CN102358893A

CN102358893A - 高效分泌表达AcAP5的中国仓鼠卵巢基因工程细胞株

Info

Publication number: CN102358893A
Application number: CN2011103040793A
Authority: CN
Inventors: 余琼; 张巍; 付海燕; 刘威
Original assignee: Heilongjiang University
Current assignee: Heilongjiang University
Priority date: 2011-10-10
Filing date: 2011-10-10
Publication date: 2012-02-22

Abstract

高效分泌表达AcAP5的中国仓鼠卵巢基因工程细胞株，涉及高效分泌表达AcAP5的CHO细胞株。本发明是要解决目前用CHO表达外源基因产物的表达量低，且无法满足工业化生产的问题。高效分泌表达AcAP5的中国仓鼠卵巢基因工程细胞株，利用二氢叶酸还原酶缺陷型中华仓鼠卵巢细胞作为宿主细胞，经筛选、扩增后得到稳定、高效表达AcAP5的细胞株。本发明的CHO细胞株可以高效表达AcAP5，表达量最高达到12mg/L·72h，且可以工业化生产。用于抗凝血、抗血栓。

Description

高效分泌表达AcAP5的中国仓鼠卵巢基因工程细胞株

技术领域

本发明涉及高效分泌表达AcAP5的CHO细胞株。

背景技术

犬钩虫吸血时，其头腺分泌一种具有抗凝血活性的物质，被称作犬钩虫抗凝血肽(anticoagulant peptide，AcAPs)。该物质本质是一种蛋白水解酶，具有延长血浆凝血酶原时间(pt)、抑制血液凝固以及促进纤维蛋白溶解的作用。AcAPs目前已有AcAP5、AcAP6、AcAPc2三种重组蛋白。AcAP5由77个氨基酸组成，是Xa因子的高效特异性抑制剂，与Xa的反应位区在肽37-42(-C-R-S-R-G-C-)，作用位点在第40位精氨酸和第41位甘氨酸之间。AcAPs的抗凝血、抗血栓作用有将会成为临床上一种新的抗凝剂和抗血栓治疗药物。

目前用CHO表达AcAP5的最高表达量是6mg/L，且无法满足工业化生产。

发明内容

本发明是要解决目前用CHO表达外源基因产物的表达量低，且无法满足工业化生产的问题，提供高效分泌表达AcAP5的中国仓鼠卵巢基因工程细胞株。

本发明高效分泌表达AcAP5的中国仓鼠卵巢基因工程细胞株，利用二氢叶酸还原酶缺陷型中华仓鼠卵巢细胞(CHO-dhfr^-)作为宿主细胞，经筛选、扩增后得到稳定、高效表达AcAP5的细胞株，表达量最高达到12mg/L·72h。

本发明高分泌表达AcAP5的中国仓鼠卵巢基因工程细胞株的构建方法，按以下步骤进行：

一、目的片段双酶切：由上海生工公司合成带有信号肽的AcAP5基因序列克隆到T载体上，将T载体用BamHI和NotI进行双酶切，反应体系如下：

酶切反应条件为37℃放置3小时，然后将酶切产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳，目的片段用DNA GEL EXTRACTION KIT纯化回收，得到插入片段；

二、质粒载体双酶切：用BamHI和NotI双酶切消化质粒载体pcDNA3.1/V5-His-C，反应体系如下：

酶切反应条件为37℃放置3小时，然后将酶切产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳，再用DNA GEL EXTRACTION KIT纯化回收，得到酶切后的质粒载体；

三、DNA片段的连接，反应体系如下：

连接反应条件为16℃放置过夜，获得连接产物重组质粒pcDNA3.1/V5-His-C-AcAP5；

四、细胞培养：用含100mL/L胎牛血清、NAA、1×HT的DMEM培养基培养二氢叶酸还原酶缺陷型中国仓鼠卵巢细胞CHO-dhfr^-；

五、重组质粒转染CHO：将构建好的重组质粒pcDNA3.1/V5-His-C-AcAP5与质粒pDCH1P11混合，使用Lipofeetmine^TM 2000Reagent共转染CHO-dhfr^-细胞，在24孔板中进行转染，细胞达到95％融合时，将培养基更换为无抗生素、无血清的CHO-S-SFM II，500μL/孔，转染6h后更换含100mL/L FBS的CHO-S-SFM II，继续培养48h，用ELISA试剂盒鉴定阳性转染的细胞按1∶10传代，24h细胞贴壁后更换为选择性培养基，培养14～16d后有阳性克隆形成，然后用定向消化的方法将阳性克隆转入24孔板，又传代至12孔板，经ELISA试剂盒测定对阳性克隆中10株高表达的细胞克隆进行扩大培养；

六、MTX的加压培养：以MTX加压筛选，浓度依次为2×10^-8mmol/L、1×10^-7mmol/L和5×10^-7mmol/L，最终得到能够在5×10^-7mmol/L的MTX中正常生长的CHO细胞株，即为高效分泌表达AcAP5的中国仓鼠卵巢基因工程细胞株。

步骤一所述带有信号肽的AcAP5基因序列根据Genbank中犬钩虫(Ancylostomacaninum)的mRNA序列(Aceession：U30795)的原始序列，去掉原始信号肽序列，同时根据表达系统的特点选择CHO-dhft^-偏爱密码子。为了使转录和翻译效率最高，同时使表达产物分泌到细胞外，在原始序列5’端加上Kozak序列和信号肽，在原始序列两端分别加上限制性内切酶BamHI和NotI的位点。

步骤一所述带有信号肽的AcAP5基因的序列如SEQ ID NO：1所示。

步骤一所述带有信号肽的AcAP5基因中加入的信号肽的基因序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明高效分泌表达AcAP5的中国仓鼠卵巢基因工程细胞株的表达产物的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。

本发明选用CHO-dhfr^-细胞作为宿主细胞，具有以下优点：CHO-dhfr^-细胞适用于各种蛋白质的分泌表达和胞质内表达；在MTX选择压力下，DHFR基因及该基因两侧的序列可以大量扩增；对培养基的适应性强，可以用无血清的培养基培养；CHO细胞既可进行贴壁培养也可进行悬浮培养；可大量地规模性生产，培养量可达5000L。

本发明的CHO细胞株可以高效表达AcAP5，表达量为9～12mg/L·72h，且可以工业化生产。AcAP5可以抗凝血、抗血栓，其主要抑制凝血因子Xa，直接与Xa的活性中心结合从而特异性抑制Xa，阻断凝血的共同途径，达到抗凝血作用。本发明为犬钩虫抗凝血肽抗凝活性的深入研究和临床应用奠定了基础。

附图说明

图1为具体实施方式一中重组质粒DNA的测序图；图2为具体实施方式一中阳性克隆的RT-PCR产物电泳图。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式高效分泌表达AcAP5的中国仓鼠卵巢基因工程细胞株，利用二氢叶酸还原酶缺陷型中华仓鼠卵巢细胞(CHO-dhfr^-)作为宿主细胞，经筛选、扩增后得到稳定、高效表达AcAP5的细胞株，表达量最高达到12mg/L·72h。

本实施方式高效分泌表达AcAP5的中国仓鼠卵巢基因工程细胞株的构建方法具体如下：

酶切反应条件：37℃放置3小时，将酶切产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳，目的片段用DNA GEL EXTRACTION KIT纯化回收，得到插入片段。

二、质粒载体双酶切：用BamHI和NotI双酶切消化质粒载体pcDNA3.1/V5-His-C(购自Invitrogen公司)，反应体系如下：

酶切反应条件：37℃放置3小时，将酶切产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳，再用DNA GELEXTRACTION KIT纯化回收，得到酶切后的质粒载体。

三、DNA片段的连接：反应体系如下：

连接反应条件：16℃放置过夜，连接反应产物转化感受态细胞E.coli Top10(购自天津天有利科技有限公司)，采用菌落PCR的方法筛选阳性菌落，并进一步提取重组质粒DNA进行测序，测序结果表明无碱基的错误，未改变载体阅读框，方向相同(如图1)。BamHI、NotI和DNA连接酶购自NEB公司。

四、细胞培养：

二氢叶酸还原酶缺陷型中国仓鼠卵巢细胞CHO-dhfr^-由哈尔滨医科大学病理教研室赠予，用含100mL/L胎牛血清(FBS)、NAA、1×HT的DMEM培养基(购自GIBCO公司)培养。

五、重组质粒转染CHO：

将构建好的重组质粒pcDNA3.1/V5-His-C-AcAP5与质粒pDCH1P11混合，使用Lipofeetmine^TM 2000Reagent(购自Invitrogen公司)共转染CHO-dhfr^-细胞，在24孔板中进行转染，细胞达到95％融合时，将培养基更换为无抗生素、无血清的CHO-S-SFM II，500μL/孔，转染6h后更换含100mL/L FBS的CHO-S-SFM II(不含HT、NAA)1mL，继续培养48h，用ELISA试剂盒(购自R&D公司)鉴定阳性转染的细胞按1∶10传代，24h细胞贴壁后更换为选择性培养基(不含HT、NAA，但含0.75mg/L的G418(购自上海浩然生物技术有限公司)，100mL/L的FBS)，培养14～16d后有阳性克隆形成(因培养基中不含HT，故存活细胞为成功共转染的细胞)；然后用定向消化的方法将阳性克隆转入24孔板，又传代至12孔板，经ELISA试剂盒测定对阳性克隆中10株高表达的细胞克隆进行扩大培养。

六、MTX的加压培养：待细胞长成单层，取培养3d的上清用ELISA试剂盒检测，以MTX(氨甲喋呤)加压筛选，浓度依次为2×10^-8mmol/L、1×10^-7mmol/L和5×10^-7mmol/L，最终得到能够在5×10^-7mmol/L的MTX中正常生长的CHO细胞株，即为高效分泌表达AcAP5的中国仓鼠卵巢基因工程细胞株。

本实施方式的阳性克隆的RT-PCR鉴定试验，具体方法为：收集MTX加压筛选后的细胞，以TRIzol进行细胞总RNA的提取，RNA反转录后以P1和P2为引物进行PCR扩增，PCR反应条件为：95℃预变性5min；94℃30s，51℃30s，72℃30s，共30个循环；再72℃最终延伸5min。

上游引物P1：5′-AGTGCGGCGAGAACGAGTGG-3′

下游引物P2：5′-CGATGACGGTGTCGCGGTAGAA-3′

试验结果如图2所示，泳道1为DNA marker，泳道2为阳性克隆的RT-PCR产物，泳道3为未转染的细胞。对未转染pcDNA3.1/V5-His-C-AcAP5和pDCH1P11的CHO细胞进行扩增后无条带。由于CHO细胞自身并无AcAP5 mRNA形式存在，所以未转染细胞无相应片段被扩增。而稳定转染的细胞株中扩增出295bp的片段，表明目的片段已完整的整合到CHO细胞中，有目的基因的转录。

重组AcAP5蛋白表达水平的检测试验，具体方法为：分别对2×10^-8mmol/L、1×10^-7mmol/L和5×10^-7mmol/L三个不同浓度MTX加压培养后的细胞株培养72h，之后取培养液上清，用ELISA试剂盒测定重组AcAP5蛋白含量。检测结果如下：

MTX浓度(mmol/L)	重组AcAP5蛋白表达量(mg/L)
		MTX^-	0.1-0.3
2×10^-8	1.0-3.0
		1×10^-7	5.0-8.0
5×10^-7	9.0-12.0

抗凝蛋白AcAP5抗大鼠血栓的实验，具体方法为：取SD大鼠40只(SD大鼠体重为270-330g购于哈尔滨医科大学附属第二医院实验动物中心)，随机分为5组，每组8只，分别模型对照组、阳性药对照组、AcAP5低剂量组、AcAP5中剂量组和AcAP5高剂量组。阳性药选用肝素钠注射液(给药剂量为1650U/kg，肝素钠注射液购自上海第一生化药业有限公司，国药准字H31022051，批号：091104)，AcAP5低剂量组、AcAP5中剂量组和AcAP5高剂量组(5倍递增)的给药剂量分别为40μg/kg、200μg/kg和1mg/kg。全部由静脉注射给药，经静脉注射给药后，立即将分离好的颈动脉置于YLS-14B小动物血栓生成仪的探测接头内，启动血栓生成仪，用恒流直流电刺激(1mA)。记录探头通过红外扫描测量血液的流通量并换算出血管堵塞程度(测量的时间间隔为4s，以百分数表示数据，全部过程持续5min)。将所有数据以

表示，采用SPSS17.0统计软件进行统计分析，采用单因素方差分析及SNK-q检验。其中血栓生成仪为YLS-14B小动物血栓生成仪，购自济南益延科技发展有限公司。

AcAP5抗大鼠颈总动脉血栓的效果[n，

％]如下表所示：

组别	n	给药剂量	颈总动脉的堵塞程度(％)
				模型对照组	8	0μg/kg	100.00±0.00
阳性药对照组	8	1650U/kg	49.45±39.62
				AcAP5低剂量组	8	40μg/kg	38.53±43.15^*
AcAP5中剂量组	8	200μg/kg	25.74±42.68^*
				AcAP5高剂量组	8	1mg/kg	11.48±13.66^**

与模型对照组比较：^*P＜0.05，^**P＜0.01。

结果表明：模型对照组的颈动脉堵塞程度与AcAP5低、中、高3个剂量组比较差异均有统计学意义。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤一所述带有信号肽的AcAP5基因的序列如SEQ ID NO：1所示。其它与具体实施方式一相同。

本实施方式带有信号肽的AcAP5基因的序列由上海生工公司合成。

本实施方式带有信号肽的AcAP5基因的序列根据Genbank中犬钩虫(Ancylostomacaninum)的mRNA序列(Aceession：U30795)的原始序列，去掉原始信号肽序列，同时根据表达系统的特点选择CHO-dhft^-偏爱密码子。为了使转录和翻译效率最高，同时使表达产物分泌到细胞外，在原始序列5’端加上Kozak序列和信号肽，在原始序列两端分别加上限制性内切酶BamHI和NotI的位点。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤一所述带有信号肽的AcAP5基因中加入的信号肽的基因序列如SEQ ID NO：2所示。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式四：本实施方式高效分泌表达AcAP5的中国仓鼠卵巢基因工程细胞株的表达产物的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。

Claims

1.高效分泌表达AcAP5的中国仓鼠卵巢基因工程细胞株，其特征在于利用二氢叶酸还原酶缺陷型中华仓鼠卵巢细胞作为宿主细胞，经筛选、扩增后得到稳定、高效表达AcAP5的细胞株，具体方法按以下步骤进行：

酶切反应条件为37℃放置3小时，然后将酶切产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳，再用DNAGEL EXTRACTION KIT纯化回收，得到酶切后的质粒载体；

三、DNA片段的连接，反应体系如下：

2.根据权利要求1所述的高效分泌表达AcAP5的中国仓鼠卵巢基因工程细胞株，其特征在于步骤一所述带有信号肽的AcAP5基因的序列如SEQ ID NO：1所示。

3.根据权利要求1所述的高效分泌表达AcAP5的中国仓鼠卵巢基因工程细胞株，其特征在于步骤一所述带有信号肽的AcAP5基因中加入的信号肽的基因序列如SEQ ID NO：2所示。

4.权利要求1所述高效分泌表达AcAP5的中国仓鼠卵巢基因工程细胞株的表达产物的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。