JPH07503369A - 血小板及び／又は内皮下層へのｖＷＦの結合の拮抗剤である抗血栓性ポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 血小板及び／又は内皮下層へのｖＷＦの結合の拮抗剤である抗血栓性ポリペプチ ド 本発明は新規な抗血栓性ポリペプチド、その製造及びそれを含む製薬学的組成物 に関する。さらに具体的には、本発明は、フオンビルプラント因子（ｖ　Ｗ　Ｆ 　）の構造から誘導された部分を含み、本質的に血液の血小板及び／又は内皮下 層に結合することができる新規なポリペプチドに関する。

ｖＷＦは２２残基のシグナル配列、７４１残基の“プロ（ｐｒｏ）”領域、及び いくつかの繰り返し構造に組織された２０５０アミノ酸の成熟タンパク質を含む ２８１３アミノ酸のグリコリル化タン／＜り質である［Ｔｉｔａｎｉ　Ｋ、ｅｔ 　ａｌ、、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２５（１９８６）３１７１−３１８４； Ｖｅｒｗｅｉｊ　Ｃ，Ｌ、ｅｔ　ａｌ、、ＥＭＢＯＪ、旦（１９８６）１８３９ −１８４７］。この複合糖タンパク質は生体内で、内皮細胞又は血小板中の特定 の小胞中に保存されて、又は分泌過程の間の分泌及びタンノくり質分解的成熟の 後に血漿中を循環する形態で存在する。ｖＷＦの循環形態は高分子量（最高２０ ゜０００ｋＤａ）マルチマーの形態で存在し、そのプロトマーは約４５０ｋＤａ のダイマーである。ｖＷＦ遺伝子はいくつかの研究チームによりクローニングさ れて配列決定され、染色体１２の短アーム（ｓｈｏｒｔａｒｍ）についてマツピ ングされた［５ａｄｌｅｒ　Ｊ、Ｅ、ｅｔａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃ ａｄ、Ｓｃｉ、８２　（１９８５）６３９４−６３９８；Ｖｅｒｗｅｉｊ　Ｃ， Ｌ、ｅｔ　ａｌ、、ＥＭＢＯＪ、５　（１９８６）１８３９−１８４７：５ｈｅ ｌｔｏｎ−１ｎｌ。

ｅｓ　Ｂ、Ｂ、ｅｔ　ａｌ、、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２５（１９８６）３ １６４−３１７１；Ｂｏｎｔｈｒｏｎ　Ｄ、ｅｔ　ａｌ、、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａ ｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、よヱ（１９８６）７１２５−７１２７；Ｇｉｎｓｂｕｒｇ　 Ｄ、ｅｔ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ　２２８（１９８５）１４０１−１４０６１ ゜ ｖＷＦは、一方で内皮下層のいくつかの成分及び他方で血液の血小板（特に血小 板ＧＰ１ｂレセプター）の間の複雑であまり理解されていない相互作用により、 動脈血栓の発生に随伴する。重要な点は、循環する血漿ｖＷＦは血小板ＧＰ１ｂ レセプターと自然には結合しないことであり、血小板との相互作用の部位のアン マスキングには、例えばｖＷＦのコンフォーメーション変化に続いて内皮下層と の相互作用が必要であると思われる。かくして活性化されたｖＷＦと血小板ＧＰ １ｂレセプターの間の相互作用は、血液の血小板を活性化に導き、その後ある種 の接着性タンパク質（フィブリノゲン、トロンポスポンジン、ｖＷＦなど）の存 在下で血小板は凝集し、線維細胞性血栓を形成する能力を得る。

血小板の活性化におけるｖＷＦの初期の役割に鑑み、ｖＷＦは抗血栓剤の製造の ために選ばれる薬理学的標的となる。しがし薬理学的観点からこの分子を利用す ることができるためには、循環ｖＷＦが血小板に結合できないこと、その血栓発 生活性（ｔｈｒｏｍｂｏｇｅｎｉｃ　ａｃｔｉｖｊｔｙ）においてｖＷＦの異な る接着機能（内皮下層及び血小板）が果すそれぞれの寄与に関する我々の知識の 欠如、治療薬として用いることができるために十分に純粋で均一な産物を十分な 量で生産する困難、ｖＷＦの大きなサイズ及び複雑性、その三次構造の動力学な どの多く、の困難を克服しなければならない。ｖＷＦのいくつかのフラグメント はタンパク質分解的消化により得られ、薬理学的観点から研究された。組み換え フラグメントも生産された［ＥＰ　２５５　２０６：Ｓｕｇｉｍ。

ｔｏ　Ｍ、ｅｔ　ａｌ、、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　３０（１９９１）５２０ ２−５２０９；Ａｚｕｍａ　Ｈ，ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、λ６６　（１９９１）１２３４２−１２３４７１　、これらの研究か ら、得られた分子は完全に満足なものではなく、特にある非生理学的リガンド（ 例えばリストセチン又はポッロセチン）の不在下でｖ　Ｗ　Ｆ−血小板相互作用 の最適拮抗剤として挙動しないか、あるいは他の場合、おそらく血小板ＧＰ１ｂ へのｖＷＦの結合の潜在部位のアンマスキングのために化学的に修飾しなけわば ならない（例えば還元及びアルキル化）ことが明らかになる。

本発明は少なくとも部分的に血小板の活性化に本質的に拮抗できる新規な分子を 提供する。本発明の分子はｖＷＦ構造から誘導された接着部分、及び接着部分の 機能的露呈を可能にし、分子の生体内における安定性及び分布を与える部分を含 む。実際に出願人は、ｖＷＦを事実上タンパク質性の構造に遺伝子的に「カプリ ング（ｃｏｕｐ　］　ｉｎｇ）Ｊさせ、そのような分子を満足できる量で生産す ることが可能であることを示した。さらに本発明の分子はｖＷＦから誘導され、 従って所望の効果に非常に特異的な小さい構造（例えばｖＷＦ−ＧＰ１ｂ相互作 用のみの拮抗剤）を生成し、利用することを可能にする。さらに出願人は、その ようなカプリングがその結合部位におけるこの構造の露呈を促進することを示し た。従って本発明のポリペプチドは、血小板へのｖＷＦの結合に少なくとも部分 的に拮抗し、それにより血小板の活性化を阻害することができる、ｖＷＦから誘 導された構造を安定な構造内で露出することができるようにする。本発明のポリ ペブチｉは、゛１皮下層へのｖＷＦの結合に少なくとも部分的に拮抗することが できる、ｖＷＦから誘導された構造を、安定な構造内で露出することも可能にす る。

従って本発明の主題は血小板及び／又は内皮下層へのｖＷＦの結合に少なくとも 部分的に拮抗することができる、ｖＷＦ構造から誘導された接着部分、及び事実 上タンパク質性であり、安定化及び生体内におけるその露呈を可能にする部分を 含む分子に関する。

さらに特定すると本発明の分子において接着部分はｖＷＦの残基４４５〜７３３ の間にあるペプチド配列全体又は一部、あるいはこの配列の変異体を含む。ｖＷ Ｆのへブチド配列は公開されているので、本発明の分子の接着部分の残基の番号 付けは、Ｔｉｔａｎｉ　ｅｔ　ａｌ、［Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　λ５　（１ ９８６）３１７１−３１８４１により公開されたｖＷＦ配列の番号付けを参照す る。この機能は本発明の分子内に豊富に存在することができると理解される。こ のｖＷＦ配列の一部（残基Ｔｈｒ４７０からＶａ１７１３）を図１に示し、図に おいてそれはヒト血清アルブミンのＣ−末端にカプリングしている。

本発明の目的の場合、変異体という用語は血小板及び／又は内皮下層へのｖＷＦ の結合に少なくとも部分的に拮抗することができる配列の修飾により得られたい ずれの分子をも示す。修飾は、いずれの突然変異、置換、欠失、付加又は例えば 遺伝子工学法を用いて得られる変更も意味すると理解するべきである。そのよう な変異体は、例えば特にその結合部位に関する分子の親和性の向上の目的、その 生産量を増加させる目的、タンパク質分解に対する感受性を低下させる目的、そ の治療効率を向上させるか又は副作用を減少させる目的、あるいはそれに新しい 薬物動態学的又は生物学的性質、例えば特に本質的に非潜在的方法で発現される 接着機能を与える目的などの種々の目的のために生成することができる。

本発明の特に有利なポリペプチドは、接着部分が：（ａ）ｖＷＦの残基４４５〜 ７３３の間のペプチド配列、又は（ｂ）ＧＰｌｂ及び／又は内皮下層へのｖＷＦ の結合に少なくとも部分的に拮抗することができるペプチド配列（ａ）の一部、 又は（ｃ）構造的修飾（突然変異、付加置換、及び／又は１つ又はそれ以上の残 基の欠失）により構造（ａ）又は（ｂ）から誘導され、ＧＰｌｂ及び／又は内皮 下層へのｖＷＦの結合に少なくとも部分的に拮抗することができる構造、又は （ｄ）例えばペプチドバンクから単離され、ＧＰｌｂ及び／又は内皮下層へのｖ ＷＦの結合に少なくとも部分的に拮抗することができる非天然のペプチド配列を 有するポリペプチドである。

さらに特定すると（ｂ）型の構造の中に、ｖＷＦと血小板ＧＰ１ｂの間の相互作 用に拮抗する能力を保持している構造、例えばＭｏｒｉｅｔ　ａｌ、［Ｊ、Ｂｉ ｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６３　（１９８８）１７９０１−１７９０４］により記載の ペプチドＧ１０又はＤ５、あるいはコラーゲン［Ｐａｒｅｔｉ　Ｆ、１．ｅｔ　 ａｌ、、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ。

６１］及び／又はヘパリン［Ｆｕｊ　ｉｍｕｒａ　Ｙ、ｅｔ　ａｌ、Ｊ。

又はボツロセチン［Ｓｕｇｉｍｏｔｏ　Ｍ、ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｂｉ。

１、Ｃｈｅｍ、２６旦（１９９１）１８１７２−１８１７８］　、及び／又はス ルファチド［Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅ　Ｏ，ｅｔ　ａｌ、、Ｂｌ。

Ｏｄ　ヱ旦（１９９１）２３１０−２３１７１及び／又はリストセチンなどに結 合する能力、あるいはこれらの異なる接着機能の間のいずれかの組み合わせを保 持しているペプチドを挙げることができる。

（Ｃ）型の構造は、例えばいくつかのＮ−又はＯ−グリコジル化部位が修飾又は 除去された分子、ならびに１つ、数個、又はすべてのシスティン残基が置換され た分子、あるいは別の場合、ｖＷＦに伴うＩＩＢ型病理学に含まれる少なくとも １つの残基、例えば残基Ａｒｇ５４３、Ａｒｇ５４５、Ｔｒｐ５５０、Ｖａ　Ｉ 　５５３又はＡｒｇ５７８などが影響を受けた点及び／又は多重突然変異体を含 む。それは又、問題の結合部位との相互作用にほとんど又は全く関与しない領域 の欠失により（ａ）又は（ｂ）から得た分子、及び（ａ）又は（ｂ）に対して例 えばＮ−末端メチオニン及び／又は分泌シグナル配列、及び／又は安定化構造へ の結合を可能にするポリペプチドアダプターなどの追加の残基を含む分子も含む 。

例えば・ −その最小変種（ｍｉｎｉｍｕｍ　ｖｅｒｓｉｏｎ）がｖＷＦの残基Ｃｙｓ４７ ４とＰｒｏ４８８の間にあるペプチドＧ１０に対応するＰ１型ペプチドに、又は −その最小変種がｖＷＦの残基Ｌｅｕ６９４とＰｒｏ７０８の間にあるペプチド Ｄ５に対応するＰ２型ペプチドに、又は−その名称がそれぞれ残基Ｐｒｏ４８８ とＬｅｕ６９４の間にあるｖＷＦフラグメント、及び欠失によって得たその変異 体に対応するＸ型又はＸＤ型ペプチドに、又は −Ｘ型及びＸＤ型ペプチドのいずれかの変異分子として定義されるＸ＊型ペプチ ドに、あるいはこれらのペプチドのいずれかの組み合わせ、中でも −ＰＬ−Ｐ２型ペプチド； −Ｐｉ−ＸＳＰｉ−ＸＤ、ＰＬ−Ｘ＊型ペプチドニーＸ−Ｐ２、ＸＤ−Ｐ２、Ｘ ＊−Ｐ２型ペプチド；−Ｐｉ−Ｘ−Ｐ２型ペプチド； −ＰＬ−ＸＤ−Ｐ２型ペプチド。

−ＰＬ−Ｘ＊−Ｐ２型ペプチドニ ー上記で定義され、本発明の分子内で１回以上露呈されるいずれかの接着ペプチ ドにカプリングした安定化構造を含む本発明のポリペプチドを挙げることができ る。

本発明の分子の接着部分は、直接又はペプチドリンカ−を介してタンパク質性安 定化構造にカプリングさせることができる。さらに接着部分は分子のＮ−末端又 はＣ−末端を構成することができる。本発明の分子の場合、接着部分はキメラの Ｃ−末端部分を構成するのが好ましい。

本発明のポリペプチドの安定化構造は、血漿半減期が長いポリペプチドであるの が好ましい。例えばそれはアルブミン、アポリポタンパク質、免疫グロブリン又 はトランスフェリンなどであることができる。そのようなタンパク質から構造的 修飾により誘導されたペプチド、あるいは人工的又は半一人工的に合成された血 漿半減期の長いペプチドも適したペプチドであることができる。さらに用いられ る安定化構造は、本発明のポリペプチドが用いられる生物に関して免疫原性が弱 いか、又は非免疫原性であるポリペプチドであるのがもっと好ましい。

本発明の特に有利な実施態様において、安定化構造はアルブミン又はアルブミン の変異体、例えばヒト血清アルブミン（Ｉ　Ｓ　Ａ）である。アルブミンの変異 体は、ヒト血清アルブミンの与えられた同形をコードする遺伝子の遺伝子工学法 による修飾（突然変異、欠失及び／又は付加）によって得た血漿半減期の長いい ずれのタンパク質、ならびにそのような遺伝子によりコードされるタンパク質の 試験管内修飾によって得た血漿半減期の長いいずれの巨大分子をも示すと理解さ れる。アルブミンは非常に各型性なので、多くの天然の変異体が同定され、挙げ られている［Ｗｅｉｔｋａｍｐ　Ｌ、Ｒ，ｅｔ　ａｌ、、Ａｎｎ、Ｈｕｍ、Ｇｅ ｎｅｔ、３７　（１９７３）２１９］　、例えば該接着機能と成熟ｌ５Ａ（７） 間のキメラは、治療において特に有用な薬物動態学的性質及び抗血栓活性を有す る。

本発明の他の主題は上記のキメラ分子の製造法に関する。さらに具体的には、こ の方法は真核又は原核細胞宿主に所望のポリペプチドをコードするヌクレオチド 配列を発現させ、続いて生産されたポリペプチドを収穫することから成る。

本発明に関して有用な真核宿主の中に動物細胞、酵母又は菌を挙げるきる。動物 細胞に関し、Ｃ０３ＳＣＨＯ，Ｃ１２７などの細胞を挙げることができる。さら に具体的には、本発明で用いることができる菌の中に、アスペルギルス種（Ａｓ ｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｓｓｐ、）又はトリコデルマ種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ 　ｓｓｐ、）を挙げることができａｃｔｅｒｉｕｍ）、バシルス（Ｂａｃ　ｉ　 １１ｕｓ）又はストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属するバク テリアの使用が好ましい。

本発明に関して有用なヌクレオチド配列は種々の方法で製造することができる。

一般にこれらはポリペプチドのそれぞれの機能的部分をコードする配列を読み取 り枠内に組み立てることにより得られる。これらは当該技術分野における熟練者 の技術により、例えば細胞のメツセンジャーＲＮＡ　（ｍＲＮＡ）から直接、又 は産物を与える細胞により調製した相補的ＤＮＡ　（ｃＤＮＡ）からの再クロー ニングにより単離することができ、又は別の場合、問題のヌクレオチド配列は完 全に合成配列であることができる。さらに続いてヌクレオチド配列を、例えば遺 伝子工学法により修飾し、該配列の誘導体又は変異体を得ることもできると理解 される。

さらに特定すると本発明の方法の場合ヌクレオチド配列は、その制御下におかれ 、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を宿主細胞において発現 させる転写開始領域（プロモーター領域）を含む発現カセットの一部を形成する 。この領域は用いられる宿主細胞において強く発現される遺伝子のプロモーター 領域に由来するものであることができ、発現は構成性又は調節性である。酵母に 関し、プロモーターはホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）　、グリセルアル デヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ）　、ラクターゼ（旦ΔＣ ４）　、エノラーゼ（ＥＮＯ）　、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）など の遺伝子のプロモーターであることができる。バクテリアに関し、プロモーター はバクテリオファージ　ラムダの右又は左遺伝子（ＰＬ、Ｐヮ）のプロモーター 、あるいはトリプトファン（Ｐ、、、）又はラクトース（Ｐ、、、）オペロンの 遺伝子のプロモーターであることができる。さらにこれらの調節領域は、例えば 試験管内突然変異誘発により、追加の調節要素又は合成配列の導入により、ある いは最初の調節要素の欠失又は置換により修飾することができる。発現カセット は、予定されている宿主において機能的な、本発明のポリペプチドをコードする ヌクレオチド配列の直下流に位置する転写停止領域も含むことができる。

好ましい実施態様の場合、本発明のポリペプチドは真核又は原核宿主におけるヌ クレオチド配列の発現、及び該配列の発現産物の培地中への分泌によって得られ る。実際に組み換え法を用い、培地において分子を直接得られるのは特に有利で ある。この場合、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の前に、 用いる宿主の分泌経路にナセントポリベブチドを方向付けるリーダー配列（又は シグナル配列）が先行する。このリーダー配列はｖＷＦの、又はそれが本来分泌 タンパク質である場合は安定化構造の天然のシグナル配列であることができるが 、他のいずれかの機能性リーダー配列又は人工のリーダー配列であることもでき る。これらの配列の１つ又は他の選択は、特に用いられる宿主により指示される 。機能性シグナル配列の例には、性フェロモン又は酵母のキラー毒素の遺伝子の シグナル配列が含まれる。

発現カセットの他に組み換え宿主の選択を可能にする１種又はそれ以上のマーカ ー、例えばＳ、セレビンアｘ（Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）酵母のＵＲＡ３遺伝 子、あるいはゲネチシン（Ｇ４１８）などの抗生物質又はある種の金属イオンな どの他の毒性化合物に対する耐性を与える遺伝子を加えることができる。

発現カセット及び選択マーカーを含むアセンブリーは、問題の宿主細胞に直接、 又は機能性自己複製ベクター中にあらかじめ挿入して導入することができる。最 初の場合、宿主細胞のゲノムに存在する領域と相同の配列をこの配列に加えるの が好ましく、該配列は発現カセット及び選択遺伝子の各側に位置し、相同的組み 換えによる配列の標的組み込み（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ　ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ）により、宿主のゲノムにアセンブリーが組み込まれる頻度を増すことができる 。発現カセットが複製系に挿入される場合、クルイベロミセス属の酵母の場合に 好ましい複製系は、最初にに、ドロソフィラ（Ｋ、ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒ且思 ）から単離されたプラスミドｐＫＤｌから誘導され、サツカロミセス属の酵母の 場合に好ましい複製系はＳ、セレビシアエの２μプラスミドから誘導される。さ らにこの発現プラスミドは該複製系の全体又は一部を含むことができるか、ある いはプラスミドｐＫＤ１がら誘導された要素及び２μプラスミドから誘導された 要素を組み合わせることができる。

さらに発現プラスミドは、エンゴリキア　コリなどのバクテリア宿主及び選ばれ た宿主細胞の間のツヤトルベクターであることができる。この場合、バクテリア 宿主において機能する複製起点及び選択マーカーが必要である。発現ベクターに バクテリアのユニーク配列の回りの制限部位を置（こともでき、こねは宿主細胞 の形質転換の前に試験管内の切断及び切断ベクターの再連結によりこれらの配列 を除去することを可能にし、コピー数の増加及び該宿主における発現プラスミド の安定性の向上を得ることができる。例えばそのような制限部位は、発現ベクタ ーで非常に希少であり、一般に不在であれば、５’　−ＧＧＣＣＮＮＮＮＮＧＧ ＣＣ−３’　（Ｓ工ｉｆ）又は５°　−ＧＣＧＧＣＣＧＣ−３°　（ＮＯｔｒ） に対応するものであることができる。

そのような発現ベクター又はカセットの構築の後、これらを選ばれた宿主細胞に 、文献に記載の標準的方法に従って導入する。これに関し、細胞中に異種ＤＮＡ を導入することができるいずれの方法も用いることができる。これには特に形質 転換、エレクトロポレーション、接合（Ｃｏｎｊｕｇａ　ｔ　１ｏｎ）又は当該 技術分野における熟練者に既知の他の方法が含まれる。酵母の型の宿主の場合の 例として、用いられた種々のクルイベロミセス株を、Ｉｔｏ　ｅｔ　ａｌ、［Ｊ 、Ｂａｃｔｅｒｉ。

１．１５３　（１９８３）１６３］により記載の方法に従って酢酸リチウム及び ポリエチレングリコールの存在下で全細胞を処理することにより形質転換した。

Ｄｕｒｒｅｎｓ　ｅｔ　ａｌ、［Ｃｕｒｒ、Ｇｅｎｅｔ１８　（１９９０）７］ により記載のエチレングリコールとジメチルスルホキシドを用いる形質転換法も 用いた。Ｋａｒｕｂｅ　ｅｔ　ａｌ。

［ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　１８２　（１９８５）９０］により記載の方法に 従ってエレクトロポレーションにより酵母を形質転換することもできる。別の案 も下記の実施例に詳細に記載する。

形質転換細胞の選択の後、該ポリペプチドを発現する細胞を接種し、“連続”法 の場合は細胞成長の間に、又は“バッチ”培養の場合は成長の最後に該ポリペプ チドの回収を行うことができる。続いて本発明の主題を構成するポリペプチドを 分子、薬物動態学及び抗血栓性特性化の目的のために培養上澄み液から精製する 。

本発明のポリペプチドのための好ましい発現系は、宿主細胞としてクルイベロミ セス属の酵母を用いることにあり、酵母は最初にに、マルクシアヌス（Ｋ、ｍａ ｒｘｉａｎｕｓ）変種ドロソフイラにおいて単離された染色体外レプリコンｐＫ Ｄｌから誘導されたあるベクターを用いて形質転換される。これらの酵母、特に に、ラクチス及びに、フラギリス（Ｋ、ｆｒａｇｉｌｉｓ）は一般に該ベクター を安定して複製することができ、さらにＧＲＡＳ　（Ｇｅｎｅｒａｌｌｙ　Ｒｅ ｃｏｇｎｉｚｅｄＡｓ　５ａｆｅ）生物の表に含まれているという利点を有する 。好ましい酵母はプラスミドｐＫＤｌから誘導された該プラスミドを安定して復 製することができ、選択マーカー及び発現カセットが挿入されて本発明のポリペ プチドを多量に分泌することができるクルイベロミセス属の工業的味（ｉｎｄｕ ｓｔｒｉａｌ　５ｔｒａｉｎ）であることが好ましい。

本発明は上記のキメラポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、及びそのよ うな配列を含む組み換え真核又は原核細胞にも関する。

本発明は医薬品としての本発明のポリペプチドの適用にも関する。さらに特定す ると本発明の主題は１種又はそれ以上の上記のポリペプチドを含む製薬学的組成 物である。特にこれらの組成物は血栓の予防又は処置に用いることができる。

本発明を下記の実施例を用いてさらに完全に記載するが、実施例は例示であり、 制限ではないと考えるべきである。

図の一覧表 以下の図で示すプラスミドの図は一定の比率に従って描かれておらず、行われる クローニングの理解に重要な制限部位のみが示されている。

図１：ＩＳＡ−ｖＷＦ型のキメラタンパク質をコードするＨｉｎｄＩＩＩ制限フ ラグメントのヌクレオチド配列。黒い矢印はＩＳＡの“プレ“及び“プロ”領域 の末端を示す。Ｍｓ±ＩＩ及びＰｓ↓Ｉ制限部位に下線を引く。アミノ酸の番号 付け（右側の欄）は成熟キメラＨ８Ａ−ｖＷＦ４７０−→７１３タンパク質（８ ２９残基）に対応し、この特定のキメラのｖＷＦのフラグメントＴｈｒ４７０− Ｖａ１７Ｌ３は残基Ｔｈｒ５８６からＶａ１８２９まで番号付けされている。成 熟ｖＷＦの残基Ｔｈｒ４７０、Ｌｅｕ４９４、Ａｓｐ４９８、Ｐｒｏ５０２、Ｔ ｙｒ５０８、Ｌｅｕ６９４、Ｐｒｏ７０４及びＰｒｏ７０８に下線を引く。

図２：Ｈ３Ａ−ｖＷＦ型（Ａ）及びｖＷＦ−ＩＳＡ　（Ｂ）又はｖ　Ｗ　Ｆ−Ｉ ＳＡ−ｖＷＦ　（Ｃ）型のキメラの線図。用いた略字：Ｍ／ＬＰ、適宜分泌シグ ナル配列が続く翻訳開始メチオニン残基、ＩＳＡ、成熟ヒト血清アルブミン又は その変異体の１っ；ｖＷＦ、血小板及び／又は内皮下層に結合する性質を有する ｖＷＦのフラグメント、又は遺伝子工学法によって得たその変異体の１つ（又は それ以上）。黒い矢印は成熟タンパク質のＮ−末端を示す。

図３：Ａ、プラスミドｐＹＧ１０５の制限地図、及び本発明のキメラタンパク質 の発現のためのプラスミドの構築の戦略。用いた略字：Ｐ、転写プロモーター： Ｔ１転写ターミネータ−、ＩＲ，プラスミドｐＫＤ１の逆方向反復塩基配列；Ｌ ＰＨｓ＾、ＩＳＡ“プレプロ”領域、Ａｐ”及びＫｍ’はそれぞれアンピシリン （Ｅ、　コリ）及びＧ４１８（酵母）に対する耐性のための遺伝子を示す。

Ｂ１本発明で例示されるＩＳＡ及びｖＷＦの間のハイブリッドの発現のための主 要プラスミドの遺伝的特性及び関連性。第１１のプラスミドはＩＳＡの全体及び ｖＷＦのフラグメント又は変異分子の間の翻訳融合体（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ａｌ　ｆｕｓｉｏｎｓ）に相当するＨｉｎｄＩ　Ｉ　Ｉ制限フラグメントを含む ｐＵＣ型プラプラスミドる。発のクローニングに対応する。

図４ニブラスミドｐＹＧ１２４８　（ＩＳＡ−ＰＬ−Ｘ−Ｐ２型のキメラの発現 のためのプラスミド）及びｐＫａｎ７０７　（対照標準プラスミド）を用いて形 質転換した株ＣＢ５２９３．９１を４日間培養した後に（３角フラスコ（Ｅｒｌ ｅｎｍｅｙｅｒｓ））分泌された材料の特性化。

この実験において、図ＡＳＢ及びＣの結果は同一ゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ　８． ５％）上で移動させ、続いて別々に処理したものである。

Ａ、クーマシーブルー染色１分子量標準（第２列）；ＹＰＬ培地でプラスミドｐ Ｋａｎ７０７を用いて（第１列）、あるいはＹＰＤ培地（第３列）又はＹＰＬ培 地（第４列）でｐＹＧ１２４８を用いて形質転換した５０μｍの培養に相当する 上澄み液。

Ｂ、分泌された物質の、ヒトｖＷＦに対するマウス抗体を用いた後の免疫学的特 性化、ビオチニル化分子量標準を用いる以外はＡと同様の凡例。

Ｃ１分泌された物質の、ヒト　アルブミンに対するウサギ抗体を用いた後の免疫 学的特性化：　ＹＰＬ培地でプラスミドｐＫａｎ７０７を用いて（第１列）、あ るいはＹＰＤ培地（第２列）又はＹＰＬ培地（第３列）でｐＹＧ１２４８を用い て形質転換した５０μｌの培養に相当する上澄み液。

図５．プラスミドｐＹＧ１２０６を用いて形質転換した株ＣＢ５２９３．９１に よるＩＳＡ−Ｐ２型のキメラの分泌の速度論。

Ａ１クーマシーブルー染色；分子量標準（第１列）；成長の２４時間後（第２列 ）、４０時間後（第３列）又は４６時間後（第４列）のＹＰＤ培地中の２．５μ ｍの“流加”培養に相当する上澄み液。

Ｂ１分泌された物質の、ヒトｖＷＦに対するマウス抗体の使用後の免疫学的特性 化：ビオチニル化分子量標準を用いる以外はＡと同様の凡例。

図６・プラスミドｐＫａｎ７０７　（参照標準プラスミド、第２列）、ｐＹＧ１ ２０６　（ＩＳＡ−Ｐ２型のキメラの発現のためのプラスミド、第３列）　、ｐ ＹＧ１２１４　（ＩＳＡ−ＰＬ型ノキメラノ発現のためのプラスミド、第４列） 及びｐＹＧ１２２３　（ＩＳＡ−ＰＬ−ＸＤ−Ｐ２型のキメラの発現のためのプ ラスミド、第５列）を用いて形質転換したＫ。

ラクチスにより分泌された物質の特性化；分子量標準（第１列）。スポットした 試料はＹＰＤ培地で成長させ、８，５％アクリルアミドゲル中で移動させ、クー マシーブルー染色した後の５０μｍの定常培養の上澄み液に相当する。

図７：ブラ７、ミＦｐＹＧ１３１１　（ＩＳＡ−ｖＷＦ５０８−→７０４）及び ｐＹＧ１３１３　（ＩＳＡ−ｖＷＦ４７０−→７０４、Ｃ４７１Ｇ。

Ｃ４７４Ｇ）を用いて形質転換した株ＣＢ５２９３．９１の４日間の培養（３角 フラスコ）の後に分泌され、５ＤＳ−ＰＡＧＥ８．５％ゲル上で移動させた後の 物質の特性化。

Ａ１クーマシーブルー染色、ＹＰＬ培地においてプラスミドｐＹＧ１３１１　（ 第１列）又はｐＹＧ１３１３　（第２列）を用いて形質転換した１００μｍの培 養に相当する上澄み液：分子量標準（第３列）。

Ｂ１分泌された物質の、ヒトｖＷＦに対するマウス抗体を用いた後の免疫学的特 性化：Ａと同様の凡例。

Ｃ１分泌された物質の、ＩＳＡに対するウサギ抗体を用いた後の免疫学的特性化 ：Ａと同様の凡例。

図８．プラスミドｐＹＧ１３６１　（ＩＳＡ−ｖＷＦ４７０．−→１０４、Ｃ４ ７１Ｇ、Ｃ４７４Ｇ、Ｒ５４３Ｗ）及びｐＹＧ１３６５　（ＩＳＡ−ｖＷＦ　４ ７０−→７０４、Ｃ４７１Ｇ、Ｃ４７４Ｇ、Ｐ５７４Ｌ）を用いて形質転換した 株ＣＢ５２９３．９１を４日間培養した後に分泌され、５ＤＳ−ＰＡＧＥ８．５ ％ゲル上で移動させた後の物質の特性化。この実験の場合、図Ａ、Ｂ及びＣの結 果は同一のゲル上で移動させ、別々に処理したものである。

Ａ１クーマシーブルー染色、ＹＰＬ培地においてプラスミドｐＹＧ１３６１．（ 第１列）又はｐＹＧ１３６５　Ｃ第２列）を用いて形質転換した１００μｌの培 養に相当する上澄み液：分子量標準（第３列）。

Ｂ１分泌された物質の、ヒトｖＷＦに対するマウス抗体を用いた後の免疫学的特 性化、Ａと同様の凡例。

Ｃ１分泌された物質の、ＩＳＡに対するウサギ抗体を用いた後の免疫学的特性化 　Ａと同様の凡例。

図９　パラホルムアルデヒド固定ヒト血小板の凝集に関する試験管内拮抗剤活性 のアッセイ、対照標準Ｒ，Ｇ１２９８６に対するハイブリッドＨ３Ａ−ｖＷＦ６ ９４−７０８、［ＩＳＡ−ｖＷＦ４７０−７１３　Ｃ４７１Ｇ、Ｃ４７４Ｇ］及 Ｕ　［ＩＳＡ−ｖＷＦ４７０−７０４　Ｃ４７ＩＧ、Ｃ４７４Ｇ］のＩＣ５ｏ０ 血小板凝集の投薬量依存性阻害の測定は、ヒトｖＷＦ、ボッロセチン（８，２ｍ ｇ／ｍｌ）及び種々の希釈の試験生成物の存在下でＰＡＰ−４アグリゴメーター を用い、３７℃で撹拌しながら行う。続いて対照標準の凝集（生成物不在）を２ 分の１に阻害できる生成物の濃度を決定する（ＩＣ，。）。

書廊男 一般的クローニング法 プラスミドＤＮＡの分取用抽出（ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏ ｎ）、プラスミドＤＮＡの塩化セシウム勾配遠心、アガロ・−ス又はアクリルア ミドゲル電気泳動、電気溶出によるＤＮＡフラグメントの精製、フェノール又は フェノール／クロロホルムを用いたタンパク質抽出、食塩水媒体におけるＤＮＡ のエタノール又はイソプロパツール沈澱、エンエリキア　コリにおける形質転換 などの分子生物学で伝統的に用いられる方法は、当該技術分野における熟練者に 周知であり、文献に十分に記載されている［Ｍａｎｉａｔｉｓ　Ｔ、ｅｔ　ａｌ 、、”Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｒａｎｉｎｇ、ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａ ｎｕａｌ＋、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、 Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ、Ｙ、、１９８２；Ａｕ５ｕｂｅｌ 　Ｆ、Ｍ、ｅｔ　ａｌ、（ｅｄｓ、）、”Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ 　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ＋、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　 ５ｏｎｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、１９８７］。

制限酵素はＮｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ　（Ｂｉｏｌａｂｓ）、Ｂ ｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　（ＢＲＬ）又 はＡｍｅｒｓｈａｍにより供給され、供給者の勧告に従って用いる。

ｐＢＲ３２２及びｐＵＣ型プラプラスミドＭ１３シリーズのファージは市販のも のに由来する（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ ｓ）。

連結の場合、ＤＮＡフラグメントをアガロース又はアクリルアミドゲル電気泳動 によりそのサイズに従って分離し、フェノール又はフェノール／クロロホルム混 合物を用いて抽出し、エタノールで沈澱させ、続いて供給者の勧告に従ってファ ージＴ４　ＤＮＡリガーゼ（ＢｉｏｌａｂＳ）の存在下でインキュベートする。

５゛突出末端（ｐｒｏｔｒｕｄｉｎｇ　ｅｎｄ）の充填（ｆｉｌｌｉｎｇ）はＥ 、コリ　ＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｂｉｏｌａｂｓ）のフレノウフラグメントを用 い、供給者の勧告に従って行う。３゛突出末端の破壊は製造者の勧告に従って用 いられるファージＴ４　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ）の存在下で行う 。５°突出末端の破壊はＳ１ヌクレアーゼによる制御された処理により行う。

合成オリゴデカキンヌクレオチド一方向付は試験管内突然変異誘発は、Ｔａｙｌ ｏｒ　ｅｔ　ａｌ、［Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ。

１３　（１９８５）８７４９−８７６４１により開発された方法に従い、Ａｍｅ ｒｓｈａｍの販売によるキットを用いて行う。

いわゆるＰＣＲ［Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ−ｃａｔａｌｙｚｅｄ　Ｃｈａｉｎ　Ｒ ｅａｃｔｉｏｎ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ、５ａｉｋｉ　Ｒ，Ｋｅｔ　ａｌ、、５ｃ ｉｅｎｃｅ　Ａ３０　（１９８５）１３５０−１３５４＋Ｍｕｌｌｉｓ　Ｋ、Ｂ 、ａｎｄ　Ｆａｌｏｏｎａ　Ｆ、Ａ、、Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍ、上５５　（１９ ８７）３３５−３５０）によるＤＮＡフラグメントの酵素増幅は、“ＤＮＡ熱サ イクラ−（ＤＮＡ　ｔ　ｈ　ｅ　ｒｍａｌ　ｃｙｃｌｅｒ）’　（Ｐｅｒｋｉｎ 　Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ）を用い、製造者の規格に従って行う。

ヌクレオチド配列の確認は、Ｓａｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ、［Ｐｒｏｃ。

Ｎａ　ｔ　１．　Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、　ＵＳＡ、ヱ４　（１９７７）５４６３ −５４６７コにより開発された方法により、Ａｍｅｒｓｈａｍの販売によるキッ トを用いて行う。

ｖＷＦのアミノ酸の番号付けはＴｉｔａｎｉ　ｅｔ　ａｌ、［Ｂｉ。

ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２５（１９８６）３１７１−３１８４１の番号付けである 。

本発明のタンパク質の発現のためのプラスミドのＤＮＡを用いたＫ。

ラクチスの形質転換は、当該技術分野における熟練者に既知のいずれかの方法に よって行い、その例を本文に示す。

他に記載がある場合を除いて、用いるバクテリア株はＥ、コリＭＣｌ０６０　（ ＩａｃｌＰＯＺＹＡＳＸ７４、ｇａｌＵ、ｇａ±に、５ｔｒＡ゛）、又はＥ、コ リＴＧＩ（工且旦、且り旦Ａ、Ｂ、亜Ｅ、−（力。

土、九Σ旦Ｄ５／Ｆ↓二見Ｄ３６、旦工旦Ａ”Ｂ”、里Ｉ９、±見旦Ｚ、Ｍ１５ ）である。

用いる酵母株は出芽酵母に属し、さらに特定するとクルイベロミセス属の酵母に 属する。特にＫ　ラクチスＭＷ９８−８Ｃ（ａＳｕｒａＡ。

ａｒｇ、ｌｙｓ、Ｋ４、ｐＫＤｌｏ）及びに、−７クチスＣＢ５２９３．９１を 用い、株ＭＷ９８−８Ｃの試料を１９８８年９月１６日にＢａａｒｎ　（Ｎｅｔ ｈｅｒｌａｎｄｓ）のＣｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ　ｖ。

ｏｒ　Ｓｃｈｉｍｍｅｌｋｕｌｔｕｒｅｎ　（ＣＢＳ）に寄託し、そコテ番号Ｃ Ｂ５５７９．８８として登録された。

プラスミドｐＥＴ−８ｃ５２Ｋを用いて形質転換したバクテリア株（Ｅ　コリ） を１９９０年４月１７日にＡｍｅｒｉｃａｎ　ＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏ１ １ｅｃｔｉｏｎに番号ＡＴＣＣ６８３０６として寄託した。

本発明のタンパク質をコードする発現プラスミドを用いて形質転換した酵母株は 、３角フラスコ又は２リツトルのパイロット発酵槽（Ｓ　ＥＴＲＩＣ，Ｆｒａｎ ｃｅ）において、肥沃培地（ｒ　ｉ　ｃｈ　ｍｅｄ　ｉ　ｕｍ）（ＹＰＤ・１％ 　酵母抽出物、２％　バクトベプトン（Ｂａｃｔｏｐｅｐｔｏｎ）、２％　グル コース：又はＹＰＬ：１％　酵母抽出物、２％バクトペブトン、２％　ラクトー ス）中の２８℃で一定の撹拌をしながら培養する。

実施例１ニブラスミドｐＥＴ−８ｃ５２Ｋ及びその変異分子の構築ヒトｖＷＦの 残基４４５〜７３３をコードするｖＷＦ　ｃＤＮＡのフラグメントは、ｖＷＦと 一方で血小板、ならびに他方で基底膜及び内皮下層組織のいくつかの要素の間の 相互作用に関するいくつかの重大な決定因子を有する。これらの遺伝的決定因子 （ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）の増幅は、例えばｖＷＦを発現す るヒト細胞系から、及び例えばヒト謄帯静脈内皮細胞の系から［Ｖｅｒｗｅｉｊ 　Ｃ，Ｌ。

ｅｔ　ａｌ、、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、よ３（１９８５）４６９ ９−４７１７１　、又はヒト血小板のＲＮＡから、例えばＷａｒｅｅｔ　ａｔ、 ［Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、８８　（１９９１）２９４６−２９ ５０１に記載の案に従って行うことができる。細胞ＲＮＡをＣａｔｈａｌａ　ｅ ｔ　ａｔ、［ＤＮＡ　４　（１９８３）３２９−３３５１により最初に記載され たグアナシニウムチオシアナート抽出法を用いて精製し、ｖＷＦの増幅するべき 部分を含む相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の合成の鋳型として用いる。第１段階でＡ ｍｅｒｓｈａｍの販売によるキット及び増幅するべき部分のＣ−末端に位置する 隣接残基をコードするｍＲＮＡのヌクレオチド配列に相補的なオリゴデオキシヌ クレオチドを用いて非コード鎖の合成を行う。続いて得られた溶液につき、上記 のオリゴデオキシヌクレオチド及びｖＷＦの増幅するべき部分のＮ−末端に位置 する隣接残基をコードするヌクレオチド配列と同一のオリゴデオキシヌクレオチ ドをプライマーとして用い、ＰＣＲ法により３０回の酵素増幅を行う。増幅され たフラグメントを続いてＭ１３型ベクター中にクローニングし、マルチクローニ ング部位の各側に位置する普遍的プライマー、又はそのいくつかの同形の配列が 既知であるｖＷＦ遺伝子の増幅領域に特異的なオリゴデオキシヌクレオチドを用 いた配列決定によりそれを確認できるようにする［５ａｄｌｅｒ　Ｊ、Ｅ、ｅｔ 　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、８２　（１９８５）６３９ ４−６３９８；Ｖｅｒｗｅｉｊ　Ｃ，Ｌ、ｅｔ　ａｌ、、ＥＭＢＯＪ、５（１９ ８６）１８３９　１８４７；５ｈｅｌｔｏｎ−Ｉｎｌｏｅｓ　Ｂ、Ｂ、ｅｔ　ａ ｌ、、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２５（１９８６）３１６４−３１７１；Ｂｏ ｎｔｈｒｏｎ　Ｄ、ｅｔ　ａｌ、。

Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１７　（１９８６）７１２５−７１２７ １゜プラスミドｐＥＴ−８ｃ５２にはヒトｖＷＦの残基４４５−７３３をコード するｖＷＦ　ｃＤＮＡのフラグメントを含み、特にｖＷＦとＧＰｌｂの間の相互 作用の拮抗剤であるペプチドＧ１０及びＤ５を含むので特に有用である［Ｍｏｒ ｉ　Ｈ，ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、２６３　（１９８８）１７９０１−１７９０４］　、プラスミドｐ５ Ｅに存在するｖＷＦのフラグメントは、位置４５９．４６２．４６４．４７１及 び４７４におけるシスティン残基が特定部位の突然変異誘発によりグリシン残基 に突然変異している以外はプラスミドｐＥＴ−８ｃ５２にのｖＷＦのフラグメン トと同一である。プラスミドｐ７Ｅは位置５０９及び６９５におけるシスティン 残基も特定部位の突然変異誘発によりグリシン残基に突然変異している以外はプ ラスミドｐ５Ｅと同−ＩＮＤＩＴＩ制限フラグメントの構築 Ｅ、２．１．　ＰＬ−Ｘ−Ｐ２型ペプチドＥ、２．　１．　１　ｖＷＦの残基Ｔ ｈｒ４７０−Ｖａｌ１７１３見恵旦Ｉ及びＹ王±ＩＩ部位に下線）及び５’　− ＣＣＣＧＧＧＡＴＣＣＡＡＧＣＴＴＡＧＡＣＴＴＧＴＧＣＣＡＴＧＴＣＧ−３’ 　（ＳＱ２０２９、ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄｌ　Ｉ　Ｉ部位に下線）を用いたプ ラスミドｐＥＴ−８ｃ５２にのＰＣＲ増幅により、ｖＷＦの残基Ｔｈｒ４７Ｑか らＶａｌ１７１３を含むフラグメントが生成される（図１、残基Ｔｈｒ５グし、 クローンの配列を配列決定により確認する。がくしで増幅された５ｔｌｌ−Ｈｉ ｎｄｌｌｌ制限フラグメントを含み、そのペプチド配列はＴｉｔａｎｉ　ｅｔ　 ａｌ、［Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２５　（１９８６）３１７１−３１８４１ に記載の対応する配列と同一である。プラスミドｐＹＧ１２２０はプラスミドｐ ＹＧ４０４のＨｉｎｄＩＩＩ−Ｍｓ±Ｉｌフラグメントの後にこのＭｓ±Ｉ　ｌ −ＨｌｎｄＩ　Ｉ　Ｉ制限部位を含む（実施例４及び図３Ｂを参照）。

Ｅ、２．　１．　２．　ｖＷＦの残基Ｔｈｒ４７０−Ｐｒｏ７．０４天然のｖＷ Ｆの残基７０５は０−グリコジル化され、ｖＷＦの残基Ｌｅｕ６９４からＰｒｏ ７０８により限定されるペプチド配列内に位置する［Ｍｏｒｉ　Ｈ，ｅｔ　ａｌ 、、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６３（１９８８）１７９０１−１７９０４３゜ さらに、哺乳類細胞のグリコジル化から末端シアル酸を遊離することがその機能 であるノイラミニダーゼで天然のｖＷＦを処理すると、例えばポッロセチンなど の血小板凝集補因子の不在下で血小板ＧＰ１ｂへのｖＷＦの結合の部位を露出で きることが知られている。従って組み換えｖ　Ｗ　Ｆ　、特に０−グリコジル化 がシアル酸を含んでいないことが認められている酵母によって分泌されるｖＷＦ のＯ−グリコジル化部位の全体又は一部を除去すると、そのような補因子の不在 下で血小板ＧＰ１ｂを本質的に認識することができる０７０４を含むＭ土工Ｉ　 ｌ−Ｈｌｎｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉフラグメントを、前記実施例と同様の方法で生成する 二オリゴデオキシヌクレオチド５’　−ＣＣＣＧＧＧＡＴＣＣＣＴＴＡＧＧＣＴ ＴＡＡＣＣＧＧＴＧＡＡＧＣＣＧＧＣ−３’　（Ｓｑ２１４、ＢａｍＨＩ及びＭ ｓ±ＩＩ部位に下線）及び５゛メントの形態でクローニングし、クローンの配列 を配列決定により確認する。かくして生成されたＭｓ　ｔ　Ｉ　ｌ−Ｈｌｎｄ　 Ｉ　Ｉ　Ｉフラグメントの配列は、翻訳停止を限定するＴＡＡコドンがｖＷＦの 直下流に位置し、残基４７１及び４７４がグリシン残基であってシスティン残基 でないことを除いて図１に示す対応する配列に相当する。プラスミドｐＹＧ１３ １０はプラスミドｐＹＧ４０４のＨｉｎｄＩＩＩ−Ｍｓ±ＩＩフラグメントの後 にこの￥５ｔｌｌ−Ｈｉｒ＋ｄｌＩＩ制限部位を含む（実施例４及び図３Ｂを参 照）。

Ｅ、２゜１．３．　ｖＷＦの残基Ｌｅｕ４９４−Ｐｒｏ７０４プラスミドｐＹＧ １３１０に存在するペプチド配列も位置４８５．４９２．４９３及び５００にト レオニン又はセリン残基を有し、それは天然のヒトｖＷＦ分子において当然Ｏ− グリコジル化されており、Ｍｏｒｉ　ｅｔ　ａｌ、［Ｊ、ＢｉｏｌＣｈｅｍ、２ ６３（１９８８）１７９０１、−１７９０４１により限定されたペプチドＧ１０ に直接接して位置する。オリゴデオキシヌクレオチド５’　−ＣＣＣＧＧＧＴＡ ＣＣＴＴＡＧＧＣＴＴＡＣＴＧＴＡＴＧＴＧＧＡＧＧＡＣＡＴ（、−３°　（Ｓ 　ｑ　３０に下線）を用いたＰＣＲ法によるプラスミドｐＥＴ８Ｃ−５２にの増 幅により、ｖＷＦの残基Ｌｅｕ４９４からＰｒｏ７０４を含むフラグメントが生 成される。増幅フラグメントを最初に酵素Ｋｐｎｌ及びＢａｍＨＩで切断し、同 酵素で切断したｐＵＣ型ベクター中にクローニングする。

配列決定により期待した配列に相当することが確認された１つの特定の１ｎｄｌ ｌＩフラグメントを含む。プラスミドｐＹＧ１３７３はプラスミドｐＹＧ４０４ のＨｉｎｄＩ　Ｉ　Ｉ−竺ｌ工ＩＩフラグメントの後にこの￥」」Ｉ　ｌ−Ｈｌ ｎｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉ制限フラグメントを含む（実施例４及び図３Ｂを参照）。

Ｅ、２．　１．　４．　ｖＷＦの残基Ｔｙｒ５０８−Ｐｒｏ７０４ＰＣＲ増幅の 後にプラスミドｐＹＧ１３７３に存在するペプチド配列も位置５００にトレオニ ン残基を有し、それは天然のヒトｖＷＦ分子において当然Ｏ−グリコジル化され ている。オリゴデオキシヌクレオチドＡＧＧＡＧＧＡＧＧＧＧＣＴＴＣＡＧＧＧ ＧＣＡＡＧＧＴＣ−３°　（Ｓｑ２６２２、ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄｌ１１部位 に下線）を用いたＰＣＲ法によるプラスミドｐＥ７８Ｃ−５’２にの増幅により 、ｖＷＦの残基Ｔｙｒ５０８からＰｒｏ７０４を含むフラグメントが生成される 。増幅フラグメントを最初に酵素Ｋｐｎｌ及びＢａｍＨＩで切断し、同酵素で切 断したｒ）ＵＣ型ベクター中にクローニングする。配列決定により期待した配列 に相当することが確認された１つの特定のクローンを単離する。

Ｅ、２．　１．　５．　ｖＷＦの残基Ｐｒｏ５０２−Ｐｒｏ７０４対合させると 実施例Ｅ、２．　１．　４．に従ってＰＣＲ増幅した後に得られるプラスミドの ＭｓｔＩＩ及びＰｓｔ１部位の間にクローニングすることができ、それによりヒ トｖＷＦの残基Ｐｒｏ５０２からＰｒｏ７０４を含むＭｓｔユｌｌ−Ｈ１ｎｄｌ ｌｌ制限フラグメントの生成を可能にするるオリゴデオキシヌクレオチド５”　 −ＴＴＡＧＧＧＴＴＡＣＣＡＣＣＴＴＴＧＣＡＴＧＡＣＴＴＣＴＡＣＴＧＣＡ− ３°　（Ｓｑ２７５１）及び５’　−ＧＴＡＧＡＡＧＴＣＡＴＧＣＡＡＡＧＧＴ ＧＧＴＡＡＣＣＣ−３′　の挿入により、ヒトｖＷＦの残基Ｐｒｏ５０２らＰｒ ｏ７０４に相当するペプチド配列を上記のプラスミドから生成する。プラスミド ｐを含む（実施例４及び図３Ｂを参照）。

Ｅ、２．　２　ｖＷＦの残基Ｔｈｒ４７０−Ａｓｐ４９８：ＰＩ型ペプチド 特定の実施態様の場合、ｖＷＦの結合部位は成熟ｖＷＦの残基Ｔｈｒ４７０から Ａｓｐ４９８を含むペプチドである。この配列はＭａｒｊｌ−１７９０４］によ り記載のペプチドＧＩＯ（Ｃｙｓ４７４−Ｐｒ。

４８８）を含み、ヒトｖＷＦとヒト血小板のＧＰｌｂの相互作用に拮抗すること ができる。ペプチドＧＩＯを含む配列は、例えばＰＣＲ増幅法ＴＣＣＡＡＧＣＴ ＴＡＧＴＣＣＴＣＣＡＣＡＴＡＣＡＧ−３’　（Ｓｑｌ配列決定により期待した 配列に相当することが確認された１つの特定のＩフラグメントを含む。プラスミ ドｐＹＧ１２１０はプラスミドｐＹＧ照）。

Ｅ、２．　３．　ｖＷＦの残基Ｌｅｕ６９４−Ｐｒｏ７０８　：Ｐ２型ペプチド 第２の実施態様の場合、ＧＰｌｂへのｖＷＦの結合の部位は合成オリゴデオキシ ヌクレオチド、例えばオリゴデオキシヌクレオチド５°　−ＴＴＡＧＧＣＣＴＣ ＴＧＴＧＡＣＣＴＴＧＣＣＣＣＴＧＡＡＧＣＣＣＣＴＣＣＴＣＣＴＡＣＴＣＴＧ ＣＣＣＣＣＣＴＡＡＧＣＴＴＡ−３°及び５’　−ＧＡＴＣＴＡＡＧＣＴＴＡＧ ＧＧＧＧＧＣＡＧＡＧＴＡＧＧＡＧＧＡＧＧＧＧＣＴＴＣＡＧＧＧＧＣＡＡＧＧ ＴＣＡＣＡＧＡＧＧＣＣ−３°を用いて直接創造する。これらのオリゴデオキシ ヌクレオチドは、対合するとｖＷＦの残基Ｌｅｕ６９４からＰｒｏ７０８により 限定されるペプチドＤ５　［Ｍｏｒｉ　Ｈ，ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈ ｅｍ。

λ旦旦（１９８８）１７９０１−１７９０４１に相当するＭｓｔＩＩ−Ｈｉｎｄ ＩＩＩフラグメントを含むＭｓ±Ｉｌ−Ｂｇ±ＩＩ制限フラグメントを形成する 。プラスミドｐＹＧ１２０４はプラスミドｐＹＧ４０４のＨｉｎｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉ −Ｍｓ±ＩＩフラグメントの後にこのＭｓｔＩＩ−Ｈｉｎｄｌｌ！制限フラグメ ントを含む（実施例４及び図３Ｂを参照）。

Ｅ、２．　４．　ＰＬ　−ＸＤ−Ｐ：２型ヘフチＦプラスミドｐＥＴ−８ｃ５２ にの有用な変異体につき、ペプチドＧ１０及びＤ５の間の部位特異的突然変異誘 発により、例えばコラーゲン−及び／又はヘパリン−及び／又はボッロセチンー 及び／又はスルファチド−及び／又はリストセチン−結合部位を欠失させる。例 は残基Ｃｙｓ５０９及び１１ｅ６６２の間の部位特異的突然変異誘発により欠失 させたプラスミドｐＭＭＢ９である。オリゴデオキシヌクレオチド５ｑ１９６９ 及び５ｑ２０２９を用いたこのプラスミドのＰＣＲ増幅により、残基Ｔｈｒ４７ ０からＴｙｒ５０８及びＡｒｇ６６３からＶａ１７１３、特にｖＷＦのペプチド ＧＩＯ及びＤ５を含むＭｓｔｌｌ−ＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメントが生成され 、それからは特に残基ＧＩｕ５４２とＭｅｔ６２２の間に位置するコラーゲン− 結合部位［Ｒｏｔｈ　Ｇ、Ｊ。

ｅｔ　ａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２５（１９８６）８３５７−８３６１ １が欠失していた。プラスミドｐＹＧ１２１７はプラスミドｐｔ　Ｉ　ｌ−Ｈｌ ｎｄＩ　Ｉ　Ｉ制限フラグメントを含む（実施例４及び図３Ｂを参照）。他の実 施態様において、部位特異的突然変異誘発とＰＣＲ増幅を組み合わせた方法を用 いることにより、図１のＭｓｔｌｌ−ＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメントの随意な 変異体を生成することが可娃になるが、それからは１つ又はそれ以上のスルファ チド−及び／又はボッロセチンー及び／又はヘパリン−及び／又はコラーゲン− 結合部位が欠失していた。

Ｅ、２．５．　Ｐｉ−Ｘ＊−Ｐ２型ペプチドＥ、２．　５．　１．　システィン 残基の置換によるコンフォーメーション変化 ａｍ旦Ｉ及びＭｓｔｌＩ部位に下線）及び５ｑ２０２９を用いたプラスミドｐ５ Ｅ及びｐ７ＥのＰＣＲ増幅産物を最初にＢａｍＨＩ制限フラグメントの形態でｐ ＵＣ型ベクター中にクローニングし、クローンの配列を配列決定により確認する 。かくして生成されたＭｓｔｌｌ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントの配列は、ｖＷ Ｆの残基４７１及び４７４がグリシン残基であってシスティン残基でないこと以 外は図１に示す対応する配列に相当する。プラスミドｐＹＧ１２７１はプラスミ ドｐＹＧ４０４のＨｉｎｄｌｌｌ−Ｍ且±ＩＩフラグメントの後にこのＹ互±Ｉ Ｉ一旦１ユｄｌｌＩ制限フラグメントを含む（実施例４及び図３Ｂを参照）。プ ラスミドｐＹＧ１２６９は、オリゴデオキシヌクレオチド５ｑ２１４９及び５ｑ ２０２９を用いたＰＣＲ増幅の間に鋳型としてプラスミドｐ７Ｅを用いる以外は 同様の方法で生成する。

Ｅ、２．５．２．　ＩＩＢ型突然変異の導入によるコンフォーメーション変化 他の特に有用な突然変異は、ｖＷＦに伴うＩＩＢ型病理学（ＧＰｌｂに関するｖ ＷＦの固有親和性の向上）に含まれる少なくとも１つの残基、例えば残基Ａｒｇ ５４３、Ａｒｇ５４５、Ｔｒｐ５５０、Ｖａ１５５１、Ｖａ　１５５３Ｐｒｏ５ ７４及びＡ　ｒ　ｇ　５７８１：：影響ヲ与、ｔル。ｔｔ験管内の遺伝子組み換 え法は、１つ又はそれ以上の追加の残基をｖＷＦ配列中に随意に、例えば位置Ａ ｓｐ５３９及びＧ１ｕ５４２の間に余分のメチオニンを導入することもできる。

ある特定の実施例では、それぞれオリゴデオキシヌクレオチド５’　−ＧＴＧＣ ＴＧＡＡＧＧＣＣＴＴＴＧＴＧＧＴＣＧＡＣＡＴＧＡＴＧＧＡＧＴＧＧＣＴＧＣ ＧＧＡＴＡＴＣＣＣＡＧＡＡＧＴＧＧＧＴＡＧＣＧＧＴＧＧＣＣＧＴＧＧＴＧＧ ＡＧＴＡＣＣ−３’　（Ｓｑ２８５１　；Ａｒｇ５４３残基を特定するコドンに 下線）及び５′−ＧＧＧＣＴＣＡＡＧＧＡＣＣＧＧＡＡＧＣＧＣＴＴＡＡＧＣＧ ＡＧＣＴＧＣＧＧＣＧＣＡＴＴＧＣＣＡＧＣＣＡＧ−３°　（Ｓｑ２８５５：残 基Ｌｅｕ５７４を特定するコドンに下線）を用いた部位特異的突然変異誘発によ り、突然変異Ａｒｇ５４３−−Ｔｒｐ５４３　（Ｒ５４３Ｗ）及びＰｒｏ５７４ −→Ｌｅｕ５７４　（Ｐ５７４Ｌ）を導入する。ヌクレオチド配列の確認の後、 ヒトｖＷＦのＩＩＢ型突然変異、Ｒ５４３Ｗ及びＰ５７４Ｌを含むＹ且±Ｉ　ｌ −Ｈｌｎｄ　Ｔ　Ｉ　Ｉ制限フラグメントがそれにより生成される。プラスミド ｐＹＧ１３５９　（Ｒ５４３Ｗ）及ＩＩＩ制限フラグメントを含む（実施例４及 び図３Ｂを参照）。オリゴデオキシヌクレオチド５ｑ２８５１を用いた突然変異 誘発は、位置Ｖａ１５３８、ｌ１ｅ５４６及びＶａ１５５１にそれぞれ５ａｌＩ 、Ｅｃ。

ＲＶ及びＹ±ｕＩ部位も導入する。これらの制限部位はヒトｖＷＦの対応する天 然の配列には存在せず、従って残基Ｖａ１５３８及びＶａ１５５１の間に所望の 突然変異を容易に導入するために特に有用である。例えばオリゴデオキシヌクレ オチド５’　−ＡＴＣＣＣＡＧＡＡＧＴＧＣＧＴＡ−３°　（Ｓｑ３０１７、■ ＩＢ型突然変異Ｃｙｓ５５０を特定するコドンに下線）及び５°−ＣＧＣＧＴＡ ＣＧＣＡＣＴＴＣＴＧＧＧＡＴスミドｐＹＧ１３５９中にクローニングし、それ により突然変異Ｒ５４３Ｗ及びＷ５５０Ｃを含むプラスミドｐＹＧ１３７４を生 成することができる（図３Ｂ）。同様にしてオリゴデオキシヌクレオチド５°− ＴＣＧＡＣＡＴＧＡＴＧＧＡＧＣＧＧＣＴＧＣＧＧＡＴ−３’　（Ｓｑ３０１９ 、天然の配列に由来する残基Ａｒｇ５４３を特定するコドンに下線）及び５°− ＡＴＣＣＧＣＡＧＣＣＧＣＴＣＣＡＴＣＡＴＧ−３’　（ＳＱ３０２０）は、対 合するとＳａ↓Ｉ−ＥｃｏＲＶ制限フラグメントを形成し、それを酵素Ｓａ±１ 及びＥｃｏＲＶで切断したプラスミドｐＹ６１３７４中にクローニングし、それ により突然変異Ｗ５５０　Ｃのみを含むプラスミドｐＹＧ１３８６を生成するこ とができる（図３Ｂ）。

実施例３・内皮下層へのｖＷＦの結合の部位を含むＭｓｔｌｌ−ＨｉｎｄＩＩＩ 制限フラグメントの構築 特定の実施例において内皮下層組織の成分、特にコラーゲンへのｖＷＦの結合の 部位を、プラスミドｐＥＴ−８ｃ５２にのＰＣＲ増幅により生成する。例えばオ リゴデオキシヌクレオチド５Ｑ２２５８　（５°−ＧＧＡＡＴＴＣＡＡＧＣ”ｒ ＴＡＡＣＡＧＡＧＧＴＡＧＣＴＡＡＣＧＡＴＣｄｌｌｌ制限フラグメントは天然 のｖＷＦの残基Ｃｙｓ５０９からＣｙｓ６９５（Ｘ型ペプチド）を含む。この制 限フラグメント、及びプラスｌ制限フラグメントが生成される（図３Ｂ）。

ＸＤ　（Ｅ、２．　４ヲ参照）　又ｌ；！Ｘ＊　（Ｅ、２．　５．を参照）の変 異分子も同様の戦略で生成することができ、それはｖＷＦのスルファチド−及び ／又はポツロセチンー及び／又はヘパリン−及び／又はコラーゲン−結合部位、 及び／又はＧＰｌｂに関するｖＷＦの親和性の変化（ＶＷＦに伴うＩＩ型痔病理 学に責任のあるいずれかの残基の間の所望の組み合わぜを含む。他の実施態様に おいて、コラーゲンに結合することができるドメインを、残基９９１及び１１１ ４の間にあり、Ｐａｒｅｔｉｅｔ　ａｌ、［Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、（１９８ ７）２旦ス、１３８３５−１３８４１３に記載されているｖＷＦフラグメントか ら創造することもできる。

実施例４・ＩＳＡのＣ−末端におけるカプリングプラスミドｐＹＧ４０４は特許 出願ＥＰ３６１．９９１に記載さレテＴＧの直上流に天然に存在する２１ヌクレ オチドの後にブレプローＨ３Ａ遺伝子をコードする１（ｉｎｄｌｌｌ制限フラグ メントを含む。このフラグメントは最もＣ−末端の３つのアミノ酸（ロインンー グリシンーロイシン残基）を除＜ＩＳＡをコードする遺伝子の全体に相当するＨ ｉｎｄＩＩＩ−ＭｓｔＩＩ制限フラグメントを含む。このフラグメントを実施例 ２又は３に記載のＭｓ±ｌｌ−Ｈ１ｎｄｌｌｌフラグメントのいずれか１つと連 結すると、特定の性質を与えられたｖＷＦフラグメントが翻訳読み取り枠中でＨ ８Ａ分子のＣ−末端に位置するキメラタンパク質をコードする複合遺伝子（ｃｏ ｍｐｏｓｉｔｅ　ｇｅｎｅ）を含むＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメントの生成を可 能にする。そのような複合遺伝子を図３Ｂの表に例示する。

実施例５：ＩＳＡのＮ−末端におけるカプリング特定の実施態様において、部位 特異的突然変異誘発及びＰＣＲ増幅を組み合わせた方法により、その配列が接着 性を与えられたｖＷＦフラグメントを含むシグナルペプチド（例えばＩ　Ｓ　Ａ プレプロ領域）、及びＩＳＡの成熟形態又はその変異分子の１つの間の翻訳カプ リングから生ずるキメラタンパク質をコードするハイブリッド遺伝子を構築する ことが可能になる。これらのハイブリッド遺伝子は翻訳開始ＡＴＧの５゛末端及 び翻訳停止コドンの３゛末端においてＨｉｎｄｌｌｌ制限部位がフランキングし 、それによりこれらのキメラタンパク質の発現のためのプラスミドを、例えば次 の実施例で詳細に記載する戦略に従って生成できるようにするのが好ましい。

実施例６　発現プラスミド 前記のキメラタンパク質は酵母において、調節的又は構成的機能性プロモーター 、例えばプラスミドｐＹＧ１０５　（クルイベロミセス　ラフのＰ　Ｈ０５プロ モーター）に存在するプロモーター、あるいは特許出願ＥＰ　３６１　９９１に 記載のようなハイブリッドプロモーターから発現することができる。プラスミド ｐＹＧ１０５及びｐＹＧ１０６は実施例Ｅ　４　及びＥ、５、のＨｉｎｄｌＩＩ 制限フラグメントによりコードされる遺伝子をＫ　ラクチスにおいて機能性であ る調節的（ｐＹＧ１０５）又は構成的（ｐＹＧ１０６）プロモーターから発現す ることを可能にするので、本発明において特に有用である。プラスミドｐＹＧＩ Ｏ５は、ゲネチシン（Ｇ４１８）に対する耐性のための遺伝子中に位置する１つ のＨ４ｎｄｌＩＩ制限部位が部位特異的突然変異誘発により破壊されているが不 変のタンパク質（オリゴデオキシヌクレオチド５゛−ＧＡＡＡＴＧＣＡＴＡＡＧ ＣＴＣＴＴＧＣＣＡＴＴＣＴＣＡＣＣＧ−３’　）が保存されている、特許出願 ＥＰ　３６１　９９１に記載のプラスミドｐＫａｎ７０７に相当する。続いて突 然変異プラスミドのＵＲΔ３遺伝子をコードするＳａ±ｌ−８ａ、ｃＩフラグメ ンＩ・をに、ラクチスの旦ΔＣ４プロモーター（Ｓａ　Ｉ　ｌ−Ｈｌｎｄ　Ｉ　 Ｉ　Ｉフラグメントの形態で）ＩＩ−３ａｌｌ制限フラグメントで置換した。プ ラスミドｐＹＧ１０５はクルイベロミセス酵母において有糸分裂的に非常に安定 であり、その制限地図が図３に示されている。プラスミドｐＹＧ１０５及びｐＹ Ｇ１０６は５ａｉｌ−ＨｉｎｄｌｌＩフラグメントによりコードされる転写プロ モーターの性質のみが互いに異なる。例えばプラスミドｐＹＧ１２２０、ｐＹＧ １３１０、ｐＹＧ１３７３、ｐＹＧ１３０９、ｐＹＧ１３５０、ｐＹＧ１２１０ 、ｐＹＧ１２０４、ｐＹＧ１２１７、ｐＹＧ１２６９、ｐＹＧ１２７１、ｐＹＧ １３５９、ｐＹＧ１３６０、ｐＹＧ１３７４、ｐＹＧ１３８６及びｐＹＧ１２７ ６のＨｉ　ｎ　ｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉ制限フラグメントをプラスミドｐＹＧ１０５のＨ ｉｎｄＩ　Ｉ　１部位に“生産的配向で“　（アルブミン“プレプロ”領域を転 写プロモーターに対して近接して置く配向として定義）クローニングすると、そ れぞれ発現プラスミドｐＹＧ１２４８、ｐＹＧ１３１３、ｐＹＧ１３７５、ｐＹ Ｇ１３１１、ｐＹＧ１３５５、ｐ’ＹＧ１２１４、ｐＹＧ１２０６、ｐＹＧ１２ ２３、ｐＹＧ１２７９、ｐＹＧ１２８３、ｐＹＧ１３６１、ｐＹＧ１３６５、ｐ ＹＧ１３７７、ｐＹＧ１３８９及びｐＹＧ１２７７が生成される。

実施例７．酵母の形質転換 クルイベロミセス属に属する酵母、特にに、ラクチス株ＭＷ９８−８Ｃ及びＣＢ ５２９３．９１の形質転換を、例えば全細胞を酢酸リチウムで処理する方法［１ ｔｏ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１５３　（１９８３）１６３− １６８１を以下のように応用して行う。細胞成長は５０ｍ１のＹＰＤ培地中の２ ８℃で撹拌しなから６００ｎｍにおける光学濃度（ＯＤｓｏｏ）が０．　６〜０ ．８となるまで行い、低速遠心により細胞を収穫し、無菌ＴＥ溶液（ｌ　ＱｍＭ 　Ｔｒ　ｉ　５−ＨＣＩ、　ｐＨ７，４；　１ｍＭ　ＥＤＴＡ）中で洗浄し、３ 〜４ｍｌの酢酸リチウム（ＴＥ中のＯ，１Ｍ）に再懸濁して約２ｘｌＯ８細胞／ ｍ＋の細胞濃度を得、続いて穏やかに撹拌しながら３０℃で１時間インキュベー トする。

得られた感受性細胞の懸濁液のＯ，１ｍｌのアリコートをＤＮＡ、及び最終濃度 が３５％のポリエチレングリコール（ＰＥ０４゜。。、Ｓ　ｉ　ｇｍａ）の存在 下の３０℃で１時間インキュベートする。４２℃における５分間の熱ショックの 後、細胞を２回洗浄し、０．２ｍｌの無菌水中に再懸濁し、２ｍｌのＹＰＤ培地 中の２８℃で１６時間インキュベートし、Ｐ□プロモーター（ＥＰ　３６１　９ ９１を参照）の制御下で発現されるＧ４１８耐性遺伝子の表現型を発現させ、続 いて２００μｌの細胞懸濁液を選択ＹＰＤ皿（０４１８，２００ｇｇ／ｍｌ）上 で平板培養スル。皿は２８℃でインキュベートし、形質転換細胞は細胞成長の２ 〜３日後に現れる。

実施例８．キメラの分泌 Ｇ４１８を補足した肥沃培地上の選択の後、組み換えクローンをＨＳＡとｖＷＦ の間のキメラであるタンパク質を分泌するその能力に関して調べる。例えばプラ スミドｐＹＧ１２１４　（ＨＳＡ−Ｐｉ）　、ｐＹＧ１２０６　（ＨＳＡ−Ｐ２ ）　、ｐＹＧ１２２３　（ＨＳＡ−Ｐｉ−ＸＤ−Ｐ２）及びｐＹＧ１２４８　（ ＨＳＡ−Ｐｉ−Ｘ−Ｐ２）又はｐＫａｎ７０７（対照標準ベクター）で形質転換 された株ＣＢ５２９３．９１に相当するいくつかのクローンをＹＰＤ又はＹＰＬ 培地中の２８℃でインキュベートする。細胞が定常成長期に達したら遠心により 細胞上澄み液を回収し、ｉ！ｉ宜最終濃度が６０％のエタノール中の一２０℃で ３０分間沈澱させることにより１０倍に濃縮し、その後５ＤＳ−ＰＡＧＥ８．５ ％ゲル上の電気泳動の後にゲルをクーマシーブルーで染色することにより直接、 あるいはｖＷＦに対するマウス抗体又はＩＳＡに対するウサギポリクローナル血 清を一次抗体として用いた免疫プロッティングの後に調べる。

免疫学的検出実験の場合、最初にニトロセルロースフィルターを特異的−次抗体 の存在下でインキュベートし、数回洗浄し、ヒツジ抗マウス（抗−ｖＷＦ免疫プ ロッティング）又は抗−ウサギ（抗−Ｈ３Ａ免疫プロッティング）抗体の存在下 でインキュベートし、続いてＶｅｃｔａｓｔａｉｎ　（Ｂｉｏｓｙｓ　Ｓ、Ａ、 、Ｃｏｍｐｉａｇｎｅ、Ｆｒａｎｃｅ）の販売による“ＡＢＣキット“を用いて アビジン−パーオキシダーゼ複合体の存在下でインキュベートする。その後過酸 化水素の存在下で３．３′　−ジアミノベンジジンテトラヒドロフ岨ノド（Ｐｒ ｏｌａｂｏ）を製造者の勧告に従って加えることにより免疫学的反応を視覚化す る。

図４〜８の結果は、Ｋ、ラクチス酵母がＨＳＡ及びｖＷＦフラグメントの間のキ メラであるタンパク質を分泌でき、これらのキメラがＨＳＡ又はｖＷＦに関して 特異的な抗体により認識されることを示す。

実施例９：分泌産物の精製及び分子特性化例えば実施例６の発現プラスミドを用 いて形質転換された株ＣＢ５２９３．９１に相当する培養上澄み液中に存在する キメラを最初にＨ３Ａ部分及びｖＷＦ部分に特異的な抗体を用いて特性化する。

図４〜８の結果は、Ｋ、ラクチス酵母がＨＳＡ及びｖＷＦフラグメントの間のキ メうであるタンパク質を分泌でき、これらのキメラが免疫学的活性であることを 示す。これらのキメラのい（らがを精製するのも望ましい。培養物を遠心しく１ ０，０００ｇ、３０分間）、上澄み液を０．２２ｍｍフィルター（Ｍｉｌｌｉｐ ｏｒｅ）に通過さ也続いて識別限界が３０ｋＤａである膜を用いた限外濾過（Ａ ｍｏ　ｃ　ｏ　ｎ）により濃縮する。得られた濃厚液を続いてＴｒｉｓ−ＨＣＩ 溶液（５０ｍＭ　ｐＨ８）ｉ：：対して透析し、その後カラム上で精製する。例 えばプラスミドｐＹＧ１２０６を用いて形質転換した株ＣＢ５２９３．９１の培 養上澄み液に相当する濃厚液はＢｌｕｅ−Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ　（ＩＢＦ）上の アフィニティークロマトグラフィーにより精製する。イオン交換クロマトグラフ ィーによる精製も用いることができる。例えばキメラＨＳ、Ａ　−ｖＷＦ　４７ ０−７１３の場合、限外濾過の後に得られる濃厚液をＴｒｉｓ−ＨＣＩ溶液（５ ０ｍＭ　ｐＨ８）に対して透析し、続いて同緩衝液で平衡化したカチオン交換カ ラム（５ｍＤ　（Ｓ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に２０ｍ１の 両分で適用する。その後カラムをＴｒｉｓ−ＨＣ１溶液（５０ｍＭ　ｐＨ８）で 数回洗浄し、続いてＮａＣ２勾配（０〜１Ｍ）を用いてキメラタンパク質をカラ ムから溶離する。キメラタンパク質を含む画分を集め、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ ＣＩ溶液（ｐＨ８）に対して透析し、続いてＳ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗカラムに再 度適用する。

カラムから溶離した後、タンパク質を含む画分を集め、水に対して透析し、特性 化の前に凍結乾燥する。例えばＣＢ５２９３．９１酵母により分泌されるタンパ ク質［ＨＳＡ−ｖＷＦ４７０−７０４　Ｃ４７１Ｇ。

Ｃ４７４Ｇ］の配列決定は、予想されたＩＳＡのＮ−末端配列（Ａｓｐ−Ａｌａ −Ｈｉｓ、、、）を与え、ＨＳＡ“プロ”領域のＡｒｇ−Ａｒｇ残基のダブレッ トの直接のＣ−末端側におけるキメラの正しい突然変異を示している（図１）。

ＨＳＡ及びｖＷＦの間のキメラであるタンパク質の基本的モノマー性もＴＳＫ３ ０００カラム［Ｙｏｙｏ　ＳｏｄａＣｏｍｐａｎｙ、０．２Ｍ　Ｎａ２５ｏ、を 含むカコジル酸塩溶液（ｐＨ７）で平衡化］上の溶離プロファイルにより確認さ れ、例えばキメラ［ＨＳＡ−ｖＷＦ４７０−７０４　Ｃ４７１Ｇ、Ｃ４７４Ｇ］ はこれらの条件下で見掛けの分子量が９５ｋＤａのタンパク質として挙動し、そ のモノマー性を示している。

実施例１０：ＨＳＡ及びｖＷＦの間の遺伝子ハイブリッドの血小板凝集に関する 拮抗剤活性 Ｐｒ１ｏｒ　ｅｔ　ａｌ、［Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９２）↓０： ６６］により記載の方法に従い、パラホルムアルデヒド−固定ヒト血小板の凝集 の投薬量−依存性阻害の測定により、生成物の拮抗剤活性を決定する。測定はア ブリボメーター（ＰＡＰ−４、Ｂｉｏ　Ｄａｔａ、Ｈｏｒｓｈａｍ、Ｐ、Ａ、Ｕ ＳＡ）で行い、それはＷＷＦ、ボッロセチン（８，２ｍｇ／ｍｌ）及び異なる希 釈（濃度）における試験生成物の存在下の３７℃で撹拌しながら、光透過率の経 時変化を記録する。各測定に関し、４００ｍ１　（８ｘｌＯ’血小板）のバラホ ルムアルデヒド−安定化ヒト血小板（０，５％、続いて［ＮａＣ１（１３７ｍＭ ）；ＭｇＣｌｘ　（１ｍＭ）　；　ＮａＨｚＰＯｎ　（１３６ｍＭ）；ＮａＨＣ Ｏｓ（１０ｍＭ）；ＫＣＩ　（２，７ｍＭ）；グルコース（５，６ｍＭ）；ＨＳ Ａ　（３，５ｍｇ／ｍｌ）；ＨＥＰＥＳ緩衝液（１０ｍＭ、Ｉ）８７．３５）］ に再懸濁）の懸濁液をアブリボメーターの円筒室（８，７５Ｘ５０ｍｍ、Ｗｅｌ ｌｃｏｍｅ　Ｄｉｓｔｒｉｗｅｌｌ、１５９　ｒｕｅＮａｔｉｏｎａｌｅ、Ｐａ ｒｉｓ）の３７℃で４分間予備インキュベートし、続いて発熱物質−非含有調剤 ビヒクル［マンニトール（５０ｇ／ｌ）：クエン酸（１９２ｍｇ／Ｉ）：Ｌ−リ シンモノヒドロクロリド（１８２，６ｍｇ／Ｉ）；ＮａＣ１（８８ｍｇ／Ｉ）； 　（ＩＭ）ＮａＣ１の添加によりｐＨを３．５に調節］中の種々の希釈における 試験生成物の溶液３Ｑｍｌ、又は調剤ビヒクルのみ（対照標準試験）を加える。

得られた懸濁液を続いて３７℃で１分間インキュベートし、１２．５ｍｌ＋７） ヒトｖＷＦ　［Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｐａｒｓ　１ｐｐ ａｎｙ、ＮＪ、ＵＳＡ；ホルムアルデヒド−固定血小板（２ｘｂ ０ｍｇ／ｍ１．ｐ、３６−４５：ｖＷ　Ｐｒｏｇｒａｍ？Ｍを参照）を含むヒト 血漿を用い、ＰＡＰ−４（Ｐｌａｔｅｌｅｔ　Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ　Ｐｒｏ ｆｉｌｅｒ”）の使用に関する勧告に従って測定したフォンビルプラント活性が １１％〕を加え、これを３７℃で１分間インキュベートしてから１２．５ｍｌの ポツロセチンの溶液［Ｓｕｇｉｍｏｔ。

ｔ、ｈｒｏｐｓ　Ｊａｒａｒａｃａ）毒（Ｓｉ　ｇｍａ）から精製］を加える。

続いて時間の関数としての透過率の読みの記録を、室内におかれ、アブリボメー ターにより１１１０ｒｐｍで磁気撹拌される棒磁石（ＷｅＩｎｃｏｍｅ　Ｄｉｓ ｔｒｉｗｅｌｌ）を用いて撹拌しながら２分間行う。従って時間を経た光透過度 の平均変化（各希釈に関してｎ３５）は、濃度を変えることができる試験生成物 の不在又は存在下における、ｖＷＦ及びボツロセチンの存在による血小板凝集の 尺度である。そのような記録から、各濃度の生成物による血小板凝集の％阻害を 決定し、％阻害を生成物の希釈の逆数の関数として与える直線を対数一対数目盛 上にプロットする。続いてＩＣ５ｏ（又は凝集の５０％阻害を起こす生成物の濃 度）をこの直線上で決定する。図９の表はいくつかの本発明のＨ３Ａ−ｖＷＦキ メラのＩＣ６゜値を比較しており、それらのいくつかがＰｒｉ。

ｒ　ｅｔ　ａｌ、［Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　（１９９２）よ旦：６６］ に記載され、標準値として試験に含んだ生成物ＲＧ１２９８６より優れた血小板 凝集拮抗剤であることを示す。さらに、ブタ血漿ｖ　Ｗ　Ｆ（Ｓ　ｉ　ｇｍａ） の存在下におけるヒト血小板の凝集の阻害に関する同様の試験により、本発明の ハイブリッドのいくつか、特にいくつかのＩＩＢ変異体がポツロセチン型の補因 子の不在下における非常に優れた血小板凝集拮抗剤であることを示すことができ る。これらの特定のキメラのボッロゼチン−依存性拮抗もＷａｒｅ　ｅｔ　ａｌ 、［Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、（１９９１）８８；２９４６］に より最初に記載された案に従い、モノクローナル抗体１”１−ＬＪ−ＩＢＩ　（ １０ｍｇ／ｍｌ）の置換により示すことができ、新しい血小板（１０’血小板／ ｍ１）の存在下の２２℃で３０分間インキュベートした後にｖＷＦの競争的阻害 剤が血小板ＧＰＩｂに結合する［Ｈａｎｄａ　Ｍ、ｅｔ配列表 配列番号：１ 配列の長さ：　２５９１− 配列の型・核酸 鎖の数−２本 トポロジー・直鎖状 配列の種類、他の核酸　ｃ　ＤＮＡ ハイボセチカル・Ｎ。

アンチセンス＝Ｎ。

配列の特徴 特徴を表す記号　ＣＤＳ 存在位置・２６．．２５８７ 配列番号　１ 人為ｃＧＣＴＴＣＧＴＣＴＣＣＣＡＡＡＣＡＧＡｕＣＴＣ入＾Ｃ〒ＣＴＯＣＣＭ ＷＣＴＣＣＡＡ入ＡＡＴＴＴにＧＡＧＡＡＡＧＡＬｙｓ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　５ａ ｒ　Ａｌａ　Ｌｗｓ　Ｇｉｎ　ｆｉｘｖ　Ｌｚｕ　ＬＹｓ　ＣｙＳ＾ｌａ　５ｅ ｒ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ｌｙｓ@Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　２０９α７　 ＴＴＣＡＡＡ　（ＸＪ　！　Ｇｌｕ　ＧＴＡ　Ｇ？Ｔ　Ｃ’ｌｌｌ：　ＣＴＧ　 Ａ＆　ＣＡＣＡＣＡ　ｆロ′α工υＶ　ＧＣＴ　Ｇ＾fｉ７α７ 人ユａ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｔｒｐ　Ａｌａ　Ｖａｌ　入１ａ　入ｒｏ　 Ｌａｕ　５ｅｒ　Ｇｉｎ　＾ｒＱ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ@Ａｌａ　Ｇｌｕ　 Ｐｈｅ　Ａｌａ　２２９Ｃ入＾σＴＴＴＣＣＡｊｌＧＴＴＡＣＴＣｋｃｌＧＡＴ ＣＴ’ＴＡＣＣ八＾ｈＣＴＣＣ＾ＣｋＣＧＧｋ％ＴＣ；Ｃ’ＩＹＸ：ＣｋＴＧＧ ＸＧhＴ ＧｌｕｖａｌＳｅｒＬｙｓＬａｕｖａｌＴｈｒＡ５ｐＬｅｕＴｈｒＬｙｓνａｌ ）ｌｉｓＴｈｒＣｌｕＣｙｇ〔）シ５ＨｉｓＧｌｙＡｓｐ２S９ ｒ１ｑｕｒｌ！ｌ　（ａ） Ｃ〒０ＣＴＴＯＡＡＴＯＴ０１−丁Ｇ＾丁Ｇ＾ＣＮコＧＯロａａへＣＣＴ丁ＯＣ Ｃへ＾ＧＴＡ丁Ａ〒ＣＴｆ７ｒＧ＾＾＾Ａ〒Ｃ＾ＡＧ＾ＴＬａｕ　Ｌｅｕ　Ｇｌ ｕ　Ｃｙｍ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ａｒ９　八１６　＾＄１５ＩＪｕ　＾ｌ ａＬソＳ↑ｙｒｌｌ豐Ｃｙｓ　Ｇｌｕ@八ｓｎ　Ｇｉｎ　八ｓｐ　２６９ ｍ　ｘ’ｒｃ　’ｒａｔ　ｘ　ＡＡＡ　ｅｒａ　ＡＡＯｃｕ　’ｒｏｅ　ｍ　Ｏ ＡＡ　ＡＡＡ　αゴＣｒＱ　ＴＴＣＪ　（２ＡＡ　ＡＡＡ　sＣＣＣｋＣＴＥＸ ： ｋｒ　Ａｌａ８ｅｒ　Ｓｅｒ　ＬＨｓ　ｔａｕ　ＬＭｓ　Ｏｌｕ　Ｃｙｓ　Ｃｙ ｍ　Ｇｌｕ　Ｌｑｓ　Ｐｒｏ−〜−ＫＩ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　rｅｒ　Ｈｌｓ　Ｃ ｙｍ　２！＋９ ＾？ｒ　ｏｃｃＯＡＡ　Ｇｒｍω講紡ＴＯＡ〒ω叩＾司αゴαテ（ｉＡｃＴｒｏ αゴクＩＴＡ　（ＸゴＣ儲Ｔｉテ！１ｅＡｌｅ０１ｕＶａ１０１ｕ＾ｍｎＭｐＯ １ｕＮｅｔＰｒ６＾１−＾＃ｔａｕｐｒｏＳｉｒし・ｕ＾１ａＡｌａ＾ａｐＦＩ ｈａ３Ｇ９（Ｆ’ｌ’ｒＱＡＡＮ７ｒＡｌｌｉｆｆＱＡＴＧＴ？ＴＯＣ＾ＡＡＡ １ｉＣ丁＾〒Ｃｃ′ｒＧ鳥ｃｏｅ＾＾＾ａａ＾Ｔ１１ｍ１ニアＴＣＣ’窒f００ ＣＡ？０ Ｖａｌ　Ｏｌｕ　ｔ４ｒ　ｔｙｓ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　ａｙｓ　ＬＩｆＭ　Ａｓｎ 　Ｑｒ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　ＬＹｓ〜ｑ　Ｖａｌ　Ｐ■＝@Ｌａｕ　Ｇｌ ｙ　Ｎｅｔ　３２９ 〒〒ＴＴＴ’Ｑ？Ａ？ＧＡＡ’ｒＡ？１１０ＡＱＡｒＣＡ？０ｒＯＡ？？ＡＣ〒 ｅ’ｒ０７１：ＯＴＡＣＴｉＣＴＣＣＴＧｍ（？ＩＴＰｈａ　ＩＪｕ　’Ｔ’ｙ ｒ　Ｑｌｕ　ＴｙｒＡｌａ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｈｌｍ　Ｐｒｏ　Ｍｐ　１７ｒ　 Ｈｅｒ　Ｖａｔ　Ｖａｌ　Ｌａｕ@Ｌａｕ　Ｌａｖ　Ａｒｇ　ｔａｕ　３４９（ Ｋｌ：Ａ＾ＧＡＣＡ？Ａ〒（ＩＡ＾＾Ｑ：Ｎ？ｒＣＴＡＱ＾〇八＾Ｇ〒ＱＣ〒ａ へｒＯＣＣａｑ−Ω＊Δ−Ω＾丁ＣＣＴＣＡ〒ＱＩＬＡ！Ａｌａ　ｔｙｓ　Ｔｈ ｒ　Ｑｒ　Ｏｌｕ　ｔｈｒ　Ｔｈｒ　１４１１０１ｕ　Ｌｙｅ　Ｃｙｇ　ｃｙｓ ＾ｌａ＾ｌａ　ＡＬａ　ｋｑ　Ｐｒｏ@）ｌｉｓ　Ｇｌｕ　Ｃｙｓ　３６９ 〒＾〒ＯＣＣ入八＾０テ０テテｅＯＡ丁Ｃ八＾Ｔテテλ＾＾ＣＯ〒ＣＴＴｃＴａ ａ＾＾ＧＡＯＣＣＴＣ八Ｇ入＾〒〒Ｔ＾Ａ↑Ｃ＾＾＾’ｒ’ｙｒ　Ａ１１ｌ　Ｌ ｎ　ｖａｌ　ｐｍ　Ａｓｐ　Ｃ１ｕ　ｔｈｅ　Ｌｖｇ　Ｐｒｏ　Ｌａｕ　Ｖａｌ 　Ｑｌｕ　Ｃ１ｕ　Ｐｒｏ　Ｇｉ氏@Ａｓｎ　Ｌａｕ　Ａｌａ　Ｌｙｅ　３＠９ ＣＡ＾＾＾Ｔ　？０７０ＡＯＣＴＴ〒Ｔ丁Ｇ＾ａＣ＾Ｇ　ＣＴｒ　ＯＣＡ　Ｑ＾ Ｇ丁＾Ｃ入＾＾丁Ｔｃｃ＾Ｇ入＾〒０ＣＧｃＴ＾ＴＴＡ　（VｒＴ Ｇｉｎ　Ｍｎ　Ｃｙｓ　ＧＬｕ　ＩＪυＰｌｙ　Ｇｌｕ　Ｇｉｎ　ｕｕ　Ｇｌｙ 　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ｌｙｅ　Ｐｈｅ　（ｉｌｎ　ｋｓｎ＾ｌ＝@Ｌａｕ　Ｌａｕ 　Ｖａｌ　４６９ ０ｆｆｒ？ＡＣＡｄ：ＡＡＯＡＡＡＧＴＡＣｆＩＣＡＡ（７１’Ｃ〒ＣＡＮコｒ ｃｃ＾ＡｃｔｅＴＴａ〒＾０ＡＧＯＴＣＴＣＡ＾ＧＡＡＡＣ＾ｒｖｔｙｒ〒ｈｒ ＬｙｎＬｖｇＶａｌＰｒｏＯ１ｎＶａｌＳ＠ｒ？ｈｒＰｒｏＴｈｒｔａｕシー１ ０１ｕＶａｌＳｅｒ１０１ｕＶａｌＳｅｒＡｒ　００＾八＾＾Ｇ丁ａ　ａｙ：ｍ 　＾＾＾〒ａＴ〒ＧＴ　ＡＡＡ　ＣＡＴ　ＣＣＴ　ＧＡＡ０Ｃ＾＾＾＾　＾Ｇ＾ Ａ↑ＧＣＣＸ−τ（s　（ＣＡ Ｌａｕ　Ｏｌｙ　ＬｔｙＣｙｍｌ　ＱＩ’ｌ　Ｓｅｒ　ｕｌｓ　Ｃｙｓ　Ｃｙｓ 　ｕｙｓ　Ｈｌｍ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ＾ｌａ　Ｌｙｓ＾ｒｇ　lｅｔ　Ｐｒｏ　Ｃ ｙｓ　Ａｌａ　４４９（！ＡＡＣ＆ｌ（丁Ａ丁Ｃ丁ＡＴ１１？（ｉ’ｍＧＴｅＣ ＴＧＡＡＣＣＡＧｆｒＡＴｖｒ（＋ＴＯＴＴＣＣＡ丁ＱＡＯＡＭＡＣＯＣＣＡＧ Ｔ` Ｇｌｕ＾＃ＴＹｒｔａｕｓｅｒＶａｌＶａｔｌｎｕＡｉｎＧｌｎし・ｕＣｙｓＶ ａｌＩａｕＨｌｍＧｌｕしｙｓＴｈｒＰｒｏＶａ１４６９にπＧＡＣＸスク℃に ：ＣＡＡＡ　７１１１：　Ｗ　ＮＩＪ　ＧＡＡ　’ＴＣＣ７１℃ａｙ　ＡＪＣｘ 　ａスα講π℃ηテπ講＄＠ｒ　Ａｊｐ　Ａｒ９　Ｖａｌ　ＴＹｒ　Ｌ＋ｙｊ　 ａｙｓ　Ｃｙｓ　笥ｒ　Ｇｌｕ　Ｉｓ＠ｒ　Ｌ＃ｌＪ　Ｖａｌ　Ｉｌｕ＋ｎ　Ａ ｒｑ@Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｃｙｓ　ｔｈｌｌ　胸ｒ　４８９αテｃｒａωいＱ℃ω Ｔυ講にスＴＡＣ＋７’１丁αでＭ講ＱＣｉテ紡ＴαゴＧＡＡＭ講ｆｆに℃ｉ℃ Ａｌａ　Ｌ＃ｕＯ１ｕ　ｖａ１Ａｊ９　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　ＶＮ　Ｐｒｏ 　ｔｙａ　Ｇｌｕ　ｐｈｅ　Ａｇｎ＾Ｌ＋ｔ　ＧＷ　Ｔｔｔ秩@Ｐｈｅ　Ｔｈｒ 　ｋ　５０９ ＣＷ　（ＸＪ　ＯＡＴ　ｋＴｋ　ＴＯＣＪｔＣＡ　ｅｒｒ　ＴＣ’ｒωＷ　ＡＡ ＯＧＡＯＡＯＡ　ＣＭ　ＡＩ’ＣＡＡＯＡＭ　ＣＡＡ　ＡＣs　Ｇｌ：Ａ　ＣＴ ｒ ＨＬｍ＾１ｍＡｍｐ１１１１ｃｙｓＴｈｒＩＪｕｓｅｒＧｌｕしｙ＠Ｇｌｕ＾ｒ ｇａｌｎ１１・ＬｙｓしｙｓＯ１ｎＴｈｒ＾１Ｇしｅｕ５２X ―丁ＧＡｌｆ　ＣＴｒ　ＣＴ’Ｇ　ＡＡＡ　ＣＡＣＭＧ　ＣＣＣＡＡＧ　（（Ａ 　ＡＣＡ　ＡＡＡ　ＧＡＧ　ＣＡＡ　ＣＴＣＡＭ　（Ｃ’ｒ@Ｇ’ｌＴ　Ａ’ｍ 　ＣＪ＋Ｔ ＶａｌＧｌｕＬｅｕＶａｔＬｙｅ）ｌｉｅＬｙｅＰｒｏＬｙｓ＾１ａＴｈｒｔ、 ＹｓＯｌｕＣｌｎＬｏｕｔ、ｙｓ＾ｌａＶａＩＭｅｔ＾’１j５４９ Ｇ八ＴＴｒＣ（ＣＡＯＣＴｆｆｒＧＴＡＧ八ＧＡＡＧ７１）Ｃ’ＩへＧＣＡＡＧ ＧＣＴＧＡＣＧ＾〒入鳥ＧＧ＾Ｇ＾ｃｃ’ｒｃｅ’ｒｒｒｃモ■ 八ｔｐＴ’ｍ＾ｌ−＾１ａＦ’ｈ＊ＶへｌＧｌｕＬｙｇＣｙｓＣｙｓしｙｍ八へ ａ＾ｑ＾ｇＬｙｉＧｌｕＴｈｒｃｙｓＰｔ＋ｅＡｌａ５６９ＴＯＣＣＡＧＧＡＧ ＣＣＧＱＧ＾０ＯＣＣＷ；（ｉＴＧ（？ＴＧＣＣＴＣＣＣｋｃ八Ｇ八ＴＣｊＣＣ ＣＣへＧへＧＩｃｃＣＣＣ）ＣＣ）ＣＴＣｙｓ　Ｇｉｎ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｇ＋ ’／　ＧｌｙＬｅｕ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　ｐｒｏ　ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ａ１１ｐ＾ｌ ａ　ｐｒｏ　Ｖａｌ@Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｔｔｔｒ　６０９Ｌ：ＪｃＣＴ ｆｆｉ　（７ＴＣｆｆ　ｍ　ＣＴＣＣＡＴ　（ＸＸ’　ＴＣ’ＣＴＣＣＡＯＧ　 ｌ？１℃賀工ωβαゴＧＡＧ　７１テＧＡＡ　i７ｒＯＣＴ’０ 〜ｒｐ　Ｌａｕ　Ｖａｌ　Ｐｈｅ　ｔａｕ　ｔａｕ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　 Ｓｅｒ　Ａｒｇ　ｔａｕ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｇｌｕ@Ｐｔｗ　Ｇｌｕ　 ＶａＬ　ｔａｕ　６４９ＡＡｌｎ　０１！　ＴＴＴ　ケ℃（７Ｔ’ＣＦ　（ＡＣ ＡＴＣＡＴＯＧＡＧαカ１α℃＾ππｘ　ＣＡＧ　ＡＩＩＩＧ　’ｒｗ　ｃｒｒ ｃ　pＸ：　ｏ’ｒａ しｙｍ　Ａｌａ　Ｐｈ＠Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ｍｅｔ　ｍｔ　ｄｌｕ　Ａｒ ａ　Ｌａｕ＾ｔ’Ｑ　ｌｉｅ　ｋｒ　Ｇｌｎ　Ｌｙｓ　Ｔｒ吹@Ｖａｌに＝ｇ　 Ｖａｌ　６６９ α！　ＧＴＧ　（ｍ　（ｌＪ４　ＴＡＣＣＡＣＧＡＣ（ｆｆ　ＴＥＸ　ＣＡＣα ！　’ｒＡＣＡＴＣαｃ　ＣＴＣＡＡＧ　ａｘ　ＣＱＩＩＩ@ＡＡＧ　ｃｃｘ ＡｌａＶａｌＶａｌＧｌｕＴｙｒＨ１ｓＡｓｐＧｌｙＳｅｒＨ１ｓＡｌａＴｙｒ Ｉｌ＊ＧｌｙＬａｕＬｙｓ＾ｓｐＡｒｇＬｙｓＡｒｇ６！１X αｎ　ＴＣＡ　ＧＡＧ　ＣＴＧ　ＯＡ　ＣＧＣＡＴＴα：ＣＡＧＣＧＡＧ　０？ １：＋　ＡＡＧ　Ｔ＾ＴＯＣＧαＣＡＯＣＣＡＧ　ｆｆｒｏ@（！工π℃ Ｐｒｏ　Ｓ＠ｒ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　１１＠＾ｌａ　ｂｒ　Ｇｉ ｎ　ｖａｌ　Ｌｙｓ　ＴｙｒＡｌａ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　ａｌ氏@Ｖａｌ＾ｌａ　 Ｓｉｒ　７０９ Ａｃｅ　ＡＯＣＧＡＧ　ＧＴＣＴＴＧ　ＭＡ　ＴＡＣＡＣＡ　ＣＴＯ’ｒＴｃ　 ＣＡＡ　Ａπ：　ＴＩ’ｌｌ”　ＡＧ：　ＡＡＧ　ＡＴＣＧ`Ｃα℃αゴ賜 ＴｈｒＳｅｒＧｌｕＶａｌｌｊ２ＬＩＬｙｓＴｙｒＴｈｒｔａｕＰｈｅＧｉｎｌ ｉｅＰｈｅｓｅｒｔ、ｙｓＩｌｅＡｓｐｋｒＱＰｒｏＧｌｕt２９ ０！　ＴＣＣＣ１）：　ＡＴＣＧ：ＣＣＴＧ　ＣＴＣＣ’ｌ’Ｇ＾ＴＧ　Ｃｃｃ ＡＧＣＣＡＧ　ＧＫ　Ｃｏ：　ＣＭ　Ｃｏｏ＾ＴＧ　ＴＣＣbＯ［ｌｉ　ＡＡＣ ＡｌａｓｅｒＡｒｇＩｌｅＡｈａＬｉ＝ｕＬｅｕＬａｕＭｅｔＡｌａ５ｅｒＧｉ ｎＧｌｕｐｒｏＧｉｎＡｒ９ＭｅｔＳ＠ｒＡｒ９八５ｎ７４X ＴＴＴ　（ｆ　ＣＱＣＴＸ’　ＧＴＣＣＡＧ　（ＸＩ（ＣＴＧ　ＭＧ　ＡＡＧ　 ＡＡＧ　ＡＡＩｆｆ　ｌｌＦｍ　ＡＴｒ　＋７ｒＧ　Ａ’Ｗf　ＣＣＯＣＴＯ（ ＩＯｃ　Ａ’１７ Ｐｈｅ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　ＴＹｒ　Ｖａｌ　Ｇｉｎ　Ｏｌｙ　Ｌａｕ　Ｌｙｓ　 Ｌ、ｙｓ　ｇｍ　ｂｙｔｓ　Ｖａｌ　Ｉｌｅ　Ｖａｌ　ｌｉ■@Ｐｒｏ　Ｖａｌ 　（Ｉｌｙ　ｌｉｅ　７６９α刀αＩＣ＾Ｔ　ａｃｃＡＡＣＣＴ’ＣＡＡＧ　Ｃ ＡＧ　ＡＴＣα℃０℃＾ＴＣＧＡＧ　ＡＡＧ　ＣＡＧ　（ＣＴαＴＣＡＧ　Ｍｅ 　ＡＡＧＧｌｙＰｒｏＨｉｓＡｌａＡｓｎＬｅｕＬｙｓＧｉｎｌｉｅＡｒｇＬｅ ｕｌｉｅＧｌｕＬｙｓＧｉｎ＾１ａＰｒｏＧｌｕ＾ｊｎしｙｓ７Ｑ９ＧＣＣＴＴ Ｃ（ｎ’Ｇ　ＣＴＣ八ＧＣ八ＧＴ　ＧＴＩ：ｉ　Ｇ＾ＴＧ八Ｇ　へＴＣＧ＾ＧＣ 八ＣＣへ＾　＾ＧＧＧ＾Ｃａ八Ｇ　ＡＴＣへＴＴ@＾ＩＸ’　丁ＡＣ Ａｌａ　Ｐｈ＠Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｊｖｐ　Ｇｌｕ　Ｌ ｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｎ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　hｌｅ　Ｖａｌ　Ｓ ｅｒ智ｒ８０９ σ℃ππＧに口了俣てαゴω鴨α℃αゴαゴαテＡＣＴ　（ｊ℃α：（ＣＣＣＧ Ｎ：Ａ■αフＣＡＡＧＴＣ−Ｃｙｓ　Ａｓｐ　Ｌａｕ＾ｌａ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ＾ ｌａ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　ＰＨＩ　Ｔｈｒ　ｔａｕ　Ｐｒｏ　ｆｚｓｒ　Ａｓｐ　 Ｍｅｔ@Ａｌａ　Ｇｉｎ　Ｖａｌ　８２９ 丁＾ＡＧＣＴＴ Ｆｉｇｕｒ＠ｌ　（ｃ） Ｆｉｇｕｒｅ　２Ａ （場合により）　Ｆｉｇｕｒｅ四 （場合ニヨリ）　Ｆｉｇｕｒｔ２Ｃ ｒｉｇυｒｅ２ ↓ Ｆｉｇｕｒｅ　３　（ａ） ｐＹＧ１３７ｊ　ｐＥＴ−８ｃ５２にへのＩ’ＣＲｖｗＦａ＊＊−ｐ７ｏａ　ｓ ｓｏロ　ｐＭ１３フ５ＵｑＨ１）ｆｆ＋シロ０２１ ｐＹＧ１３６！　ｐＥＴ−８ｃ５２にへのｒ’ＣＲｗｖＦ５ｏＬ＞１４　なし　 ｐＹｄ＋３１１＋Ｅｑｌ＆２１ａｇｑ九ス２＋ ｐＹｃＩ５５０　５ｑ２７５１＋５ｑ２７５２１：Ｊ’＆ｐＹＧ＋３０９　ｖｌ ｆｆｓＯ２−＋−７０４なＬ　ｐｒａｌｓｓｓの１ｌｓｔＩＩ−ＰｓｔＴ７ラグ メノトの１・・・・・・・　ｒ嘉％ｃ！＋■Ｓ品Ｒ−・・・−・・・・　・・・ ・・・・・・・・・・・・　・・・・・・・ｒＹｃ１２７１　ｐ５Ｅへのｌ’Ｃ Ｒｖｖｒ４フ０−〉ツボ３　Ｔ喝Ｉｓ、丁４９２ｒ　丁４ヲ）＋　ｐＹＧ１２１ ３＋ｆｑ２１４９＋５ｑ２６２９ＩＣ４７１Ｇ、Ｃ４１４０Ｍ％０６＋Ｔ１０Ｓ ＰＹＧｌ１７４　５ｑ３０１７＋Ｓｑ３０１８ｍＪろＩ）ＹＧ１３５９　、ｗｖ ＜ｔｏ−−７ｏ４　丁４＠５＋　Ｔ４９２ＨＴｉ９３＋　ｐxａ１３フ７ ｆ’＋ＥｃｏＲＶ−Ｍ］ｕ１７ラグメン）のＢｑ　Ｃ４７１′＋　ｅ４７４１ｆ ｆ＋　ｓｓｏ。

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Claims (23)

【特許請求の範囲】
1. １．ｖＷＦ構造から誘導され、血小板及び／又は内皮下層へのｖＷＦの結合に少 なくとも部分的に拮抗することができる接着部分、ならびに生体内でのその安定 化及び露呈を可能にする部分を含む組み換えポリペプチド。
2. ２．接着部分がｖＷＦの残基４４５と７３３の間のペプチド配列の全体又は一部 、あるいはこの配列の変異体を含むことを特徴とする請求の範囲１に記載のポリ ペプチド。
3. ３．接着部分が （ａ）ｖＷＦの残基４４５〜７３３の間のペプチド配列、又は（ｂ）ＧＰ１ｂ及 び／又は内皮下層へのｖＷＦの結合に少なくとも部分的に拮抗することができる ペプチド配列（ａ）の一部、又は（ｃ）構造的修飾（突然変異、付加置換、及び ／又は１つ又はそれ以上の残差の欠失）により構造（ａ）又は（ｂ）から誘導さ れ、ＧＰ１ｂ及び／又は内皮下層へのｖＷＦの結合に少なくとも部分的に拮抗す ることができる構造、又は （ｄ）例えばランダムペプチドバンクから単離され、ＧＰ１ｂ及び／又は内皮下 層へのｖＷＦの結合に少なくとも部分的に拮抗することができる非天然のペプチ ド配列 から選ばれる構造を有することを特徴とする請求の範囲２に記載のポリペプチド 。
4. ４．接着部分がＰ１、Ｐ２、Ｘ、ＸＤ及びＸ＊型ペプチド又はこれらのペプチド のいずれかの互いの組み合わせから選ばれる配列を含むことを特徴とする請求の 範囲３に記載のポリペプチド。
5. ５．ペプチドの組み合わせがＰ１−Ｐ２型、Ｐ１−Ｘ型、Ｐ１−ＸＤ型、Ｐ１− Ｘ＊型、Ｘ−Ｐ２型、ＸＤ−Ｐ２型、Ｘ＊−Ｐ２型、Ｐ１−Ｘ−Ｐ２型、Ｐ１− ＸＤ−Ｐ２型及びＰ１−Ｘ＊−Ｐ２型ペプチドから選ばれることを特徴とする請 求の範囲４に記載のポリペプチド。
6. ６．接着部分が１回より多く露呈される請求の範囲４及び５に定義された型のい ずれかのペプチドを含むことを特徴とする請求の範囲４に記載のポリペプチド。
7. ７．接着部分が安定化構造のＮ−末端にカプリングしていることを特徴とする請 求の範囲１〜６のいずれか１つに記載のポリペプチド。
8. ８．接着部分が安定化構造のＣ−末端にカプリングしていることを特徴とする請 求の範囲１〜６のいずれか１つに記載のポリペプチド。
9. ９．安定化構造が血漿半減期の長いポリペプチドであることを特徴とする請求の 範囲１〜８のいずれか１つに記載のポリペプチド。
10. １０．血漿半減期の長いポリペプチドがアルブミン、アポリボタンパク質、免疫 グロブリン又はトランスフェリンなどのタンパク質であることを特徴とする請求 の範囲９に記載のポリペプチド。
11. １１．血漿半減期の長いポリペプチドが請求の範囲１０に記載のタンパク質の構 造的修飾（突然変異、付加置換及び／又は１つ又はそれ以上の残基の欠失、化学 的修飾）により誘導されることを特徴とする請求の範囲９に記載のポリペプチド 。
12. １２．安定化構造が、それが用いられる生物に関して弱い免疫原性であるか又は 非免疫原性のポリペプチドであることを特徴とする請求の範囲９〜１１のいずれ か１つに記載のポリペプチド。
13. １３．安定化構造がアルブミン又はアルブミンの変異体であることを特徴とする 請求の範囲９に記載のポリペプチド。
14. １４．請求の範囲１〜１３のいずれか１つに記載のポリペプチドをコードするヌ クレオチド配列。
15. １５．発現されたポリペプチドが分泌されるようにするリーダー配列を含むこと を特徴とする請求の範囲１４に記載のヌクレオチド配列。
16. １６．転写開始領域及び場合により転写停止傾城の制御下で請求の範囲１４及び １５のいずれかに記載のヌクレオチド配列を含む発現カセット。
17. １７．請求の範囲１６に記載の発現カセットを含む自己複製プラスミド。
18. １８．請求の範囲１４及び１５のいずれかに記載のヌクレオチド配列、又は請求 の範囲１６に記載の発現カセット、又は請求の範囲１７に記載のプラスミドが挿 入された組み換え真核又は原核細胞。
19. １９．酵母、動物細胞、菌又はバクテリアであることを特徴とする請求の範囲１ ８に記載の組み換え細胞。
20. ２０．酵母であることを特徴とする請求の範囲１９に記載の組み換え細胞。
21. ２１．サッカロミセス又はクルイベロミセス属の酵母であることを特徴とする請 求の範囲２０に記載の組み換え細胞。
22. ２２．請求の範囲１８〜２１のいずれか１つに記載の組み換え細胞を発現のため の条件下で培養し、生産されたポリペプチドを回収することを特徴とする請求の 範囲１〜１３のいずれか１つに記載のポリペプチドの製造法。
23. ２３．請求の範囲１〜３０のいずれか１つに記載のポリペプチドを１種又はそれ 以上含む製薬学的組成物。