JP2989853B2 - ポリペプチド、その製造方法、ｄｎａ塩基配列及び形質転換細胞宿主 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はヒトエラスターゼに対する阻止作用を有する
ポリペプチド、その製造方法及びこれを含有する医薬組
成物に関する。本発明は更に、上記ポリペプチドを発現
させる（express）ための宿主の遺伝子学的修飾（genet
ic modification）、これによつて得られた宿主、上記
の修飾操作に使用される遺伝子物質（genetic materia
l）及び該物質のためのベクターに関する。

ヒト白血球エラスターゼ（HLE）は、ヒト多形核白血
球のアズール好性顆粒（azurophil granule）中に存在
するタンパク分解酵素である。通常の環境下においてこ
れらの顆粒はバクテリアのごとき外来性物質を含有する
フアゴソームと融合しまたこの粒子（顆粒）はHLEと他
のリソソーム酵素（lysomal enzyme）との組合せにより
代謝される。しかしながら、ある種の病理学的条件下に
おいては、多形核白血球はエラスチン及びコラーゲンの
ごとき宿主タンパク質に結合することになり、HLEも含
めて、上記顆粒の内容物が宿主組織（tissue）上に直接
放出される（release）ことがあり得る。その結果とし
て生ずる宿主織織上でのHLEの劣化作用（degradative a
ctivity）により組織が損傷を受け、これが気腫（emphy
sema）（２）、成人の呼吸困難症候群（respiratory di
stress syndrome）（１）、乾癬（psoriasis）（３）及
び水胞性皮膚炎（bullous dermatosis）（４）のごとき
疾患の原因となり得ると考えられる。

HLEの強力な（potent）タンパク分解作用がα_１−ア
ンチトリプシン及びα_２−マクログロブリンのごとき阻
止剤のタンパク分解阻止作用（antiproteolytic activi
ty）によりある程度緩和される（balance）ことは知ら
れている。これらの阻止剤は血清及び表皮を含む種々の
組織から検出されている（5,10）。更に、ヒト白血球プ
ロテアーゼの低分子量阻止剤が精液（11）、頸部粘液
（12）、気管支分泌物（13）及び耳下線分泌物（14）及
びヒト血清（６）中に存在することも知られている。こ
れらの供給源の全てからの阻止剤は免疫反応活性（6,1
5）又はアミノ酸配列（16,17）の分析から抗ロイコプロ
テアーゼ又はその代謝産物と同一であること及び更にト
リプシンの強力な阻止剤であることが知られている。低
分子量阻止剤はHochstrasser等によつても気管支粘液か
ら検出されており（21）、また、乾癬症の皮膚において
も検出されている（22）。トリプシンも阻止する、プロ
テアーゼに対する他の阻止剤も文献に記載されている
（18,19）。更に、エラスターゼ阻止剤は犬、ライオン
及び猫の顎下線（submandibular gland）からも検出さ
れている。

本発明の第１の要旨によれば、式I: で表わされるポリペプチドであって、ヒト白血球エラス
ターゼに対する阻止作用を有するポリペプチドが提供さ
れる。

本発明のポリペプチド又はそのフラグメントは、これ
らはヒト白血球エステラーゼ及び豚の膵臓エステラーゼ
のごときプロテアーゼに対する阻止作用を有するが、ト
リプシンに対しては有意な阻止作用を示さないという意
味においてセリンプロテアーゼについて特異的な阻止作
用を有することが好ましい。

本発明のポリペプチド又はそのフラグメントは、等電
点電気泳動法で測定して、約9.7のpHに等電点を有す
る。

上記ポリペプチド及びそのフラグメントは遺伝子工学
的方法によつて調製し得るが、ヒトの皮膚の乾癬症痂皮
（psoriatic scale）からも取得し得る。

前記式（Ｉ）のポリペプチドはヒト白血球エステラー
ゼに対する阻止作用を有するポリペプチドであつて、ヒ
トの皮膚の乾癬症痂皮（psoriatic scale）から取得し
得るかつ下記の特性ａ）〜ｄ）の１つ又はそれ以上を有
するポリペプチドである； ａ） 約9kDの分子量（SDS−PAGEにより測定）を有す
る； ｂ） pH約9.7の等電点（等電点電気泳動法により測
定）を有する； ｃ） ヒト白血球エラスターゼの他に豚の膵臓エラスタ
ーゼに対する阻止作用を有する；及び ｄ） トリプシン、ヒトカテプシンＧ、α−キモトリプ
シン及びプラスミンに対して大きな（significant）活
性を示さない。

ヒトの皮膚から取得し得るポリペプチドとしては単離
及び精製によつて取得し得るポリペプチド及びかかるポ
リペプチドのフラグメントが挙げられる。

式（Ｉ）のポリペプチドはプロテイナーゼ３に対して
も阻止作用を有する。

本発明のポリペプチド及びそのフラグメントは生物学
的に純粋なかつ均質な形で取得し得る。本発明によれ
ば、更に、（associated native glycosylation）を伴
わない、前記で定義したごときポリペプチドが提供され
る。

前記したごときポリペプチドの他に、本発明にはポリ
ペプチド同族体（homologue）のごとき、ヒト白血球エ
ステラーゼに対する阻止作用を有する他の生成物も包含
される。従つて本発明によれば、更に、ヒト白血球エラ
スターゼに対する阻止作用を有する、前記で定義したご
ときポリペプチドの、ポリペプチド同族体が提供され
る。

これらのポリペプチド同族体としては、１種又はそれ
以上のアミノ酸残基の同一性又は位置の点で前記で定義
したものと異るポリペプチドが挙げられる。例えばかか
る同族体においてはかかるアミノ酸残基が置換されてい
るか又はかかるアミノ酸残基が末端又は中間に付加され
ているか又は削除されていることがあり得る。かかる同
族体はヒト白血球エラスターゼに対する阻止作用を示し
そして、所望ならば、豚の膵臓エラスターゼに対する阻
止作用のごとき、式（Ｉ）のポリペプチドの有する追加
的な活性の一つ又はそれ以上を示し得る。本発明の製品
として、例えば加水分解に対してより安定なもの（従つ
て、天然に産出するものより顕著な効果又はより長時間
持続する効果を有し得るもの）、又は、欠失されるか又
は例えばアラニン残基又はセリン残基によつて置換され
るシステイン残基を１個又はそれ以上有するかつ微生物
系から活性な形で、潜在的により容易に単離されるもの
が挙げられる。

本発明のポリペプチド、そのフラグメント及びポリペ
プチド同族体は生物学的に純粋なかつ均質な形で取得し
得る。

本発明のポリペプチドは遺伝子工学的方法によつて好
都合に調製し得る。本発明のポリペプチド同族体はかか
る同族体についてコードする遺伝子の発現により調製し
得る。かかる遺伝子は周知の位置特異的突然変異法（si
te directed mutagenesis）による、cDNA及びゲノム遺
伝子の修飾（modification）により容易に取得し得る。

従つて、本発明の別の要旨によれば、組換えDNA製造
技術（recombinant DNA technology）により製造される
ごとき、ポリペプチド（前記で定義したもの）及びその
同族体が提供される。

本発明の別の要旨によれば、ポリペプチドをコード
（coding）する遺伝子物質（genetic material）からな
る複製可能なプラスミド発現ビヒクル（replicable pla
smidic expression vehicle）で形質転換された宿主細
胞（host cell）を培養することにより上記ポリペプチ
ドを発現させついでかく発現されたポリペプチドを回収
することからなる、前記ポリペプチドの製造方法が提供
される。

本明細書においては“複製可能なプラスミド発現ビヒ
クル”という用語は最も広い意味で使用されており、例
えば、染色体外遺伝体（extr−chromosomal element）
として細胞内で複製し得るプラスミド及び宿主細胞中に
組込む（integrate）することにより複製し得るプラス
ミドが包含される。

上記方法は大腸菌（E.Coli）、酵母又は哺乳動物細胞
のごとき適当な宿主細胞を使用して行い得る。使用した
宿主細胞に応じて、本発明のポリペプチドは哺乳動物の
炭水化物又は他の真核生物の炭水化物によりグリコシル
化（glycosylate）されるか、又はグリコシル化されな
いことがあり得る。

所望の代謝物（metabolite）が宿主細胞から商業的に
有用な速度で排出されない場合には、宿主細胞を培養し
ついで細胞をそのままで収穫しそして所望のポリペプチ
ドを、例えば宿主細胞の生長に必要な栄養を含有する媒
体から分離した後、細胞を抽出することにより回収し得
る。代謝物が宿主細胞から、周囲の培養液に移行する場
合には、ポリペプチドは通常の方法で抽出することによ
り回収し得る。

従つて本発明の別の要旨によれば、前記で定義したご
ときポリペプチドを発現することができる形質転換宿主
（transformant host）であつて、この形質転換宿主は
複製可能なプラスミド発現ビヒクルからなるものであり
そして上記ビヒクルは上記ポリペプチドについてコード
する遺伝子物質であることを特徴とする形質転換宿主が
提供される。

本発明の別の要旨によれば、前記で定義したごときポ
リペプチドについてコードする遺伝子物質からなる複製
可能プラスミド発現ビヒクルを宿主に挿入することによ
り、宿主を形質転換することを特徴とする形質転換宿主
の製造方法が提供される。

外来遺伝子物質を宿主中に導入するのに適当な方法は
文献から一般的に知られている。かかる方法はベクター
と外来遺伝子物質からなる複製可能発現ビヒクルを形成
させついでこのビヒクルを宿主中に導入することからな
る。ビヒクルの宿主中への導入は宿主に適当な処理を行
うことにより、例えば大腸菌の場合には、塩化カルシウ
ム溶液で処理することにより促進し得る。

本発明の別の要旨によれば、前記したごときポリペプ
チドを形質転換宿主中で発現することができる複製可能
プラスミド発現ビヒクルが提供される。

従つて本発明によれば、更に、前記で定義したごとき
ポリペプチドについてコードする遺伝子をベクターの適
当な挿入位置に挿入することにより、上記ポリペプチド
の合成に使用することのできる複製可能プラスミド発現
ビヒクルを得ることを特徴とする複製可能プラスミド発
現ビヒクルの製造方法が提供される。

本発明の別の要旨によれば前記ポリペプチドについて
コードするDNA塩基配列（DNA sequence）が提供され
る。

本発明のDNA塩基配列としては原核又は真核宿主細胞
内における前記ポリペプチドの発現を保証するのに有用
なDNA塩基配列が挙げられる。本発明のDNA塩基配列は特
異的に下記のものからなると考えられる： ａ） 第13図に示すごときDNA塩基配列及びそのフラグ
メント、及び特に、式（Ｉ）のポリペプチドについてコ
ードするフラグメント又はその相補的ストランド； ｂ） ハイブリツド形成により第13図に示すDNA塩基配
列又はそのフラグメントを形成するDNA塩基配列；及び ｃ） 遺伝暗号の縮重（degeneracy）がない場合、ハイ
ブリツド形成により第13図に示すDNA塩基配列又はその
フラグメント及び特に式（Ｉ）のポリペプチドについて
コードするフラグメントを形成するDNA塩基配列。

部分ｂ）中に特異的に包含される塩基配列は、対立遺
伝子変異体（allelic variant）の形の式（Ｉ）のポリ
ペプチドをエンコードする（encode）ゲノムDNA塩基配
列である。部分ｃ）により特異的に包含される塩基配列
は人造DNA（manufactured DNA）である。人造DNAはPCT
公開特許出願WO83/04053に記載のAlton等の方法及びNat
ure、第292巻、756−762（1981）に記載のEdge等の方法
により容易に調製し得る。

第13図に例示される塩基配列のフラグメントとしては
EC₀R I及びSal Iのごとき制限酵素及びBspM I及びBamH
Iによる逐次的切断（sequential digestion）により生
ずるフラグメント並びに式（Ｉ）のポリペプチドについ
てコードするフラグメントが挙げられる。第14図及び第
15図に例示される塩基配列は部分的cDNA塩基配列であ
り、第16図に例示される塩基配列は完全cDNA塩基配列で
ある。従つて、本発明によれば第14図又は第16図に示さ
れるごときDNA塩基配列又はその相補的ストランドから
実質的になるDNA塩基配列が提供される。

遺伝番号の縮重により、本発明の適当なポリペプチド
についての遺伝子を構成するのに使用し得るコドンの選
択が実質的に自由になる。宿主について好ましいコドン
が通常選択される。

前記DNA塩基配列又はこれに対応するRNA又はcDNAの塩
基配列の任意の部位にハイブリデーシヨンを行うことの
できるポリスクレオチドプローブ（probe）を構成し得
る。興味のある塩基配列を明確に検出するためには、ヌ
クレオチドブローブは、決定するのに十分な長さの塩基
配列とハイブリツド形成（hybridise）することのでき
るヌクレオチド塩基配列からなることは理解されるであ
ろう。一般にプローブは決定されるべき塩基配列の、少
なくとも８個の共役ヌクレオチド（consecutive nucleo
tide）においてハイブリツド形成することができるであ
ろう。

従つて本発明の他の要旨によれば、前記したごときDN
A塩基配列、又はそのフラグメント又は対応するRNA塩基
配列とハイブリツドを形成することができるヌクレオチ
ド塩基配列からなりかつ場合によりラベルされているか
（labelled）又はマークされている（marked）成分を有
するポリヌクレオチド プローブが提供される。

本発明のポリヌクレオチド プローブは従来既知の方
法に従つてラベルするか又はマークすることができる；
例えば任意の好都合な方法に従つて放射性同位元素³²P
でラベルするか又は別法として、ハイブリデーシヨン技
術で周知の方法により放射性同位元素でラベルすること
により³⁵S−放射性同位元素でラベルしたプローブ（³⁵S
−radiolabelled probe）を得ることができる。別法と
して、ポリヌクレオチドプローブは、1981年３月15日〜
20日にコロラド州、キーストンで開催された、“精製遺
伝子（Purified Genes）を使用する発生生物学（Develo
pment Biology）”に関する1981年のICN−UCLAシンポジ
ウムの会報、第XXIII巻,1981、第647−658頁に記載され
るD.C.Ward等の方法によりビオチン又はこれに類似する
化合物でラベルするか又は英国、ケンブリツチで開催さ
れた第604回Biochemical Society Meeting（1983年７月
１日）のアブストラクトに記載されるD.B.Malcomn等の
方法により酵素ラベルする（enzyme−labelled）ことも
できる。

本発明の別の要旨によれば、少なくとも前記したごと
きポリペプチドのフラグメントを結合させるのに有用な
抗体が提供される。本明細書中で使用される“抗体”と
いう用語は、他のものを示す記載がない限り、ポリクロ
ナール及びモノクロナールのごとき無傷の（intact）抗
体及び抗体フラグメント並びに英国特許出願第2,188,68
3号明細書に記載されるごときキメラ抗体（chimeric an
tibody）を意味する。本明細書において“フラグメン
ト”という用語は、他のものを示す記載がない限り、抗
体の結合領域（binding region）を含有するフラグメン
トを意味する。かかるフラグメントはFc部分（Fc porti
on）を欠いているフラグメントと定義されるFab型フラ
グメント例えばFab,Fab¹及びＦ（ab¹）_２フラグメント
であり得るか又は無傷抗体中のＨ鎖（heavy chain）成
分を連結しているジスルフイド結合の還元的開裂（redu
ctive cleavage）により得られる、いわゆる“半分子”
（“half−molecule）フラグメントであり得る。

本発明の抗体は、所望ならば、例えば本発明のポリヌ
クレオチドプローブとの関係で述べたごときラベル又は
マーカー成分を担持し得る。すなわち、例えば抗体は蛍
光マーカーを含有し得る。しかしながら、本発明の抗体
はラベル又はマーカー成分を担持する必要はない。すな
わち、例えば本発明の抗体は、本発明の抗体に属する種
（species）の抗体に対する抗体である第二抗体（secon
d antibody）によつて検出し得る。第２抗体はラベルさ
れた成分又はマーカー成分を有するであろう。

かかる抗体又はプローブは前記したごときポリペプチ
ド又は対応するDNA又は適当な場合にはRNAが存在するか
又は存在しないかを検出するのに使用することができ、
従つてエラスターゼに対する阻止作用を有する物質が存
在するか又は存在しないかを検出するのに使用すること
ができる。すなわち、上記プローブ又は抗体は、エラス
ターゼによつて誘発される状態が、少なくとも部分的
に、エラスターゼ阻止物質の不存在によつて生起され得
るか否かを示すのに使用し得る。

本発明のポリペプチドのエラスターゼ阻止剤として作
用するための効力は、ヒト白血球エラスターゼ（HLE）
の低分子量ペプチド基質（substrate）に対する作用を
本発明の化合物が阻止する能力により決定される。阻止
剤の効力は阻止剤とHLEとの相互反応により形成される
錯体の解離定数kiの反応動力学的測定値（kinetic dete
rmination）を得ることにより評価する。基質としては
K.Nakajima等によりJ.Biol,Chem.,254:4027−4032（197
9）に記載されており、また、T.Teshima等によりJ.Bio
l,Chem.,257:No.9,5085−5091（1982）に記載されてい
るごとき、アニライド メトキシスクシニル−アラニル
−アラニル−プロリル−バリン−ｐ−ニトロアニライド
が使用される。これらの研究に使用されるHLE酵素はEla
stin Products社（ミズリー州、セントルイス）から入
手することができ、あるいは、Preparative Biochemist
ry、第13巻、57−67頁（1983）に記載されるB.R.Uiscar
ello等の方法によつて精製し得る。

前記したごときポリペプチドは、そのままあるいは既
知の適当な方法で精製して使用することができそして例
えば薬理学的に許容され得る稀釈剤又は担体と混合する
ことにより製剤化し得る。投与は当業者に既知の種々の
経路で行い得る。特に、投与は非経口的投与例えば鼻内
投与、直腸投与、肺投与により行うことができ、あるい
は、筋肉内注射又は皮下注射のごとき注射により行い得
る。医薬組成物は使用されるべき投与方法に応じて製剤
されるであろう。例えば、医薬組成物が鼻内投与される
場合には、組成物を粉末化エアゾールとして調製し得
る；また、組成物を注射によつて投与する場合には、組
成物は無菌溶液又は懸濁液として調製し得る。適当な稀
釈剤としては水溶液が挙げられそして緩衝剤及び表面活
性剤のごとき添加剤を添加し得る。

本発明の医薬組成物には放出制御製剤（controlled r
elease formulation）も包含される。例えば本発明のポ
リペプチドを生分解性重合体中にカプセル封入するか又
はかかる重合体のマトリツクス中に分散させ、その結果
ポリペプチドを重合体マトリツクスの分解が進むにつれ
て放出させることができる。放出持続製剤（sustained
releace formulation）中で使用するのに適当な生分解
性重合体としては、水性の生理学的な環境下に置いたと
き、加水分解により徐々に分解するポリエステルが挙げ
られる。ポリペプチドを長時間に亘つて放出する特定の
医薬組成物は欧州特許第58481号明細書に記載されてい
る。この組成物においてはポリアクチド（polyactide）
が使用されており、水性の生理学的環境下に置いた場
合、ポリペプチドは実質的に全てのポリペプチドが放出
されるまで、組成物から連続的に放出される。

本発明のポリペプチドは、エラスターゼにより誘発さ
れる組織のタンパク質の分解が原因である症状の処置に
有用である。

本発明のポリペプチドは炎症状態、肺の症状、皮膚の
症状及び粘液分泌を伴う症状を処置するために、必要な
ときに、温血動物、特にヒトに投与し得る。本発明のポ
リペプチドが有用であり得る症状の例としては、アテロ
ーム性動豚硬化症、関節炎症、気腫、成人の吸収器症候
群（respiratory syndrome）、ノウ胞性線維症、気管支
炎、急性非リンパ球（non−lymphobastic）白血病及び
乾癬が挙げられる。

本発明によれば、更に、上記したごとき病気の処置に
使用される医薬の製造における、前記ポリペプチド又は
その同族体の使用も提供される。

本発明によれば、更に、本発明のポリペプチド又はそ
の同族体の有効量を温血動物、例えばヒトに投与して上
記したごとき病気を処置することを特徴とする温血動物
の病気の処置方法が提供される。

以下においては本発明を実施例及び添付図面により例
示する。

ヒト白血球エラスターゼ阻止剤の単離 乾癬又はアトピー性皮膚炎に罹つている患者の皮膚か
ら痂皮（scale）を採取し、プールしそして１〜100gの
バツチを得た。正常なヒトのカルス（皮膚硬結）（call
us）を含有する痂皮材料を蒸留水（10〜200ml）に懸濁
させ、１％クエン酸及びギ酸を使用して懸濁液のpHを2.
8に調節し、10容量％のエタノールで稀釈しついで凍結
した（−80℃）。ついでウルトラトラツクス（ultratur
rax）（氷上で１時間、超音波処理（15分、400ワツ
ト）、ウルトラトラツクス（１時間）及び遠心分離（50
00×ｇで10分間）を行うことにより機械的に破砕した。
得られた沈降物を50％エタノール及び50％クエン酸塩／
ギ酸塩で再び抽出し、両方の抽出操作で得られた上澄液
を一緒にした。一緒にした抽出物を限外過（Amicon Y
M5）により濃縮しついで0.01Mギ酸アンモニウム（pH4.
0）を経て過して（diafiltrate）粗抽出物を得た。

精 製 上記の単離操作により得られた粗抽出物を（下記の方
法に従つて）クロマトグラフイーにより精製して、ヒト
白血球エラスターゼに対して阻止作用を有する物質の均
質な試料を得た。

粗抽出物を、最初、カチオン交換HPLCにより精製し
て、ヒト白血球エラスターゼそれ自体のごとき物質から
のヒト白血球エラスターゼに対する阻止作用を有する物
質を分離した。第１図に示すごとく、HLEに対する阻止
作用を有する物質を約26〜58分の間に広いピークとして
溶離した。プロミネント（prominent）阻止剤を含有す
るフラクシヨンをC₈−逆相カラム（C₈−reversed−phas
e column）上で更に精製しついで適当な均質性（homoge
neity）が認められるまで再びクロマトグラフイーにか
けた（第２図参照）。

HLEに対する阻止作用を有する物質を含有するフラク
シヨンを一緒にしついでポリLCカラム（Poly LC colum
n）上でのクロマトグラフイーにかけた。分離を行つ
て、プロミネント阻止剤であることが示された成分を含
有する物質を得た。この成分をC₁₈−逆相クロマトグラ
フイーにより更に精製した（第４図参照）。幾つかの製
剤においては95％以上の純度を得るためには（C₁₈−逆
相クロマトグラフイー、ポリLCについての分析的操作に
より及びSDS−PAGEにおける不純物の完全な不存在及び
等電点により示されるごとく）、サイズ排除クロマトグ
ラフイー及び逆相ポリＦ−HPLCからなる追加的なクロマ
トグラフイーが必要であつた。

カチオン交換−HPLC カラム :TSK CM 3−SW（7.5×150mm,LKB Bromma,スエ
ーデン） 操 作 :20分間、緩衝液A,流率0.5〜1.0ml/分； 30分間、100％まで濃度を線状勾配で変化させた緩衝
液B;流率1ml/分;20分間、緩衝液B;及び50分、緩衝液
Ｃ。

緩衝液A:0.01Mギ酸アンモニウムpH4.0 緩衝液B:0.5Mギ酸アンモニウムpH4.0 緩衝液C:0.5Mギ酸アンモニウムpH3.0 粗抽出物を上記条件下でクロマトグラフイーにかけ
た；その際、１フラクシヨン当り60滴を自動的に捕集;2
80nmでUV−検出を行つた。

逆相−C₈−HPLC カラム :ヌクレオシル（Nucleosil）300−7 C₈−HPLC
カラム（250×14.7mm,Macherey−Nagel,Duren,ドイ
ツ）。

操 作 :流率−3ml/分 20ml20％緩衝液B;75ml、60％まで濃度を線状勾配で変
化させた緩衝液B;15ml,100％まで濃度を線状勾配で変化
させた緩衝液B;30ml,100％緩衝液Ｂ。

緩衝液A:0.1％TFA 緩衝液B:0.1％TFAアセトニトリル。

試料を上記条件下でクロマトグラフイーにかけた;215
nmでUV−検出を行いかつピークでの捕集（peakwise col
lection）を行つた。60％緩衝液までの勾配（gradien
t）で溶離した、阻止作用を有する物質を含有するフラ
クシヨンを一緒にし、凍結乾燥しついで前記と同一のカ
ラム上でかつ同一条件で再びクロマトグラフイーにかけ
た。

ポリ−（２−スルホエチルアスパラタミド）−HPLC カラム :ポリLCカラム（200×4.6mm,コロンビア,MD,U
SA） 操 作 :流率1ml/分 10ml、緩衝液A;30ml、50％まで濃度を線状勾配で変化
させた緩衝液Ｂ 10ml,100％まで濃度を線状勾配で変化させた緩衝液B;
10ml緩衝液Ｂ。

緩衝液A:5mMKH₂PO₄,pH3.1＋25％アセトニトリル 緩衝液B:5mMKH₂PO₄,0.5MKCl,pH3.1＋25％アセトニト
リル 凍結乾燥試料を緩衝液Ａに溶解しついで上記の条件下
でクロマトグラフイーを行つた；その際220nmでUV検定
を行いかつピークでの捕集を行つた。

逆相−C₁₈−HPLC カラム :ヌクレオシル10−5C₁₈（250×4.6mm,Bischof
f,Leonbergドイツ） 操 作 :流率1ml/分 30分間、10％から40％まで濃度を線状勾配で変化させ
た緩衝液B; 10分間、100％まで濃度を線状勾配で変化させた緩衝
液Ｂ 緩衝液A:0.1％TFA 緩衝液B:アセトニトリル中の0.1％TFA 試料を上記条件下でクロマトグラフイーにかけ、その
際215nmでUV−検出を行いかつピークでの捕集を行つ
た。必要に応じて、阻止作用を有する物質を含有するフ
ラクシヨンを均質性が得られるまで前記と同一の系で再
いクロマトグラフイーにかけた。

サイズ排除HPLC カラム :TSK 2000カラム（600×7.5mm,LKB,Bromma,ス
ウエーデン） 操 作 :流率1ml/分 0.1％TFA 試料を上記の条件下でクロマトグラフイーにかけ、そ
の際、215nmでUV検出を行いかつフラクシヨン当り20滴
を捕集した。MrはペプチドVal−gly−ser−glu,インシ
ュリン、Ｂ−鎖フラグメント22−36,アプロチニン、鶏
卵アルブミン及び牛血清アルブミンを使用して検量し
た。

逆相−Poly F−HPLC カラム :Poly Fカラム（80×6.2mm,Dupont.Dreieich,
ドイツ） 操 作 :流率1ml/分 30ml,10％から40％まで濃度を線状勾配で変化させた
緩衝液B;2ml,100％まで濃度を線状勾配で変化させた緩
衝液B;10ml緩衝液Ｂ。

緩衝液A:1％NH₄ 緩衝液B:アセトニトリル中の１％NH₄ 凍結乾燥試料を緩衝液Ａに溶解しついで上記の条件下
でクロマトグラフイーにかけた。その際、215nmでUV検
出を行いかつピークでの捕集を行つた。

タンパク質の決定 タンパク質濃度は逆相−C₁₈−クロマトグラフイーに
おける215mmでの吸収の集積（integration）により測定
した。検量剤（calibrator）として次のものを使用し
た：ユビキチン（Sigma）及び組換え体エグリン（recom
binant）Ｃ（Ciba−Geigy）。

SDA−PAGE 製造業者の使用説明書に従つてPharmacia Phast Syst
em（Pharmacia,Freiburg,ドイツ）及び均質な20％SDS−
ゲルを使用してナトリウム ドデシル サルフエート
ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS−PAGE）を行つ
た。試料を凍結乾燥しついで0.01M H₃PO₄,8M尿素、2.5
％SDS及び0.02％ブロモフエノールブルー中（pH6.8）で
沸騰させること（５分間）により還元した。標準として
ミオグロブリンフラグメント（Pharmacia）又は馬ミオ
クロビン（Serva）及びユビキチン（Sigma）を使用し
た。銀染色（silver stain）を製造業者（Sigma）の指
示に従つて行つた。

等電点電気泳動 Servalyt Precoates pH3−10及びTest−Mix9（Serv
a）を使用して等電点電気泳動を行つた。予備電気泳動
（preforcussing）を３ワツトで30分間行いそして銀色
素（stain）（Sigma）とクーマシー（Comassie）ブルー
Ｒ染色色素を製造業者（Serva）の指示に従つて使用し
た。これと並行して、上記Precoatesをスライスし、溶
離して、阻止活性ペプチドを局在化させた。約1mmのス
ライスを100μのアセトニトリルで溶離した。溶出液
（eluate）を乾燥させ、20mgのHLEを含有する100μの
緩衝液（0.1M HEPES,0.5M NaCl,1％BSA,pH7.5）に再溶
解させた。30分間、インキユベート（incubate）した
後、残留HLE活性を測定した。

生物学的性質 以下で述べるごとき方法に従つてプロテアーゼ阻止剤
による種々のプロテアーゼの阻止効果を測定した。その
結果を第１表に示す。

ヒト白血球エラスターゼに対する阻止作用 ヒト白血球エラスターゼ（EC.3.4.21.37）の活性をNa
kajima等の方法（文献７参照）に従つて測定した。HLE
に対する阻止効果は合成ペプチド メトキシ−サクシニ
ル−アラニル−プロピル−バリル−ｐ−ニトロアニライ
ド（AAPVpNA,Sigma）を使用して測定した。

試料（100μ）及び100μHLE（200ng/ml;Elastin
Products Corporation,Pacific,MO,USA）を分析用緩衝
液（assay buffer）（0.1M,HEPES,0.5M NaCl,10％DMSO,
pH7.5）中で室温で30分間インキユベートした。ついで
分析用緩衝液中の基質（800μ,0.5mM）を添加した。

405nmでの吸光度の変化を１時間まで測定し、阻止率
（％）を残留活性と対照から算定した。解離定数（Ki）
はGreen及びWorkの方法（文献８参照）に従つて、前記
と同一の系内で、2mMの基質と（１μg/ml）HLE（最終濃
度）を使用して測定した。

豚膵臓エラスターゼに対する阻止効果 豚膵臓エラスターゼ（EC.3.4.21.36）の活性を蛍光発
性基質（fluorogenic substrate），メトキシ−サクシ
ニル−アラニル−アラニル−プロピル−バリル−トリフ
ルオルメチルクマリン（AAPV−AFC,Bachem,Budendorf,
スイス）を使用して測定した。

エラスターゼ（100μ）と阻止剤（100μ）を30分
間、プレインキユベートした。ついで基質の溶液（0.1m
M溶液,1.8ml）を添加した。蛍光試薬（fluorescence）,
Ex400Em505を添加しついで阻止率（％）を試料の当社の
活性と対照から算出した。解離常数（Ki）はGreen及びW
orkの方法（文献８参照）に従つて測定した。

カテプシンＧ及びα−キモトリプシンに対する阻止効果 カテプシンＧ及びα−キモトリプシンの活性をNakaji
ma等の方法（文献９参照）に従つて、HLE−サクシニル
−アラニル−アラニル−プロリル−フエニルアラニル−
ｐ−ニトロアニライドの同族体（AAPFpNA,Sigma社）を
使用して測定した。阻止率の測定については、阻止剤の
最高濃度は１μg/mlであつた；これはカテプシンＧ及び
α−キモトリプシンと比較して、３倍のモル濃度であ
る。

トリプシン及びプラスミンに対する阻止効果 100μの阻止剤（１μg/ml）と100μのトリプシン
（１μg/ml）又はプラスミン（１μg/ml）を30分間イン
キユベートしついで0.05M HEPES及び0.12M NaCl（pH7.
5）中の、0.1mMの基質、トシル−グリシル−プロリル−
リシン−pNA（Boehringer,Mannheim,FRG）を添加した。

プロテイナーゼ３に対する阻止効果 J.Exp.Med171,357−362（1990）に記載されているLud
emannの方法に従つて、ヒト多形核白血球を精製した。
ヒト白血球エラスターゼ及びカテプシンＧが存在しない
ことは、Nakajimaの方法（文献７参照）に従つて、それ
ぞれ、基質、メトキシ−サクシニル−アラニル−アラニ
ル−プロリル−バリル−ｐ−ニトロアニライド（AAPVpN
A）及びサクシニル−アラニル−アラニル−フエニル−
ｐ−ニトロアニライドを使用して、プロテイナーゼ３製
剤の活性が示されないことにより確認した。

エラスチノール活性（elastinolytic activity）は牛
ウナジ靭帯エラスチン（bovine ligamentum nuchae ela
stin−FITC Elastin Products,USA）の加水分解により
測定した。

プロテイナーゼ３製剤（１μ）をカーボネート緩衝
液（50μ,0.1M）、NaN₃（0.02％）及びBrij35（0.01
％）（pH8.5）中の式（Ｉ）のエラスターゼ阻止剤（０
−１μｇ）と共に37℃で30分間プレインキユベートし
た。ついでカーボネート緩衝液（100μ,0.1M）、NaN₃
（0.02％）及びBrij35（0.01％）（pH8.5）中のエラス
チン−FITC（1mg）を添加した。混合物を穏やかに攪拌
しながら37℃で４時間インキユベートしついで6000×ｇ
で遠心分離した。上澄液を20倍に稀釈しついで溶解エラ
スチン−FITCの蛍光をPerkin Elmer LS50マイクロタイ
タープレートを使用してEx489nm,Em513nmで測定した。
蛍光は酵素を含有していない対照により修正し、酵素を
含有していない対照に対する％で表わした。

式（Ｉ）のポリペプチドはプロテイナーゼ３に対する
強力な阻止剤であり、9.5×10^-9MのIC₅₀に相当する活性
を有することが認められた。

特 徴 本発明の阻止剤（ポリペプチド）の分析的サイズ排除
クロマトグラフイー（Tsk2000）は５〜10KDの５〜10kD
の見掛分子量（apparent molecular mass）を与えた
（第５図参照）。SDS−DAGE上での本発明の阻止剤の分
子量は約9kDであり、第５図に示すごとく、ユビキチン
（MW＝8500）に近似する泳動（migration）を示した。

本発明の阻止剤の等電点は銀染色法及びゲルスライス
中での阻止剤の平行的酵素検出法（parallel enzyme de
tection）によつて示されるごとく、pH9.7であつた（第
６図参照）。

本発明の阻止剤はセリンエラスターゼHLE及び豚膵臓
エラスターゼを阻止することが認められている。しかし
ながら、α−キモトリプシン及びトリプシン及びプラス
ミンは、少なくとも３倍過剰の阻止剤によつて阻止され
ない。HLEの阻止についての平衡解離定数（Ki）を、第
７図に示すごとく、Green及びWorkの方法（文献８参
照）に従つて測定した。

本発明の阻止剤は酸に対して安定であることも認めら
れた。

HLE阻止剤の構造決定 直接的アミノ酸配列決定（direct sequencing） 本発明の阻止剤の精製物約５μｇについて、Applied
Biosystems Model 470 A Gas Phase Sequencerを使用し
てかつフエニルチオビダントインのModel120Aオンライ
ン分析により、アミノ酸配列の分析を行つた。この分析
により第８図に示すごとく、30個のアミノ酸残基の配列
が認められたが、システインについては、同定される残
基の存在しないことが暗示された。アミノ酸の当初の収
量（yield）は分子サイズ６−8Kダルトンの単鎖ポリペ
プチドと同等であつた。

カルボキサミドメチル化（Carboxamidomethylation）
（CAM） 精製した本発明の阻止剤（10μｇ）を水（50μ）に
溶解し、6Mグアニジン塩酸塩、0.1Mトリスハイドロクロ
ライドpH8.5緩衝液（30μ）と混合した。チユーブを
窒素でフラツシユしついでジチオトレイトール溶液（グ
アニジン緩衝液中の50mg/ml溶液５μ）を添加した。
チユーブを再び窒素でフラツシユし、シールしついで37
℃で４時間保持した。グアニジン緩衝液中のヨードアセ
トアミド（5mg）を添加し、チユーブを再び窒素でフラ
ツシユした後、チユーブを周囲温度で１時間、暗所に保
持した。試料を0.1％トリフルオル酢酸水溶液で1mlまで
稀釈しついで直ちにVydec C₁₈カラム（25×0.46cm）に
供給した。カラムを水中に0.1％トリフルオル酢酸から
アセトニトリル中の0.1％トリフルオル酢酸までの線状
勾配で1ml/分で70分展開させた。この操作により２つの
ピーク（第９図参照）、すなわちクラクシヨン33−34の
少量成分とフラクシヨン35−36の主要成分（約67％）が
得られた。各々の成分を別々に、再びカルボキサミドメ
チル化条件下に暴露したが、再度クロマトグラフイーに
かけた場合、変化は認められず、従つて、最初の反応が
完結していることが認められた。

アミノ酸分析 カルボキサミドメチル化で得られた小量成分の半分
を、真空中、110℃で６時間、１％のフエノールを含有
する6N塩酸で加水分解した。加水分解物をLKB Alpha＋
アミノ酸分析器を使用して分析して、第２表に示すごと
き比率を得た。分析試料は少なかつたが、バツクグラン
ドコレクシヨン（background correction）は適用しな
かつた。

キモトリプシンによる消化 C₁:フラクシヨン33−34のCAM誘導体の残りの半分を0.
1M炭酸アンモニウム（50μ）及び0.2M塩化カルシウム
中に溶解しついでキモトリブシン（Worthington,20μg/
ml溶液10μ）で処理した。溶液を37℃で１時間保持し
ついで0.1％トリフルオル酢酸水溶液（200μ）で稀釈
しこれをVydec C₁₈カラムに直接、供給した。アセトニ
トリル中のトリフルオル酢酸の濃度を0.1％まで線状勾
配で変化させながら、この溶液を60分間、1ml/分の割合
でカラムに供給した。この操作においては第10図に示す
ごとく３つの主ピークが得られた。これらのピークの各
々を可能な限り配列した（sequence）。得られた結果を
以下に示す。

C₂:フラクシヨン35−36のCAM誘導体の半分を上記と同
一の条件下でキモトリプシンを用いて消化した。HPLC状
態図（profile）（第11図）は分解（degradation）がよ
り多く行われたことを示しているが、ピーク１及び３
（第10図）は第２の消化ピーク１及び８と同一の程度に
存在していると思われる。他のピーク、第10図における
ピーク２は第２消化におけるより、比較的に、はるかに
小さく、他の２つと同一の位置において明瞭でない。C₂
からの追加のピーク、すなわち、３、４、６、７及び９
が配列されている。これらのピーク（第８図）はピーク
７から離れて示されており、このことは６と同一の配列
を、これが採用される限り、有することを示している。

トリプシンによる消化 T:前記CAMで得られた主要成分、フラクシヨン35〜36
の残部を0.1M炭酸アンモニウム（50μ）及び0.2M塩化
カルシウム（１μ）中に溶解しついでトリプシン（0.
1M炭酸アンモニウム10μ中、200ng）で処理した。溶
液を37℃で30分間保持し、0.1％トリフルオル酢酸水溶
液で稀釈しついで直ちにC₁₈カラムに供給しそしてこの
カラムを他の酵素消化の場合と同様に展開した（第５図
参照）。この操作においては２つの明確な（definabl
e）生成物のピークが示されかつ出発原料が残留してい
ないことが示された。関連するシークエンスのデーター
は第１図に示されている。

単一アミノ酸分析を行つた結果から、アミノ酸含有量
が正確ではないが近似的に示され、これはより小さいフ
ラクシヨンに分解するための酵素の選択に役立つた。

直接的アミノ酸配列決定（direct sequencing）によ
り最初の30個の残基（アミノ酸残基）が示され、これを
大型トリプシンフラグメントT10により確認した。トリ
プシンを使用した条件下では主要生成物について大型フ
ラグメントが得られる；すなわち、リシン結合の全てが
切断されることがない。全構造体を包含するこれらのフ
ラグメントは第８図に示されている。切断点は塩基性残
基に限定されていた。

これに対して、キモトリプシンは１個の芳香族アミノ
酸残基の後方は切断（cleave）しないが、２個のメチオ
ニンの後方及びロイシン−33の後方は切断した。更に、
ロイシン−20の後方で切断が生起した。

Ｃ−末端グリタミンは強いプロリンピークの後方のT9
及びC2−３ペプチド中に見出される非常に小さいが検出
可能な残基に基づいて決定された。しかしながら、この
Ｃ−末端グリタミンはかかるＣ−末端残基から予測され
た。第８図に包含されていない、種々の他のペプチドに
より、更に構造の確認を行つた。

より小さいCAM誘導体のクリモトリプシンによる消化
を行うことによりアミノ酸配列の決定を行い、下記のデ
ーターを得た： 入手されたデーターからはCAM誘導体の主成分と小量成
分との間の差は認められなかつた。これはＮ−末端にお
いて伸長（extension）又は欠失（deletion）が生じて
いることに基づいている。

決定された構造（第８図）は小さい、主として塩基性
のポリペプチドの構造である。この構造体はかかる分子
についての通常高い含有量のプロリンを有しており、更
に、グリシン及びシステインは均密に取込まれた（cag
e）分子を示している。

57残基のポリペプチドからなる、本発明の阻止剤の他
に、ヒト白血球エラスターゼに対する阻止作用を有する
別の物質も単離され、その中のポリペプチドについて部
分的にアミノ酸配列を決定した（sequenced）。下記の
ごとき結果が得られた： ピークII:主要成分Ｅ 小量成分Ｄ ピークIII:主要成分Ｅ 小量成分Ｄ ピークIV:主要成分Ｂ 小量成分Ｃ ピークV:主要成分Ａ 小量成分は主要エラスターゼ阻止剤と同一の位置から
出発している。

上記Ｎ−末端アミノ酸配列において、成分A,B及びＣ
の１−19,1−６及び１−４のアミノ酸配列の決定は、そ
れぞれ、該アミノ酸配列の後続部分より不確実である。

単離された追加的成分は本発明の前記阻止剤と類似の
性質、例えば類似の生物学的性質を有することが認めら
れた。

かくして、ヒト白血球エラスターゼに対する阻止作用
を有する物質は、ヒト白血球エラスターゼと1:1のモル
比で結合すると考えられた酸安定性のポリペプチドから
なる卓越した（prominent）阻止剤を含有することが見
出された。この阻止剤はカゴ（cage）状構造体の形で多
数のジスルフイド結合（このジスルフイド結合がペプチ
ドを上記形状に保持している）と結合していると考えら
れる。エラスターゼ、特にHLEに対する高い親和性と特
異性（specifity）は、阻止剤を、エラスターゼにより
誘発される組織のタンパク分解が原因となつている症
状、例えば乾癬及び気腫の処置に使用するのに有用なも
のにせしめている。前記本発明の卓越した阻止剤と類似
する性質を有する、同種のポリペプチドを示す他のポリ
ペプチドも単離されている；実際、関連するポリペプチ
ドの部分的なアミノ酸配列は、本発明の卓越した阻止剤
のアミノ酸配列の少なくとも一部の存在を指示してい
る。

プロテイナーゼ３は、卓越した阻止剤（式Ｉのポリペ
プチド）によつて効果的に阻止される、ヒト白血球エラ
スターゼ及び豚膵臓エラスターゼ以外の第３のエラスチ
ン分解性セリンプロテアーゼである。この阻止剤は皮膚
及び恐らくは他の器官における、ヒト白血球エラスター
ゼにより生起される組織のタンパク分解の生理学的調節
剤であると考えられるので、この阻止剤がプロテイナー
ゼ３も阻止することは興味のあることであると考えられ
る。両者の酵素、ヒト白血球エラスラーゼは好中球（多
形核白血球）のアズール好性顆粒の構成成分でありそし
て両者は、この酵素を気道に点滴した後にハムスターに
気腫状の組織分解を誘発し得る（Kao,R.C.,Wehner N.G.
Skubitz,K.M,Gray B.H.J.R,Huidal,“Protinase3A Dist
inct Human Polymorphonuclear Leukocyte Proteinase
that produces Emphysema in Hamsters";J.Clin.Inves
t.82,1963−1973,1988参照）。この阻止剤はいずれかの
酵素に予備吸着させた後に該酵素を阻止することができ
るので、エラスターゼにより誘発される肺の病気及びプ
ロテイナーゼ３により誘発される組織の分解の治療にお
いて有用である。

ヒト白血球エラスターゼ阻止剤の合成 式（Ｉ）のポリペプチド〔“卓越した阻止剤”（“pr
ominent inhibitor"）〕を以下に述べる方法で合成し
た。

式（Ｉ）のポリペプチドのアミノ酸配列をエンコード
するDNA塩基配列を下記の点を考慮して設計した： １） プラスミドの適当な部位における連結（ligatio
n）を可能にする一重鎖粘性末端； ２） 後続する遺伝子操作を促進するための５′−末端
における一連の制限エンドヌクレアーゼ塩基配列； ３） 翻訳終結コドン； ４コード領域の５′−末端のコドンは、通常A/Tに富
むように選択される。他のコドンは、通常、酵母菌及び
／又は大腸菌（F.coli）の発現に対して好ましいものが
選択される； 遺伝子は第３表に示す６種類のオリゴヌクレオチドか
ら集成した。

オリゴヌクレオチドの調製 0.2ミクロ モルスケール上の孔径制御ガラス支持体
（controlled pore glass support）に結合させた、
５′−ジメトキシトリチル塩基を保護されたヌクレオシ
ド−２−シアノエチル−N,N−ジイソプロピルホスホル
アミダイトと保護されたヌクレオシドから、Applied Bi
osystems 380 A DNAシンセサイザー上でApplied Biosys
tem社によつて示されているプロトコールに従つて、第
３表に示したオリゴヌクレオチド塩基配列を調製した。

各々のオリゴヌクレオチドを、固体支持体から分離し
かつ全ての保護基を除去した後、水（1ml）中に溶解し
た。オリゴヌクレオチド溶液（400μ）に3M酢酸ナト
リウムの溶液（pH5.6,40μ）とエタノール（1ml）を
添加し、混合物を−70℃で２時間貯蔵した。かく得られ
た沈澱を遠心分離により捕集し（13,000rpm,10分間）、
ペレツトをエタノール：水（7:3）混合物（200μ）で
洗浄し、真空中で短時間乾燥しついで水（15μ）及び
10μのホルムアミド／染料混合物（10mM NaOH,0.5mM
EDTA,0.01％ブロムフエノールブルー,0.01％キシレンシ
アノール,80％ホルムアミド）に溶解した。

オリゴヌクレオチドを8.3M尿素を含有する50mMトリス
−ボーレート（Tris−borate）（pH8.3）中の10％ポリ
アクリルアミド上で精製した。適当な長さのオリゴヌク
レオチドを、通常、最も顕著なバンドをUV造影すること
により同定し（Narang,Method in Engymalogy,vol 68,9
0−98,1979参照）ついでゲルから切除しついで5mMトリ
ス−ボーレート（pH8.3）中で300mVで３〜４時間電気溶
離（electroelute）した。水溶液をｎ−ブタノールで処
理することにより（混合し、回転させついで上部有機層
を除去）、約200μまで濃縮した。精製オリゴヌクレ
オチドをエタノール（2.5容量）を添加することにより
−70℃で20時間、0.3M酢酸ナトリウム溶液から沈澱させ
た。

遺伝子の集成（assembly） オリゴヌクレオチドEL12〜EL15（各々200μＭ）を、A
TP（800pM,25pMのγ−³²P ATP含有）、100μＭのスペル
ミジン、20mMのDTT、10mMのMgCl₂,50mMのTris−HCl（pH
9.0）及び0.1mMのEDTAを含有する溶液25μ中で、T4ポ
リヌクレオチド キナーゼ（3.6単位）を使用して37℃
で２時間ホスホリル化（phosphorylate）した。溶液を1
00℃で５分間加熱して反応を完結させついで第４表に示
すごとく、対にして混合して二重鎖（duplex）Ｉ〜III
を得た（オリゴヌクレオチドEL11及びEL16（25μ中、
200mM）はホスホリル化しないで使用した）。0.3M酢酸
ナトリウム（pH5.6,200μ）及びエタノール（850μ
）を添加し、二重鎖を−20℃で20時間沈澱させた。得
られた沈澱を遠心分離により捕集し、エタノール：水
（7:3）混合物で洗浄しついで水（50μ）に溶解させ
た。最初、溶液を沸騰水浴中で100℃で２分間加熱する
ことによりオリゴヌクレオチドの対をアニールした。つ
いで浴を40℃までゆつくり冷却した（約４時間）。二重
鎖Ｉ及びIIを含有する溶液を一緒にし、凍結乾燥しつい
でT4 DNAリガーゼ（１単位;BRL）、50mMのTris（pH7.
6）、10mMのMgCl₂、５％（W/W）PEG8000,1mMのATP及び1
mMのDTTを含有する溶液（BRL,Focus,Vol8,No.1,Winter1
986）に溶解しついでDNAを30℃で５分間ついで16℃で20
時間凍結させた。3M酢酸ナトリウム（20μ）及び水
（150μ）を添加しついでエタノール（750μ）を添
加しかつ−20℃で20時間冷却することにより生成物を沈
澱させた。沈澱を遠心分離により捕集し、エタノール
（1ml）で洗浄しついで水（15μ）及びホルムアミド
／染料混合物（10μ）中に溶解しついで50mMトリス−
ボーレート（pH8.3）、1mM EDTA及び8.3M尿素中の10％
ポリアクリルアミドゲル上で精製した。132塩基及び135
塩基の長さのDNA鎖（strand）についてのバンドをオー
トラジオグラフイーにより同定しついで個々のオリゴヌ
クレオチド塩基配列について述べた方法で単一ゲルスラ
イスから電気溶離により単離した。水溶液（50μ）を
最初、100℃で２分間加熱しついで40℃まで４時間で冷
却させることによりDNA鎖をアニールした。

二重鎖IIIを上記連結反応生成物に、該生成物の調製
について述べたと同様の方法で、但し、粘性末端をアニ
ールする前に混合物を40℃に加熱して、連結させた。生
成物、すなわち、第13図に示すごとき遺伝子塩基配列を
８％ポリアクリルアミドゲル上で精製しついでゲルスラ
イスからの電気溶離により前記したごとき方法で単離し
た。沈澱させた後、遺伝子を、個々のオリゴヌクレオチ
ドについて述べたごとき方法をT4ポリヌクレオチド キ
ナーゼでホスホリル化しついで水（20μ）に溶解し
た。

ヒトエラスターゼ阻止剤の合成遺伝子のクローニング 上記した合成遺伝子をマルチ−クロニング配列を含有
するプラスミドベクターpUC18（BRL,520−5363 SA）中
にクローンした。

ベクターを調製するために、10μｇのpUC18を水（42
μ）及び10×Ｂ制限緩衝液（BCL）に溶解した。制限
エンドヌクレアーゼBamH I（３μ）（BCL,8単位／μ
）を添加しついで線状化（linearised）プラスミド
が、超らせんの（supercoiled）かつニツクされた（nic
ked）環状のものに比べて主体となるまで、上記の混合
物を37℃で１時間インキユベートした。DNAをエタノー
ルを使用して４℃で30分間沈澱させ、エタノール：水
（7:3）混合物を洗浄しついで水（44μ）及び10X高塩
濃度緩衝液（high salt buffer）中に溶解した。制限エ
ンドヌクレアーゼEco R I（１μ）（BCL,90単位／μ
）を添加しついで混合物を、大きなEco R I−Bam H I
フラグメントが主体になるまで37℃で１時間インキユベ
ートした。DNAを−20℃で20時間沈澱させ、エタノー
ル：水（7:3）で洗浄しついで水（20μ）に溶解し
た。

大きなRco R I−Bam H Iフラグメントを前記したごと
き方法で１％調製アガロースゲル上で精製し、電気溶離
しついで沈澱させついで水（20μ）に溶解した。合成
遺伝子を結合させるために、ベクターDNA（EcoR I−Bam
H Iフラグメント水溶液,2μ）、合成遺伝子（前記の
水溶液,5μ）、5Xリガーゼ緩衝液（６μ;250mM Tri
s,pH7.6,50mM MgCl₂,25％W/V PEG8000,5mM ATP,5mM DT
T,BRL社製），水（15μ）及びT4 DNAリガーゼ（２μ
,1単位／μ）の混合物を16℃で４時間インキユベー
トした。DNA混合物を直接使用して（リゲーシヨン混合
物自体１μ又は水で５倍に稀釈したリゲーシヨン混合
物２μ）、E.coli菌株HB101を形質転換した。DNA混合
物（１又は２μ）を氷上のE.coliコンピテント細胞に
添加しついで氷上で45分間インキユベートしついで42℃
で45秒間熱衝撃を加えた。氷上に２分間放置後、100μ
のSOS緩衝液（バクトトリプトン（Bactotryptone）２
％；酵母エキス0.5％;NaCl10mM;KCl2.5mM;MgCl₂,MgSO₄2
0mM（各々10mM）；グルコース20mM）を添加し、混合物
を37℃で１時間インキユベートした。懸濁液のアリコー
トから５μ/mlのアンピシリンと共にＬプレート上で
コロニーを形成させた（plato）。形質転換細胞の、ク
ローニングされた合成遺伝子について“Molecular Clon
ing;A Laboratory Manual"中にManiatis等により記載さ
れ、また英国特許出願第8502605号明細書に記載される
標準的方法を使用して、コロニーハイブリダイゼーシヨ
ン分析によりスクリーニングを行つた。全体で160個の
コロニーをフイルター（Schleicher及びSchuell）上で
面線培養し（streak）、37℃で20時間生長させ、分離し
（lyse）ついで乾燥（bake）した。フイルターを、ラン
ダム−ラベルキツト（landom−label kit）（Pharmacia
社）を使用してオリゴヌクレオチド塩基配列EL13（第１
表）から調製した放射性プローブと65℃で20時間ハイブ
リツド形成された。正のハイブリデーシヨン信号を与え
る６個のコロニー（34,40,42,106,109及び156）を小さ
な規模で（100ml）、Ｌブイヨン中で37℃で20時間生長
させそしてManiatis等により“Molecular Cloning:A La
boratory Manual"に記載されるごとき方法に従つて、プ
ラスミドDNAを塩化セシウム中での密度勾配遠心により
調製した。

DNAの塩基配列の決定はSanger等により“Proc Nat.Ac
ad.Sci.USA,74 5463−5467（1977）に記載される標準チ
エーンターミネーシヨン法（standard chain−terminat
ion method）に従つてSequene（登録商標）kit（United
State Biochemical Corporation社製）を使用して行つ
た。オリゴヌクレオチドELS1及びELS2（第５表参照）を
シーケンス プライマー（sequence primer）として使
用した。

クローン156からのプラスミドDNAは第13図に示すごと
き塩基配列を含有しており、このプラスミドをコードpA
G76と称する。プラスミドpAG76を使用して標準的な方法
により下記のE.coli菌株のコンピテント細胞を形質転換
した。

HB101 MSD462（W3110 Delta lac） MSD522（CGSC 6300） DH5 Alpha β−ガラクトシダーゼ−ヒトエラスターゼ阻止剤融合タ
ンパク質の発現 ヒトエラスターゼ阻止剤の合成遺伝子塩基配列を商業
的に入手されるベクター,pUEX2（Amersham Internation
plc.−ブタペスト条約に従つて寄託）中でクローニン
グした。このベクターはバクテリオフアージ ラムダか
らのRpプロモーターの転写調節下でβ−ガラクトシダー
ゼについての遺伝子を含有している。このプラスミド
は、プラスミドを含有する形質転換細胞をアンピシリン
に対して耐性にするβ−ラクタマーゼ遺伝子及びRpプロ
モーターの温度感受性リプレツサー（CI857）について
の遺伝子を含有している。

EcoR I及びSal Iを使用して逐次消化（sequential di
gestion）を行いついで得られた222bpフラグメントを１
％アガロースゲル上での電気泳動により精製することに
より、pAG76（MSD522から調製）から遺伝子を単離し
た。

最初、DNAをDEAE NA45ペーパー上に電気溶離しついで
DNAをNA45ペーパーから1M NaCl溶液を使用して溶離する
ことによりDNAフラグメントを上記ゲルから単離した。

DNAバンドの幅とゲルの深さに切断したNA45ペーパー
の小片を1XTE緩衝液（10mMトリス−HCl,1mM EDTA;pH8.
0）で湿潤させた。湿潤させたNA45ペーパーを、ゲル中
にスロツト中に置き、溶離すべきバンドの直前で切断し
た。電気泳動を５分間行つて、DNAバンドをNA45ペーパ
ー中に吸収させた。DNAを含有するNA45ペーパーを最
初、1XTE緩衝液で洗浄しついで70℃で10分間、必要に応
じて攪拌しながら（vortexing）、1M NaCl（200μ）
で２回処理した。NaCl溶液を一緒にし、DNAをエタノー
ル（1ml）を使用して４℃で10分間沈澱させた。DNAを遠
心分離により捕集し、エタノール：水（7:3）で洗浄
し、乾燥しついで水（20μ）に溶解した。

ベクターを調製するために、５μｇのpUEX2を高塩濃
度緩衝液（BCL:50μ）中で、37℃で１時間、EcoR I及
びSal Iを使用して消化した。DNAをエタノールを用いて
沈澱させ、１％アガロース上で精製した。6.7kbベクタ
ーフラグメントを電気溶離により上記のNA45ペーパー上
で単離し、沈澱させついで水（20μ）中に溶解させ
た。

連結を行うために、５μのベクターDNA（１μｇ）
を、エステラーゼ阻止剤遺伝子フラグメント（10μ,1
μｇ）、5Xリガーゼ緩衝液（BRL;6μ）、水（８μ
）及びT4 DNAリガーゼ（１μ,1μ／μ）に添加し
た。連結は16℃で20時間行つた。DNA混合物を直接又は
水で５倍に稀釈して使用して、合成遺伝子のクローニン
グについて先に述べたと同様の方法でE.coli MSD462及
びMSD522細胞を形質転換した。MSD462においては全体で
８個のコロニーが得られ、MSD522においては全体で75個
のコロニーが得られた。６個のMSD462コロニーと３個の
MSD522コロニーについて前記したごときハイブリデーシ
ョン分析による検査を行つた。全てのコロニーが正であ
ることが認められ従つて37℃及び42℃で発現するタンパ
ク質を検討するため、全てのコロニーを小さい規模で生
長させることにより更に分析を行つた。これらの小規模
での生長は下記のごとく行つた： 菌株（culture）を振盪インキユベーター（250rpm）
内の、0.02％のカゼイン水解物、グルコース（2.0g/
）、MgSO₄・7H₂O（1mM）、CaCl₂・2H₂O（0.1mM）、ア
ンピシリン（50μg/ml）及びチアミン（４μg/ml）を含
有するM9培地（medium）75ml中で、37℃で20時間生長さ
せた。細胞を新しい培地に移してOD550を0.1としついで
OD550が0.4〜0.5になるまで37℃でインキユベートしつ
いで42℃で３時間インキユベートした。細胞を遠心分離
により捕集しついでラエムリ（laemmli）緩衝液（0.125
mMトリス−HCl,pH6.8）SDS（２％w/v）、グリセリン（2
0％w/v）、新たに添加したβ−メルカプトエタノール
（２％w/v）を含有するブロムフエノール（痕跡）中で
沸騰させることにより（100℃,15分）、アリコートを分
離（lyse）した。タンパク質は20％ポリアクリルアミド
ゲル中でかつクーマシーブリリアントブルーで染色して
電気泳動を行うことにより検査した。MSD522からの３個
のクローン及びMSD462からの５個のクローンは全てマー
カーのβ−ガラクトシターゼより分子量の大きい新しい
タンパク質を産生しそしてβ−ガラクトシターゼタンパ
ク質は先代（parent）pUEX2ベクターにより産生され
た。MSD522からのクローンの１つをpAG77と称する。

β−ガラクトシダーゼ−ヒトエラスターゼ阻止剤融合タ
ンパク質の調製 β−ガラクトシダーゼ−エラスターゼ融合タンパク質
（pAG77）を発現するE.coli MS522の組換え体菌株（rec
ombinant strain）を原液（stock）から回収し、アンピ
シリン（50μg/ml）を補充したＬ寒天プレート上に線状
に接種し（streak）ついで37℃で20時間インキユベート
した。細胞のループをこのプレートから、前記したごと
き補充されたM9培地を75ml含有する250mlエルレンマイ
ヤーフラスコ４個の各々に移した。これらのフラスコを
オービタル（orbital）インキユベーター上で300rpmで
振盪することにより37℃で20時間ついで42℃で４時間イ
ンキユベートした。

β−ガラクトシダーゼ−ヒトエラスターゼ阻止剤融合タ
ンパク質の精製 E.coli細胞を回収し、リシス緩衝液（lysis buffer）
（15％スクロース、50mM EDTA,50mMトリス塩酸,pH8.0）
に懸濁させついでリゾーム/LDS（それぞれ、0.5mg/ml及
び0.05％）で処理することにより溶解し（lyse）ついで
４℃で音波処理を行つた（MSEソニケーターを使用;45秒
×４）。

得られた懸濁液を遠心分離し、ペレツトフラクシヨン
を水に再び懸濁させついで遠心分離した。

洗浄したペレツトを50mMのβ−メルカプトエタノール
を含有する、リン酸塩で緩衝した生理的食塩水中の6Mグ
アニジン塩酸塩中で可溶化した。

この溶液をリン酸塩緩衝生理的食塩水で十分に透析し
ついで得られた沈澱を遠心分離により捕集した。

沈澱をSDSポリアクリルアミドゲルを含有する緩衝液
中に溶解しついで10％還元性ゲル系を使用してポリアク
リルアミドゲル電気泳動にかけた。

ゲルはクーマシーブルーで染色し、融合タンパク質に
対応するタンパク質バンドを切取つた。これをウサギに
抗血清を生ぜしめるための抗原（immugen）として使用
した。

酵母におけるエラスターゼ阻止剤の調製 酵母分泌ベクターpDP258 上記酵母分泌ベクターは第18図に示されているかつブ
タペスト条約に従つて寄託されているものである。この
ベクターはMFアルフア１プレプロ領域内のSTE13プロセ
ツシング信号へのコード配列の融合を可能にする。タン
パク質のコード配列をSTE13シグナルに融合してコード
されたタンパク質を分泌させる方法を記載している報文
は多数存在するが、部分的に加工された又は加工されて
いない融合タンパク質の分泌又は細胞内での蓄積も報告
されている。この問題はMFアルフアー１プレプロ領域に
おける他の加工部位を利用することにより回避し得る；
例えばBitter,G.A.等、P.N.A.S.81.5330−5334（198
4）;Brake,A.J.等、P.N.A.S.81.4642−4646（1984）;.Z
sebo.K.M.等,J.Biol.Chem.261,5858−5865（1986）;Loi
son,G等、Bio/Technology６,72−77（1988）;Ernst,J.
F.,DNA７ 355−360（1988）参照。

第18図に例示されているpDP258の構成を以下で概説す
る。制限酵素の位置は近似的である。

Flessel,M.C.等の報文（Genetics121,223−236,198
9）に記載される−959でのEcoR I部位から、Kurjan,J.
J.及びHerskowitzの報文（Cell,30,933−943,1982）に
記載されている263でのHind III部位までのMFアルフア
ー１プロモーター及びプレプロコード配列EcoR I−Hind
IIIフラグメント。このフラグメントはKurjan及びHers
kowitzの報文（Cell,30,933−943,1982）により記載さ
れているプラスミド69Aから誘導し得る。

Sal I（1606）−Esp I/Aat II領域はpBR328の2550bp
Sal I−Aat IIフラグメントから誘導される（Covarrubi
as,L.等,Gene13,25−35,1981）。

LEU2遺伝子を含有するEsp−EcoR1（１）領域はYEp13S
（YEp213）から誘導される（Broch,J.R.Method in Enzy
mol,101,307−325,1983及びSherman,F.等,Method in Ye
ast Genetics,Cold Spring Harbor1986,p95）。２μ配
列中に存在するHind III部位は、Hind IIIで切断し、ク
レナウ（Klenow）ポリメラーゼを充填しついで再連結す
ることにより破壊される。

プラスミドpAAH5（Ammerer,G.,Method in Enzymol,10
1,192−201）から誘導されるADC1ターミネーターを含有
するHind III−Sph IフラグメントをT4ポリメラーゼで
処理してブラント末端（flush−ended）DNAを形成させ
た。Sal I部位（第18図の1606に示されている）を切断
し、T4ポリメラーゼを使用して充填した（fill）。ADC1
フラグメントをプラスミド フラグメントと連結して、
MFアルフアー１プロモーターから生ずる転写（transcri
pt）を終止するための適当な配向（orien tation）を有
するADC1ターミネーターを含有する組換え体を形成させ
る。このクローニングによりSal I部位（図示）及びHin
d III部位（カツコ内）も生成する。このポリリンカー
を１個のHind III部位だけがクローニングにより保存さ
れるように設計した。pDP528は第18図に示されるごとき
配向のポリリンカーを含有している。カツコ内に示され
るHind III部位はポリリンカークローニングにより破壊
される。

イースト分泌ベクターの修飾 第18図に示されるプラスミドを更に修飾して、MFアル
フアー１プレプロ領域内のシグナルペプチドの位置に制
限部位、Sph IそしてKEX2加工部位にStu Iを導入するこ
とにより、タンパク質をコードするDNA塩基配列をこれ
らのプロセツシングシグナルに融合させることを可能に
し、エンコードされたタンパク質の細胞外媒体への分泌
を促進した。生体外においては、突然変異誘発（mutage
nesis）はAmersham International plcにより、その“O
rigonucleotide−directed in vitro mutagenesis syst
em version2"）code RPN1523）に詳述されている方法に
従つて行つた。この方法で使用される他の操作は当業者
には周知のものであり、例えば、“Molecular Cloning
−A Laboratory Manual"、第２版,Sambrook,J.,Fritsc
h,E.F.及びT.Maniatis,C.S.H.1989年編集に記載されて
いる。

シグナルペプチドプロセツシング部位におけるSph I部
位の導入 エラスターゼ阻止剤をコードする塩基配列をMFアルフ
アー１“プレ”分泌リーダーに融合することを可能にす
るために、制限（restriction）及びT4ポリメラーゼ処
理の後に、MFアルフアー１ジクナル配列の最後のコドン
（アミノ酸19）の第３の塩基で終結するブラント末端が
生ずるようにSph I制限酵素部位を設定した（例えばErn
st,J.F.,DNA７,355−360 1988参照）。突然変異誘発性
（mutagenic）オリゴヌクレオチド プライマーを設定
しかつ合成して、MFアルフアー１ジクナル塩基配列に必
要とされる配列の変化を導入した。

pDP258からの小さいSst I〜Hind IIIフラグメント
（第18図）を、Sst I＋Hind IIIをカツトしたRF M13 mp
18 DNA（BRL520−8227 SA）中にクローニングした。潜
在的に、組換えプラーク（recombinant plaques）（Ｘ
−gal＋IPTG上で白色）はサイジング（sizing）のため
のRFDNAの小規模の製剤及びアガロースゲル電気泳動に
よる制限酵素分析により特徴ずけられる。第1A図に示す
ごときオリゴヌクレオチド プライマーを使用して生体
内突然変異誘導実験を行うために、大規模の一本鎖鋳型
DNA製剤をこのフラグメントを含有するクローンから生
成させた。突然変異（mutagenised population）の形質
変換を行つた後、15プラークを採り出し、一本鎖鋳型DN
Aを調製した。アガロースゲル電気泳動によるサイジン
グを行つた後、11個の鋳型を標準的なチエーンターミネ
ーシヨン配列決定法によりエキストラＴ残基（第１図に
おいて＊印の付いた“A"に対して相補的）の出現につい
て試験した。ついで既知のMFアルフアー１プロモータ又
はコード配列に追加的な変化が検出されなかつた別の配
列研究からクローン＃６を選択した。ついでクローン＃
６の鋳型DNA製剤（preparation）の10倍稀釈物１μを
コンピテントTG1に形質転換した。プラークを採取し、T
G1細胞（Amersham kitに記載）を予め接種した2xTYの培
地1mlに接種した。これらの菌株を振盪しながら37℃で
５時間生長させ、100mlの2xTYメデウムを接種するのに
使用した。更に５時間振盪培養を行つた後、二本鎖RFDN
Aを標準的なプラスミド調製法により調製した。ついで
クローン＃６からの小Sst I−Hind IIIフラグメントを
制限酵素による切断により生成させ、このフラグメント
をアガロースゲル電気泳動により分離してから精製し
た。ついで精製フラグメントを大Hind III−Sst I pDP2
58フラグメント（第18図参照）にクローニングして、pD
P294、すなわち、推定上のシグナルペプチド開裂部位を
含有するpDP258を生成させた。

KEX2プロセツシング部位でのStu I部位の導入 エラスターゼ阻止剤をコードする塩基配列をKEX2プロ
セツシングシグナルと融合することを可能にするため
に、Stu I部位をPCR突然変異誘発により導入した。

２種のPCRプライマーを生成させた。第１のもの（33
マー）は上記第2A図に示す塩基とは別の、MFアルフアー
１配列に類似していた（Kurjan,J.及びHerskowitz,1.Ce
ll30,933−943,1982）。このプライマーはPCR生成物中
に新しいStu I部位と現存するHind III部位を包含させ
るために設定した。第２の30マーオリゴヌクレオチドプ
ライマーはNsi I制限部位を包含するMFアルフアー１領
域211〜−241（Flessel等、Genetics121:223〜236,198
9）に類似していた。これらの２種のオリゴをPCR増幅反
応におけるプライマー及びプラスミド（例えばpDP258）
鋳型として使用して、約490bpのフラグメントを生成さ
せることができる。１容量のフエノール：クロロホル
ム：イソアミルアルコール（25:24:1）で抽出しついで
エタノールで沈澱させた後、PCR DNA生成物を１容量の
水に溶解させた。このDNAをNsi I及びHind III制限酵素
で切断した。この反応の生成物をアガロースゲル上に供
給し、約490bpで生ずるバンドを標準的方法で精製し
た。

pDP258のXba I〜Hind III領域を含有するpUC18（BRL5
20−5363 SA）を生成させた。Nsi I部位（Fessel等の−
227）はこのプラスミドにおいて少なかつた（uniqu
e）。このプラスミド中のNsi I−Hind IIIフラグメント
を標準的なクローニング法により、新しいStu I部位を
含有するPCR−生成フラグメントで置換した。Stu I部位
を含有する６個のクローンを同定した。クローン＃６は
ジデオキシ配列が正しい位置に新しいStu I部位を含有
していること及び公知の配列と異り、追加的な突然変異
がないことを特徴とする。このプラスミドをpDP273と称
する。

pDP258のXba I−Hind III大フラグメント及びpDP273
からのXba I−Hind IIIフラグメントを制限酵素切断及
びアガロースゲル上での分離により調製した。寒天ゲル
から精製した後、これらのフラグメントを連結しそして
形質転換してコンピテントE.coli（HB101）にした。小
スケールDNA標本を36個のコロニーから生成させた。こ
のDNAをStu I及びSst I制限酵素で消化した。クローン
＃９をアガロースゲル電気泳動により目視し得るごとき
正しい制限酵素パターンを有するものとして同定した
（pDP274）。ついでpDP274DNAをXba Iで切断しついでpD
P258からの小さいXba Iフラグメントの精製製剤を用い
て連結した。この連結混合物を用いて形質転換した36個
のE.coliコロニーから小スケールDNA製剤を調製した。E
coR I及びStu Iで消化した後、正しい、当初の自然の向
きの小さいXba Iフラグメントを含有する２種のクロー
ンが同定された。更に操作を行うために、１つのクロー
ン（pDP289）、すなわち、KEX2プロセツシング部位にSt
u I部位を有するpDP258を調製した。

酵母分泌シグナルの下流のエラスターゼ阻止剤遺伝子の
クローニング pAG76を制限酵素BspMI（第13図参照）で切断しついで
T4ポリメラーゼで処理して５′突出端部（overhang）を
充填することによりブラント末端DNAを生成させた。フ
エノール：クロロホルム：イソアミルアルコール混合物
で抽出し、エタノールで沈澱させた後、上記DNAを水に
溶解しついでBam H I制限酵素で消化した。エラスター
ゼ阻止剤をコードする小フラグメントをアガロースゲル
からの精製することにより単離した。３種のベクターの
各々を以下に述べるごとく消化して、大フラグメントを
アガロースゲルから単離した。

pDP258−Hind IIIで切断、T4ポリメラーゼで５′突出
端部を充填,BamH Iで切断。

pDP289−Stu I及びBamH Iで切断。

pDP294−Sph Iで切断、T4ポリメラーゼで処理して
３′突出端部を除去、BamH Iで切断。

３種の精製ベクターフラグメントの各々をエラスター
ゼ阻止剤フラグメントと連結した。連結混合物の各々の
試料をコンピテントHB101E.coli中に移した。３種の連
結混合物の各々を使用して得られたコロニーから20〜40
個の小スケールDNA試料を調製した。制限酵素BamH I＋P
st Iで消化しついでアガロースゲル上でフラグメントを
分離することにより組換え体を同定した。MFアルフアー
１とエラスターゼ阻止剤をコードする塩基配列との融合
において適当な配列を有するクローンをDNA塩基配列決
定により確認した。更に分析を行うために選択されたク
ローンは下記の通りである： pDP280 STE13/エラスターゼ阻止剤融合物； pDP258から誘導。

pDP298 SIGPEP/エラスターゼ阻止剤融合物； pDP294から誘導。

pDP299 KEX2/エラスターゼ阻止剤融合物； pDP289から誘導。

これらの構造体（construct）をJRY188（Brake等,P.
N.A.S.,81,4642−4646,1984）に形質転換した（Sherman
等）。クローンを接種しついで液状YPAD（Sherman等,Me
thod in Yeast Genetics,Cold Spring Harbor,1986,p16
4,165）中に、又はLEU“ドロツプ−アウト”メデア
（“drop−out"media）（Synthetic Complete Medium m
inus leucin,Sherman等,Method in Yeast Genetics,Col
d Spriner Harbor,p164,165,1986）中で30℃で定常期ま
で生長させた。活性エラスターゼ阻止剤はpDP280クロー
ンからの培養株の上澄液中で検出できた（第19図参
照）,pDP298及びpDP299クローンからの阻止剤物質の収
量は低かつた。

前記構造体を更に、酵母菌株XS95−6C（Yeast Geneti
c Stock Center,カルフオルニア大学，バークレイ,CA94
720）に形質転換した。30℃で72時間振盪培養（250rp
m）を行い、培養菌が定常期に到達したとき（典型的に
はOD600＝４〜６）、全細胞をペレツト化することによ
り培養菌上澄液を回収した。以下で述べるごとき酵素効
力評価を行うことにより、活性を培養菌上澄液中で検定
した。生の（native）エラスターゼ阻止剤を使用する標
準曲線（後期参照）に基づいて、pDP298クローンは3.5
μg/mlまでの活性エラスターゼ阻止剤を培養菌上澄液に
分泌させた。

組換え体ヒトエラスターゼ阻止剤タンパク質の精製 STE13プロセツシング部位（pDP280）を使用して得ら
れる物質及び液状−LEU“ドロツプ−アウト”メデイア
中で生長させたJRY188の宿主を下記の方法で精製した。

培養液上澄液（２まで；振盪フラスコ中で生長）を
0.22μフイルターを使用して過した。液をアミコン
（Amicon）スパイラル コンセントレーター中で3000Mr
カツトオツフフイルターを使用して約10倍に濃縮した。
ついで濃縮液を20容量の10mMギ酸アンモニウム（pH4）
を使用して３回透析した。透析物質を予備平衡化した
（pre−equilibrated）スルホプロピル セフアロース
（Sulphopropyl Sepharose）カラムに送入し、10mMへ50
mMギ酸アンモニウムを使用して傾瀉溶離した。活性フラ
クシヨンをプールし、濃縮しついでサイズ排除クロマト
グラフイー カラム（Pharmacia,HR100）に通送し、リ
ン酸塩緩衝食塩水で溶離した。

Ｎ−末端塩基配列の決定の際に、式（Ｉ）の成熟（ma
ture）ポリペプチド（60％）及び式（Ｉ）の成熟ポリペ
プチド＋１個又は２個のglu−alaアミノ酸末端伸長鎖
（terminal extension）を与えるミクロ不均質（microh
eterogeneous）生成物が得られた。これらの伸長鎖は酵
母菌株による不完全なプロセツシングに基づくものと考
えられ従つてこれらの末端伸長鎖を有するポリペプチド
を式（Ｉ）の成熟ポリペプチドから50mM酢酸ナトリウム
pH4.5中のMonoS HPLCにより、０〜0.5Mの間で濃度を変
化させた塩化ナトリウムを溶離剤として使用して分離し
た。ミクロ不均質生成物は乾癬プラークから単離された
ポリペプチドによつて示されるものと同一の特殊な活性
を示すことが認められた。

同様の方法を使用してSIGPEP及びKEX2プロセツシング
部位を使用して得られた構造体を培養することにより産
生されたタンパク質を精製した。これらの構造体につい
ては式（Ｉ）の成熟ポリペプチドについての適当なＮ−
末端塩基配列を有する均質な生成物が得られた。

他の宿主中で生長させた構造体（construct）につい
て使用した精製法は上記したものと本質的に同一であ
る。例えば、シグナルペプチド開裂部位を使用して得ら
れた構造体を酵母菌株XS956C中で生長させついで前記の
プロトコールに従つて精製して、乾癬プラークから単離
したポリペプチドと同一の特異的な活性を示す単一の化
合物として、式（Ｉ）の成熟ポリペプチド4mgを得た。

エラスターゼ阻止剤の存在を決定するための分析 例えば組換え体DNA製造技術により式（Ｉ）のポリペ
プチドを製造する際の、式（Ｉ）のポリペプチドの存在
とその量は下記の分析法を使用して監視した。この分析
法においては、上記物質の活性はＮ−メトキシサクシニ
ル−ala−ala−pro−val−ｐ−ニトロアニライド（AAP
V,Sigma社）を基質として使用して、豚膵臓エラスター
ゼの阻止効果により測定した。

試料、例えば、酵母の発酵からの上澄液（100μ）
を分析用緩衝液（0.1M Hepse/0.5M NaCl/pH7.5;R1A等級
の牛アルブミン血清を１％含有）と混合した。混合物を
室温で30分間インキユベートしついで分析用緩衝液中の
基質（800μ,2.5mM）を添加しついで混合物を室温で
２分間インキユベートした。405nmでの吸光度の変化率
を２分間測定しついで乾癬プラークから単離した式
（Ｉ）のポリペプチドを使用して作成した標準曲線から
活性を算定した（標準物質は０〜2.5μg/mlの範囲で使
用した）。

HLEに対する組換え体エラスターゼ阻止剤の阻止活性 前記の方法で製造した組換え体エラスターゼ阻止剤に
ついて上記した方法を使用して、ヒト白血球エラスター
ゼに対する阻止活性を調べた。組換え体ポリペプチドは
乾癬症の皮膚から得られたポリペプチドと同等の阻止活
性を有することが認められた。

粗組換え体エラスターゼ阻止剤のPoly LC−HPLC 100μｇの粗組換え体エラスターゼ阻止剤をPoly LCカ
ラム上でクロマトグラフイーにかけ、ヒト白血球エラス
ターゼ阻止ピークを出現させた。２つの主ピーク（Ｉ及
びII）が観察された。ピークＩは215nmでの積分吸光度
に基づいて、23μｇのタンパク質と19.4μｇの活性阻止
剤（MW7017,HLEで滴定）を含有していた。ピークIIは8.
4μｇのタンパク質と6.9μｇの活性阻止剤を含有してい
た。従つてこれらのピークは実質的に純粋な阻止剤であ
ると考えられる。１μｇのピークＩとヒト乾癬症皮膚か
ら得られた式（Ｉ）のポリペプチド１μｇについて共溶
離（coelution）試験を行つた結果ピークＩが得られ、
皮膚から得られた物質はこの系と同一であつた。このこ
とは、同様に単一ピークを示すPR18−HPLCによる共溶離
試験により更に立証された。

Poly LC−HPLCのピークＩについて、Green及びWorkの
方法に従つてkiを測定することによりHLEに対しての効
果を調べた。ピークＩは8.0×10^-8Mのkiを示し、一方、
ヒトの皮膚からの阻止剤は3.3×10^-10Mのkiを示した。G
reen及びWorkの方法の精度について、ピークＩの物質は
ヒトの乾癬症皮膚からのポリペプチドと同等の活性を有
すると考えられる。

上記の粗組換え体阻止剤は約75％の不活性タンパク
質、５％の下記のごときHLE阻止剤、すなわち、Poly LC
−HPLC上での滞留時間の点でヒトの皮膚から得られた式
Ｉのポリペプチドと相違するHLE阻止剤（この相違は恐
らくは、ｎ−末端における伸長又は欠失に基づくものと
思われる）及び20％の下記のごとき阻止剤、すなわち、
TSK2000サイズ排除HPLC,RP18−HPLC、Poly LC−HPLCに
おける滞留時間及び阻止活性の点でヒトの乾癬症皮膚か
ら得られたポリペプチドと同一のHLE阻止剤（Poly LC−
HPLCにおけるピークＩ）からなると考えられる。

ヒト白血球エラスターゼ阻止剤のcDNA塩基配列 特定のポリペプチドをコードするDNA塩基配列の誘導
又は決定（derivation）は標準的方法を使用して行い得
る。かかる方法としてはスクリーニング技術、すなわ
ち、可能なDNA塩基配列の組合せを表わす混合オリゴヌ
クレオチドを用いる組換え体cDNAライブラリーのハイブ
リデーシヨンスクリーニング及びPCR（ポリメラーゼ鎖
反応）として知られる方法のごとき増幅技術が挙げられ
る。

上記の２つの方法によるcDNAライブラリーのスクリー
ニングについての実験プロトコールは“Molecular Clon
ing"−Sambrook,J;Fritsch,E.F及びMariatis,T.;第２
版、Cold Spring Habor Laboratory Pressに記載されて
いる。

上記した周知の方法を使用して“卓越した阻止剤”
（すなわち式Ｉのポリペプチド）についてcDNA塩基配列
を決定した。肺のcDNAラムダgt₁₁ライブラリーを使用
し、第14図に示すごとき塩基配列を得た。この塩基配列
は第15図に示すごとく継続するものと考えられる。翻訳
停止コドンはコード塩基配列の後方に存在しそしてポリ
アデニル化シグナルは３′より前の153bp（153bp furth
er3′）に存在すると考えられる。また、250bpイントロ
ンは遺伝子の３′末端に存在すると考えられる。

更に別の操作においては、ヒトの肺のcDNAライブラリ
ーからのエラスターゼ阻止剤の製剤（preparation）の
主活性成分（及び微量成分）の完全アミノ酸配列をコー
ドするcDNAクローンを単離した。第16図にかかるクロー
ンの１つ（E14）の完全DNA塩基配列が示されている。こ
の塩基配列は他の独立の（independent）cDNAクローン
及びPCRにより同一のcDNAから単離されたDNAフラグメン
トからのクローンについても立証された。この塩基配列
はエラスターゼ阻止剤コード領域の他に、上流“イン−
フレーム”（“in−frame"）タンパク質コード配列の存
在も示している。上流塩基配列はつぎのごとき特徴を有
する： ａ） エラスターゼ阻止剤タンパク質配列のすぐ上流の
19アミノ酸コドンは、タンパク質配列分析により同定さ
れる小量（minor）タンパク質部分（ピークV,成分Ａ）
から誘導されるタンパク質配列データーと一致する。

ｂ） エラスターゼ阻止剤コード配列の開始から−26〜
＋10の残基からの反復ペプチド モチーフの６個のコピ
ー（通常、Val−Lys−Gly−Ｘ−Y,XはAsp,Val,Glu,Pro,
Ser又はLysである）。エラスターゼ阻止剤製剤（prepar
ation）の種々の小量成分のＮ−末端は特異的なタンパ
ク分解開裂の部位であるこのモチーフと一致しない。

ｃ） トランスメンブランドメインのシグナル配列の一
部を表わし得る、このクローンによりエンコードされる
Ｎ−末端は高度に親水性である（18残基からの13）。

このクローンは従来の見解、すなわちAUGによれば認
識し得る翻訳開始コドンを含有していない。プライマー
伸長の研究の結果は、培養したヒトケラチノサイト（HK
E78）からのmRNA中で確認されるcDNA塩基配列の開始部
の前の約80個の塩基での主転写を示した。他のmRNA種
（ヒトの肺からの全RNAを含む）の範囲内の類似のメツ
セージの存在はこの方法によつては示されたかつた。

膵臓腺癌全RNAのノザン法分析は約750塩基の類似の転
写（homologous transcript）の存在を示した。これは
プライマー伸長データーの上記cDNA塩基配列からの、予
測されたサイズ（predicted size）と不一致ではない
（約190塩基のポリアデニル化の長さを仮定して）。

エラスターゼ阻止剤に対する抗体 ニユージーランド ホワイトラビツトを使用して、式
（Ｉ）のポリペプチドに対する抗体を生じさせた。下記
のワクチンを使用した。

1. 式Ｉのポリペプチドの16N−末端アミノ酸残基から
なる基質（Ａ）をLerner等の方法（Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA78:3403−3407）に従つて、マレイミドベンゾイル
−ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを介して牛血
清アルブミンとカツプルさせたもの。

2. 基質（Ａ）を上記におけるごとく牛スリオグロブリ
ンとカツプルさせたもの。

3. 基質（Ａ）をメチル−牛血清アルブミンとカツプル
させたもの。

4. β−ガラクトシダーゼと式Ｉのポリペプチドの融合
タンパク質。

上記1.2.及び3.のポリペプチドについて使用した免疫
感作操作は下記の通りである： １日目−フロインド完全補助液中のペプチド250μｇ
を皮下投与した； 39日目−フロインド不完全補助液中のペプチド250μ
ｇを皮下投与した； 66日目−フロインド不完全補助液中のペプチド250μ
ｇを皮下投与した； 107日目−1mgのペプチドを補助液を使用しないで静脈
内投与した； 120日目−採血。

上記4.の融合タンパク質について使用した免疫感作操
作は下記の通りである： １日目−フロインド完全補助液中のタンパク質ワクチ
ン200μｇを皮下投与した； 22日目−フロインド不完全補助液中のタンパク質ワク
チン100μｇを皮下投与した； 61日目−フロインド不完全補助液中のタンパク質ワク
チン200μｇを皮下投与した； 94日目−タンパク質ワクチン130μｇを補助液を使用
しないで静脈内投与した； 107日目−採血。

生成した抗血清の交差反応性（cross reactivity）を
SDS−PAGE及びウエスタン法により測定した。融合タン
パク質（前記4.）を使用して生成させた抗血清は乾癬プ
ラークから単離した式Ｉのポリペプチド及び式Ｉの組換
え体ポリペプチド（１μg,2000倍に稀釈して検出）及び
α−アンチトリプシンと交差反応することが認められ
た。抗血清を非可動化α_１−アンチトリプシン（5mlの
シアノゲンブロマイド活性化セフアロス4Bカラムに結合
させたα_１−アンチトリプシン25mg,Parmacia社）から
なるカラムを通過させることにより（４回）、α−アン
チトリプシン交差反応性を除去した（90％）。前記1.,
2.及び3.のペプチドから生じさせた抗血清も式Ｉの組換
え体ポリペプチドと交差反応した。

種々の体組織を抗血清で処理した；この処理は組織と
抗血清を1:50の割合で使用しそしてイムノペルオキシダ
ーゼ（immunoper oxidase）法に従つて行つた。肝胆汁
系の肝細胞については強い反応性が認められ、胃内の筋
性粘膜については僅かな反応性が認められ、扁排内のラ
ミナ スピノサ（lamina spinosa）及び静脈平滑筋細胞
については僅かな反応性が認められそして皮膚の表皮の
ストラタム コルネウム（stratum corneum）、ストラ
タム グラヌロスム（stratum granulosm）、ストラタ
ム スピノスム（stratum spinosm）及びストラタム
バサレ（stratum basale）については強い反応性が認め
られた。

略 号 AAPEpNA :スクシニル−アラニル−プロリル−フエニ
ルアラニル−Ｐ−ニトロアニライド AAPV−AFC:メトキシ−スクシニル−アラニル−アラニ
ル−プロリル−バリル−トリフルオロメチルクマリン AAPVpNA :メトキシ−スクシニル−アラニル−プロリ
ル−バリル−Ｐ−ニトロアニライド TGPLpNA :トシル−グリシル−プロリル−リシン−Ｐ
−ニトロアニライド HLE :ヒト白血球エラスターゼ TFA :トリフルオル酢酸 DMSO :ジメチルスルホキシド PCR :ポリメラーゼ鎖反応−DNA−塩基配列の増
幅方法、例えばK.Kleppe等、Nol.Biol（1971），56.341
−361;及び欧州特許出願公開第0201.184号及び“Molecu
lar Cloning−A Laboratory Manual"第２版,Sambrook
J,Fritsch,E.F.and T,Maniatis.CSH1989参照。

アミノ酸の記号 Ｇ又はGly:グリシン Ａ又はAla:アラニン Ｓ又はSer:セリン Ｔ又はThr:スレオニン Ｃ又はCys:システイン Ｎ又はAsn:アスパラギン Ｑ又はGlu:グルタミン酸 Ｌ又はLeu:ロイシン Ｉ又はIle:イソロイシン Ｖ又はVal:バリン Ｍ又はMet:メチオニン Ｆ又はPhe:フエニルアラニン Ｙ又はTyr:チロシン Ｗ又はTrp:トリプトフアン Ｐ又はPro:プロリン Ｄ又はAsp:アスパラギン Ｅ又はGlu:グルタミン酸 Ｈ又はHis:ヒスチジン Ｋ又はLys:リシン Ｒ又はArg:アルギニン 第１図〜第８図についての説明 第１図は50gの乾癬症痂皮からの酸性化した抽出物の
カチオン交換クロマトグラフイー（TSK CM3 SE−HPLC）
を示す。カラムフラクシヨンを自動的に捕集し（60滴／
フラクシヨン）そしてタンパク質含有量を280nmで監視
した。フラクシヨンのHLE阻止活性（HLE−１）を評価し
た。各フラクシヨン５μについて、合成テトラペプチ
ド基質メトキシ−スクシニル−アラニル−アラニル−プ
ロリル−バリル−ｐ−ニトロアニライドのHLE−誘発タ
ンパク分解に対する阻止活性を評価した。阻止活性フラ
クシヨン（ハツチを付けた領域）を一緒にし、更に精製
した。

第２図はカチオン交換クロマトグラフイーから誘導さ
れたフラクシヨンを含有するエラスターゼ阻止剤の逆相
−C₈−クロマトグラフイー（ヌクレオシル300C₈HPLCで
ある（但し第２の再クロマトグラフイーを条件とす
る）。タンパク質含有量を215nmで連続的に記録した。
エラスターゼ阻止剤含有フラクシヨンを一緒にし（ハツ
チを付けた領域）ついでPoly LCクロマトグラフイーに
かけた。

第３図は逆相C₈クロマトグラフイーから誘導されたエ
ラスターゼ阻止剤含有フラクシヨンのポリスルホエチル
アスパラトアミドクロマトグラフイー（Poly LC−HPL
C）である。タンパク質含有量を215nmで記録した。タン
パク質含有量と阻止能力に基づいて最もすぐれたピーク
Ｖ（全体の約20％）を捕集し、逆相C₁₈クロマトグラフ
イーにより更に精製した。

第４図はPoly LC−HPLCから誘導された主エラスター
ゼ阻止成分の逆相−C₁₈−クロマトグラフイー（ヌクレ
オシル5 C₁₈−HPLC）である（但し第２の再クロマトグ
ラフイーを条件とする）。バツチ付き領域は精製された
“卓越した”エラスターゼ阻止剤を表わす。この製剤を
使用して特性決定を行つた。

第５図は0.1％のTFAを溶離剤として使用するTSK2000
HPLC上での分析ゲルクロマトグラフイーにより決定し
た、式Ｉのポリペプチドの見掛分子量（apparent molec
ular mass）である。タンパク質含有量は215nmで監視し
た。Mrマーカーとして下記のものを使用した： Val−Gly−Ser−Glu MW＝390,インシユリンβ−鎖フラ
グメント22−30、MW＝6512,大豆トリプシン阻止剤MW＝2
2,000.オボムコイド トリプシン阻止剤MW＝27000,牛血
清アルブミンMW＝67000。

第６図はServalyt（登録商標）プレコートpH3−10上
での式Ｉのポリペプチドの等電点電気泳動である。標準
としてシトクロムＣ（Cy−ｃ）、リボヌクレアーゼＡ
（Rib A），鯨からのミオグロブリン（Myo I）及び馬か
らのミオグロブリン（Myo II）からなるServa Text Mix
9を使用した。ゲルを銀を染色するか（頂部に示されて
いる）か又はスライスし、アセトニトリルで溶離しつい
でエラスターゼ阻止活性（HLE−Ｉ）（下部に示されて
いる）を評価した。

第７図は“卓越した”エラスターゼ阻止剤（式Ｉのポ
リペプチド）のヒト白血球エラスターゼに阻止効果を示
す。精製HLE（組換え体エグリンＣを用いて１μg/mlに
滴定）を“卓越した阻止剤"0.05〜0.8μｇ（逆相C₁₈HPL
Cにおいて215nmでの集積吸光度に基づくタンパク質含有
量）に対して滴定した。酵素と“卓越した”阻止剤を21
℃で30分間、プレインキユベートし、残留活性を、基質
として2mM AAPV−pNAを使用してE1分から測定した。Ki
はGreen及びWorkの方法（文献８）で算定して３×10^-10
Mであつた。

第８図は“卓越した”エラスターゼ阻止剤、すなわち
式Ｉのポリペプチドの塩基配列を示す。

ブタペスト条約に基づく寄託の詳細 下記のプラスミドをブタペスト条約に基づいて英国、
スコツトランド、23st、Machar Drive Aberdeen AB2、1
RY所在のThe National Collection of Industrial and
Marine Bacteriaに寄託した。

プラスミドpUC18及びpUFX2は1990年５月31日に寄託。

プラスミドpDP258は1990年５月28日に寄託。

【図面の簡単な説明】

第１図は乾癬症プラークからの式Ｉのポリペプチドの抽
出と精製で使用するカチオン交換クロマトグラフーを示
す。 第２図は乾癬症プラークからの式Ｉのポリペプチドの抽
出と精製で使用する逆相−C₈−クロマトグラフを示す。 第３図は乾癬症プラークからの式Ｉのポリペプチドの抽
出と精製で使用するポリ−スルホエチルアスパラトアミ
ドクロマトグラフーを示す。 第４図は乾癬症プラークからの式Ｉのポリペプチドの抽
出と精製で使用する逆相−C₁₈−クロマトグラフイーを
示す。 第５図は式Ｉのポリペプチドの分子量の決定で使用した
分析ゲルクロマトグラフイーを示す。 第６図は式Ｉのポリペプチドの等点電の決定で使用した
等電点電気泳動法を示す。 第７図は式Ｉのポリペプチドによるヒト白血球エラスタ
ーゼの滴定を示す。 第８図は式Ｉのポリペプチドの塩基配列を示す。 第９図〜第12図は式Ｉのポリペプチドの発現で使用した
DNA塩基配列を示す。 第13図は式Ｉのポリペプチドの発現で使用したDNA塩基
配列を示す。 第14図及び第15図は式Ｉのポリペプチドについての部分
的cDNA塩基配列を示す。 第16図は式ＩのポリペプチドについてのcDNAの塩基配列
を示す。 第17図はプラスミドpUEX2を示す。 第18図は酵母中で式Ｉの成熟ポリペプチドを発現させる
のに使用されるプラスミドpDP258を示す。 第19図は酵母中で式Ｉのポリペプチドの蓄積を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 9/99 Ｃ１２Ｎ 9/99 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (31)優先権主張番号 ８９２４７１７．５ (32)優先日 1989年11月２日 (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） 微生物の受託番号 ＮＣＩＭＢ ４０２８８ 微生物の受託番号 ＮＣＩＭＢ ４０２８９ 微生物の受託番号 ＮＣＩＭＢ ４０２９０ (72)発明者 マイケル・デリツク・エツジ イギリス国．チエシヤー．コングルト ン．タダー・ウエイ．６ (72)発明者 デービツド・ピオリ イギリス国．チエシヤー．リムン．ラツ シユ・グリーン・ロード．136 (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎｅＳｅｑ

Claims (11)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】式I: で表わされるポリペプチドであって、ヒト白血球エラス
   ターゼに対する阻止作用を有するポリペプチド。
2. 【請求項２】組換え体DNA製造技術により製造される、
   請求項１に記載のポリペプチド。
3. 【請求項３】請求項１に記載のポリペプチドをコードす
   るDNA塩基配列を有するDNA。
4. 【請求項４】ａ）式Ｉのポリペプチドをコードする、第
   13図に示されるDNA塩基配列又はそのフラグメント又は
   その相補的鎖；又は ｂ）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下
   で第13図に示されるDNA塩基配列とハイブリダイズするD
   NA塩基配列； からなるDNA塩基配列を有するDNAであって、ヒト白血球
   エラスターゼに対する阻止作用を有するポリペプチドを
   コードするDNA。
5. 【請求項５】第14図又は第16図に示されるDNA塩基配列
   からなるDNA塩基配列を有するDNA又はその相補鎖。
6. 【請求項６】請求項１又は２に記載のポリペプチドをコ
   ードする遺伝子を挿入した、形質転換細胞宿主内で発現
   することのできる複製可能なプラスミド発現ビヒクル。
7. 【請求項７】請求項１又は２に記載のポリペプチドを発
   現することのできる形質転換細胞宿主であって、該宿主
   は請求項６に記載の複製可能なプラスミド発現ビヒクル
   を含有しているものである形質転換細胞宿主。
8. 【請求項８】請求項１又は２に記載のポリペプチドに結
   合させるのに有効な抗体。
9. 【請求項９】請求項１又は２に記載のポリペプチドをコ
   ードする遺伝子を、ベクター中の適当な部位に挿入し
   て、請求項１又は２に記載のポリペプチドの合成に使用
   することのできる複製可能なプラスミド発現ビヒクルを
   得ることを特徴とする、請求項６に記載の複製可能なプ
   ラスミド発現ビヒクルの製造方法。
10. 【請求項１０】請求項６に記載の複製可能なプラスミド
    発現ビヒクルで形質転換された宿主細胞を培養すること
    を特徴とする、請求項１に記載のポリペプチドの製造方
    法。
11. 【請求項１１】請求項６に記載の複製可能なプラスミド
    発現ビヒクルを宿主に挿入することにより該宿主を形質
    転換することを特徴とする、請求項７に記載の形質転換
    細胞宿主の調製方法。