CHO-S.attp细胞；
(3)电穿孔转染，细胞计数，离心后弃掉上清；
(4)重悬细胞，加入质粒至细胞悬液中，对细胞悬液进行电穿孔，然后细胞转入摇床进行培养；
(5)FACS检测细胞的转染效率，同时对细胞进行加压筛选，加入抗生素之后的每2-3天查看细胞生长情况，直至细胞活率恢复至90％，进行FACS检测。
具体的，所述步骤(3)中，所述CHO-S.attp细胞活率为95％以上，取2×106细胞以800rpm，5min离心。
具体的，所述步骤(4)中，所述质粒中目的基因质粒和Bxb1重组酶质粒的质量比例为1:9。
具体的，所述步骤(5)中，所述对细胞进行加压筛选方法具体为：分别加入终浓度为500ug/ml，1000ug/ml的抗生素进行筛选。
在本发明的第四方面，还提供一种对CHO-S.attp细胞株进行定点整合位点重组验证的方法，包括以下步骤：
(1)提取CHO-S.attp细胞基因组；
(2)设计引物如下
(3)进行PCR实验，
(4)胶回收目的片段，进行attp，attb重组位点测序。
本发明成功构建了CHO-S.attp重组细胞株，以CHO-S.attp细胞株作为宿主细胞可以高效的完成目的基因细胞株构建。与现有技术相比较，本发明具有以下有益效果：与中国发明专利(授权公告号CN 100381573 C)相比，本发明先构建CHO-S.attp宿主细胞，含GFP标记蛋白，可便于长期简捷的方法鉴定CHO-S.attp宿主细胞的稳定性，经验证培养60天CHO-S.attp细胞仍稳定表达GFP，即稳定扩增attp位点序列。后续以CHO-S.attp为宿主细胞，借助Bxb1重组酶，可高效快速的构建阳性率高，表达量高的靶蛋白细胞系，应用便捷广泛。本发明成功构建了CHO-S.attp细胞株；应用CHO-S.attp细胞株作为宿主细胞进行目的基因定点整合细胞株的构建，可以获得阳性率高，表达量高，稳定性好的目的基因细胞株；减少用于细胞系构建所消耗的人力和时间，提高构建细胞系的效率和成功率。
以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
附图说明
图1是本发明实施例1中attp attb序列图；
图2是本发明实施例1中attp质粒设计图；
图3是本发明实施例1中Bxb1质粒设计和attb质粒设计图；
图4是本发明实施例1中CHO-S.attp重组细胞株示意图；
图5是本发明实施例1中目的基因细胞株构建示意图；
图6是本发明实施例2中attP，attB整合为attL，attR位点整合验证示意图。
具体实施方式
为了使发明实现的技术手段、创造特征、达成目的和功效易于明白了解，下结合具体图示，进一步阐述本发明。但本发明不仅限于以下实施的案例。
须知，本说明书所附图式所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。
实施例1
一种CHO-S.attp重组细胞株的构建方法和应用方法，包括以下步骤：
1、材料准备
1.1质粒准备：将attp位点序列(见图1和表1，attp共48bp，attb共43bp，attp attb各有相同的8bp，为Bxb1酶剪切位点)和GFP报告基因构建到含有PCDNA3.3载体质粒构建(见图2，attp位点与GFP标记蛋白相临近，可直接作为attp位点整合至细胞组的标记，质粒含有Bla抗生素，用于筛选attp位点发生整合的阳性细胞)：将带有attB位点序列(见图1和表1,attp共48bp，attb共43bp，attp attb各有相同的8bp，为Bxb1酶剪切位点)和目的蛋白基因构建到pcDNA5载体，Bxb1重组酶基因构建到POG44载体(见图3，Bxb1质粒，Bxb1序列紧接在CMV启动子之后，保证Bxb1酶正常表达，attb质粒，attb序列前方无CMV启动子，当attp位点和attb位点在Bxb1整合酶作用下，发生整合，attp前方的CMV启动子将与hygromycin抗生素相连，启动hygromycin抗性基因，用于筛选整合至attp和attb位点发生定点整合的阳性克隆)。
表1
1.2培养基准备：FreestyleCHO培养基中加入8nm L-Glutamine。
1.3细胞准备：培养CHO-S细胞，活率≥95％，密度维持在0.25×106-3×106之间。
2、构建CHO-S.attp细胞株
2.1抽提含有attp位点序列和GFP报告基因PCDNA3.3质粒50ug，OD:1.8-2.0。
2.2电穿孔转染：细胞计数，CHO-S细胞活率达到95％以上，取5×106细胞以800rpm，5min离心，弃掉上清。
2.3用82ul 4D NucleofectorTM SF Solution和18ul 4D NucleofectorTM SFSupplement重悬CHO-S细胞，加入10ug attp质粒至细胞悬液中，将细胞悬液转至电转杯中。
2.4打开LONZA电穿孔仪，选择CHO-S程序进行电转。
2.5室温孵育10min,将细胞转入10ml Freestyle CHO+8nm L-Glutamine培养基中进行培养，摇床转速220rpm,CO2浓度8％，湿度80％。
2.6 48小时之后FACS检测细胞的转染效率(即GFP阳性率)，同时对细胞进行加压筛选，分别加入终浓度为10ug/ml，20ug/ml，30ug/ml的抗生素blasticidin进行筛选。
2.7加入抗生素之后的每2-3天查看细胞生长情况，直至细胞活率恢复至90％，进行FACS检测。
2.8选择GFP阳性率最高的抗生素浓度筛选的细胞池进行有限稀释实验，96孔板每孔铺1个细胞，每孔200ul含抗生素的培养基，将铺好的的96孔板放于37℃，5％CO2的培养箱中静置培养10-15天。
2.9观察细胞状态，挑选单克隆，进行FACS检测，选出阳性率高，峰型对称的阳性克隆进行扩大培养和稳定性检测。如图4所示，以GFP为标记蛋白的CHO-S.attp宿主细胞，阳性率为99.3％，表达量为43500。
3、以CHO-S.attp作为宿主细胞进行目的基因细胞系构建
3.1培养CHO-S.attp细胞。
3.2电穿孔转染：细胞计数，CHO-S.attp细胞活率达到95％以上，取5×106细胞以800rpm，5min离心，弃掉上清。
3.3用82ul 4D NucleofectorTM SF Solution和18ul 4D NucleofectorTM SFSupplement重悬CHO-S.attp细胞，加入10ug attp质粒至细胞悬液中，其中attB位点序列和和目的蛋白基因质粒和Bxb1重组酶质粒共转染已经准好的细胞中(目的基因质粒和Bxb1重组酶质粒的质量比例为1:9)，将细胞悬液转至电转杯中。
3.4打开LONZA电穿孔仪，选择CHO-S程序进行电转。
3.5室温孵育10min,将细胞转入10ml Freestyle CHO+8nm L-Glutamine培养基中进行培养，摇床转速220rpm,CO2浓度8％，湿度80％。
3.6 48h之后FACS检测细胞的转染效率，即目的基因阳性率。同时对细胞进行加压筛选，分别加入终浓度为500ug/ml，1000ug/ml的hygromycin进行筛选。
3.7加入抗生素之后的每2-3天查看细胞生长情况，直至细胞活率恢复至90％，进行FACS检测。如图5所示，经hygromycin抗生素筛选得到attp位点和attb位点发生定点整合的靶基因阳性细胞系，阳性率达97.8％，表达量58100。
实施例2
定点整合位点重组验证实验，步骤如下：
1、提取CHO-S.attp细胞基因组；
2、设计引物
表1
3、进行PCR实验
PCR反应液组成(50ul反应体系)如下表：
| Extaq | 0.25ul |
| 10Xpcr buffer | 5ul |
| dNTP | 4ul |
| template | <500ng |
| Primer-F | 1.0uM |
| Primer-R | 1.0uM |
| 灭菌水 | up to 50ul |
表2
PCR反应条件：扩增1kb的DNA反应条件如下所示：
4、胶回收目的片段，进行测序。
如图6所示，提取靶基因细胞系基因组，并作为pcr模板，分别获得含attp序列，attb序列的pcr产物，与原始attp,attb相比对，序列比对成功，说明attp，attb位点发生定点整合。
本发明使用attP、attB位点特异性重组序列得到的重组细胞模型，具有耗时短，表达量高，阳性率高，稳定性好等优点，可直接用于抗体筛选，并可以提高抗体筛选的质量，加速后续的抗体体外研发进程，同时推进抗体药物研发阶段项目进度。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
序列表
<110> 上海药明生物技术有限公司
<120> 一种CHO-S.attp重组细胞株及其构建方法和应用
<130> WH-NP-21-101070
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列（未知）
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 1
tccaaaatgt cgtaacaact ccgccc 26
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列（未知）
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 2
gctgaaagca cgagattctt cgccc 25
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列（未知）
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 3
gctcctttcg ctttcttcc 19
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（未知）
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 4
taccgtacac cactgagtcc 20
<210> 5
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列（未知）
<400> 5
ggtttgtctg gtcaaccacc gcggactcag tggtgtacgg tacaaacc 48
<210> 6
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列（未知）
<400> 6
ccggcttgtc gacgacggcg gactccgtcg tcaggatcat cc 42
Claims (6)
1.一种CHO-S.attp重组细胞株作为宿主细胞构建目的基因细胞系的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)质粒构建：将attp位点序列和GFP报告基因构建到含有PCDNA3.3载体，共用CMV启动子；将带有attB位点序列和目的蛋白基因构建到pcDNA5载体，Bxb1重组酶基因构建到POG44载体；attp序列为GGTTTGTCTGGTCAACCACCGCGGACTCAGTGGTGTACGGTACAAACC；attb的序列为CCGGCTTGTCGACGACGGCGGACTCCGTCGTCAGGATCATCC。
(2)培养CHO-S.attp细胞；
(3)电穿孔转染：细胞计数，离心后弃掉上清；
(4)重悬细胞，加入质粒至细胞悬液中，对细胞悬液进行电穿孔，然后细胞转入摇床进行培养；
(5)FACS检测细胞的转染效率，同时对细胞进行加压筛选，加入抗生素之后的每2-3天查看细胞生长情况，直至细胞活率恢复至90％，进行FACS检测。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述步骤(3)中，所述CHO-S.attp细胞活率为95％以上，取2×106细胞以800rpm，5min离心。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述步骤(4)中，所述质粒中目的基因质粒和Bxb1重组酶质粒的质量比例为1:9。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述步骤(5)中，所述对细胞进行加压筛选的方式具体为：分别加入终浓度为500ug/ml，1000ug/ml的抗生素进行筛选。
5.采用权利要求1所述方法构建的CHO-S.attp重组细胞株。
6.一种对权利要求5所述的CHO-S.attp重组细胞株定点整合位点重组验证的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取CHO-S.attp细胞基因组；
(2)设计引物如下：
(3)进行PCR实验；
(4)胶回收目的片段，进行attp，attb重组位点测序。
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