JPH0353893A - リンホトキシン誘導体の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、抗腫瘍剤として有用なヒトリンホ１・キシン
誘導体を大量に製造するための方法に関する。

〔従来の技術及び発明が解決しようとする課題〕リンホ
トキシンはリンパ球をマイトジエンで刺激したときに産
生されるリンホカインの一つであり、抗腫瘍活性を有す
る。リンホトキシンのｃＤＮＡ（Ｐ，Ｗ．Ｇｒａｙら、
Ｎａｔｕｒｅ　３１２：　７２１，　１９８４；　Ｙ．
Ｋｏｔ＋ａｙａｓｈｉら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１００
：　７２７，　１９８６；特開昭６２−　２８２５８３
）やゲノム遺伝子（（；，ｌ’ｉ，Ｎｅｄｗｉｎら、Ｎ
ｕｃＩｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１３：　６３６Ｌ
　１９８５；　　特開昭６２１１０９５）が各種細胞か
らクローニングされ、これを（２） 用いて大腸菌（特開昭６１−５６１９７　、特開昭６２
１５１１８２、特開昭６２−２８２５８３）あるいは動
物細胞（特開昭６１−５６１９７　、特開昭６ｉ１１１
９２８、特開昭６２−１８１７７９、特開昭６２−１９
５２８５、特開昭６３２４５６９２）で発現した組換え
リンホトキシンが得られている。

又Ｎ末端を欠失したリンホトキシン誘導体を大腸菌で発
現させた例もいくつか報告されている（特開昭６２−１
８１２９８、特開昭６３　−　８３９８、特開昭６３８
３９９、特開昭６３−６３３９２　、特開昭６３　−　
２７０６９８、特開昭６４　−　６２９８）。この中に
２０番目のメチオニンのコドンを翻訳開始コドンとして
使用しこのメチオニンから始まる誘導体を発現さセた物
（特開昭６２−１８１２９８、特開昭６３−８３９９）
も含まれているが、大腸菌内で発現させた場合Ｎ末端の
メチオニンが欠失している可能性がある。

しかしながら、前記いずれの方法においても、ヒトリン
ホトキシン又はそのＮ−末端欠失ＢＭ　Ｎ体をそれ自体
として発現せしめる方法であり、融合蛋白質として発現
せしめる方法ではない。これら（３） の方法には、目的蛋白質の発現量が比較的少いという共
通の問題点がある。

国際公開問８８／０９３４３にはリンホトキシンとプロ
テイン−Ａとの融合蛋白質の高レベルの発現が記載され
ている。しかしながら、それに記載されているのは融合
蛋白質の製造を目的とする方法であって、該融合蛋白質
からヒ１−リンホ１・キシンを開裂・単離する方法は開
示されていない。一般に融合蛋白質を開裂せしめて目的
蛋白質を単離する方法の１つとして酵素による方法が知
られている。しかしながら、目的蛋白質中にその酵素の
ための認識部位が存在する場合、目的蛋白質がそごで切
断され、目的とする全長帯白質が得られないと言う問題
点がある。例えば、天然型リンホトキシンをトリプシン
で処理すると、１５番目のアルギニンと１６番目のグル
タ５ンの間、１９番目のリジンと２０番目のメチオニン
の間、８９番目のリジンと９０番目のアラニンの間でそ
れぞれ切断され４つの断片になることが知られている　
（Ｂ．Ｂ．Ａｇｇａｒｗａｌら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．２６０：　２３３４．　１９８５）。従って、融合
蛋（４） 白質を介してのヒトリンホトキシンの製造に当っても、
融合蛋白質をトリプシン等で処理することによりヒトリ
ンホトキシンが複数の断片に切断されてしまい目的とす
るリンホトキシンは得られないと予想されるところであ
る。

〔課題を解決するための手段〕

しかしながら、全く予想外なことに、ヒトリンホトキシ
ンを他の蛋白質との融合蛋白質として発現せしめ、これ
をプロテアーゼ阻害剤の非存在下、すなわち宿主細胞が
本来イｆしているプロテアーゼ活性の存在下で発現生戒
物を回収する場合、ヒトリンホトキシンの１９位のリジ
ンと２０位のメチオニンとの間のペプチド結合が選択的
に切断され、すなわち、前記Ａｇｇａｒｗａｌら、Ｊ．
Ｂｉｏ１．Ｃｈｅｍ．２６０，２３３４．１９８５に記
載されている８９位のリジンと９０位のアラニンとの間
ではあまり切断されず、この結果ヒトリンホトキシンの
２０位のメチオニンからＣ末端側全体から成るＮ末端欠
失ヒトリンホトキシン誘導体が効率よく得られることを
、本発明者らは見出（５） した。

本発明者らはさらに、ヒトリンホトキシンと他の蛋白質
とから成る融合蛋白質を１−リプシン又はトリプシン様
プロテアーゼで処理する場合もやはり１９位のリジンと
２０位のメチオニンとの間が優先的に切断され、２０位
のメヂオニンからＣ末端側全体から戊るＮ末端欠失ヒ１
・リンホ１・キシン誘導体が効率よく得られることを見
出した。

本発明は上記のごとき新規な知見に基くものであり、ヒ
トリンホ１・キシンの１９位のリジンからＮ末端側のペ
プヂド部分を欠くヒ１・リンホ１・キシン誘導体の製造
方法において、ヒトリンホトキシンの１９位のリジンよ
りＮ末端側の任意の部位において他の蛋白質と融合して
成る融合蛋白質をコードする遺伝子を含有する発現プラ
スミドにより形質転換された微生物宿主を培養して該融
合蛋白質を生成せしめ、そして蛋白質分解酵素阻害剤を
添加することなく、培養物から前記ヒトリンホトキシン
誘導体を採取することを特徴とする方法；並びにリンホ
トキシンの１９位のリジンからＮ末端側の（６） ペプチド部分を欠くヒトリンホ１・キシン誘導体の製造
方法において、ヒトリンホ１・キシンの１９位のリジン
よりＮ末端側の任意の部位において他の蛋白質と融合し
て成る融合蛋白質をトリプシン又はトリプシン様プロテ
アーゼで処理することにより１９位のリジンと２０位の
メチオニンとの間のベプチド結合を優先的に開裂せしめ
ることを特徴とする方法を提供するものである。

〔具体的な説明〕

本発明の方法は融合蛋白質中に含まれるヒトリンホｌ・
キシンの１９位のリジンと２０位のメチオニンとの間を
プロテアーゼの作用により選択的に切断することを特徴
とするものであり、リンホトキシンに必要な条件は融合
蛋白質のリンホトキシン領域が少なくとも１９位のリジ
ンからＣ末端側を含むことである。すなわち、第１８位
のセリンからＮ末端側の構造は特に限定されない。例え
ば１９位のリジンから上流の任意の位置で他の蛋白質と
直接結合していてもよく、またア尖ノ酸又はペプチドか
（７） ら成るリンカーを介して結合していてもよい。また、１
９位のリジンからＣ末端側のア≧ノ酸配列は天然ヒトリ
ンホトキシンのアミノ酸配列でもよく、リンホトキシン
活性を有する如何なるヒトリンホ１・キシン変異体であ
ってもよい。

融合蛋白質を構成するリンホ１・キシン以外の蛋白質（
パートナー蛋白質）は、融合蛋白質の形或のために知ら
れている任意の蛋白質であることができる。具体的な例
としてプロテインーＡ又はその部分を挙げることができ
るが、これに限定されるものではなく、使用される宿主
において天然に大鼠に産生されている種々の蛋白質、あ
るいは組換え体として大量に産生される蛋白質、例えば
宿主が大腸菌である場合、β−ガラクトシダーゼ、β−
ラクタマーゼ、メタピロ力テカーゼ等を使用することが
できる。この様な蛋白質としては、該蛋白質内部にトリ
プシンもしくは１−リプシン様プロテアーゼの認識部位
、又は使用される宿主細胞中に自然に存在する他のプロ
テアーゼの認識部位を含み、トリプシンもしくはトリプ
シン様プロテ（８） アーゼ処理によってリンホトキシンの回収の間該細胞内
プロテアーゼによって低分子量のベプチドに断片化する
ものが望ましい。

本発明の方法においては、前記のごとき融合蛋白質をコ
ードする遺伝子を含有する発現プラスミドにより形質転
換された宿主微生物を培養することにより融合蛋白質を
生成せしめる。生理活性蛋白質を含有する融合蛋白質を
コードする遺伝子を含むプラスξドは種々知られており
、またヒトリンホトキシンについて言えば、これとプロ
テイン八との融合蛋白質をコードする遺伝子を含有する
プラスミド例えばプラスミドｐＰＲＡＬＴ１（微工研条
寄第１８９９号（ＰＩＥＲ門ＢＰ−１８９９）が国際公
開ＷＯ　８８／０９３４３において知られており、本発
明についてはこれらのプラスくドを用いることができる
。また、リンホトキシン以外の生理活性物質の融合蛋白
質中のバー１・ナー蛋白質をコードする遺伝子を含むプ
ラスξドが種々知られており、これらのプラスくドから
パートナー蛋白質の遺伝子を切り出して前記プロテイン
八を含む融合蛋白の遺伝子と置き（９） 換えることは常用技術により可能である。従って、本発
明においては、前記具体的に挙げたプラスミド以外に種
々のプラスミドを作製しそれを用いることができる。

本発明の１つの態様によれば、大腸菌等の微生物宿主中
で前記融合蛋白質を生或セしめ、次にこれを常法に従っ
て回収・桔製し、その場合にプロテアーゼ阻害剤を添加
しない。こうずることにより、宿主細胞により生産され
たプロテアーゼが融合蛋白質に作用して、これを、ヒト
リンホトキシンの１９位のリジンと２０位のメチオニン
との間で切断する。目的蛋白質の回収・精製は常法に従
って行うことができる。例えば宿主細胞を培養した後、
これを常法に従って、例えば遠心分離又は濾過により集
める。次に、こうして得られた細胞を、常法に従って、
例えばホモジナイザーによる処理、超音波処理等により
破砕する。この破砕物から常法に従って、例えば遠心分
離により細胞片等の固形物を除去することにより上清を
得る。この上清から目的蛋白質を得るには、蛋白質の単
離・桔製（１０） のための常法を用いればよく、具体的な例を実施例１に
記載する。

本発明の第二の態様に従えば、前記の融合蛋白質をまず
調製し、次にこれを人為的に加えたトリプシン又はトリ
ブシン様プロテアーゼ活性を有するプロテアーゼにより
１９位のリジンと２０位のメチオニンの間で切断し、目
的蛋白質を常法に従って精製する。トリプシン様プロテ
アーゼとしては、例えばプラスくン、キモトリプシン等
を使用する。

一例として、融合蛋白質をｐ１１７〜９のＴｒｉｓ緩衝
液又はリン酸緩衝液に、ｌｕｇ／一〜１０■／　ｍｌに
なるように溶解し、モル比で１／１０〜１　／１０００
量のトリプシンを添加し、室温ないし３７゜Ｃで反応す
る。

反応液の一部を採り、ＳＯＳ　−　ＰＡＧＥにかけて約
１６．５ｋＤａのリンホトキシン断片が生成しているこ
とを確認する。反応液をさらに適当なカラムクロマトグ
ラフィーに通して精製することにより、目的とするリン
ホトキシン誘導体を得ることが出来る。

この具体例は実施例２に記載してある。

（１１） ？発明の効果〕 本発明により、Ｎ末端１９アミノ酸残基を欠失ししたヒ
トリンホトキシン誘導体を大量に調製することが可能と
なり、しかも得られたリンホトキシンは抗腫瘍活性を有
することが示された。従って、本発明により、癌の治療
薬として期待されるヒ１・リンホトキシンを大量に提｛
Ｊ（することが出来る。

次に実施例により本発明をさらに具体的に説明する。な
お、実施例においては、リンホ１・キシン活性を、文献
記載の方法（Ｂ．Ｂ．八ｇ　ｇ　ａ　ｒ　Ｗ　ｎ　Ｉら
、Ｊ．Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．２６０：　２３４５−２
３５４．　１９８５）に準して測定した。すなわち、５
％牛胎児血清、０．５％ペニシリン、０．５％ストレプ
トマイシン、及び１μｇ／ｍｌのアクチノマイシンＤを
含有するイーグルＭＥＭ培地にマウスＬ−Ｍ細胞を培養
し、その３Ｘ１０’細胞／　１００ｐ１をウェルに入れ
、２倍希釈系列で希釈したサンプル１００μｌを加えて
、５％ＣＯ■雰囲気下３７゜Ｃ２４時間培養した。ウ．
ｌルを洗浄した後、０．０５％クリスタルハイオレッＬ
／ホルマリン／エタノール溶液１００〃を加えて３０分
間細胞を染色し（１２） た。次に０．０５Ｍ　ＮａＨｚＰＯ４／エタノール溶液
１００ＩＩｌで色素を溶出し、分光光度計を用いて５７
０ｎｍの吸光度を測定した。吸光度を希釈倍列に対して
プロットし、５０％殺細胞に要する量を１ユニットと定
義し、リンホトキシン活性を求めた。

大腸菌ＨＢＩＯＩ／ｐＰＲＡＬＴ１（プラスミドｐＰＲ
ＡＬＴ１を含有する大腸菌χ１７７６／ｐＰＲＡＬＴ１
が微工研条寄第１８９９号として寄託されている。）を
アンピシリン５０μｇ／一含有２ＸＴＹ培地（１．６％
バタトトリプトン、１％バクトイーストエキストラクト
、０．５％ＮａＣ　ｊ２　）に懸濁し、一晩前培養を行
った後、５ｌのアンピシリン５０μｇ　／　ｍｌ並びに
０．１％グリセロール含有２ＸＴＹ培地に懸濁し、３７
゜Ｃで１６時間培養した。培養液を７０００ｘ　ｇ　．
　３０分間遠心して集菌し、菌体２１２ｇ　　（湿重量
）を得た。これをリン酸緩衝液（０．ＯＩＭリン酸緩衝
液、ｐｌｌ８．　２　，　０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０）
２Ｉ！．に懸濁し、ゴーリンホモジナイザーで３回ホモ
ジナイズした。上清に硫安を加え、１０％硫（１３） 安画分を除去した後、３０％硫安沈澱を得た。これを７
％硫安を含む２５０ｍｇ．のリン酸緩衝液に溶解し、同
緩衝液で平衡化したブチル１・ヨパール力ラム（カラム
容積６０ｍｆｉ）にかけた。全てのカラム操作は室温で
行った。同緩衝液で洗浄した後、リン酸緩衝液で溶出を
行った。溶出液をリン酸緩衝液に対して透析し硫安を除
去した後、リン酸緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ　｝ヨバ
ールカラム（カラム容積８０ｍｌ）にかけた。Ｏ〜ＩＭ
のＮａＣｌ．濃度勾配をかけたリン酸緩衝液で溶出し、
０．２Ｍの溶出画分２００ｍｌを集めた。溶出液１０　
ｒｔｒＲをリン酸緩衝液で平衡化したセフアクリルＳ−
３０００カラム（１８０ｍｊ！）にかけ、リンホトキシ
ン活性を有する両分を集めた。生或産物の分子量はＳＯ
Ｓ　−　ＰＡＧＥで約１６．５ｋＤａであった。

精製ポリペプチドの総収量は約６０ｍｇであった。

Ｕ　　　人ポリペプチドのトリプシン 大腸菌１１ＢＩＯＩ／ｐＰＲＡＬＴ１（ｐＰＲＡＬＴ１
を含有する大腸菌がχ１７７６／ｐＰＲＡＬＴ１微工条
菌寄第１８９９号として寄託されている。）をアンビシ
リン５０μｇ　／　ｍｌ含有Ｌブロス（１．０％バタト
トリプトン、０．５％ハ（１４） クトイース１−エキスｌ・ラクト、０．５％ＮａＣ　ｌ
　）に懸濁し、一晩前培養を行った後、５Ｉｌの同培地
に懸濁し、３７゜Ｃで１６時間培養した。培養液を４　
”Ｃ７０００Ｘ　ｔ：　．　３０分問遠心して集菌し、
菌体１５０ｇ（湿重量）を得た。これをＴＢＳ緩衝液（
１０ｍＭＴｒｉｓ−１ＩＣ／．，　　ｐＨ８．２，　　
１００ｍＭ　　　ＮａＣｆｆ　　，　　ｌｍＭ　　ＥＤ
ＴＡ）２Ｉ！．に懸濁し、超音波破砕した。上清に硫安
を加え７％硫安画分を除去した後、上清にＴｗｅｅｎ２
０を０．０２％になるように添加し、７％硫安を含むＴ
ＥＴ緩衝液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＩＩＣ之，　ｐｌ＋
８．　２　．　１ｍＭ　ＥＤＴＡＯ．０２％Ｔｗｅｅｎ
２０）で平衡化したプチルトヨパールカラム（カラム容
積６０ｍＲ）にかけた。全てのカラム操作は４℃で行っ
た。同緩衝液で洗浄した後、ＴＥＴ緩衝液で溶出を行っ
た。溶出液をＴＥＴ緩衝液に対して透析し硫安を除去し
た後、同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ　Ｉ−ヨパール力
ラム　（カラム容積８０ｍＲ）にかけた。０〜ＩＭのＮ
ａＣ　１濃度勾配をかけたＴＥＴ緩衝液で溶出し、０．
２Ｍの溶出画分２００雌を集めた。

この両分にトリプシン（シグマ社製、ｎｏｖｉｎｓ（１
５） Ｐａｎｃｒｅａｓ　Ｔｙｐｅ　Ｘ　Ｔ　）を０．　２　
ｐｇ　／　ｄになるように添加し、３７゜Ｃ，１２０分
間反応させた。反応液にトＩＪ　’７’シンインヒビタ
ー（シグマ社製、ＳｏｙｂｅａｎＴｙｐｅ　１−Ｓ）を
０．２　ｔｔｇ／　ｍｌになるように添加した後、ＴＥ
Ｔ緩衝液で平衡化したセフアクリルＳ−３０００カラム
（２００ｍｆｆｉ）にかけ、リンホトキシン活性を有す
る両分を集めた。第１図に精製融合ポリペブチト゜並び
にトリプシン処理後の生或産物のＳＤＳＰＡＧＥを示す
。生戒産物の分子量は約１６．５ｋＤａであった。又精
製ポリペプチドの総収量は約５０■であった。

１〔安庄セ車３ユ　　′１された生Ｊ　の生′実施例１
および実施例２で得られたポリペプチドについて、Ｎ末
端アミノ酸配列分析を行ったところ、いずれもＭｅｔ　
−　Ｈｉｓ　−　Ｌｅｕ　−　Ａｌａ　−　ＨｉｓＳｅ
ｒ　−　Ａｓｎ　−　Ｌｅｕ　−　Ｌｙｓ　−　Ｐｒｏ
−＾１ａ　−　Ａｌａ−と解読出来、２０番目のＭｅｔ
から始まるリンホトキシンであることが示された。又ア
ξノ酸組戒分析の結果、第１表に示すように２０番目の
メチオニンから始まるリンホトキシンに期待される組成
と測（１６） 定誤差内で一致した。またマウスＩ、−Ｍ細胞に対する
殺細胞活性を測定したところ、２Ｘ１０′７Ｕ／■蛋白
質という比活性が得られた。

Ａｓｘ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｇｌｘ Ｇｌ　ｙ Ａｌａ Ｖａｌ Ｃｙ　Ｓ Ｍｅｔ Ｔｉｅ Ｌｃｕ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｌｙｓ １０，４ ６．４ １７．９ １３．０ ９．９ １２．７ ８．７ ０．０ ２．２ ３，３ ２１．４ ７．１ １０．０ ５．７ （１７） 築上表（続き） Ｈ　　ｉ　　ｓ ８．６ ９ Ａｒｇ ２．４ ２ Ｐ　ｒ　ｏ １０．５ ■ ■ Ｔｒｙ １．７ ２ 計 １　５２ ４．

【図面の簡単な説明】

第１図は、 融合ポリペプチトとそのトリプシン 分解産物の ＳＯＳ ＰＡＧＥを示す図である。 （１８）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ヒトリンホトキシンの１９位のリジンからＮ末端側
   のペプチド部分を欠くヒトリンホトキシン誘導体の製造
   方法において、ヒトリンホトキシンの１９位のリジンよ
   りＮ末端側の任意の部位において他の蛋白質と融合して
   成る融合蛋白質をコードする遺伝子を含有する発現プラ
   スミドにより形質転換された微生物宿主を培養して該融
   合蛋白質を生成せしめ、そして蛋白質分解酵素阻害剤を
   添加することなく、培養物から前記ヒトリンホトキシン
   誘導体を採取することを特徴とする方法。 ２、前記宿主が大腸菌である、請求項１に記載の方法。 ３、リンホトキシンの１９位のリジンからＮ末端側のペ
   プチド部分を欠くヒトリンホトキシン誘導体の製造方法
   において、ヒトリンホトキシンの１９位のリジンよりＮ
   末端側の任意の部位において他の蛋白質と融合して成る
   融合蛋白質をトリプシン又はトリプシン様プロテアーゼ
   で処理することにより１９位のリジンと２０位のメチオ
   ニンとの間のペプチド結合を優先的に開裂せしめること
   を特徴とする方法。