CN101514231A - 靶向性抗血栓形成的融合蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种靶向性抗血栓形成的融合蛋白，包括以下部分：(a)线虫抗凝血肽5功能结构域，其氨基酸序列与SEQ ID NO.1所示序列具有至少80％相同性；(b)水蛭肽功能结构域，其氨基酸序列与SEQ ID NO.2所示序列具有至少80％相同性；(c)RGD肽功能结构域，由3～10个氨基酸组成且含有Arg－Gly－Asp序列；(d)人凝血因子Xa识别位点，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；还公开了编码该融合蛋白的基因、含有该基因的重组表达载体、含有该重组表达载体的转化体以及制备该融合蛋白的方法；所得融合蛋白能从多个途径抑制血栓的形成及发展，并且能够靶向性地在血栓部位发挥作用，适用于预防和治疗血栓性疾病。

Description

靶向性抗血栓形成的融合蛋白及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种融合蛋白，特别涉及一种靶向性抗血栓形成的融合蛋白，还涉及该融合蛋白的制备方法和应用。

背景技术

在生理条件下，人体内的止血和凝血系统与抗凝血和纤维蛋白溶解系统处于动态平衡状态，是机体维持体内血液循环流动和防止血液丢失的关键。只要其中一个系统的作用发生异常，即可导致出血性疾病或血栓性疾病。血栓性疾病包括静脉血栓性和动脉血栓性疾病，如深层静脉血栓、急性心肌梗死、不稳定型心绞痛、急性或慢性血管内凝血、肝素引起的血小板减少症、血栓溶解后再栓塞等，严重危害人类生命和健康，已成为人类死亡与致残的主要原因，同时也是造成劳动力丧失、生活质量下降与疾病负担增加的主要原因，严重阻碍了经济发展与人民生活水平的进一步提高。因此，血栓性疾病的防治研究具有十分重要的意义，疗效好且毒副作用低的抗血栓药物的研制更是临床的迫切要求。

血栓的形成主要与血管受损、血液改变和/或血流瘀滞有关，其实质是血液中可溶性的纤维蛋白原在凝血酶的作用下转变成不溶性的纤维蛋白析出，再网络血小板和红细胞而形成。目前，血栓性疾病的防治策略主要集中在阻止凝血酶的产生、抑制凝血酶的活性、抑制血小板的聚集或促进血栓中纤维蛋白的溶解等方面。

线虫抗凝血肽5(nematode anticoagulant peptide 5，NAP5)是从犬钩虫(Ancylostoma caninum)中分离出的一种抗凝多肽，是凝血因子Xa(factor Xa，FXa)的高效特异性抑制剂。FXa是内源性和外源性凝血途径的交汇点，在凝血过程中处于关键和核心位置。研究表明，NAP5是通过直接结合于FXa的催化活性位点，干扰FXa的催化活性，阻止凝血酶的产生而起到抗血栓形成的作用。其抗凝活性高于水蛭素，具有较好的开发应用潜力，目前已作为新型抗凝抗栓药物进入临床试验，但NAP5的天然来源非常有限，提取工艺繁琐，产量低，而且对已经产生的凝血酶无效，在一定程度上限制了其应用。

水蛭素(hirudin，HV)是从水蛭(Hirodo)唾液腺分泌物中分离出的一种酸性多肽，是目前发现的最有效的凝血酶抑制剂，其C端12肽是具有抗凝血酶功能的最小结构片段。它能与纤维蛋白原竞争性地结合凝血酶，抑制凝血酶的活性，阻断纤维蛋白形成，从而防止血栓的形成和发展。其效果明显优于肝素，而又无肝素诱导的血小板减少症，但其生物半衰期短，出血副作用强且功能单一，只能防治静脉血栓而对动脉血栓无效，在应用上也存在较大的局限性。

RGD肽是一类含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp)序列的短肽，是细胞外基质和血液中多种粘附蛋白所共有的细胞粘附识别位点。血小板膜糖蛋白(GP)II b2 IIIa复合物在血小板活化后形成粘附分子受体，其能识别纤维蛋白原配体上的RGD序列而与纤维蛋白原结合，是血小板聚集和血栓形成的最后共同通路。利用RGD肽竞争性地阻断GP II b2IIIa与纤维蛋白原的结合，从而抑制血小板的聚集，是防治血栓性疾病特别是动脉血栓性疾病的一种有效手段。

在抗血栓新药研究领域，要开发出一个全新的抗血栓药物是非常困难的，目前的研究热点大都集中在对现有药物的改造和几种药物的优势组合方面。近年来的研究表明，许多抗凝血、抗血小板、溶栓和靶向成分具有互补和协同增效作用，利用融合蛋白技术将其组合连接，所得融合蛋白可能比各成分单独或联合使用具有更好的复合活性或能显著降低毒副作用，这已成为抗血栓药物发展的一个新方向。

发明内容

有鉴于此，为克服现有技术存在的不足，本发明的目的之一在于提供一种靶向性抗血栓形成的融合蛋白，功能全面，能从多个途径抑制血栓的形成及发展，并且能够靶向性地在血栓部位发挥作用，可在发挥更好的复合活性的同时尽可能地降低毒副作用，适用于预防和治疗各种静脉血栓性疾病和动脉血栓性疾病，且效果良好。

为达到此目的，在本发明的第一方面，提供了一种靶向性抗血栓形成的融合蛋白，包括以下部分：

(a)NAP5功能结构域，其氨基酸序列与SEQ ID NO.1所示序列具有至少80％相同性；

(b)水蛭肽功能结构域，其氨基酸序列与SEQ ID NO.2所示序列具有至少80％相同性；

(c)RGD肽功能结构域，由3～10个氨基酸组成且含有Arg-Gly-Asp序列；

(d)人FXa识别位点，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

进一步，所述NAP5功能结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，水蛭肽功能结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，RGD肽功能结构域由Arg-Gly-Asp组成；

进一步，所述NAP5功能结构域的C末端与水蛭肽功能结构域的N末端通过人FXa识别位点连接，水蛭肽功能结构域的C末端与RGD肽功能结构域的N末端直接连接；

进一步，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

SEQ ID NO.1所示序列为NAP5的氨基酸序列，由77个氨基酸组成；SEQ IDNO.2所示序列为水蛭肽(水蛭素第53～64位氨基酸)的氨基酸序列，由12个氨基酸组成。在本发明的融合蛋白中，NAP5功能结构域选自NAP5或其功能等同物；水蛭肽功能结构域选自水蛭肽或其功能等同物。所述功能等同物是指具有相同生物活性的由原多肽衍生的多肽。在本领域中，氨基酸序列与原多肽序列具有至少80％相同性的衍生多肽，通常不会改变原多肽的生物活性。这些衍生蛋白包括但不限于：在原多肽的氨基酸序列中经过取代、缺失和/或添加一个或多个氨基酸的多肽。

为了便于融合蛋白的分离纯化，在融合蛋白的N末端或C末端可以融入标签蛋白，如谷胱甘肽转移酶(GST)标签、组氨酸(6×His)标签、麦芽糖结合蛋白(MBP)标签或Strep(II)标签等。在本发明的融合蛋白中，标签蛋白优选组氨酸标签。为了便于在融合蛋白纯化后切除其末端的标签蛋白，在融合蛋白和标签蛋白之间还可以引入蛋白酶的酶切位点，如肠激酶(EK)的酶切位点、烟草蚀斑病毒(TEV)蛋白酶的酶切位点、TAGZyme系统的酶切位点、SUMO蛋白酶的酶切位点或PreScission蛋白酶的酶切位点等。在本发明的融合蛋白中，蛋白酶的酶切位点优选EK酶切位点。SEQ ID NO.4所示序列由112个氨基酸组成，其中，第1～6位氨基酸为组氨酸标签，第7～11位氨基酸为EK酶切位点，第12～16位为五肽序列，第17～93位氨基酸为NAP5功能结构域，第94～97位氨基酸为人FXa识别位点，第98～109位氨基酸为水蛭肽功能结构域，第110～112位氨基酸为RGD肽功能结构域。

本发明的目的之二在于提供编码所述融合蛋白的基因，为后期构建重组表达载体、制备所述融合蛋白及研究其生物活性等提供必要的基础。

为达到此目的，在本发明的第二方面，提供了编码所述融合蛋白的基因。

进一步，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

根据所述融合蛋白的氨基酸序列和基因工程宿主细胞的密码子偏好性，可以确定所述融合蛋白的编码基因序列；根据表达载体上的多克隆位点特征，可以进一步在编码基因序列两端增加限制性内切酶的酶切位点，设计所述融合蛋白的基因序列，以便于构建重组表达载体。在本发明中，编码所述融合蛋白的基因优选由SEQ ID NO.5所示序列组成的多核苷酸。SEQ ID NO.5所示序列由358个核苷酸组成，开放阅读框为第9～347位核苷酸，编码由SEQ ID NO.4所示序列组成的融合蛋白；第3～8位和第348～355位核苷酸分别为EcoRI和NotI酶切位点，第1～2位和第356～358位核苷酸分别为5’端和3’端保护序列。该基因序列是根据毕赤酵母的密码子偏好性和毕赤酵母表达载体pPIC9K上的多克隆位点特征而设计。

本发明的目的之三在于提供包含所述基因的重组表达载体。

为达到此目的，在本发明的第三方面，提供了包含所述基因的重组表达载体。

采用基因工程技术表达的融合蛋白可以存在于宿主细胞内，也可以从宿主细胞中分泌出来，优选的表达方式是从宿主细胞中分泌出来，以简化融合蛋白的分离纯化过程；分泌信号肽可使细胞有效地将外源蛋白分泌至细胞外，将融合蛋白基因序列插入分泌信号肽序列的下游，即可达到使表达的融合蛋白分泌至胞外的目的。为保证融合蛋白能形成正确的折叠和空间构象，融合蛋白最好是以可溶形式表达。编码融合蛋白的基因，插入至宿主细胞的染色体中。在本发明中，表达载体优选酵母表达载体，更优选毕赤酵母表达载体，最优选毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K。

本发明的目的之四在于提供包含所述重组表达载体的转化体，为制备所述融合蛋白及研究其生物活性等提供有力的工具。

为达到此目的，在本发明的第四方面，提供了包含所述重组表达载体的转化体。

表达融合蛋白的宿主细胞可以是细菌、酵母、动物细胞或植物细胞。在本发明中，宿主细胞优选酵母，更优选毕赤酵母，最优选毕赤酵母GS115。巴斯德毕赤酵母表达系统作为一种高效表达系统，和其它原核、真核表达系统相比，具有许多优点：具有强有力的醇氧化酶基因(AOX)启动子，可严格调控外源蛋白的表达，表达量高；将外源蛋白基因整合到宿主染色体上进行整合型表达，稳定性好；可分泌表达外源蛋白且自身分泌蛋白量少，有利于目的蛋白的纯化；具有真核生物的亚细胞结构和糖基化、脂肪酰化、蛋白磷酸化等翻译后修饰加工功能；发酵工艺成熟、易放大，培养基不含蛋白、成本低廉，适合于工业化生产。

本发明的目的之五在于提供一种制备所述融合蛋白的方法，操作简便、成本低廉，所得融合蛋白收率高、质量好。

为达到此目的，在本发明的第五方面，提供了一种制备所述融合蛋白的方法，包括以下步骤：在适合表达所述融合蛋白的条件下，培养所述转化体，诱导其表达所述融合蛋白，再对表达产物进行分离、纯化，最终获得所述融合蛋白。

表达的融合蛋白可利用物理、化学或其它特性通过各种方法进行分离和纯化。这些方法是本领域技术人员所熟知的，包括但不限于：复性处理、用蛋白沉淀剂处理、离心、渗透破菌、超声处理、分子筛层析、离子交换层析、高效液相层析、亲和层析等方法及这些方法的结合。

本发明的目的之六在于提供所述融合蛋白的应用。

为达到此目的，在本发明的第六方面，提供了所述融合蛋白在制备预防和/或治疗血栓性疾病的药物中的应用。

本发明的融合蛋白具有靶向性抗血栓形成活性。有效量的融合蛋白可以和药学上可接受的载体组合，或者，与其它具有抗血栓活性的天然药物提取物和/或化学合成药物和药学上可接受的载体组合，制成预防和/或治疗血栓性疾病的药物。

此外，本发明的融合蛋白还具有抗炎、抗增殖和抗纤维化等多种药理活性：能防止肿瘤细胞的转移，配合化学治疗和放射治疗可促进肿瘤中的血流量而增强疗效；能抑制凝血酶在急性脑出血时对脑组织的损伤作用；能减轻凝血酶所致的脑组织水肿和离子含量的变化，阻断凝血酶对血脑屏障的破坏作用；能抑制凝血酶介导的神经细胞凋亡和刺激小胶质细胞活化、增生、分泌细胞因子等作用；能降低蛋白尿，改善肾功能，降低血脂等。

本发明的有益效果在于：

(1)本发明将FXa抑制剂NAP5、凝血酶抑制剂水蛭肽和抗血小板聚集的RGD肽进行有机重组，研制出抗血栓形成的融合蛋白，功能全面，不仅可以阻止凝血酶的产生，防止纤维蛋白和血细胞结合形成血凝块，而且可以抑制已存在的凝血酶(包括游离的和结合在血凝块上的凝血酶)的活性，还可以阻止血小板的聚集，通过各组分的优势组合达到了效益的最大化，能够从多个途径阻断血栓的形成及发展，更高效地达到抗血栓效果，适用于各种静脉血栓性疾病和动脉血栓性疾病的预防和治疗，效果良好。

(2)FXa在血栓部位的活性显著高于其它部位，能特异地识别FXa识别位点并切除其下游片段。本发明通过重组的方法将FXa识别位点融入水蛭肽的N末端，进一步获得靶向性抗血栓形成的融合蛋白，在融合蛋白到达血栓部位前，水蛭肽的N末端被封闭，抗凝活性丧失，可避免全身出血副作用的发生，而且水蛭肽的分子量被增大，体内代谢速度减缓，半衰期延长，可降低使用剂量或减少使用频率；当融合蛋白到达血栓部位后，被大量高活性的FXa特异性识别并切割，水蛭肽被释放并在血栓部位富集，可更好地发挥抗凝血酶功能，增强作用的靶向性，而且水蛭肽的释放量和活性强度受FXa数量和活性的控制，可以实现融合蛋白作用强度的自我调节。

(3)本发明通过重组的方法将FXa识别位点作为连接肽引入NAP5和水蛭肽之间，在物理上将NAP5和水蛭肽分隔开来，有利于二者各自形成正确的折叠和空间构象，消除二者之间可能存在的相互干扰，便于二者充分发挥各自的作用。

(4)本发明的融合蛋白分子量小，且在血栓部位裂解成两个片段：NAP5片段、水蛭肽与RGD肽片段，分别发挥作用，免疫原性和毒性相对较小，安全。

(5)本发明提供了编码所述融合蛋白的基因，为后期构建重组表达载体和转化体、制备所述融合蛋白以及研究所述融合蛋白的生物活性等提供了必要的基础。

(6)本发明成功构建了所述融合蛋白的重组表达载体和转化体，实现了所述融合蛋白的高效、稳定和分泌性表达，为制备所述融合蛋白、开展所述融合蛋白的功能研究和抗血栓药物研究等提供了有力的工具。

(7)本发明还提供了一种制备所述融合蛋白的方法，操作简便，成本低廉，所得融合蛋白收率高、质量好，适合于工业化生产。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中：

图1为本发明融合蛋白基因的琼脂糖凝胶电泳鉴定图；

图2为本发明重组表达载体pPIC9K/339的构建示意图；

图3为本发明融合蛋白的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定图；

图4为经EK和FXa酶切的本发明融合蛋白的琼脂糖凝胶电泳鉴定图；

图5为本发明融合蛋白的免疫蛋白印迹(Western blot)鉴定图。

具体实施方式

以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

一、融合蛋白基因的制备

根据融合蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO.4)、毕赤酵母的密码子偏好性和毕赤酵母表达载体pPIC9K上的多克隆位点特征设计并合成如下聚合酶链式反应(PCR)引物P1～P8(SEQ ID NO.6～13)：

P1：5′-cggaattccatcatcatcatcatcatgatgatgatgataagcaaagaccagctaagaag-3′

P2：5′-ccacaatcatccaaccattcgttttcaccacattctgggtaagccttcttagctggtct-3′

P3：5′-ggttggatgattgtggtactcaaaagccatgtgaagctaagtgtaacgaagaaccacca-3′

P4：5′-caacaaacaacctctagatctacaaattggatcttcttcttctggtggttcttcgtt-3′

P5：5′-tctagaggttgtttgttgccaccagcttgtgtttgtaaggatggtttttacagagatac-3′

P6：5′-tgttgatcacattcttcttctctaacacaatcaccaataacagtatctctgtaaaaa-3′

P7：5′-aagaatgtgatcaacatgaaattattcatgttattgaaggtagagattttgaaccaatt-3′

P8：5′-taagcggccgcttaatcacctctttcatcgtaagcatcttctggaattggttcaaaatc-3′

其中，P1的5’端下划线部分为EcoRI酶切位点，P8的5’端下划线部分为NotI酶切位点；P1的3’端下划线部分与P2的3’端下划线部分、P2的5’端下划线部分与P3的5’端下划线部分、P3的3’端下划线部分与P4的3’端下划线部分、P4的5’端下划线部分与P5的5’端下划线部分、P5的3’端下划线部分与P6的3’端下划线部分、P6的5’端下划线部分与P7的5’端下划线部分、P7的3’端下划线部分与P8的3’端下划线部分分别互补。

采用Pyrobest^TMDNA Polymerase PCR试剂盒(Takara公司)，通过三轮PCR拼接，制备融合蛋白基因(SEQ ID NO.5)：

第一轮PCR：分别以引物P1与P2、P3与P4、P5与P6或P7与P8为上、下游引物进行PCR扩增，获得DNA 1～4，反应体系为：上、下游引物各50pmol、dNTP混合物40nmol、10×PCR反应缓冲液5μL，Taq酶2U、双蒸水补充至总体积为50μL；反应条件为：首先，温度95℃预变性5分钟；其次，温度94℃变性1分钟，55℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，共32个循环；最后，温度72℃延伸10分钟；

第二轮PCR：以DNA 1和DNA 2为模板，以引物P1与P4为上、下游引物进行PCR扩增，获得DNA 5；以DNA 3和DNA 4为模板，以引物P5与P8为上、下游引物进行PCR扩增，获得DNA 6，反应体系与反应条件与第一轮PCR相同；

第三轮PCR：以DNA 5和DNA 6为模板，以引物P1与P8为上、下游引物进行PCR扩增，获得所述融合蛋白基因，反应体系与反应条件与第一轮PCR相同。

第三轮PCR产物采用质量百分浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，结果如图1所示，其中M泳道为DNA分子量标准，1和2泳道为第三轮PCR产物，从图可知，第三轮PCR产物在约358bp的位置出现一条特异性DNA条带，与目的片段预期大小相符；鉴定正确的第三轮PCR产物采用DNA凝胶回收试剂盒(上海博亚生物技术有限公司)切胶回收纯化约358bp的目的片段，获得融合蛋白基因。

二、重组表达载体的构建

重组表达载体pPIC9K/339的构建如图2所示，将所得融合蛋白基因用EcoRI和NotI(Takara公司)进行双酶切，双酶切产物采用DNA凝胶回收试剂盒切胶回收纯化约339bp的目的片段，再与同样经EcoRI和NotI双酶切的毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K(Invitrogen公司)在T4 DNA连接酶(Takara公司)的作用下进行连接，连接产物转化入大肠杆菌JM109(Takara公司)感受态细胞，用含有氨苄青霉素(Roche公司)的LB平板筛选阳性转化体，再用质粒小量制备试剂盒(北京百泰克生物技术有限公司)提取质粒，委托上海英骏生物技术有限公司进行测序，测序结果显示在pPIC9K质粒的EcoRI和NotI位点之间插入有与SEQ ID NO.5所示序列第9～347位核苷酸一致的DNA片段，表明重组表达载体pPIC9K/339构建成功。

三、工程酵母的构建

将所得重组表达载体pPIC9K/339用SalI(Takara公司)酶切使线性化后，用电穿孔法转化入毕赤酵母GS115(Invitrogen公司)感受态细胞，用不含组氨酸(His)的MDS平板筛选阳性转化体，所得阳性转化体进一步采用G418筛选法，在含有不同浓度的G418(Roche公司)的YPD平板上筛选高拷贝转化体，所得高拷贝转化体采用质粒小量制备试剂盒提取质粒，PCR法进行鉴定：以提取的质粒为模板，以引物P1与P8为上、下游引物进行PCR扩增，反应体系和反应条件与前述第一轮PCR相同，所得PCR产物进行质量百分浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳，在约339bp的位置出现一条特异性DNA条带，表明所得高拷贝转化体的质粒中含有融合蛋白基因，所得高拷贝转化体即为构建成功的高表达工程酵母，用甘油于温度-80℃冻存备用。

四、融合蛋白的制备

将所得工程酵母接种至YPD平板上进行活化，再挑取外观优良的单菌落接种至BMGY培养基中，在温度30℃、振摇速度280r/min的条件下培养18小时至OD₆₀₀≈1，离心，弃上清液，用无菌水重悬洗涤菌体，重复洗涤两次，再将菌体以MM培养基重悬，在温度30℃、振摇速度300r/mi n的条件下培养48小时(每24小时补加无菌甲醇至最终体积百分浓度为1.0％)，离心，收集上清液，超滤离心(浓缩、脱盐并更换缓冲液)，所得超滤产物用HiTrap^TM Chelating HPColumns(Pharmacia公司)进行亲和层析纯化，获得融合蛋白，用BCA蛋白定量试剂盒(北京天泰生物公司)测定其浓度为0.9mg/mL。

取超滤产物和洗脱产物，用SDS-PAGE进行鉴定，结果如图3(a)和(b)所示，其中M泳道为蛋白质分子量标准，1’泳道为超滤产物，2’泳道为未被亲和层析柱吸附的洗脱产物，1～3泳道为被亲和层析柱吸附的依次洗脱产物，从图可知，3泳道的洗脱产物在分子量约20kD处有明亮的特异性蛋白条带，与融合蛋白的预期分子量大小一致，含杂蛋白少，纯化效果好。

取融合蛋白，分别用EK(NEC公司)和FXa(Promega公司)酶切，酶切产物用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，结果如图4所示，其中M泳道为蛋白质分子量标准，1泳道为融合蛋白，2泳道为EK酶切产物，3泳道为EK和FXa双酶切产物，从图可知，融合蛋白可以被EK和Fxa酶切，酶切片段大小与预期分子量大小吻合。

取融合蛋白，进行SDS-PAGE，电泳完毕后电转移至硝酸纤维素膜上，洗膜封闭后加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗组氨酸标签单克隆抗体，置温度37℃孵育1小时，洗膜后显色，进行Western blot鉴定，结果如图5所示，其中1泳道为超滤产物，2泳道为未经诱导表达的对照样品，3泳道为融合蛋白，M泳道为蛋白质分子量标准，从图可知，工程酵母在用甲醇诱导前不表达融合蛋白，用甲醇诱导后可以表达融合蛋白。

五、融合蛋白的生物活性鉴定

1、抗血小板聚集活性测定

取健康成年男性静脉血3mL，按体积比为9∶1加入质量百分浓度为3.8％的枸橼酸钠，700r/min离心10分钟，收集上清，得富血小板血浆(PRP)，剩余部分再以4000r/min离心15分钟，收集上清，得贫血小板血浆(PPP)；用PPP稀释PRP使血小板数量为25×10⁴～30×10⁴/μL，作为PRP试剂；用血小板聚集仪进行测定，先用PPP 200μL调零；样品组：取PRP试剂各200μL，分别加入不同浓度的经FXa过量酶切的融合蛋白5μL使其终浓度为0.01μg/mL、0.10μg/mL、5.00μg/mL以及未经FXa酶切的融合蛋白5μL使其终浓度为0.10μg/mL，室温静置15分钟，加入预热至温度37℃的浓度为200μmol/L的二磷酸腺苷(ADP)5μL，测定最大聚集率；同时设对照组：以生理盐水5μL替代融合蛋白；按下述公式计算血小板聚集抑制率：血小板聚集抑制率(％)＝(对照最大聚集率-样品最大聚集率)/对照最大聚集率×100％。

结果见表1，从表1可知，经FXa过量酶切的融合蛋白在浓度为0.10μg/mL时抗血小板聚集活性为39.0％，已经达到饱和，而未经FXa酶切的融合蛋白在浓度为0.10μg/mL时抗血小板聚集活性为35.6％，二者活性差别较小，表明本发明的融合蛋白具有很好的抗血小板聚集活性。

表1、本发明融合蛋白抗血小板聚集活性测定结果

2、血浆凝血酶原时间(PT)、血浆凝血酶原国际标准化比率(INR)和活化部分凝血酶时间(APTT)测定

取健康成年男性静脉血10mL，按体积比为9∶1加入质量百分浓度为3.8％的枸橼酸钠，4000r/min离心15分钟，收集上清，得贫血小板血浆(PPP)；取经不同处理的本发明融合蛋白，分别制备下述样品：①经EK完全酶切的融合蛋白，用生理盐水稀释成一系列浓度，如表2所示；②未经酶切、③经EK完全酶切、④经EK完全酶切和FXa不完全酶切、⑤经EK完全酶切和FXa过量酶切的融合蛋白，分别用PPP稀释至浓度为5.00μg/mL，同时设对照(用天然水蛭素替代融合蛋白)；用TYXN-96多功能智能血液凝集仪分别测定PT、INR和APPT。

结果见表2和表3，从表2可知，经EK完全酶切的融合蛋白(水蛭肽活性被封闭，仅显示NAP5活性)在浓度为2.50～5.00μg/mL(即193.8～387.6nmol/L)时的PT值约为空白对照(浓度为0.00μg/mL)的2倍；在浓度低于2.5μg/mL(即193.8nmol/L)时的APPT值即可达到空白对照的2倍，这与文献报道的NAP5活性浓度为50～500nmol/L一致，表明本发明的融合蛋白对内、外源凝血途径均有抑制作用，具有较好的抗凝活性，且抗凝活性与融合蛋白量呈正相关；从表3可知，在相同浓度的经不同处理的本发明融合蛋白中，经EK完全酶切的融合蛋白抗凝活性最强，随着FXa酶切程度的逐渐加大(水蛭肽被逐渐释放)，融合蛋白的抗凝活性逐渐降低，经FXa过量酶切的融合蛋白(NAP5活性被封闭，仅显示水蛭肽活性)的PT值与天然水蛭素相近；上述结果模拟了给予融合蛋白后的体内凝血过程，起初，抗凝以NAP5为主力，其作用于FXa的活性中心，抑制凝血酶原转化为凝血酶；之后，随着FXa含量增加，NAP5不再起主要作用，而水蛭肽被逐渐释放，成为抑制凝血酶的主力。

表2、经EK完全酶切的融合蛋白测定结果

表3、经EK完全酶切、FXa不完全酶切或过量酶切的融合蛋白测定结果

3、抗凝血酶活性测定

根据文献方法(陈华友等.凝血酶滴定法测定水蛭素活性的改进.生物技术，第12卷第6期，24～25，2002年12月)进行抗凝血酶活性测定；样品A为经EK完全酶切后的融合蛋白，浓度为0.7mg/mL；样品B为经FXa过量切割的融合蛋白，浓度为0.1mg/mL；样品C为天然水蛭素，浓度为0.1mg/mL。

结果见表4，从表4可知，经EK酶切的融合蛋白抗凝血酶活性极低，证明N末端被封闭的水蛭肽丧失了绝大部分抗凝血酶活性；而经FXa过量酶切后，具有自由N末端的水蛭肽被释放，其抗凝血酶活性得到恢复，与天然水蛭素相比活性稍低，表明本发明融合蛋白抗凝血酶活性较高，且作用具有靶向性。

表4、融合蛋白抗凝血酶活性测定结果

由于FXa、凝血酶和血小板聚集诱发的血液凝固是诱导血管血栓形成的重要因素，因此，基于上述生物活性鉴定结果，可以得出如下结论：本发明融合蛋白中的各成分均能有效地发挥各自的功能，防止纤维蛋白和血细胞结合形成血凝块，并抑制游离的和血凝块上的凝血酶的活性，对内、外源凝血途径均有抑制作用，可以防止各类血栓的形成及发展，适用于预防和治疗静脉血栓性疾病和动脉血栓性疾病，效果良好。

此外，在本发明的优选实施例中，融合蛋白的EK酶切位点和NAP5之间融入了一个五肽，生物活性鉴定结果显示NAP5的抗凝活性未受该五肽的影响，表明本发明的融合蛋白具有进一步修饰改造的空间；从另一角度看，也可以说NAP5功能结构域是由NAP5的衍生蛋白(在NAP5序列的N末端添加有五个氨基酸残基的蛋白，序列相同性为93.9％)组成，生物活性鉴定结果显示该衍生蛋白具有与NAP5相同的抗凝活性，为NAP5的功能等同物，证实在本发明的融合蛋白中，NAP5功能结构域可以选自NAP5或其功能等同物；同理，水蛭肽功能结构域也可以选自水蛭肽或其功能等同物。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

序列表

<110>重庆大学

<120>靶向性抗血栓形成的融合蛋白及其制备方法和应用

<160>13

<210>1

<211>77

<212>PRT

<213>犬钩虫(Ancylostoma caninum)

<400>1

Lys Ala Tyr Pro Glu Cys Gly Glu Asn Glu Trp Leu Asp Asp Cys

  1               5                  10                  15

Gly Thr Gln Lys Pro Cys Glu Ala Lys Cys Asn Glu Glu Pro Pro

                 20                  25                  30

Glu Glu Glu Asp Pro Ile Cys Arg Ser Arg Gly Cys Leu Leu Pro

                 35                  40                  45

Pro Ala Cys Val Cys Lys Asp Gly Phe Tyr Arg Asp Thr Val Ile

                 50                  55                  60

Gly Asp Cys Val Arg Glu Glu Glu Cys Asp Gln His Glu Ile Ile

                 65                  70                  75

His Val

<210>2

<211>12

<212>PRT

<213>水蛭(Hirodo)

<400>2

Asp Phe Glu Pro Ile Pro Glu Asp Ala Tyr Asp Glu

  1               5                  10

<210>3

<211>4

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>3

Ile Glu Gly Arg

  1

<210>4

<211>112

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：靶向性抗血栓形成的融合蛋白

<400>4

His His His His His His Asp Asp Asp Asp Lys Gln Arg Pro Ala

  1               5                  10                  15

Lys Lys Ala Tyr Pro Glu Cys Gly Glu Asn Glu Trp Leu Asp Asp

                 20                  25                  30

Cys Gly Thr Gln Lys Pro Cys Glu Ala Lys Cys Asn Glu Glu Pro

                 35                  40                  45

Pro Glu Glu Glu Asp Pro Ile Cys Arg Ser Arg Gly Cys Leu Leu

                 50                  55                  60

Pro Pro Ala Cys Val Cys Lys Asp Gly Phe Tyr Arg Asp Thr Val

                 65                  70                  75

Ile Gly Asp Cys Val Arg Glu Glu Glu Cys Asp Gln His Glu Ile

                 80                  85                  90

Ile His Val Ile Glu Gly Arg Asp Phe Glu Pro Ile Pro Glu Asp

                 95                 100                 105

Ala Tyr Asp Glu Arg Gly Asp

                110

<210>5

<211>358

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>CDS

<222>(9)...(347)

<220>

<223>人工序列的描述：编码所述靶向性抗血栓形成的融合蛋白的基因

<400>5

cggaattc cat cat cat cat cat cat gat gat gat gat                38

         His His His His His His Asp Asp Asp Asp

           1               5                  10

aag caa aga cca gc t aag aag gct tac cca gaa tgt ggt gaa aac    83

Lys Gln Arg Pro Ala Lys Lys Ala Tyr Pro Glu Cys Gly Glu Asn

                 15                  20                  25

gaa tgg ttg gat gat tgt ggt act caa aag cca tgt gaa gct aag     128

Glu Trp Leu Asp Asp Cys Gly Thr Gln Lys Pro Cys Glu Ala Lys

                 30                  35                  40

tgt aac gaa gaa cca cca gaa gaa gaa gat cca att tgt aga tct     173

Cys Asn Glu Glu Pro Pro Glu Glu Glu Asp Pro Ile Cys Arg Ser

                 45                  50                  55

aga ggt tgt ttg ttg cca cca gct tgt gtt tgt aag gat ggt ttt     218

Arg Gly Cys Leu Leu Pro Pro Ala Cys Val Cys Lys Asp Gly Phe

                 60                  65                  70

t ac aga gat act gtt att ggt gat tgt gtt aga gaa gaa gaa tgt    263

Tyr Arg Asp Thr Val Ile Gly Asp Cys Val Arg Glu Glu Glu Cys

                 75                  80                  85

gat caa cat gaa att att cat gtt att gaa ggt aga gat ttt gaa     308

Asp Gln His Glu Ile Ile His Val Ile Glu Gly Arg Asp Phe Glu

                 90                  95                 100

cca att cca gaa gat gct tac gat gaa aga ggt gat taagcggccgctta  358

Pro Ile Pro Glu Asp Ala Tyr Asp Glu Arg Gly Asp

                105                 110

<210>6

<211>59

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物P1

<400>6

cggaattcca tcatcatcat catcatgatg atgatgataa gcaaagacca gctaagaag 59

<210>7

<211>59

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物P2

<400>7

ccacaatcat ccaaccattc gttttcacca cattctgggt aagccttctt agctggtct 59

<210>8

<211>59

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物P3

<400>8

ggttggatga ttgtggtact caaaagccat gtgaagctaa gtgtaacgaa gaaccacca 59

<210>9

<211>57

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物P4

<400>9

caacaaacaa cctctagatc tacaaattgg atcttcttct tctggtggtt cttcgtt  57

<210>10

<211>59

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物P5

<400>10

tctagaggtt gtttgttgcc accagcttgt gtttgtaagg atggttttta cagagatac    59

<210>11

<211>57

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物P6

<400>11

tgttgatcac attcttcttc tctaacacaa tcaccaataa cagtatctct gtaaaaa    57

<210>12

<211>59

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物P7

<400>12

aagaatgtga tcaacatgaa attattcatg ttattgaagg tagagatttt gaaccaatt 59

<210>13

<211>59

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物P8

<400>13

taagcggccg cttaatcacc tctttcatcg taagcatctt ctggaattgg ttcaaaatc  59

Claims (10)

1、靶向性抗血栓形成的融合蛋白，其特征在于：包括以下部分：

(a)线虫抗凝血肽5功能结构域，其氨基酸序列与SEQ ID NO.1所示序列具有至少80％相同性；

(b)水蛭肽功能结构域，其氨基酸序列与SEQ ID NO.2所示序列具有至少80％相同性；

(c)RGD肽功能结构域，由3～10个氨基酸组成且含有Arg-Gly-Asp序列；

(d)人凝血因子Xa识别位点，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

2、根据权利要求1所述的靶向性抗血栓形成的融合蛋白，其特征在于：所述线虫抗凝血肽5功能结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，水蛭肽功能结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，RGD肽功能结构域由Arg-Gly-Asp组成。

3、根据权利要求2所述的靶向性抗血栓形成的融合蛋白，其特征在于：所述线虫抗凝血肽5功能结构域的C末端与水蛭肽功能结构域的N末端通过人凝血因子Xa识别位点进行连接，水蛭肽功能结构域的C末端与RGD肽功能结构域的N末端直接连接。

4、根据权利要求3所述的靶向性抗血栓形成的融合蛋白，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

5、编码权利要求1所述的靶向性抗血栓形成的融合蛋白的基因。

6、根据权利要求5所述的基因，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

7、包含权利要求5所述的基因的重组表达载体。

8、包含权利要求7所述的重组表达载体的转化体。

9、制备权利要求1所述的靶向性抗血栓形成的融合蛋白的方法，其特征在于：包括以下步骤：在适合表达所述融合蛋白的条件下，培养权利要求8所述的转化体，诱导其表达所述融合蛋白，再对表达产物进行分离、纯化，最终获得所述融合蛋白。

10、权利要求1所述的靶向性抗血栓形成的融合蛋白在制备预防和治疗血栓性疾病的药物中的应用。

Images