JPS62111682A - レシチン−コレステロ−ルアシルトランスフエラ−ゼの製造方法およびその製造用核酸 - Google Patents
レシチン−コレステロ−ルアシルトランスフエラ−ゼの製造方法およびその製造用核酸Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
産業上の利用分野
本発明は、レシチン−コレステロールアシルトランスフ
ェラーゼ（ＬＣＡＴ）の製造、特に組み換え宿主細胞培
養物におけるＬＣＡＴの発現に関する。 末梢由来のコレステロールは異化のため血漿（プラズマ
月こより肝に移送される。この経路（逆コレステロール
移送）における一連の反応は、末梢コレステロールの恒
常性に重要であると考えられている（１）。血漿中のコ
レステロールの代謝およ゛ヒ移送ノ過程において鍵とな
る要素は、レシチンーコレステロールアシルトランスフ
ェラーセ（ＬＣＡＴ月こよるそのエステル化である。見
かけ分子量〜６３，０００の糖タンパク質であるこの酵
素（２、３）は、肝から血漿中に分泌される（４，５）
。 生理学的な条件下で、ＬＣＡＴは、レシチンのｓｎ２位
から遊離コレステロールの３−ＯＨ位へのアシル基の転
移を触媒する。アポリポタンパク質Ａ−Ｉ（アポＡ−Ｉ
）、すなわち血漿高密度リポタンパク質（ＨＤＬ，ｌの
主要なタンパク質は、Ｌ，ＣＡＴ活性の強力な活性化因
子である（６）。血漿中における拡散性コレステロ−ノ
ーの不溶性エステル形への変換は、細胞膜と血漿の間の
濃度勾配の維持において重要である。ＬＣＡＴ活性が試
験管内あるいは生体内で抑制されているか、または遺伝
的に欠損している場合には、コレステロールはもはや血
漿に移送されず、組織中に蓄積される（７〜９）。ＬＣ
ＡＴタンパク質はいくつかの研究室で均質性になるまで
精製されているが、その作用機序はほとんど知られてい
ない。さらに、天然原料からの精製が高価であるのに加
えて、他のウィルス等によって最終生成物が汚染される
危険性がある。それに加え、天然のＬＣＡＴの活性、す
なわちある動物種に存在するＬＣＡＴのアミノ酸配列と
同じアミノ酸配列を有するＬＣＡＴ（またはその天然の
アレル体〕の活性は容易に改良することができない。従
って、本発明の目的の１つは、感染性汚染がなく、かつ
天然のＬＣＡＴの性質とは異なる性質を有するＬＣＡＴ
のアミノ酸変異体の製造を可能にするに十分な順応性を
有するＬＣＡＴの経済的な製造方法を提供することであ
る。 発明の要約 上記の目的は、ｔａｌレシチン−コレステロールアシル
トランスフェラーゼ（、ＬＣＡＴ）をコードしている核
酸を含有するベクターを組み立て、ｔｂ）該ベクターで
宿主細胞培養物を形質転換し、ｔｃ＋該形質転換体を培
養して培養物中にＬＣＡＴを放出させ、そしてｔｄ）Ｌ
ＣＡＴを培養物から回収することからなる方法によって
達成される。 本発明者らは、完全な長さのＬＣＡＴのｃＤＮＡクロー
ゾを作成し、配列決定し、翻訳されたＬＣＡＴタンパク
質およびそのリーダープレペプチドの完全なアミノ酸配
列を提供し、そして組み換え体細胞培養物における発現
方法を提供することに成功した。驚くべきことに、コレ
ステロールおよびその他の脂質が細胞膜をもとのまま維
持する上で必須の役割を果すものであるにもかかわらず
、この酵素は、明らかな宿主細胞毒性を示すことな（、
酵素的に活性な形で組み換え体細胞培養物中に発現され
た。 本発明は、改良された性質（たとえば酸化安定性の増強
、細胞培養物あるいは生体内治療におけるタンパク質加
水分解に対する感受性の減少等〕およびＬＣＡＴのアポ
リポタンパク質および補因子結合性の変化を示す、ＬＣ
ＡＴのアミノ酸配列変異体の製造方法を提供するもので
ある。 本明細書で定義する、ＬＣＡＴに関与するＤＮＡは、心
臓疾患に関係している制限酵素の多環性（ポリモルフイ
ズム〕を調べるための雑種形成（ハイブリダイゼーショ
ン〕検定に用いられる。 このような検定は、出生前の先天性ＬＣＡＴ欠損および
成人の心臓疾患体質のスクリーニングに有用である。 ＬＣＡＴは、ＬＣＡＴ欠損を有する患者、たとえば先天
性欠損を有する患者、末期腎疾患または肝炎の患者に、
治療学的有効量で、生理学的に許容しうる担体とともに
投与される。 血漿のコレステロールレベルは、ＬＣＡＴが介する血漿
コレステロールの高密度リポタンパク質への代謝、およ
びこれの血流からの除去によって低下する。また、ＬＣ
ＡＴは、他の組織からコレステロールを移動（動員）さ
せるのに有用であると同様に、アテローム性動脈硬化症
の脂肪沈積からのコレステロールの移動を促進するのに
も有用であると考えられている。 図面の説明 第１図は、ヒト・レシチン−コレステロールアシルトラ
ンスフェラーゼ（ヒトＬＣＡＴ）のｍｌ員、ゲノム性お
よびｃＤＮＡ クローンの位置、および制限酵素部位を
示すものである。ｃＤＮＡクローンから推定されるヒト
ＬＣＡＴのｍＲＮＡは、ヌクレオチドの大きさを示す尺
度の下に示されている。転写の方向は左から右である。 このｍＲＮＡは、５′−非翻訳化領域（推定される大き
さ：破線で示されている）−リーダーペプチドのコード
化領域（斜線を引いた部分）、成熟コード化領域（空白
の部分〕、およびポリアデニル化部位で終わる３′−非
翻訳化領域（棒付きの実線〕からなっている。制限酵素
、５（ＳｓｔＩ）、Ｔ（工！ｉ Ｉ ）、Ｋ（馳旦Ｉ
）、５ｃ（Ｓｃａ Ｉ）およびＰ（Ｐｓｔ Ｉ）に対応
するすべての部位が示されている。この線の下方の５本
の横棒は、実施例においてさらに詳しく記載するｃＤＮ
Ａクローンの大きさを示している。クローンｐＬ２．１
０および１９の大きさはＣ反応にかけただけであるが、
クローンｐＬ４および１２の両鎖は完全に配列決定した
。最下方の斜線入りの棒は、遺伝子の末端領域を明らか
にするために配列決定したゲノム性クローンの領域を示
している。 第２ａ図は、天然のヒトＬＣＡＴのｃ ＤＮＡをコード
しているｃ ＤＮＡのヌクレオチド配列およびアミノ酸
配列を示す。各列の左端のヌクレオチドにハ、 ｃＤＮ
ＡクローンｐＬ１２の５′末端からの数を付している。 ＬＣＡＴの完全な予想アミノ酸配列はＤＮＡ配列の上に
示されている。上記のアミノ酸配列において負の数を付
したアミノ酸は推定のす−ダープレペブチドを示し、一
方正の数を付したアミノ酸は成熟タンパク質を示す。予
想される、Ｎ−結合されるグリコジル化部位４箇所につ
いては上線を引き、ブタすい臓リパーゼの界面結合部位
と同一である６残基部分（親水性領域に囲まれている月
ま箱で囲んだ。２重の下線部分は、保存されたポリアデ
ニル化シグナルである６ヌクレオチドを示している。長
さの異なるポリ八）尾部は、４種のｃＤＮＡクローンの
同一の位置にある。１重の下線部分は、トリプシン加水
分解で得られるペプチドの分析、ならびにＮ−末端配列
決定によって得られるアミノ酸配列を示している。 第２ｂ図は、それぞれｃ ＤＮＡの５′および３′末端
と重なり合うバクテリオファージ・ラムダクロ・−ンか
ら得られるゲノム性配列を示している。５′側ヌクレオ
チドについては、利用できる配列の５′末端から任意的
に数を付している。アミノ末端側ＬＣＡＴのタンパク質
配列については第２ａ図と同じように数を付している。 ３種のリーディングフレームすべてに含まれる停止コド
ンには下線を引いている。最初のフレーム内上流停止コ
ドンはヌクレオチド１２１〜１２４のＴＧＡである。３
′側フランキングヌクレオチドおよびカルボキシ末端ペ
プチドについては、第２ａ図と同様に数を付している。 ポリアデニル化シグナルである６ヌクレオチドには２重
下線を引き、ポＩＪ ＶＳ、１尾部付加部位には１重下
線を引いている。 第３図は、ＬＣＡＴの発現ベクター１）ＳＶＬＣＡＴ、
１を示すものである。ＥはＳＶ４０の初期プロモーター
を示す。転写の方向は矢印で示す。 詳細な説明 本発明に於いては、レシチン−コレステロールアシルト
ランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）を以下の様に定義する。 すなわち、第２ａ図に示したアミノ酸配列を有するタン
パク質およびそのアミノ酸配列変異体（天然に存在する
アシルおよび予め決めた削除、挿入あるいは置換が１ま
たはそれ以上の残基について為された変異体を含む〕で
あって、コレステロールのエステル化において酵素的に
活性であるか、または酵素的には不活性であるが、酵素
的に活性なＬＣＡＴと結合しうる抗体との免疫学的な交
叉反応性を残しているかのいずれかであるタンパク質お
よびその変異体と定義する。 免疫学的交叉反応性を有するＬＣＡＴ変異体は、酵素的
に活性なＬＣＡＴと、酵素的に活性なＬＣＡＴに対して
生成させたポリクローナル抗血清との結合を競争的に阻
害することができる。このような抗血清は、常法により
、ヤギ、トリ、ウサギあるいはその他の種に、完全フロ
インドアジュバント中のＬＣＡＴを皮下注射し１次いで
不完全フロイント中のそれを腹腔内あるいは皮下にブー
スター注射することによって調製される。 酵素的には活性ではないが、酵素的に活性なＬＣＡＴの
抗血清と交叉反応することができるＬＣＡＴの変異体は
、ｔａｌＬｃＡＴの抗体、またはＬＣＡＴのための診断
検定用試薬として、ｔｂ）既知の方法に従って不溶化さ
れたときには、血漿からの結合タンパク質または抗血清
からの抗−ＬＣＡＴ抗体を精製するための試薬として、
そして（ｃｌ酵素的に活性なＬＣＡＴの抗体を生成させ
るための免疫原として有用である。 第２ａ図で示されるアミノ酸配列は、プレ・ＬＣＡ、
Ｔのものである。プレＬＣＡＴは、たとえばプレＬＣＡ
ＴをコードしているＤＮＡで形質転換された原核生物中
で合成されるが（この生物は哺乳動物のプレタンパク質
由来の完全ｆｌ Ｌ ＣＡ Ｔを分泌および加工しない
〕、上記のようなプロセッシング（加工〕を行ないつる
宿主細胞を形質転換して、培養物培地あるいは宿主細胞
のペリプラズム（性質つにおいて完全なＬＣＡＴを得る
ようにするのが好ましい。代表的には、哺乳動物細胞の
ような高等真核生物宿主細胞が、プレＬＣＡＴをプロセ
ッシングすることができ、完全なＬＣＡＴを分泌するこ
とができる（プレＬＣＡＴをコードしているＤＮＡで形
質転換することによりハあるいは、完全な（成熟）ＬＣ
ＡＴをコードしているＤＮＡを、宿主にホモローガスな
シグナル配列をコードしているＤＮＡの３′末端に５′
ライゲートし、この構築物を用いて宿主細胞を形質転換
することによって、分ａ・された完全ｆｉ Ｌ ＣＡ
Ｔが得られる。′ホモローガス“なる語句は、問題にし
ている配列が、宿主細胞内に通常存在するタンパク質あ
るいはポリペプチドの配列であることを意味する。この
場合、宿主細胞は、シグナル配列とＬＣＡＴのＰｈｅｌ
の間のペプチド結合をタンパク質加水分解切断すること
によって、発現された融合体をプロセッシング（加工）
し、次いで当該宿主細胞が何であるかによって宿主細胞
外質あるいは培地中に成熟ＬＣＡＴを分泌する。たとえ
ば、原核生物性発現ベクターの構築においては、ヒト・
ＬＣＡＴ分泌リーダーは細菌性アルカリホスファターゼ
あるいは熱安定性エンテロトキシンＩＩ ＩＪ−グーで
置換し、酵母の場合は、Ｌ ＣＡ Ｔ ＩＪ−グーは酵
母インベルターゼ、α因子あるいは酸ホスファターゼリ
ーダーで置換する。しかし、ヒト・ＬＣＡＴ分泌リーダ
ーはヘテロローガスな高等真核生物細胞によって認識さ
れる。ホモローガスなシグナル−Ｌ ＣＡ、 Ｔ融合体
で形質転換されたダラム陰性生物は細胞外質に成熟ＬＣ
ＡＴを分泌するであろうし、一方、酵母あるいはバシル
ス種（ｂａｃ ｉ Ｉ Ｉｕｓ 並、 ）は培養物培地
に成熟ＬＣＡＴを分泌するであろう。 アミノ酸配列変異体とは、少なくとも１個のアミノ酸残
基が削除、挿入あるいは他の残基で置換されているＬＣ
ＡＴ種を指す。このような変異体は、ＬＣＡＴ酵素の性
質を変えてその治療効果を強めるため、あるいは組み換
え細胞培養物中での製造を容罵にするために調製されろ
う代表的な変異体は、たとえば、タンパク質加水分解を
受けやすい部位をもはやそうではないようにすることに
よって、ある種の組み換え細胞培養物中あるいはＬＣＡ
Ｔを投与する患者の血行中で起こりつるタンパク質加水
分解に抵抗するように調製される。 これは、アルギニンおよびリジン残基を他の残基で置換
するかあるいは削除することによって、またはアルギニ
ンあるいはりジン残基の後にプロリン残基を挿入するこ
とによって行なわれる。 他の変異体はグリコジル化耐性体（Ａｓｎ ＸＴｈｒグ
リコジル化部位のアスパラギン酸塩基の置換あるいは削
除による〕、または予め決定した部位の新規グリコジル
化体である（置換あるいは挿入を行なってＡｓｎＸＴｈ
ｒ 部位を創製することによる〕。 また、酵素の触媒活性を変えた変異体（たとえば、その
基質特異性を広くするか、あるいはその回転数を増加さ
せる変異体〕、酵素中の酸化されやすい残基の削除を伴
う変異体、およびＬＣＡＴが相互作用することもあるア
ポリポタンパク質りおよびその他のタンパク質（細胞表
面受容体を含む〕との結合能力を変えた変異体も製造さ
れる。 プレＬＣＡＴあるいは成熟しＣＡＴのアミノ酸配列変異
体はいくつかの種類、すなわち削除体、挿入体あるいは
置換体に分けられる。挿入体にはアミ／末端および／ま
たはカルボキシ末端融合体ならびに１個の残基あるいは
ポリペプチドの配列内挿入体が含まれる。融合体には、
成熟Ｌ ＣＡＴと、ＬＣＡＴにホモローガスなポリペプ
チドとの融合体、例えばヒトのＬＣＡＴの場合には、他
の分泌されるヒトタンパク質由来の分泌リーダーとの融
合体、宿主細胞とホモローガスなポリペプチド（たとえ
ば宿主細胞タンパク質の分泌リーダ→との融合体、およ
び宿主細胞ならびにＬＣＡＴが由来する種の両方にヘテ
ロローガスなポリペプチドとの融合体が含まれる。本発
明の範囲内に含まれる好ましい融合体は、原核生物、酵
母、ウィルスあるいは宿主細胞のシグナル配列のシグナ
ルペプチドあるいは原核生物ペプチドとのアミノ末端融
合体である。通常分泌されるタンパク質由来の完全な配
列の残部をこのシグナル配列が欠いていることは必須で
はないが、ＬＣＡＴ融合体の分泌を避けるためには好ま
しい。 その池の挿入体が、ＬＣＡＴの成熟コード化領域内に導
入される。しかし、これらは通常、１〜４残基程度であ
り、アミノ末端あるいはカルボキシ末端融合体と比べる
と比較的小さい挿入体である。一般的には、これらはＬ
ＣＡＴ分子が混乱するのを最小限にとどめるために対で
導入されるべきである。代表的な例は、ＣＡｒｇ３６゜
→Ａｒｇ３６２Ｐｒｏ Ｇ１ｎ３６３］Ｌ ＣＡ Ｔ、
すなわちＡｒｇ３６２残基におけるトリプシン加水分解
を耐性にするために選択した変異体である。別の挿入変
異体は、ＣＰ ｒ Ｏｆ７４Ｖａ１１７５ →Ｐｒｏ１
７４ ＶａｌＶａｌＶａｌ１７５ＴＩＬ ＣＡ Ｔであ
る。特に指摘しない限り、本明細書中に記載した特定の
ＬＣＡＴ変異体は成熟ＬＣＡＴ配列における変異体であ
り、プレＬＣＡＴ変異体ではない。 削除体は、ＬＣＡＴ配列からの１またはそれ以上のアミ
ノ酸残基の除去によって特徴づけられる。 削除は、挿入と同じ理由から対で為されるのが好ましい
。、たとえば、トリプシン加水分解部位を抹殺するため
にＧｌｙ１□２ＬＹＳ１□３を削除する。その他のＬＣ
ＡＴ削除変異体は、ＣＧｌｕ４１１ＰｒＯ４１２−Δ〕
ＬＣＡＴおよび［ＡＳｎ２７２Ｔｙｒ２７３ →ΔコＬ
ＣＡＴである。ｍｅｔ ＬＣＡＴ（すなわちｍｅｔ−
成熟ＬＣＡＴの細胞内直接発現に適した変異体）を得る
ためには、残基−２３〜−１（両端を含む〕の削除が行
なわれるが、通常は、約２〜６残基以上の残基がＬＣＡ
Ｔ分子内の１つの部位で削除されることはない。 置換変異体は、目標残基の除去およびそれを他のアミノ
酸で置換することによって特徴づけられる。削除あるい
は挿入変異体と比較して、より多数の置換体が可能であ
る（特に、同じような立体構造および電荷あるいは疎水
性を有する残基が目標残基と置換されるときにはり。一
般的には、置換によって、削除あるいは挿入によって通
常可能であるよりも、さらに細か＜ＬＣＡＴの活性およ
び性質を変えることが可能になる。代表的な置換体には
、ＣＰｈｅ１７６ →Ｔｙｒ１７６’：ｌ Ｌ ＣＡ
Ｔ 、 ［：Ｖａｌｒ７ｓ＝Ｔｈｒ１７５］Ｌ ＣＡ
Ｔ 、 ＣＬｙＳ１７３ →Ｇ１ｕ１７３：ＩＬＣＡＴ
、ＣＬｙｓ１７３ →Ｈｉ ｓ １７３ ：ｌＬ ＣＡ
Ｔ、 ＣＣｙｓ３５６４Ｓｅｒａ５６］ＬＣＡＴ、〔
ＬｙＳ１５→ＡＳｎ１５〕ＬＣＡＴ、〔Ａｒｇ０５８→
Ｔｒｐ１５−Ｂ］ Ｌ ＣＡ Ｔ、〔Ａｒｇ２５６→Ｔ
ｒｐ２５６〕ＬＣＡＴ、ｃＡｒｇ３２３４ ＨｉＳ３２
３］Ｌ ＣＡ Ｔ 、 ＣＡｒｇ２５６→Ｔｒｐ２５６
’） Ｌ ＣＡ Ｔ 、 ＣＡｒｇ１４７ →Ｔｒｌ）
１４７］ Ｌ ＣＡＴ、 〔Ａｒｇ１４ｏ −＋Ａｓｎ
１４ｏコＬ ＣＡ Ｔ 、 ＣＬｙ ５１０５−ａ
−Ｈｉｓ１０５Ｘ ＣＡ Ｔ、ＣＬｙＳ１１６ →Ｈｉ
Ｓ１１６］ Ｌ ＣＡＴ、〔ＬｙＳｌｏｌｌＧｌｎｌｏ
ｌ、ＬｙＳ１１６°ＡＳｎ１１６、Ａｒｇ１４０°Ａｓ
ｎ１４０ 、 Ａｒｇ１４７１Ｈｉ ５１４７ 、 Ａ
ｒｇ１５８→Ａｓｎ１５ＢＸ ＣＡ Ｔ 、 Ｃ５ｅｒ
ＩＢ１ →Ｔｈｒ１ｇ１） Ｌ ＣＡＴ、および〔Ｈ１
Ｓ１８ｏ−Ｉ−ＡＳｎ１８ｏ″ＩＬＣＡＴが含まれる。 アミノ酸残基の削除、挿入および／または置換の組み合
わせ体も本発明の範囲内に含まれる。たとえば、ＣＴｈ
ｒ２２−＋Δ、Ｐｂｅ６７ →”ｒｈｒ５７］ｔ、 Ｃ
Ａ Ｔあるいは〔Ｌｅｕ１８３°ＶａｌＩＢ３． Ｌｅ
ｕ１ｇ５ＨｉＳ’１ｇ６４Ｌｅｕ１８５ＶａｌＶａｌＨ
ｉｓ１ｇ６］ Ｌ ＣＡ Ｔである。 アミノ酸配列変異体は、目標部位を選び（好ましくは残
基約１１４〜２５６および／または３６２〜４１６（両
端を含む〕内で行なう〕、飽和突然変異誘発によってこ
の部位に変異を導入することによって最もうま（調製さ
れる。 変異部位は予め決定するが、変異それ自体は予め決定す
る必要がない。たとえば、所定の部位における変異を最
適に行なうためには、目標コドンあるいは領域において
ランダム突然変異誘発を行ない、発現されたＬＣＡＴ変
異体を、目的活性が最適に組み合わされたものについて
スクリーニングする。既知の配列を有するＤＮＡ中の予
め決定した部位に置換突然変異を生成させる方法はよく
知られている（たとえばＭ１３プライマー突然変異誘発
〕。 ＬＣＡＴをコードしているＤＮＡは、化学合成によって
、あるいは肝臓由来のｍＲＮＡの逆転写体のスクリーニ
ングによって、あるいはいずれかの細胞由来のゲノムラ
イブラリーをスクリーニングすることによって得られる
。ＬＣＡＴをコード−しているＤＮＡの長さを考慮する
と、ＤＮＡを合成するよりもｃ ＤＮＡライブラリーを
プローブする方がより効率的であろう。しかし、ＬＣＡ
Ｔ遺伝子の一部を合成することは、ＤＮＡの調製時に特
異な制限部位を導入し、これによって、天然配列中には
存在しない該制限部位を含有するベクター中にこの遺伝
子を用いることができる様にし、そして、突然変異誘発
等による場合のようにＬＣＡＴをコードしているＤＮＡ
をさらに修飾することを必要とすることなく、ステムお
よびループ構造を除去して翻訳効率を高めることができ
る。ＬＣＡＴをコードしているｃＤＮＡは、ＬＣＡＴの
ＤＮＡの供給源とホモローガスな他のタンパク質をコー
ドしているフランキング（隣接）ＤＮＡおよびイントロ
ンを含有していない。 ヒト肝＠ ＣＤＮＡライブラリーを、標識したオリゴヌ
クレオチド（その配列は、精製ヒトＬＣＡＴの分析によ
って決定した部分的アミノ酸配列に基づいている〕を用
いて、ヒトＬＣＡＴ配列をコードしているＤＮＡについ
てプローブした。次いで、プローブすることによって同
定したプレＬＣＡＴまたは完全な（成熟）Ｌ′ＣＡＴコ
ード化ＤＮＡ全ＤＮＡ異させ、上記ＬＣＡＴのアミノ酸
変異体をコードさせ−ることができる（第２ａ図つ。た
とえば、プレ配列を削除し、開始コドンを完全すＬＣＡ
ＴをコードしているＤＮＡの５′側に隣接させて挿入し
て、組み換え体培養物中に直接ＬＣＡＴ鎖を発現させる
。 − このＤＮＡの共有結合による標識化は、螢光性の基、放
射線活性な原子あるいは化学発光性の基などの検知しつ
る物質を用い、自体既知の方法によって行なわれる。次
いでこの標識化ＤＮＡを通常の雑種形成（ハイ゛ブリダ
イゼーション〕検定に用いる。このような検定は、後記
実施例に記載したようｆ、Ｌ Ｌ ＣＡ Ｔベクターお
よび形質転換体の同定、または組織中の異常なゲノムＤ
ＮＡあるいはＬＣＡＴのｍＲＮＡの検知等の試験管内診
断に用いられる。 ＬＣＡＴに関するＤＮＡの特に有用な使用法は、心臓疾
患に関与している制限酵素多形性の同定を容易にするこ
とである。 鎌状赤血球貧血のような遺伝的疾患に関与する制限酵素
多形性の検知のための一般的な方法は知られている（３
２．３３）。ＬＣＡＴに関係するＤＮＡはこのような方
法に、以下のようにして用いられる。群の一部が心臓疾
患あるいはアテローム性動脈硬化症の生理学的徴候を示
し、他がそれらの徴候を示さな０１対象群から、既知の
方法でゲノムＤＮＡあるいはｃＤＮＡを調製する。この
群は同一の家族内から選ばれるのが好ましい。次いでこ
のＤＮＡを選択した制限酵素で完全に消化し、フラグメ
ントを電気泳動で分離する。このＤＮＡをニトロセルロ
ースフィルターに移り、ＬＣＡＴに関するＤＮＡフラグ
メントと雑種化する。この方法は通常ノーザン・ハイブ
リダイゼーションとして知られている（後記参照〕。ア
テローム性動脈硬化症への遺伝的素質を有する対象群は
、ノーザン分析において異なったパターンのバンドを示
すであろう（すなわち、制限消化多形性を示すであろう
）。たとえば、ＬＣＡＴ欠損の原因である遺伝的異常を
削除することは、ＬＣＡＴおよびそのフランキングゲノ
ム領域の完全なコード化ｆｉｌｔが本発明によって明ら
かにされたので、制限酵素多形性の直接的な応用となろ
う。 アテローム性動脈硬化症の症状と最も確かな関係を持っ
ている制限酵素は、上記のような常法のスクリーニング
によって同定されるであろう。適切な候補は既知の制限
エンドヌクレアーゼの中から選ばれる（至）。 ｃ ＤＮＡ肝臓ライブラリーも有用であるが、好ましい
被験試料はリンパ細胞ゲノムＤＮＡのλフアージライブ
ラリーである。これらの分析に用いられるプローブには
、完全長さくフルレングス〕のＬＣＡＴのｃＤＮＡ、Ｌ
ＣＡＴのゲノムＤＮＡイントロン、約５０００ ｂｐ
までの非翻訳化５′および３′フランキング領域、およ
びそれらのフラグメントが含まれる。オリゴヌクレオチ
ドプローブの大きさはノーザンハイプリダイゼーション
の目的物（ターゲット月こ依存する３、このノーザンハ
イブリダイゼーションがＬＣＡＴ対立遺伝子（アレルノ
の存在を調べることを目的としているときには、このプ
ローブは、非常に厳しい雑種形成条件下（たとえば低温
〕で検知が可能であるように、十分に小さいものになる
。たとえば、唯一個のヌクレオチドの突然変異体を決定
するには、通常約１０−２０塩基の小さいプローブを使
用すること、および非常に厳しい条件が必要となるであ
ろう。一方、ＬＣＡＴ遺伝子に多数の欠失がある場合は
、その欠失に対応するプローブによって検知される。 即ち、雑種形成がないと、所望でない対立遺伝子が存在
していることになる。しかし一般的には、このプローブ
は、ＬＣＡＴのゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡあるいはフラン
キング領域の特定部分のいずれかに対応している必要は
ないが、約３０〜５０ ｂｐのＬＣＡＴコード化ＤＮＡ
であるか、またはこれと相補的なりＮＡであることが好
ましい。 ＬＣＡＴは、プレＬＣＡＴ、ｍｅｔ−成熟ＬＣＡＴある
いはＬＣＡＴ変異体をコードしているＤＮＡを含有する
ベクターで形質転換された宿主細胞中で合成される。さ
らに加工するための大量のＤＮＡを調製するため（クロ
ーニングベクター〕、あるいはＬＣＡＴを発現させるた
めに（発現ベクターツ１．ベクターを用いてＬＣＡＴを
コードしているＤＮＡを増幅する。発現ベクターとは複
製可能なりＮＡ構築物であって、適当な宿主においてＬ
ＣＡＴを発現させうる適当な制御配列に、ＬＣＡＴをコ
ードしているＤＮＡ配列を機能的に結合させた構築物で
ある。クローニングベクターは発現制御配列を含有して
いる必要はない。このような制御配列には、転写プロモ
ーター、転写を制御するためのオペレーター配列（無い
こともある〕、ｍＲＮＡの適当なリポソーム結合部位を
コードしている配列（原核生物性発現のための〕、およ
び転写および翻訳の終止を制御する配列が含まれる。 発現およびクローニングベクターは、ＬＣＡＴの安定な
発現を容易にするか、あるいは増幅するための、および
／または形質転換体を同定するための選別遺伝子を含有
しているべきである。しかし、ＬＣＡＴ発現を維持する
ためのこの選別遺伝子は、真核生物宿主細胞を用いる同
時形質転換系中の別のベクターによって供給させること
ができる。 ベクターには、プラスミド、ウィルス（ファージを含む
）、および組み込み可能なりＮＡフラグメント（すなわ
ち、組み換えによって宿主ゲノムに組み込まれうるフラ
グメント９が含まれる。ＬＣＡＴの真核生物細胞発現に
用いるための本明細書中に記載のベクターには、微生物
中でクローニングするためのプラスミド配列が含まれ、
この場合、プラスミドは宿主ゲノムから自律的に複製す
るが、ＤＮＡは形質転換により真核生物宿主細胞ゲノム
に組み込まれるものと考えられている。同様に、ホモロ
ーガスな組み換えによってゲノム的にバシルス（ｂａｃ
ｉｌ １ｕｓ）中に組み込まれるバシルスベクターも有
用である。しかし、同様の機能を果たし、そして当分野
で知られているか、または知られるようになるその他の
あらゆる形のベクターが、本発明への使用に適している
。 通常、適切なベクターは、予定している発現宿主に適合
しうる種由来の制御配列、およびレプリコン（非組み込
み性ベクターにおいて用いるための複製起源〕を含んで
いる。形質転換宿主細胞とは、ＬＣＡＴをコードしてい
るＤＮＡを含有するベクターで形質転換またはトランス
フェクションされた細胞である。形質転換宿主細胞はク
ローン化ＤＮＡを含有しており、そして発現ベクターで
形質転換されているときには、ＬＣＡＴまたはその誘導
体を発現する。この発現されたＬＣＡＴは、選択した宿
主細胞および発現されたタンパク質中の適当なプロセッ
シングシグナル（たとえば、ホモローガスあるいはヘテ
ロローガスなシグナル配列）の存在に依存して、細胞内
に蓄積されるか、または細胞周辺腔あるいは培養物上清
のいずれかに分泌される。 ＤＮＡの各領域は、それらが機能的に互いに関連してい
るときには、「機能的」に結合している。 たとえば、プレ配列あるいは分泌リーダー用のＤＮＡは
、もしそれがポリペプチドの分泌にあずかるプレタンパ
ク質として発現されるなら、ポリペプチド用のＤＮＡと
機能的に結合している。プロモーターは、もしそれが配
列の転写を制御するものであるのなら、コード化配列に
機能的に結合しており、リポソーム結合部位は、もしそ
れが翻訳を可能にするように配置されているなら、コー
ド化配列に機能的に結合している。通常、機能的に結合
されるとは、結合するＤＮＡ配列どうしが隣接している
こと、そして分泌リーダーの場合には、隣接しておりか
つリーディング相（解読相う内にあることを意味する。 適当な宿主細胞は、原核生物、酵母または高等真核生物
細胞である。原核生物には、ダラム陰性あるいはグラム
陽性微生物、たとえばＥ、コリ（Ｅ、 ｃｏｌｉ）ある
いはバシルス類（Ｂａｃ ｉ １１ ｉ ’ｊｒ＜含ま
れる。高等真核生物細胞には後記の哺乳動物由来の確立
細胞系（セルラインフが含まれる。Ｅ、コリＢ＝Ｅ、コ
リＸ１７７６（ＡＴＣＣ３１，５３７，１、Ｅ、コリＷ
３１１０（ＡＴＣＣ２７，３２５）、シュードモナス種
（ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ５ｐｅｃｉｅｓ）、または
セラチア”マルセサンス（社コａｔｉａＭａｒｃｅｓａ
ｎｓ ）などの原核生物が適しているが、好ましい宿主
細胞はＥ、コリ２９４（ＡＴＣＣ３１，４４６，１であ
る。 宿主細胞用の発現ベクターは、通常、複製起源（クロー
ニングにおける場合のように、染色体外増幅が望まれる
場合は、この起源は細菌性起源である〕、ＬＣＡＴのコ
ード化配列の上流に位置するプロモーター、ならびにリ
ポソーム結合部位〔このリポソーム結合配列、即ちシャ
インーダルガルノ（Ｓｈｉｎ−Ｄａ１ｇａｒｎｏＪ配列
は原核生物性発現用にのみ必要である〕、ポリアデニル
化部位、および転写終止配列を含有する。既述のように
、これらの配列のあるものは、ある種の宿主内での発現
にとって必要でないことは理解されるであろう。 微生物と共に用いるための発現ベクターは、目的宿主に
よって認識される複製起源、宿主中で機能するプロモー
ター、および表現型選択遺伝子（たとえば、栄養要求性
を付与するか、あるいは抗生物質耐性を付与するタンパ
ク質をコードしている遺伝子）を含有することだけを必
要としている。 通常、ＬＣＡＴのＤＮＡは、ｐＢＲ３２２、すなわちＥ
、コＩＪ ｆｆ（由来のプラスミド〔ポリバー等（Ｂｏ
１１ｖａｒ 。 ｅｔ ａＬ−）、ジーン（ＧｅｎｅＪ４：９５（１９７
７）’：］ を用いてＥ、コリ中でクローン化される
。ｐＢＲ３２２はアンピシリンおよびテトラサイクリン
耐性遺伝子を含有するので、形質転換細胞の容易な同定
手段を与える。 クローニングベクターとは異なり、発現ベクターは、宿
主微生物によって認識されるプロモーターまたはその他
の転写促進配列を含んでいなくてはならない。通常これ
は、目的宿主にホモローガスなプロモーターである。高
等真核生物用ベクターの場合には、促進配列はプロモー
ターからの転写を増加させることが多い。組み換えＤＮ
Ａの構築体に最も一般的に用いられるプロモーターには
、β−ラクタマーーゼ（ペニシリナーゼ〕およびラクト
ースプロモーター系〔チャン等（Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａ
ｌ。 〕、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、ｖｌ、６１５（１９
７８）；およびゲーデル等（Ｇｏｅｄｄｅｌ ｅｔ ａ
ｌ、）、ネイチャー、λ比と、５４４（１９７９）］、
トリプトファン（ｔｒｐ）プＣ１（−−ター系〔ゲーデ
ル等（Ｇｏｅｄｄｅｌ ｅｔ ａｌ−大ヌクレイツク・
アシッズ°リサーチ（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ、）、麩、４０５７（１９８０）およびＥＰＯ出願公
開Ｎｏ、３６，７７６］、およびｔａｃプロモーター〔
ボアー等（Ｈ，ｄｅ Ｂｏｅｒ ｅｔ ａｌＪ、プロシ
ーディンゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・
サイエンシーズ・米国（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ’１． Ａ
ｃａｄ、Ｓｃｉ。 ＵＳＡ）、各店、２１−２５（１９８３））が含まれる
。 これらのプロモーターが最も一般的に用いられるが、そ
の他の既知の微生物性プロモーターも適している。これ
らプロモーターのヌクレオチド配列は公表されているの
で、必要とされる制限部位を供給するりンカーあるいは
アダプターを用いて、プラスミドベクター中の、ＬＣＡ
ＴをコードしているＤＮＡにこれらを機能的にライゲー
トすることができる、〔シーベンリスト等（Ｓｉｅｂｅ
ｎｌ １ｓｔｅｔ ａｌ、）、セル（Ｃｅｌｌ）、２０
．２６９（１９８０）’）。 また、原核生物性発現用において用いるためのプロモー
ターは、ＬＣＡＴをコードしているＤＮＡに機能的に結
合させたシャイン−ダルガル／Ｃ５，Ｄ、）配列を含ん
でいる。すなわち翻訳を容易にするようにＳ、Ｄ、配列
が配置されている。通常これは、細菌の構造遺伝子の２
番目のコドンから上流に存在するプロモーターおよびＳ
、Ｄ、配列が、成熟ＬＣＡＴの５′側に位置するプレＬ
ＣＡＴの配列と置き換わることを意味する。開始コドン
は、挿入性突然変異誘発によって、または細菌の遺伝子
により付与することができる。 原核生物に加えて、酵母などの真核微生物培養物がＬＣ
ＡＴをコードしているベクターで形質転換される。低級
真核性宿主微生物の中で、サツカロマイセス・セレビシ
ェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍ ｃｅｓｃｅ ｒｅｖ ｉｓ
ｉａｅ ）または一般的なパン酵母が最も普通に用いら
れる。しかし、その他の多数の菌株が本発明に有用であ
り、一般的に用いることができる。通常、酵母ベクター
は、２ミクロン酵母プラスミドまたは自律的複製配列（
ＡＲ５，）由来の複製起源、プロモーター、ＬＣＡＴま
たはその誘導体をコードしているＤＮＡ、ポリアデニル
化および転写終結のための配列、および選択遺伝子を含
んでいる。酵母中においてＬＣＡＴを発現させるのに適
するプラスミドはＹＲｐ７である〔ステインチコンブ等
（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ ｅｔ ａｌ、）、ネイチャー
（Ｎａｔｕｒｅ）、２８２．３９（１９７９）： キ
ンゲスマン等（Ｋｉｎｇｓｍａｎ ｅｔ ａｌ、）、ジ
ーン（Ｇｅｎｅ）、η、１４１（１９７９）： チェ
ンバー等（Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒ ｅｔａｌ、）、 ジ
ーン、１止、１５７（１９８０）’）Ｏこのプラスミド
は、トリプトファン中で生育する能力を欠く酵母の突然
変異株に選択マーカーを付与する旦α遺伝子を既に含有
している〔たとえば、ＡＴＣＣＮｏ、４４０７６または
ＰＥＰ４−１；ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）、ゼネテイツ
ク゛ス（Ｇｅｎｅｔ ｉｃｓ ）、且、１２（１９７７
）ｌ。従って、酵母宿主細胞ゲノム中にｔｒｐｌ損傷が
存在することが、トリプトファンの非存在下で増殖させ
ることによって形質転換を検知するための効果的な環境
を与える。同様に、Ｌｅｕ ２を欠いた酵母株（ＡＴＣ
Ｃ２０，６２２あるいは３８．６２６）は、シ１２遺伝
子を有する既知のプラスミドで補なわれる。 酵母ベクター中の適切な促進配列には、メタロチオネイ
ン、３−ホスホグリセレートキナーゼ〔ヒッツエマン等
（Ｈｉｔｚｅｍａｎ ｅｔ ａｌ、）、ジャーナル・オ
ブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ。 １３ｉｏ１． Ｃｈｅｍ、）、２５５．２０７３（１９
８０）〕、またはその他の解糖酵素、たとえばエノラー
ゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ
、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホ
スホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸インメ
ラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸
キナーゼ、トリオースリン酸インメラーゼ、ホスホグル
コースイソメラーゼおよびグルコキナーゼなど〔ヘス等
（Ｈｅｓｓ ｅｔ ａｌ、）、工Ａｄｖ−Ｅｎｚｙｍｅ
Ｒｅｇ、、η、１４９（，１９６８）：およびホーラ
ンド等（Ｈｏｌｌａｎｄ ｅｔ ａｌ、）、バイオケミ
ストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、１７．４９０
０（１９７８）］のプロモーターが含まれる。酵母発現
に用いるのに適するベクターおよびプロモーターは、ヒ
ツツエマン等（Ｒ，Ｈｉｔｚｅｍａｎ −ｅｔ ａｔ、
、ＥＰ ７３，６５７ Ａ） がさらに詳しく開示
している。 増殖条件によって転写が制御されるという利゛点をさら
に有するその他の酵母プロモーターには、アルコールデ
ヒドロゲナーゼ２、インシトクロムＣ１酸ホスフアター
ゼ、窒素代謝に関係する分解酵素および上記のメタロチ
オネインとグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲ
ナーゼ、ならびにマルトースおよびガラクトース利用に
関与している酵素のためのプロモーター領域がある。適
切な発現プラスミドを構築する際に、これらの遺伝子と
結合する終止配列をも、発現ベクターのＬＣＡ、Ｔコー
ド化配列の３′側にライゲートして、ｍＲＮＡの終止お
よびポリアデニル化を付与する。 多細胞生物由来の細胞の培養物は、本発明において好ま
しい宿主細胞となる。哺乳を椎動物あるいは非を椎動物
培養物であってもなくても、原則として、すべての高等
真核生物細胞培養物を使用することができる。培養物中
でのを椎動物細胞の増殖自体は、近年においては常套法
となっている〔組織培養（Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕ１ｔｕｒ
ｅ）、アカデミツク・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒ
ｅｓｓ）、クルスおよびパターマン（Ｋｒｕｓｅ ａｎ
ｄ Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ）編（１９７３）〕。 有用な補乳動物宿主セルラインの例は、ベロ（ＶＥＲＯ
，ｌおよびヘラ（ＨｅＬａ）細胞、チャイニーズノ１ム
スター卵巣（、ＣＨＯ）セルライン、ならびにＷ１３８
、ＢＨＫ％ＣＯ５−７およびＭＤＣＫセルラインである
。 を椎動物細胞性発現ベクター中のＬＣＡＴの転写および
翻訳制御配列は、ウィルスの供給源から得るのが好まし
い。たとえば、通常用０られるプロモーターは、ポリオ
ーマ、アデノウィルス２、および最も好ましくはシミア
ンウィルス４０ （ＳＶ４０）から得られる。このＳＶ
４０の初期および後期プロモーターは、両者がＳＶ４０
のウィルス性複製起源をも含有するフラグメントとして
ウィルスから容易に得られるので特に有用である〔フイ
アーズ等（Ｆｉｅｒｓ ｅｔ ａｌ、）、ネイチャー（
ＪＪａ ｔｕｒｅ〕、２７影、１ｘ３（１９７８））。 ウィルス性複製起源内に位置し、Ｈｉｎｄ ｍ 部位
から］は１部位に向って延びている約２５０ｂｐの配列
が含まれて（するなら、より小さいかあるいはより大き
いＳＶ４０フラグメントを使用することもできる。さら
に。 通常はＬＣＡＴに関係している、ＬＣＡＴのゲノム性フ
ロモーター、制御および／またはシグナル配列を用いる
こともできる（このような制御配列が宿主細胞によって
認識され、かつ適合し得るものであることを条件として
）。 複製起源は、たとえばＳＶ４０あるいはその他のウィル
ス（たとえば、ポリオーマ、アデノウィルス、ＶＳＶあ
るいはＢＰＶ）供給源から得ることができるような外因
性の起源を含むようにベクターを構築することによって
、または宿主細胞染色体の複製機序によって得ることが
できる。ベクターが宿主細胞染色体に組み込まれるとき
には、後者で十分であることが多い。 ウィルス性複製起源を含有するベクターを用いるとき以
外は、選択しうるマーカーをコードしているＤＮＡおよ
びＬＣＡＴあるいはその誘導体をコードしているＤＮＡ
で哺乳動物細胞を同時形質転換する。適当な選択マーカ
ーの例は、ジヒドロ葉酸レダクタ−”（ＤＨＦＲ）ある
いはチミジンキナーゼである。このようなマーカーは、
形質転換細胞（すなわち、ＬＣＡＴのＤＮＡを取り込む
能力を有していた細胞〕の同定、およびＬ ＣＡ、 Ｔ
のＤＮＡの増幅を可能にするタンパク質、通常は酵素で
ある。通常、マーカータンパク質を取り込まなければ、
細胞が必須栄養素を得ることができγλい培養培地、ま
たは非形質転換細胞にとって毒性である培養培竪質転換
体が生き残ることによって同定を行なう。一連の絶えず
増加する選択圧（通常、毒性成分の濃度を増加させるつ
下で、同定した形質転換体を培養することによって増幅
を行なう。 ＬＣＡＴおよびＤＨＦＲの両者をコードしているＤＮＡ
配列を含有するベクターによって形質転換するのに好ま
しい宿主哺乳動物細胞を選択する際には、用いられるＤ
ＨＦＲタンパク質の種類に応じて宿主を選択するのがよ
い。もし野生型ＤＨＦＲタンパク質を用いるときには、
Ｄ ＨＦ Ｒを欠く宿主細胞を選ぶのが好ましく、これ
によって、ヒポキサンチン、グリシンおよびチミジンを
欠く選択培地においてトランスフェクションをうまく行
なわせるためのマーカーとして、ＤＨＦＲコード化配列
全配列することが可能になる。この場合の適当な宿主細
胞は、ウルラウブおよびチャーシン［Ｕｒｌａｕｂ ａ
ｎｄ Ｃｈａｓｉｎ 、 Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ’１．
Ａｃａｄ。 Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７７．４２１６（１９８０Ｊ］ が
開示したようにして調製され、増殖させられる、ＤＨＦ
Ｒ活性を欠いたチャイニーズハムスター （ｃＨｏ）
セルラインである。 一方、メトトレキセート（ＭＴＸ）に対する結合アフィ
ニティーが低いＤＨＦＲタンパク質をコードしているＤ
ＮＡを制御配列として用いるときには、ＤＨＦＲ耐性細
胞を用いる必要はない。突然変異体ＤＨＦＲはＭＴＸに
対して耐性であるので、宿主細胞それ自身がＭＴＸ感受
性であるときには、ＭＴＸ含有培地を選択手段として用
いることができる。ＭＴＸを吸収しうる真核生物細胞の
ほとんどはメトトレキセート感受性であるようである。 このような有用なセルラインの１つは、ＣＨＯライン、
すなわちＣＨＯ−に、１ （ＡＴＣＣＮｏ、ＣＣＬ６１
）である。 組み換えを椎動物細胞培養物中でＬＣＡＴを合成するの
に適用するのに適したその他の方法、ベクターおよび宿
主細胞は、ゲシング等ＣＭ−Ｊ。 Ｇｅｔｈｉｎｇ ｅｔ ａｌ。、Ｎａｔｕｒｅ、 ２９
３．６２０−６２５（−’１９８１ ） 〕、マンティ
等ＣＮ、 Ｍａｎｔｅｉ ｅｔ ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ
、 ２８１．４０−４６ ］およびレビンソン等（Ａ、
Ｌｅｖｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ、、ＥＰ １１７，０
６ＯＡおよび１１７．０５８Ａ）が開示している。 非ヒト組み換え宿主あるいは真核微生物中においてヒ１
−ＬＣＡＴを発現させると、組換え細胞培養物の加工に
より、天然のグリコジル化を伴なっていないヒトＬＣＡ
Ｔが生産物として得られる。 原核生物性ＬＣＡＴは完全に非グリコジル化産物である
。 上記のベクターで形質転換された宿主細胞は、ＬＣＡＴ
が培養物中に蓄積されるまで栄養培地中で培養される。 コレステロールあるいはその池の脂質を含有する培地中
で宿主細胞を培養するのが好都合であろう。ＬＣＡＴは
、脂質と相互作用する他の触媒性因子と同様（２３−２
７）、′界面の″脂質結合部位、および伸長した直線状
の疎水性アミノ酸配列を含むその他の領域を数個呑含有
する。コレステロールおよび／または脂質の代謝に順応
あるいは適合しつる宿主細胞（たとえばコレステロール
あるいは脂質の存在下で増殖しうる原核あるいは真核微
生物を、ＬＣＡＴ等の親油性酵素の発現および／または
分泌がよりうまく行なわれるように適応させてもよい。 ＬＣＡＴは、それが直接発現されるとき、すｉわち分泌
リーダーがないときには細胞内に存在し、従って屈折体
生成物あるいは溶菌した細胞の可溶性抽出物をＬＣＡＴ
活性について検定することができる。ＬＣＡＴが分泌さ
れているときには、既知の方法によって培養物培地ある
いはべりプラスミック液を回収する。ＬＣＡＴ検定はよ
く知られている（後記実施例５を参照〕。血清あるいは
血漿からＬＣＡＴを精製するための自体既知の方法によ
って、回収抽出物あるいは培地からＬＣＡＴを精製する
（後記実施例１を参照〕。 ＬＣＡＴは薬学的に許容しうる非毒性塩、たとえば酸付
加塩または金属錯体（たとえば亜鉛、鉄などとの錯体で
あり、これらは本発明の目的にとっては塩とみなされる
）の形で投与される。このような酸付加塩の例は、塩酸
塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩、マレイン酸塩、
酢酸塩、クエン酸塩、安息香酸塩、フハク酸塩、リンゴ
酸塩、アスコルビン酸塩、酒石酸塩などである。等張食
塩水、リン酸緩衝液などに加えて静脈内投与するのが適
当である。 Ｌ ＣＡ、 Ｔは医師の指示に従って投与されるべきで
あり、その医薬組成物は通常、常用の薬学的に許容しう
る担体と有効量の酵素を含有する。その投与量は、ＬＣ
ＡＴを投与する目的（こよって異なるが、通常は、患者
の血漿ＬＣＡＴを、正常な採取血漿中のＬＣＡＴ活性の
少なくとも約２５優にするのに十分な投与レベルである
。ＬＣＡＴを、アポリポタンパク質Ａ−ＩあるいはＤな
どのアポタンパク質と同時に投与してもよい。 ＬＣＡＴは、移動可能であるか、または皮膚接着性であ
る持続放出物質から投与されるのが望ましい。ＬＣＡＴ
用に適する系の例には、Ｌ−グルタミン酸とガンマし一
グルタミン酸エチルのコポリマー〔シトマン等（Ｕ、
Ｓｉｄｍａｎ ｅｔ ａｌ−）、パイオポリマーズ（Ｂ
ｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ） 、 ２２（１）、５４７〜５
５６（１９８３）：］、ポリ（２−ヒドロキシエチル−
メタクリル酸）〔ランガー等（Ｒ，Ｌａｎｇｅｒ ｅｔ
ａｌ。 〕、ジャーナル・オブ・バイオメディカル・マテリアル
・リサーチ（Ｊ、 Ｂｉｏｍｅｄ、 Ｍａｔｅｒ、 Ｒ
ｅ５−）、とも、１６７〜２７７ （１９８１）および
ランガー、ケミッシエΦテクニーク（Ｃｈｅｍ、 Ｔｅ
ｃｈ、、 ）、旦、９８−１−５ （１９８２） ］、
］エチレンー酢酸ビニルランが−等、同上〕、またはポ
リ−Ｄ−１−）−３−ヒドロキシ酪酸（Ｅ Ｐ １３３
，９８８Ａ）が含まれる。この物質は皮下に移動される
か、または皮膚あるいは粘膜と接触させて用いられる。 λフアージクローンであるであるという事実ニもかかわ
らず１ｐ″と称される後記のｃ ＤＮＡクローンを除い
て、プラスミドは、小文字ｐを最初に、そして／または
大文字、そして／または数字を次に並べることによって
表わされる。本発明における出発プラスミドは、市販品
を利用するか、非制限的な供給源から一般的に入手する
か、あるいは入手可能なプラスミドから公知の方法に従
って構築することができる。さらに、その他の等価なプ
ラスミドが当分野で知られており、これらは当業者によ
（知られている。 ＤＮＡの１消化′とは、ＤＮＡ中のある場所だけに作用
する酵素でＤＮＡを触媒的に切断することを指す。この
ような酵素を制限酵素と呼び、それぞれの酵素が特異性
を示す部位を制限部位と称する。本発明に用いる種々の
制限酵素類は市販品を利用することができ、その反応条
件、補因子およびその他の必要条件は、酵素供給元が確
立したものを用いた。通常、制限酵素は、それぞれの制
限酵素を最初に得た微生物を表わす大文字とこれに続く
文字、およびこれに続く特定の酵素を表わす数字からな
る略語で表わされる。一般的には、緩衝液約２０μｅ中
、プラスミドまたはＤＮＡフラグメント約１μｇに対し
て、酵素約２単位を用いる。特定のＩＬ限酵素のための
適当な緩衝液および基質量は製造元が指定している。イ
ンキュベーション時間は通常３７℃で約１時間であるが
、供給元の指示に従って変えてもよい。インキュベーシ
ョンの後、タンパク質をフェノールおよびクロロホルム
で抽出して除去し、消化した核酸をエタノールで沈殿さ
せて水性画分から回収する。制限酵素による消化に次い
で、まれに、末端５′リン酸エステルの細菌性アルカリ
ホスファターゼ加水分解ヲ行なって、ＤＮＡフラグメン
トの制限切断末端２つが、閉じたループを形成し、ある
いは１環化“することにより制限部位への他のＤＮＡフ
ラグメントの挿入か妨げられることを防止する。特に記
載がなければ、プラスミドの消化に次いで５′末端脱リ
ン酸化は行なわない。脱リン酸化のための試薬および方
法は常用のものである〔マニアテイス等（Ｔ、 Ｍａｎ
ｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ、）、モレキュラー・クローニ
ング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｒｎｉｎｇ）、１３
３〜１３４（１９８２）〕。 制限消化物からの特定のＤＮＡフラグメントの１回収“
または１単離′七は、電気泳動によってポリアクリルア
ミドまたはアガロースゲル上で消化物を分離し、既知の
分子量のマーカーＤＮＡフラグメントの移動度と比較し
て所望のフラグメントを同定し、所望のフラグメントを
含有スるゲル部分を取り出し、次いで、このゲルからＤ
ＮＡを分離するこきを意味する。この方法は一般的に知
られている。たとえば、ロラン等（Ｒ，Ｌａｗｎ ｅｔ
ａｌ、、ヌクレイツク−アシツズ・リサーチ（ＮＬＩＣ
１−ｅｉｃ Ａｃ ｉｄｓ Ｒｅｓ、 ）、Ｖ、６１０
３〜６１１４（１９８１）〕およびゲーデル等ＣＤ、Ｇ
ｏｅｄｄｅｌ ｅｔ ａＬ、、ヌクレイツク・アシツズ
・リサーチ、８．４０５１（１９８０）コを参照。 １サザ一ン分析′とは、既知の標識化オリゴヌクレオチ
ドまたはＤＮＡフラグメントと雑種形成（ハイブリダイ
ゼーションクさせることによって、消化物またはＤＮＡ
を含有する組成物中のＤＮＡ配列の存在を確稈する方法
である。本明細書中においては特に記載がなければ、サ
ザーン分析とは、サザーンの方法ＣＥ、 ５ｏｕｔｈｅ
ｒｎ、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー
（Ｊ、Ｍｏ １．Ｂ ｉ ｏ ｌ−人並、５０３〜５１
７（１９７５）］によって１１％アガロースで消化物を
分離し、変性し、ニトロセルロースに移し、そしてマニ
アティス等ＣＴ、Ｍａｎｉａｔ １ｓｅｔ ａｌ、、セ
ル（Ｃａｌｌ）、−匹、６８７−７０１（１９７８）〕
の開示のようにして雑種形成させることを意味する。１
ノ一ザン′分析とは、変性剤（たとえば６％ホルムアル
デヒド〕を含有するアガロースゲルでＲＮＡを電気泳動
し、次いでニトロセルロースに移シ、そして同じくマニ
アテイス等の開示のようにして雑種形成させることによ
って行なわれるｍＲＮＡのための雑種形成法である。 ゛形質転換″とは、ＤＮＡが染色体外要素または染色体
への組み込み体゛として複製しうるように、ＤＮＡを生
物中番こ導入することを意味する。Ｅ。 コリを形質転換するための適当な方法はマンデル等ＣＭ
ａｎｄｅｌ ｅｔ ａｌ、、ジャーナル・オプ・モレキ
ュラー・バイオロジー、５３，１５４（１９７０））の
Ｃａ ＣＣ２法である。 １ライゲーシヨン１とは、２つの２本鎖核酸フラグメン
ト間にホスホジエステル結合を形成させる過程を意味す
る（マニアテイス等、同上、１４６頁〕。特に記載がな
ければ、はぼ等モル量のライゲートしようとするＤＮＡ
フラグメント０．５μｆあたり’ｌ’４ＤＮＡリガーゼ
（″リガーゼ′）１０単位を用い、既知の緩衝液および
条件を用いてライゲーションを行なうことができる。 形質転換体からのＤＮＡの１調製“とは、微生物培養物
からプラスミドＤＮＡを単離することを意味する。特に
記載がなければ、マニアテイス等（同上、９０頁〕のア
ルカＩＪ／ＳＤＳ法を用いることができる。 １オリゴヌクレオチド′とは、既知の方法によって化学
的に合成され、次いでポリアクリルアミドゲルで精製さ
れた短い１本鎖あるいは２本鎖ポリデオキシヌクレオチ
ドである。 引用した文献のすべてを、後記の参照文献の項に挙げる
。 以下に実施例を挙げ、本発明をさらに詳しく説明する。 実施例１ ヒ１−ＬＣＡＴの精製および配列決定レシチ
ン−コレステロールアシルトランスフェラーゼ（Ｊ、Ｃ
ＡＴ）を、既知の方法（１０）の改良法により、正常な
ヒト血漿Ｃ５００ｒｒｔｌ）から精製した。 ＮａＢｒ溶液（１，２４ダ／ｍｌ）中で血漿をプレパラ
ティブ遠心することにより、ｄｌ、２１〜１．２５９／
ｒｎｅのフラクションを単離した。これを、３ＭのＮａ
Ｃ１，１ｍＭのＥＤＴＡ （ｐ Ｈ７，４）で平衡化し
たフェニルアガロース〔ファーマシア（ＰＡｒｍａｃｉ
ａバＵｐｐｓａｌａ。 スウェーデン〕のカラム（２，５Ｘ２０ｃｍ）にかけた
。３ＭＮａＣ１！−１０ｍＭトリス−ＨＣｌ！（ｐＨ７
，４）溶液５００ｍ１で洗浄した後、溶出液の０Ｄ２８
ｏ が０．０５以下になるまで、このフェニルアガロ
ース支持体をざらにＯ，１５ＭのＮａＣ１−’ｒ’Ｊス
緩衝液で洗浄した。残存する吸着タンパク質を蒸留水で
溶離し、１０ｍＭのトリス−ＨＣｆｆ（ｐＨ７，４）で
平衡化したＤ Ｅ Ａ、 Ｅ−セルロース（ＤＥ−５２
、ワットマン（Ｗｈａ ｔｍａｎ） ］ のカラムに
かけた。このカラムをＮａＣ１！の勾配溶液Ｃｌ０ｍＭ
トリス−ＨＣＪ（ｐＨ７，４）中０−０．３ＭのＮａＣ
Ｊ溶液〕溶液能した。 Ｌ ＣＡ Ｔを含有するフラクションを、蒸留水で平衡
化シタヒドロキシルアパタイト〔バイオラッド（Ｂｉｏ
ｒａｄ）、ヒドロキシルアパタイトＨＴ）のカラム（１
，５Ｘ４ｃｍ）に入れ、０．１５ Ｍ ＮａＣｌ中に０
〜５ｍＭリーンへ酸ナトリウム（ｐＨ６，８）を加えた
勾配溶液で溶離した。ＬＣＡＴを含有するフラクション
を集めた。これらのカラムフラクションを免疫親和カラ
ムＣＣＮＢｒ法によってアガロースに共有結合させたア
ポリポタンパク質Ｄ（アポＤ）に特異的なポリクローナ
ル抗体を含有する〕にかけることによって、必要ならす
べての残存アポＤを除去した。銀染色によって測定され
うる勾配ゲル電気泳動によって、この最終生成物が純粋
であると判断した。 アミノ酸分析は、ニンヒドリン検出法を用いるベックマ
ン（Ｂｅｃ）ｃｍａｎ） −６３００アミノ酸分析機で
行なった。１１０℃ の共沸ＨＣＩ！中で２４時間ペプ
チドを加水分解した。ＮＦ２−末端配列決定は天然のＬ
ＣＡＴについて、試薬としてトリメチルアミン、フェニ
ルインチオシアネートおよびトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ
）を用い、標準的な気／液相配列決定機で行なった。抽
出されたアニリノチアゾリノンアミノ酸誘導体は、２５
％ＴＦＡ水溶液で自動的にフェニルチオヒダントインア
ミノ酸に変換すれ、ベック、マン・ウルトラスフイア−
・オクチル・カラム（Ｂｅｃｋｍａｎ ｕｌｔｒａｓｐ
ｈｅｒｅ ｏｃｔｙｌｃｏｌｕｍｎ）で分離された。気
／液相配列決定機または改良型ベックマン・モデル８９
０Ｂ配列決定機でトリプシンペプチドを配列決定した。 ＬＣＡＴのトリプシン消化は、０．１Ｍ）リス（ｐＨ８
，０）中０．０１％ツイーン２０を用い、３７℃で１８
時間、酵素二基質比を１：２０にして行なった。この消
化物を、ジンクローム（Ｓｙｎｃｈｒｏｍ） ＲＰ −
４カラム（４，６＋ｕ＋Ｘ １０ Ｃ１１月とかけた。 溶離溶媒は、０．１％ＴＦＡ水溶液（溶媒１）および０
．０７％ＴＦＡの１−プロパツール溶液（溶媒２）であ
る。１％の溶媒１から５０％の溶媒２までの直線勾配を
用い、スペクトラ・フィジックス（Ｓｐｅｃｔｒａ Ｐ
ｈｙｓｉｃｓ）ＳＰ８０００ＨＰＬＣを用い、流速を１
．０ａｅ／分にし、２５℃でペプチドを溶離した。この
溶離液を、ウォーターズ・アソシエーテス（Ｗａｔｅｒ
ｓＡｓｓｏｃ １ａｔｅｓＪモデル４４０吸収検知機に
よって、２１４および２８０ ｎｍにおける吸収につい
てモニターした。 実施例２ ｃＤＮＡクローニング 完全長さの１．ＣＡＴのｃＤＮＡを単離するための一般
的な方法を、実施例１で行なったヒトＬｃＡＴの制限ア
ミノ酸配列の決定から始めた（第２ａ図参照〕。本発明
者等は特に、無傷のタンパク質（ヒト血漿から単離され
るような〕のアミノ末端、およびＬＣＡＴのトリプシン
消化由来の３種の内部ペプチドフラグメントから４種類
の伸長した、有用なペプチド配列を得た。これらのペプ
チド配列のい（つかを用いて、適当な配列のための１つ
の可能なコドン選択を示す１本のオリゴヌクレオチドプ
ローブを設計し、合成した。これらのＤＮＡプローブを
用いて、我々は、ヒト成人肝臓ｆｆｌライブラリーから
外見上完全な長さのＬＣＡＴのｃＤＮＡクローンを得た
（完全な長さとは、完全なタンパク質をコードしている
、ＬＣＡＴのｍＲＮＡ部分であると本明細書中では定義
する〕。ｃＤＮＡクローンか完全ｒｊｍＲＮＡの５′お
よび３′末端を含有していないこともあるので、我々は
ｃＤＮＡクローニングに次いで、Ｌ、 ＣＡ ＴのｃＤ
ＮＡクローンの末端と重なり合うゲノム性クローンの単
離およびＤＮＡ配列決定を行なった。これにより、ＬＣ
ＡＴのｍＲＮＡの大きさおよび配列についての本発明者
等の解釈を立証することができた。 逆転写酵素を用い、既知の方法により、ヒト成人肝臓Ｒ
ＮＡから２重鎖ｃＤＮＡを調製し、Ｓ１処理した後、既
に開示されているようにして（１１）、≦ａｌＩ、Ｓｓ
ｔ ｒ 、 、Ｘｈｏ ｒおよび印改ＲＩ突出末端の制
限部位を含有する合成オリゴヌクレオチドにライゲート
した。このＤＮＡをλｇｔ １０ （Ｄ ＥｃｏＲＩ
部位に挿入した（１１．１２）。実施例１で決定したア
ミノ酸配列数個に基づいてヌクレオチドプローブを調製
し、放射性リンを用いて末端標識化した。 この操作を以下に挙げる第１表にまとめる。 ペプチド配列決定（第１列〕により、表中の唯一の１長
い′オリゴヌクレオチドプローブを合成した。実際のプ
ローブはこれらの配列の逆相補体であり、これらをＲＮ
ＡならびにＤＮＡとの雑種形成に用いることができる。 対応するＬＣＡＴのｃＤＮＡ配列をそれぞれの下段に示
した。ｃＤＮＡによってコードされているアミノ酸は、
２つの例において、ペプチドの配列決定から予想される
ものとは異なっていた〔（）で示す〕。 ｃＤＮＡ（＞５００ｂｐ）を含むλフアージライブラリ
ー（〜１．５Ｘ１０６ｐ ｆ ｕ ）を、報告（１２，
２９）のようにしてλｇｔｌＯにおいて調製した。 λｇｔｌｏにおける、オリゴＣ−ｄＴ）プライマー処理
したヒト成人肝臓ｃＤＮＡライブラリーからのファージ
約２００万を、４０個の１５ＣＩｌベトリブレートで増
殖させ、これらから３重に複製したニトロセルロースフ
ィルターを調製シた。コノフィルターを、０．７５Ｍの
ＮａＣ１，７５ｍＭクエン酸三ナトリウム、５０ｍＭリ
ン酸ナトリウム（ｐＨ６，８）５×デンハルト（Ｄｅｎ
ｈａｒｄｔ ）溶液、２０％ホルムアミド、１０％硫酸
デキストランおよび２０μｇ／Ｌｌの煮沸して超音波処
理した鮭精子ＤＮＡ中、４２℃で一晩、別々の３２ｐ−
末端標識化オリゴヌクレオチドプローブと雑種形成させ
、０．１５ＭのＮａ（Ｊ、１５ ｍ Ｍクエン酸三ナト
リウム、０．１％ＮａＤｏｄＳＯ４中、４３℃で２時間
洗浄した。極めて強く雑種形成する複製ポジ（陽性）体
１９個が、ＬＣＡＴ、４プローブと雑種形成させたフィ
ルター、ならびにＬ ＣＡ Ｔ、３プローブおよびＬＣ
ＡＴ、５プローブの両者と雑種形成させたフィルターで
観察された。 これらの同一雑種形成溶液におけるサザーンプロットは
、〜１０の独立したバンドを現わし、ノーザンプロット
は、１８Ｓより小さい雑種形５１１２ＲＮＡを現わした
。分離したプローブによる再スクリーニングに際し、取
り出したプラーク領域１９個の内、１５個はＬＣＡＴ、
４と、１２個はＬＣＡＴ、３と、そして４個はＬＣＡＴ
、１（アミノ末端タンパク質配列に基づくプローブ）と
再雑種形成した。 アミノ末端プローブと雑種形成したこの４個のファージ
は完全長さのｃＤＮＡクローンのための最良の候補であ
り、次いでプラーク精製し、ＤＮＡ配列決定により分析
した（元のクローンからのＤＮＡフラグメントでライブ
ラリーを再プローブすることによって後に回収された第
５番目のｃＤＮＡクローンと共に〕。ジデオキシ鎖成長
停止によってＤＮＡ配列決定するためＭ１３ファージベ
クターにフラグメントをサブクローンした（１３）。本
明細書の配列のすべては、両ＤＮＡ鎖の独立した分析か
ら得た。λカロン３０におけるヒトゲノム性ライブラリ
ー（１４）を、常法によってｃＤＮＡクローンの制限フ
ラグメントでスクリーニングした。 実Ｊ
ェラーゼ（ＬＣＡＴ）の製造、特に組み換え宿主細胞培
養物におけるＬＣＡＴの発現に関する。 末梢由来のコレステロールは異化のため血漿（プラズマ
月こより肝に移送される。この経路（逆コレステロール
移送）における一連の反応は、末梢コレステロールの恒
常性に重要であると考えられている（１）。血漿中のコ
レステロールの代謝およ゛ヒ移送ノ過程において鍵とな
る要素は、レシチンーコレステロールアシルトランスフ
ェラーセ（ＬＣＡＴ月こよるそのエステル化である。見
かけ分子量〜６３，０００の糖タンパク質であるこの酵
素（２、３）は、肝から血漿中に分泌される（４，５）
。 生理学的な条件下で、ＬＣＡＴは、レシチンのｓｎ２位
から遊離コレステロールの３−ＯＨ位へのアシル基の転
移を触媒する。アポリポタンパク質Ａ−Ｉ（アポＡ−Ｉ
）、すなわち血漿高密度リポタンパク質（ＨＤＬ，ｌの
主要なタンパク質は、Ｌ，ＣＡＴ活性の強力な活性化因
子である（６）。血漿中における拡散性コレステロ−ノ
ーの不溶性エステル形への変換は、細胞膜と血漿の間の
濃度勾配の維持において重要である。ＬＣＡＴ活性が試
験管内あるいは生体内で抑制されているか、または遺伝
的に欠損している場合には、コレステロールはもはや血
漿に移送されず、組織中に蓄積される（７〜９）。ＬＣ
ＡＴタンパク質はいくつかの研究室で均質性になるまで
精製されているが、その作用機序はほとんど知られてい
ない。さらに、天然原料からの精製が高価であるのに加
えて、他のウィルス等によって最終生成物が汚染される
危険性がある。それに加え、天然のＬＣＡＴの活性、す
なわちある動物種に存在するＬＣＡＴのアミノ酸配列と
同じアミノ酸配列を有するＬＣＡＴ（またはその天然の
アレル体〕の活性は容易に改良することができない。従
って、本発明の目的の１つは、感染性汚染がなく、かつ
天然のＬＣＡＴの性質とは異なる性質を有するＬＣＡＴ
のアミノ酸変異体の製造を可能にするに十分な順応性を
有するＬＣＡＴの経済的な製造方法を提供することであ
る。 発明の要約 上記の目的は、ｔａｌレシチン−コレステロールアシル
トランスフェラーゼ（、ＬＣＡＴ）をコードしている核
酸を含有するベクターを組み立て、ｔｂ）該ベクターで
宿主細胞培養物を形質転換し、ｔｃ＋該形質転換体を培
養して培養物中にＬＣＡＴを放出させ、そしてｔｄ）Ｌ
ＣＡＴを培養物から回収することからなる方法によって
達成される。 本発明者らは、完全な長さのＬＣＡＴのｃＤＮＡクロー
ゾを作成し、配列決定し、翻訳されたＬＣＡＴタンパク
質およびそのリーダープレペプチドの完全なアミノ酸配
列を提供し、そして組み換え体細胞培養物における発現
方法を提供することに成功した。驚くべきことに、コレ
ステロールおよびその他の脂質が細胞膜をもとのまま維
持する上で必須の役割を果すものであるにもかかわらず
、この酵素は、明らかな宿主細胞毒性を示すことな（、
酵素的に活性な形で組み換え体細胞培養物中に発現され
た。 本発明は、改良された性質（たとえば酸化安定性の増強
、細胞培養物あるいは生体内治療におけるタンパク質加
水分解に対する感受性の減少等〕およびＬＣＡＴのアポ
リポタンパク質および補因子結合性の変化を示す、ＬＣ
ＡＴのアミノ酸配列変異体の製造方法を提供するもので
ある。 本明細書で定義する、ＬＣＡＴに関与するＤＮＡは、心
臓疾患に関係している制限酵素の多環性（ポリモルフイ
ズム〕を調べるための雑種形成（ハイブリダイゼーショ
ン〕検定に用いられる。 このような検定は、出生前の先天性ＬＣＡＴ欠損および
成人の心臓疾患体質のスクリーニングに有用である。 ＬＣＡＴは、ＬＣＡＴ欠損を有する患者、たとえば先天
性欠損を有する患者、末期腎疾患または肝炎の患者に、
治療学的有効量で、生理学的に許容しうる担体とともに
投与される。 血漿のコレステロールレベルは、ＬＣＡＴが介する血漿
コレステロールの高密度リポタンパク質への代謝、およ
びこれの血流からの除去によって低下する。また、ＬＣ
ＡＴは、他の組織からコレステロールを移動（動員）さ
せるのに有用であると同様に、アテローム性動脈硬化症
の脂肪沈積からのコレステロールの移動を促進するのに
も有用であると考えられている。 図面の説明 第１図は、ヒト・レシチン−コレステロールアシルトラ
ンスフェラーゼ（ヒトＬＣＡＴ）のｍｌ員、ゲノム性お
よびｃＤＮＡ クローンの位置、および制限酵素部位を
示すものである。ｃＤＮＡクローンから推定されるヒト
ＬＣＡＴのｍＲＮＡは、ヌクレオチドの大きさを示す尺
度の下に示されている。転写の方向は左から右である。 このｍＲＮＡは、５′−非翻訳化領域（推定される大き
さ：破線で示されている）−リーダーペプチドのコード
化領域（斜線を引いた部分）、成熟コード化領域（空白
の部分〕、およびポリアデニル化部位で終わる３′−非
翻訳化領域（棒付きの実線〕からなっている。制限酵素
、５（ＳｓｔＩ）、Ｔ（工！ｉ Ｉ ）、Ｋ（馳旦Ｉ
）、５ｃ（Ｓｃａ Ｉ）およびＰ（Ｐｓｔ Ｉ）に対応
するすべての部位が示されている。この線の下方の５本
の横棒は、実施例においてさらに詳しく記載するｃＤＮ
Ａクローンの大きさを示している。クローンｐＬ２．１
０および１９の大きさはＣ反応にかけただけであるが、
クローンｐＬ４および１２の両鎖は完全に配列決定した
。最下方の斜線入りの棒は、遺伝子の末端領域を明らか
にするために配列決定したゲノム性クローンの領域を示
している。 第２ａ図は、天然のヒトＬＣＡＴのｃ ＤＮＡをコード
しているｃ ＤＮＡのヌクレオチド配列およびアミノ酸
配列を示す。各列の左端のヌクレオチドにハ、 ｃＤＮ
ＡクローンｐＬ１２の５′末端からの数を付している。 ＬＣＡＴの完全な予想アミノ酸配列はＤＮＡ配列の上に
示されている。上記のアミノ酸配列において負の数を付
したアミノ酸は推定のす−ダープレペブチドを示し、一
方正の数を付したアミノ酸は成熟タンパク質を示す。予
想される、Ｎ−結合されるグリコジル化部位４箇所につ
いては上線を引き、ブタすい臓リパーゼの界面結合部位
と同一である６残基部分（親水性領域に囲まれている月
ま箱で囲んだ。２重の下線部分は、保存されたポリアデ
ニル化シグナルである６ヌクレオチドを示している。長
さの異なるポリ八）尾部は、４種のｃＤＮＡクローンの
同一の位置にある。１重の下線部分は、トリプシン加水
分解で得られるペプチドの分析、ならびにＮ−末端配列
決定によって得られるアミノ酸配列を示している。 第２ｂ図は、それぞれｃ ＤＮＡの５′および３′末端
と重なり合うバクテリオファージ・ラムダクロ・−ンか
ら得られるゲノム性配列を示している。５′側ヌクレオ
チドについては、利用できる配列の５′末端から任意的
に数を付している。アミノ末端側ＬＣＡＴのタンパク質
配列については第２ａ図と同じように数を付している。 ３種のリーディングフレームすべてに含まれる停止コド
ンには下線を引いている。最初のフレーム内上流停止コ
ドンはヌクレオチド１２１〜１２４のＴＧＡである。３
′側フランキングヌクレオチドおよびカルボキシ末端ペ
プチドについては、第２ａ図と同様に数を付している。 ポリアデニル化シグナルである６ヌクレオチドには２重
下線を引き、ポＩＪ ＶＳ、１尾部付加部位には１重下
線を引いている。 第３図は、ＬＣＡＴの発現ベクター１）ＳＶＬＣＡＴ、
１を示すものである。ＥはＳＶ４０の初期プロモーター
を示す。転写の方向は矢印で示す。 詳細な説明 本発明に於いては、レシチン−コレステロールアシルト
ランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）を以下の様に定義する。 すなわち、第２ａ図に示したアミノ酸配列を有するタン
パク質およびそのアミノ酸配列変異体（天然に存在する
アシルおよび予め決めた削除、挿入あるいは置換が１ま
たはそれ以上の残基について為された変異体を含む〕で
あって、コレステロールのエステル化において酵素的に
活性であるか、または酵素的には不活性であるが、酵素
的に活性なＬＣＡＴと結合しうる抗体との免疫学的な交
叉反応性を残しているかのいずれかであるタンパク質お
よびその変異体と定義する。 免疫学的交叉反応性を有するＬＣＡＴ変異体は、酵素的
に活性なＬＣＡＴと、酵素的に活性なＬＣＡＴに対して
生成させたポリクローナル抗血清との結合を競争的に阻
害することができる。このような抗血清は、常法により
、ヤギ、トリ、ウサギあるいはその他の種に、完全フロ
インドアジュバント中のＬＣＡＴを皮下注射し１次いで
不完全フロイント中のそれを腹腔内あるいは皮下にブー
スター注射することによって調製される。 酵素的には活性ではないが、酵素的に活性なＬＣＡＴの
抗血清と交叉反応することができるＬＣＡＴの変異体は
、ｔａｌＬｃＡＴの抗体、またはＬＣＡＴのための診断
検定用試薬として、ｔｂ）既知の方法に従って不溶化さ
れたときには、血漿からの結合タンパク質または抗血清
からの抗−ＬＣＡＴ抗体を精製するための試薬として、
そして（ｃｌ酵素的に活性なＬＣＡＴの抗体を生成させ
るための免疫原として有用である。 第２ａ図で示されるアミノ酸配列は、プレ・ＬＣＡ、
Ｔのものである。プレＬＣＡＴは、たとえばプレＬＣＡ
ＴをコードしているＤＮＡで形質転換された原核生物中
で合成されるが（この生物は哺乳動物のプレタンパク質
由来の完全ｆｌ Ｌ ＣＡ Ｔを分泌および加工しない
〕、上記のようなプロセッシング（加工〕を行ないつる
宿主細胞を形質転換して、培養物培地あるいは宿主細胞
のペリプラズム（性質つにおいて完全なＬＣＡＴを得る
ようにするのが好ましい。代表的には、哺乳動物細胞の
ような高等真核生物宿主細胞が、プレＬＣＡＴをプロセ
ッシングすることができ、完全なＬＣＡＴを分泌するこ
とができる（プレＬＣＡＴをコードしているＤＮＡで形
質転換することによりハあるいは、完全な（成熟）ＬＣ
ＡＴをコードしているＤＮＡを、宿主にホモローガスな
シグナル配列をコードしているＤＮＡの３′末端に５′
ライゲートし、この構築物を用いて宿主細胞を形質転換
することによって、分ａ・された完全ｆｉ Ｌ ＣＡ
Ｔが得られる。′ホモローガス“なる語句は、問題にし
ている配列が、宿主細胞内に通常存在するタンパク質あ
るいはポリペプチドの配列であることを意味する。この
場合、宿主細胞は、シグナル配列とＬＣＡＴのＰｈｅｌ
の間のペプチド結合をタンパク質加水分解切断すること
によって、発現された融合体をプロセッシング（加工）
し、次いで当該宿主細胞が何であるかによって宿主細胞
外質あるいは培地中に成熟ＬＣＡＴを分泌する。たとえ
ば、原核生物性発現ベクターの構築においては、ヒト・
ＬＣＡＴ分泌リーダーは細菌性アルカリホスファターゼ
あるいは熱安定性エンテロトキシンＩＩ ＩＪ−グーで
置換し、酵母の場合は、Ｌ ＣＡ Ｔ ＩＪ−グーは酵
母インベルターゼ、α因子あるいは酸ホスファターゼリ
ーダーで置換する。しかし、ヒト・ＬＣＡＴ分泌リーダ
ーはヘテロローガスな高等真核生物細胞によって認識さ
れる。ホモローガスなシグナル−Ｌ ＣＡ、 Ｔ融合体
で形質転換されたダラム陰性生物は細胞外質に成熟ＬＣ
ＡＴを分泌するであろうし、一方、酵母あるいはバシル
ス種（ｂａｃ ｉ Ｉ Ｉｕｓ 並、 ）は培養物培地
に成熟ＬＣＡＴを分泌するであろう。 アミノ酸配列変異体とは、少なくとも１個のアミノ酸残
基が削除、挿入あるいは他の残基で置換されているＬＣ
ＡＴ種を指す。このような変異体は、ＬＣＡＴ酵素の性
質を変えてその治療効果を強めるため、あるいは組み換
え細胞培養物中での製造を容罵にするために調製されろ
う代表的な変異体は、たとえば、タンパク質加水分解を
受けやすい部位をもはやそうではないようにすることに
よって、ある種の組み換え細胞培養物中あるいはＬＣＡ
Ｔを投与する患者の血行中で起こりつるタンパク質加水
分解に抵抗するように調製される。 これは、アルギニンおよびリジン残基を他の残基で置換
するかあるいは削除することによって、またはアルギニ
ンあるいはりジン残基の後にプロリン残基を挿入するこ
とによって行なわれる。 他の変異体はグリコジル化耐性体（Ａｓｎ ＸＴｈｒグ
リコジル化部位のアスパラギン酸塩基の置換あるいは削
除による〕、または予め決定した部位の新規グリコジル
化体である（置換あるいは挿入を行なってＡｓｎＸＴｈ
ｒ 部位を創製することによる〕。 また、酵素の触媒活性を変えた変異体（たとえば、その
基質特異性を広くするか、あるいはその回転数を増加さ
せる変異体〕、酵素中の酸化されやすい残基の削除を伴
う変異体、およびＬＣＡＴが相互作用することもあるア
ポリポタンパク質りおよびその他のタンパク質（細胞表
面受容体を含む〕との結合能力を変えた変異体も製造さ
れる。 プレＬＣＡＴあるいは成熟しＣＡＴのアミノ酸配列変異
体はいくつかの種類、すなわち削除体、挿入体あるいは
置換体に分けられる。挿入体にはアミ／末端および／ま
たはカルボキシ末端融合体ならびに１個の残基あるいは
ポリペプチドの配列内挿入体が含まれる。融合体には、
成熟Ｌ ＣＡＴと、ＬＣＡＴにホモローガスなポリペプ
チドとの融合体、例えばヒトのＬＣＡＴの場合には、他
の分泌されるヒトタンパク質由来の分泌リーダーとの融
合体、宿主細胞とホモローガスなポリペプチド（たとえ
ば宿主細胞タンパク質の分泌リーダ→との融合体、およ
び宿主細胞ならびにＬＣＡＴが由来する種の両方にヘテ
ロローガスなポリペプチドとの融合体が含まれる。本発
明の範囲内に含まれる好ましい融合体は、原核生物、酵
母、ウィルスあるいは宿主細胞のシグナル配列のシグナ
ルペプチドあるいは原核生物ペプチドとのアミノ末端融
合体である。通常分泌されるタンパク質由来の完全な配
列の残部をこのシグナル配列が欠いていることは必須で
はないが、ＬＣＡＴ融合体の分泌を避けるためには好ま
しい。 その池の挿入体が、ＬＣＡＴの成熟コード化領域内に導
入される。しかし、これらは通常、１〜４残基程度であ
り、アミノ末端あるいはカルボキシ末端融合体と比べる
と比較的小さい挿入体である。一般的には、これらはＬ
ＣＡＴ分子が混乱するのを最小限にとどめるために対で
導入されるべきである。代表的な例は、ＣＡｒｇ３６゜
→Ａｒｇ３６２Ｐｒｏ Ｇ１ｎ３６３］Ｌ ＣＡ Ｔ、
すなわちＡｒｇ３６２残基におけるトリプシン加水分解
を耐性にするために選択した変異体である。別の挿入変
異体は、ＣＰ ｒ Ｏｆ７４Ｖａ１１７５ →Ｐｒｏ１
７４ ＶａｌＶａｌＶａｌ１７５ＴＩＬ ＣＡ Ｔであ
る。特に指摘しない限り、本明細書中に記載した特定の
ＬＣＡＴ変異体は成熟ＬＣＡＴ配列における変異体であ
り、プレＬＣＡＴ変異体ではない。 削除体は、ＬＣＡＴ配列からの１またはそれ以上のアミ
ノ酸残基の除去によって特徴づけられる。 削除は、挿入と同じ理由から対で為されるのが好ましい
。、たとえば、トリプシン加水分解部位を抹殺するため
にＧｌｙ１□２ＬＹＳ１□３を削除する。その他のＬＣ
ＡＴ削除変異体は、ＣＧｌｕ４１１ＰｒＯ４１２−Δ〕
ＬＣＡＴおよび［ＡＳｎ２７２Ｔｙｒ２７３ →ΔコＬ
ＣＡＴである。ｍｅｔ ＬＣＡＴ（すなわちｍｅｔ−
成熟ＬＣＡＴの細胞内直接発現に適した変異体）を得る
ためには、残基−２３〜−１（両端を含む〕の削除が行
なわれるが、通常は、約２〜６残基以上の残基がＬＣＡ
Ｔ分子内の１つの部位で削除されることはない。 置換変異体は、目標残基の除去およびそれを他のアミノ
酸で置換することによって特徴づけられる。削除あるい
は挿入変異体と比較して、より多数の置換体が可能であ
る（特に、同じような立体構造および電荷あるいは疎水
性を有する残基が目標残基と置換されるときにはり。一
般的には、置換によって、削除あるいは挿入によって通
常可能であるよりも、さらに細か＜ＬＣＡＴの活性およ
び性質を変えることが可能になる。代表的な置換体には
、ＣＰｈｅ１７６ →Ｔｙｒ１７６’：ｌ Ｌ ＣＡ
Ｔ 、 ［：Ｖａｌｒ７ｓ＝Ｔｈｒ１７５］Ｌ ＣＡ
Ｔ 、 ＣＬｙＳ１７３ →Ｇ１ｕ１７３：ＩＬＣＡＴ
、ＣＬｙｓ１７３ →Ｈｉ ｓ １７３ ：ｌＬ ＣＡ
Ｔ、 ＣＣｙｓ３５６４Ｓｅｒａ５６］ＬＣＡＴ、〔
ＬｙＳ１５→ＡＳｎ１５〕ＬＣＡＴ、〔Ａｒｇ０５８→
Ｔｒｐ１５−Ｂ］ Ｌ ＣＡ Ｔ、〔Ａｒｇ２５６→Ｔ
ｒｐ２５６〕ＬＣＡＴ、ｃＡｒｇ３２３４ ＨｉＳ３２
３］Ｌ ＣＡ Ｔ 、 ＣＡｒｇ２５６→Ｔｒｐ２５６
’） Ｌ ＣＡ Ｔ 、 ＣＡｒｇ１４７ →Ｔｒｌ）
１４７］ Ｌ ＣＡＴ、 〔Ａｒｇ１４ｏ −＋Ａｓｎ
１４ｏコＬ ＣＡ Ｔ 、 ＣＬｙ ５１０５−ａ
−Ｈｉｓ１０５Ｘ ＣＡ Ｔ、ＣＬｙＳ１１６ →Ｈｉ
Ｓ１１６］ Ｌ ＣＡＴ、〔ＬｙＳｌｏｌｌＧｌｎｌｏ
ｌ、ＬｙＳ１１６°ＡＳｎ１１６、Ａｒｇ１４０°Ａｓ
ｎ１４０ 、 Ａｒｇ１４７１Ｈｉ ５１４７ 、 Ａ
ｒｇ１５８→Ａｓｎ１５ＢＸ ＣＡ Ｔ 、 Ｃ５ｅｒ
ＩＢ１ →Ｔｈｒ１ｇ１） Ｌ ＣＡＴ、および〔Ｈ１
Ｓ１８ｏ−Ｉ−ＡＳｎ１８ｏ″ＩＬＣＡＴが含まれる。 アミノ酸残基の削除、挿入および／または置換の組み合
わせ体も本発明の範囲内に含まれる。たとえば、ＣＴｈ
ｒ２２−＋Δ、Ｐｂｅ６７ →”ｒｈｒ５７］ｔ、 Ｃ
Ａ Ｔあるいは〔Ｌｅｕ１８３°ＶａｌＩＢ３． Ｌｅ
ｕ１ｇ５ＨｉＳ’１ｇ６４Ｌｅｕ１８５ＶａｌＶａｌＨ
ｉｓ１ｇ６］ Ｌ ＣＡ Ｔである。 アミノ酸配列変異体は、目標部位を選び（好ましくは残
基約１１４〜２５６および／または３６２〜４１６（両
端を含む〕内で行なう〕、飽和突然変異誘発によってこ
の部位に変異を導入することによって最もうま（調製さ
れる。 変異部位は予め決定するが、変異それ自体は予め決定す
る必要がない。たとえば、所定の部位における変異を最
適に行なうためには、目標コドンあるいは領域において
ランダム突然変異誘発を行ない、発現されたＬＣＡＴ変
異体を、目的活性が最適に組み合わされたものについて
スクリーニングする。既知の配列を有するＤＮＡ中の予
め決定した部位に置換突然変異を生成させる方法はよく
知られている（たとえばＭ１３プライマー突然変異誘発
〕。 ＬＣＡＴをコードしているＤＮＡは、化学合成によって
、あるいは肝臓由来のｍＲＮＡの逆転写体のスクリーニ
ングによって、あるいはいずれかの細胞由来のゲノムラ
イブラリーをスクリーニングすることによって得られる
。ＬＣＡＴをコード−しているＤＮＡの長さを考慮する
と、ＤＮＡを合成するよりもｃ ＤＮＡライブラリーを
プローブする方がより効率的であろう。しかし、ＬＣＡ
Ｔ遺伝子の一部を合成することは、ＤＮＡの調製時に特
異な制限部位を導入し、これによって、天然配列中には
存在しない該制限部位を含有するベクター中にこの遺伝
子を用いることができる様にし、そして、突然変異誘発
等による場合のようにＬＣＡＴをコードしているＤＮＡ
をさらに修飾することを必要とすることなく、ステムお
よびループ構造を除去して翻訳効率を高めることができ
る。ＬＣＡＴをコードしているｃＤＮＡは、ＬＣＡＴの
ＤＮＡの供給源とホモローガスな他のタンパク質をコー
ドしているフランキング（隣接）ＤＮＡおよびイントロ
ンを含有していない。 ヒト肝＠ ＣＤＮＡライブラリーを、標識したオリゴヌ
クレオチド（その配列は、精製ヒトＬＣＡＴの分析によ
って決定した部分的アミノ酸配列に基づいている〕を用
いて、ヒトＬＣＡＴ配列をコードしているＤＮＡについ
てプローブした。次いで、プローブすることによって同
定したプレＬＣＡＴまたは完全な（成熟）Ｌ′ＣＡＴコ
ード化ＤＮＡ全ＤＮＡ異させ、上記ＬＣＡＴのアミノ酸
変異体をコードさせ−ることができる（第２ａ図つ。た
とえば、プレ配列を削除し、開始コドンを完全すＬＣＡ
ＴをコードしているＤＮＡの５′側に隣接させて挿入し
て、組み換え体培養物中に直接ＬＣＡＴ鎖を発現させる
。 − このＤＮＡの共有結合による標識化は、螢光性の基、放
射線活性な原子あるいは化学発光性の基などの検知しつ
る物質を用い、自体既知の方法によって行なわれる。次
いでこの標識化ＤＮＡを通常の雑種形成（ハイ゛ブリダ
イゼーション〕検定に用いる。このような検定は、後記
実施例に記載したようｆ、Ｌ Ｌ ＣＡ Ｔベクターお
よび形質転換体の同定、または組織中の異常なゲノムＤ
ＮＡあるいはＬＣＡＴのｍＲＮＡの検知等の試験管内診
断に用いられる。 ＬＣＡＴに関するＤＮＡの特に有用な使用法は、心臓疾
患に関与している制限酵素多形性の同定を容易にするこ
とである。 鎌状赤血球貧血のような遺伝的疾患に関与する制限酵素
多形性の検知のための一般的な方法は知られている（３
２．３３）。ＬＣＡＴに関係するＤＮＡはこのような方
法に、以下のようにして用いられる。群の一部が心臓疾
患あるいはアテローム性動脈硬化症の生理学的徴候を示
し、他がそれらの徴候を示さな０１対象群から、既知の
方法でゲノムＤＮＡあるいはｃＤＮＡを調製する。この
群は同一の家族内から選ばれるのが好ましい。次いでこ
のＤＮＡを選択した制限酵素で完全に消化し、フラグメ
ントを電気泳動で分離する。このＤＮＡをニトロセルロ
ースフィルターに移り、ＬＣＡＴに関するＤＮＡフラグ
メントと雑種化する。この方法は通常ノーザン・ハイブ
リダイゼーションとして知られている（後記参照〕。ア
テローム性動脈硬化症への遺伝的素質を有する対象群は
、ノーザン分析において異なったパターンのバンドを示
すであろう（すなわち、制限消化多形性を示すであろう
）。たとえば、ＬＣＡＴ欠損の原因である遺伝的異常を
削除することは、ＬＣＡＴおよびそのフランキングゲノ
ム領域の完全なコード化ｆｉｌｔが本発明によって明ら
かにされたので、制限酵素多形性の直接的な応用となろ
う。 アテローム性動脈硬化症の症状と最も確かな関係を持っ
ている制限酵素は、上記のような常法のスクリーニング
によって同定されるであろう。適切な候補は既知の制限
エンドヌクレアーゼの中から選ばれる（至）。 ｃ ＤＮＡ肝臓ライブラリーも有用であるが、好ましい
被験試料はリンパ細胞ゲノムＤＮＡのλフアージライブ
ラリーである。これらの分析に用いられるプローブには
、完全長さくフルレングス〕のＬＣＡＴのｃＤＮＡ、Ｌ
ＣＡＴのゲノムＤＮＡイントロン、約５０００ ｂｐ
までの非翻訳化５′および３′フランキング領域、およ
びそれらのフラグメントが含まれる。オリゴヌクレオチ
ドプローブの大きさはノーザンハイプリダイゼーション
の目的物（ターゲット月こ依存する３、このノーザンハ
イブリダイゼーションがＬＣＡＴ対立遺伝子（アレルノ
の存在を調べることを目的としているときには、このプ
ローブは、非常に厳しい雑種形成条件下（たとえば低温
〕で検知が可能であるように、十分に小さいものになる
。たとえば、唯一個のヌクレオチドの突然変異体を決定
するには、通常約１０−２０塩基の小さいプローブを使
用すること、および非常に厳しい条件が必要となるであ
ろう。一方、ＬＣＡＴ遺伝子に多数の欠失がある場合は
、その欠失に対応するプローブによって検知される。 即ち、雑種形成がないと、所望でない対立遺伝子が存在
していることになる。しかし一般的には、このプローブ
は、ＬＣＡＴのゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡあるいはフラン
キング領域の特定部分のいずれかに対応している必要は
ないが、約３０〜５０ ｂｐのＬＣＡＴコード化ＤＮＡ
であるか、またはこれと相補的なりＮＡであることが好
ましい。 ＬＣＡＴは、プレＬＣＡＴ、ｍｅｔ−成熟ＬＣＡＴある
いはＬＣＡＴ変異体をコードしているＤＮＡを含有する
ベクターで形質転換された宿主細胞中で合成される。さ
らに加工するための大量のＤＮＡを調製するため（クロ
ーニングベクター〕、あるいはＬＣＡＴを発現させるた
めに（発現ベクターツ１．ベクターを用いてＬＣＡＴを
コードしているＤＮＡを増幅する。発現ベクターとは複
製可能なりＮＡ構築物であって、適当な宿主においてＬ
ＣＡＴを発現させうる適当な制御配列に、ＬＣＡＴをコ
ードしているＤＮＡ配列を機能的に結合させた構築物で
ある。クローニングベクターは発現制御配列を含有して
いる必要はない。このような制御配列には、転写プロモ
ーター、転写を制御するためのオペレーター配列（無い
こともある〕、ｍＲＮＡの適当なリポソーム結合部位を
コードしている配列（原核生物性発現のための〕、およ
び転写および翻訳の終止を制御する配列が含まれる。 発現およびクローニングベクターは、ＬＣＡＴの安定な
発現を容易にするか、あるいは増幅するための、および
／または形質転換体を同定するための選別遺伝子を含有
しているべきである。しかし、ＬＣＡＴ発現を維持する
ためのこの選別遺伝子は、真核生物宿主細胞を用いる同
時形質転換系中の別のベクターによって供給させること
ができる。 ベクターには、プラスミド、ウィルス（ファージを含む
）、および組み込み可能なりＮＡフラグメント（すなわ
ち、組み換えによって宿主ゲノムに組み込まれうるフラ
グメント９が含まれる。ＬＣＡＴの真核生物細胞発現に
用いるための本明細書中に記載のベクターには、微生物
中でクローニングするためのプラスミド配列が含まれ、
この場合、プラスミドは宿主ゲノムから自律的に複製す
るが、ＤＮＡは形質転換により真核生物宿主細胞ゲノム
に組み込まれるものと考えられている。同様に、ホモロ
ーガスな組み換えによってゲノム的にバシルス（ｂａｃ
ｉｌ １ｕｓ）中に組み込まれるバシルスベクターも有
用である。しかし、同様の機能を果たし、そして当分野
で知られているか、または知られるようになるその他の
あらゆる形のベクターが、本発明への使用に適している
。 通常、適切なベクターは、予定している発現宿主に適合
しうる種由来の制御配列、およびレプリコン（非組み込
み性ベクターにおいて用いるための複製起源〕を含んで
いる。形質転換宿主細胞とは、ＬＣＡＴをコードしてい
るＤＮＡを含有するベクターで形質転換またはトランス
フェクションされた細胞である。形質転換宿主細胞はク
ローン化ＤＮＡを含有しており、そして発現ベクターで
形質転換されているときには、ＬＣＡＴまたはその誘導
体を発現する。この発現されたＬＣＡＴは、選択した宿
主細胞および発現されたタンパク質中の適当なプロセッ
シングシグナル（たとえば、ホモローガスあるいはヘテ
ロローガスなシグナル配列）の存在に依存して、細胞内
に蓄積されるか、または細胞周辺腔あるいは培養物上清
のいずれかに分泌される。 ＤＮＡの各領域は、それらが機能的に互いに関連してい
るときには、「機能的」に結合している。 たとえば、プレ配列あるいは分泌リーダー用のＤＮＡは
、もしそれがポリペプチドの分泌にあずかるプレタンパ
ク質として発現されるなら、ポリペプチド用のＤＮＡと
機能的に結合している。プロモーターは、もしそれが配
列の転写を制御するものであるのなら、コード化配列に
機能的に結合しており、リポソーム結合部位は、もしそ
れが翻訳を可能にするように配置されているなら、コー
ド化配列に機能的に結合している。通常、機能的に結合
されるとは、結合するＤＮＡ配列どうしが隣接している
こと、そして分泌リーダーの場合には、隣接しておりか
つリーディング相（解読相う内にあることを意味する。 適当な宿主細胞は、原核生物、酵母または高等真核生物
細胞である。原核生物には、ダラム陰性あるいはグラム
陽性微生物、たとえばＥ、コリ（Ｅ、 ｃｏｌｉ）ある
いはバシルス類（Ｂａｃ ｉ １１ ｉ ’ｊｒ＜含ま
れる。高等真核生物細胞には後記の哺乳動物由来の確立
細胞系（セルラインフが含まれる。Ｅ、コリＢ＝Ｅ、コ
リＸ１７７６（ＡＴＣＣ３１，５３７，１、Ｅ、コリＷ
３１１０（ＡＴＣＣ２７，３２５）、シュードモナス種
（ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ５ｐｅｃｉｅｓ）、または
セラチア”マルセサンス（社コａｔｉａＭａｒｃｅｓａ
ｎｓ ）などの原核生物が適しているが、好ましい宿主
細胞はＥ、コリ２９４（ＡＴＣＣ３１，４４６，１であ
る。 宿主細胞用の発現ベクターは、通常、複製起源（クロー
ニングにおける場合のように、染色体外増幅が望まれる
場合は、この起源は細菌性起源である〕、ＬＣＡＴのコ
ード化配列の上流に位置するプロモーター、ならびにリ
ポソーム結合部位〔このリポソーム結合配列、即ちシャ
インーダルガルノ（Ｓｈｉｎ−Ｄａ１ｇａｒｎｏＪ配列
は原核生物性発現用にのみ必要である〕、ポリアデニル
化部位、および転写終止配列を含有する。既述のように
、これらの配列のあるものは、ある種の宿主内での発現
にとって必要でないことは理解されるであろう。 微生物と共に用いるための発現ベクターは、目的宿主に
よって認識される複製起源、宿主中で機能するプロモー
ター、および表現型選択遺伝子（たとえば、栄養要求性
を付与するか、あるいは抗生物質耐性を付与するタンパ
ク質をコードしている遺伝子）を含有することだけを必
要としている。 通常、ＬＣＡＴのＤＮＡは、ｐＢＲ３２２、すなわちＥ
、コＩＪ ｆｆ（由来のプラスミド〔ポリバー等（Ｂｏ
１１ｖａｒ 。 ｅｔ ａＬ−）、ジーン（ＧｅｎｅＪ４：９５（１９７
７）’：］ を用いてＥ、コリ中でクローン化される
。ｐＢＲ３２２はアンピシリンおよびテトラサイクリン
耐性遺伝子を含有するので、形質転換細胞の容易な同定
手段を与える。 クローニングベクターとは異なり、発現ベクターは、宿
主微生物によって認識されるプロモーターまたはその他
の転写促進配列を含んでいなくてはならない。通常これ
は、目的宿主にホモローガスなプロモーターである。高
等真核生物用ベクターの場合には、促進配列はプロモー
ターからの転写を増加させることが多い。組み換えＤＮ
Ａの構築体に最も一般的に用いられるプロモーターには
、β−ラクタマーーゼ（ペニシリナーゼ〕およびラクト
ースプロモーター系〔チャン等（Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａ
ｌ。 〕、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、ｖｌ、６１５（１９
７８）；およびゲーデル等（Ｇｏｅｄｄｅｌ ｅｔ ａ
ｌ、）、ネイチャー、λ比と、５４４（１９７９）］、
トリプトファン（ｔｒｐ）プＣ１（−−ター系〔ゲーデ
ル等（Ｇｏｅｄｄｅｌ ｅｔ ａｌ−大ヌクレイツク・
アシッズ°リサーチ（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ、）、麩、４０５７（１９８０）およびＥＰＯ出願公
開Ｎｏ、３６，７７６］、およびｔａｃプロモーター〔
ボアー等（Ｈ，ｄｅ Ｂｏｅｒ ｅｔ ａｌＪ、プロシ
ーディンゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・
サイエンシーズ・米国（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ’１． Ａ
ｃａｄ、Ｓｃｉ。 ＵＳＡ）、各店、２１−２５（１９８３））が含まれる
。 これらのプロモーターが最も一般的に用いられるが、そ
の他の既知の微生物性プロモーターも適している。これ
らプロモーターのヌクレオチド配列は公表されているの
で、必要とされる制限部位を供給するりンカーあるいは
アダプターを用いて、プラスミドベクター中の、ＬＣＡ
ＴをコードしているＤＮＡにこれらを機能的にライゲー
トすることができる、〔シーベンリスト等（Ｓｉｅｂｅ
ｎｌ １ｓｔｅｔ ａｌ、）、セル（Ｃｅｌｌ）、２０
．２６９（１９８０）’）。 また、原核生物性発現用において用いるためのプロモー
ターは、ＬＣＡＴをコードしているＤＮＡに機能的に結
合させたシャイン−ダルガル／Ｃ５，Ｄ、）配列を含ん
でいる。すなわち翻訳を容易にするようにＳ、Ｄ、配列
が配置されている。通常これは、細菌の構造遺伝子の２
番目のコドンから上流に存在するプロモーターおよびＳ
、Ｄ、配列が、成熟ＬＣＡＴの５′側に位置するプレＬ
ＣＡＴの配列と置き換わることを意味する。開始コドン
は、挿入性突然変異誘発によって、または細菌の遺伝子
により付与することができる。 原核生物に加えて、酵母などの真核微生物培養物がＬＣ
ＡＴをコードしているベクターで形質転換される。低級
真核性宿主微生物の中で、サツカロマイセス・セレビシ
ェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍ ｃｅｓｃｅ ｒｅｖ ｉｓ
ｉａｅ ）または一般的なパン酵母が最も普通に用いら
れる。しかし、その他の多数の菌株が本発明に有用であ
り、一般的に用いることができる。通常、酵母ベクター
は、２ミクロン酵母プラスミドまたは自律的複製配列（
ＡＲ５，）由来の複製起源、プロモーター、ＬＣＡＴま
たはその誘導体をコードしているＤＮＡ、ポリアデニル
化および転写終結のための配列、および選択遺伝子を含
んでいる。酵母中においてＬＣＡＴを発現させるのに適
するプラスミドはＹＲｐ７である〔ステインチコンブ等
（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ ｅｔ ａｌ、）、ネイチャー
（Ｎａｔｕｒｅ）、２８２．３９（１９７９）： キ
ンゲスマン等（Ｋｉｎｇｓｍａｎ ｅｔ ａｌ、）、ジ
ーン（Ｇｅｎｅ）、η、１４１（１９７９）： チェ
ンバー等（Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒ ｅｔａｌ、）、 ジ
ーン、１止、１５７（１９８０）’）Ｏこのプラスミド
は、トリプトファン中で生育する能力を欠く酵母の突然
変異株に選択マーカーを付与する旦α遺伝子を既に含有
している〔たとえば、ＡＴＣＣＮｏ、４４０７６または
ＰＥＰ４−１；ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）、ゼネテイツ
ク゛ス（Ｇｅｎｅｔ ｉｃｓ ）、且、１２（１９７７
）ｌ。従って、酵母宿主細胞ゲノム中にｔｒｐｌ損傷が
存在することが、トリプトファンの非存在下で増殖させ
ることによって形質転換を検知するための効果的な環境
を与える。同様に、Ｌｅｕ ２を欠いた酵母株（ＡＴＣ
Ｃ２０，６２２あるいは３８．６２６）は、シ１２遺伝
子を有する既知のプラスミドで補なわれる。 酵母ベクター中の適切な促進配列には、メタロチオネイ
ン、３−ホスホグリセレートキナーゼ〔ヒッツエマン等
（Ｈｉｔｚｅｍａｎ ｅｔ ａｌ、）、ジャーナル・オ
ブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ。 １３ｉｏ１． Ｃｈｅｍ、）、２５５．２０７３（１９
８０）〕、またはその他の解糖酵素、たとえばエノラー
ゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ
、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホ
スホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸インメ
ラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸
キナーゼ、トリオースリン酸インメラーゼ、ホスホグル
コースイソメラーゼおよびグルコキナーゼなど〔ヘス等
（Ｈｅｓｓ ｅｔ ａｌ、）、工Ａｄｖ−Ｅｎｚｙｍｅ
Ｒｅｇ、、η、１４９（，１９６８）：およびホーラ
ンド等（Ｈｏｌｌａｎｄ ｅｔ ａｌ、）、バイオケミ
ストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、１７．４９０
０（１９７８）］のプロモーターが含まれる。酵母発現
に用いるのに適するベクターおよびプロモーターは、ヒ
ツツエマン等（Ｒ，Ｈｉｔｚｅｍａｎ −ｅｔ ａｔ、
、ＥＰ ７３，６５７ Ａ） がさらに詳しく開示
している。 増殖条件によって転写が制御されるという利゛点をさら
に有するその他の酵母プロモーターには、アルコールデ
ヒドロゲナーゼ２、インシトクロムＣ１酸ホスフアター
ゼ、窒素代謝に関係する分解酵素および上記のメタロチ
オネインとグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲ
ナーゼ、ならびにマルトースおよびガラクトース利用に
関与している酵素のためのプロモーター領域がある。適
切な発現プラスミドを構築する際に、これらの遺伝子と
結合する終止配列をも、発現ベクターのＬＣＡ、Ｔコー
ド化配列の３′側にライゲートして、ｍＲＮＡの終止お
よびポリアデニル化を付与する。 多細胞生物由来の細胞の培養物は、本発明において好ま
しい宿主細胞となる。哺乳を椎動物あるいは非を椎動物
培養物であってもなくても、原則として、すべての高等
真核生物細胞培養物を使用することができる。培養物中
でのを椎動物細胞の増殖自体は、近年においては常套法
となっている〔組織培養（Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕ１ｔｕｒ
ｅ）、アカデミツク・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒ
ｅｓｓ）、クルスおよびパターマン（Ｋｒｕｓｅ ａｎ
ｄ Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ）編（１９７３）〕。 有用な補乳動物宿主セルラインの例は、ベロ（ＶＥＲＯ
，ｌおよびヘラ（ＨｅＬａ）細胞、チャイニーズノ１ム
スター卵巣（、ＣＨＯ）セルライン、ならびにＷ１３８
、ＢＨＫ％ＣＯ５−７およびＭＤＣＫセルラインである
。 を椎動物細胞性発現ベクター中のＬＣＡＴの転写および
翻訳制御配列は、ウィルスの供給源から得るのが好まし
い。たとえば、通常用０られるプロモーターは、ポリオ
ーマ、アデノウィルス２、および最も好ましくはシミア
ンウィルス４０ （ＳＶ４０）から得られる。このＳＶ
４０の初期および後期プロモーターは、両者がＳＶ４０
のウィルス性複製起源をも含有するフラグメントとして
ウィルスから容易に得られるので特に有用である〔フイ
アーズ等（Ｆｉｅｒｓ ｅｔ ａｌ、）、ネイチャー（
ＪＪａ ｔｕｒｅ〕、２７影、１ｘ３（１９７８））。 ウィルス性複製起源内に位置し、Ｈｉｎｄ ｍ 部位
から］は１部位に向って延びている約２５０ｂｐの配列
が含まれて（するなら、より小さいかあるいはより大き
いＳＶ４０フラグメントを使用することもできる。さら
に。 通常はＬＣＡＴに関係している、ＬＣＡＴのゲノム性フ
ロモーター、制御および／またはシグナル配列を用いる
こともできる（このような制御配列が宿主細胞によって
認識され、かつ適合し得るものであることを条件として
）。 複製起源は、たとえばＳＶ４０あるいはその他のウィル
ス（たとえば、ポリオーマ、アデノウィルス、ＶＳＶあ
るいはＢＰＶ）供給源から得ることができるような外因
性の起源を含むようにベクターを構築することによって
、または宿主細胞染色体の複製機序によって得ることが
できる。ベクターが宿主細胞染色体に組み込まれるとき
には、後者で十分であることが多い。 ウィルス性複製起源を含有するベクターを用いるとき以
外は、選択しうるマーカーをコードしているＤＮＡおよ
びＬＣＡＴあるいはその誘導体をコードしているＤＮＡ
で哺乳動物細胞を同時形質転換する。適当な選択マーカ
ーの例は、ジヒドロ葉酸レダクタ−”（ＤＨＦＲ）ある
いはチミジンキナーゼである。このようなマーカーは、
形質転換細胞（すなわち、ＬＣＡＴのＤＮＡを取り込む
能力を有していた細胞〕の同定、およびＬ ＣＡ、 Ｔ
のＤＮＡの増幅を可能にするタンパク質、通常は酵素で
ある。通常、マーカータンパク質を取り込まなければ、
細胞が必須栄養素を得ることができγλい培養培地、ま
たは非形質転換細胞にとって毒性である培養培竪質転換
体が生き残ることによって同定を行なう。一連の絶えず
増加する選択圧（通常、毒性成分の濃度を増加させるつ
下で、同定した形質転換体を培養することによって増幅
を行なう。 ＬＣＡＴおよびＤＨＦＲの両者をコードしているＤＮＡ
配列を含有するベクターによって形質転換するのに好ま
しい宿主哺乳動物細胞を選択する際には、用いられるＤ
ＨＦＲタンパク質の種類に応じて宿主を選択するのがよ
い。もし野生型ＤＨＦＲタンパク質を用いるときには、
Ｄ ＨＦ Ｒを欠く宿主細胞を選ぶのが好ましく、これ
によって、ヒポキサンチン、グリシンおよびチミジンを
欠く選択培地においてトランスフェクションをうまく行
なわせるためのマーカーとして、ＤＨＦＲコード化配列
全配列することが可能になる。この場合の適当な宿主細
胞は、ウルラウブおよびチャーシン［Ｕｒｌａｕｂ ａ
ｎｄ Ｃｈａｓｉｎ 、 Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ’１．
Ａｃａｄ。 Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７７．４２１６（１９８０Ｊ］ が
開示したようにして調製され、増殖させられる、ＤＨＦ
Ｒ活性を欠いたチャイニーズハムスター （ｃＨｏ）
セルラインである。 一方、メトトレキセート（ＭＴＸ）に対する結合アフィ
ニティーが低いＤＨＦＲタンパク質をコードしているＤ
ＮＡを制御配列として用いるときには、ＤＨＦＲ耐性細
胞を用いる必要はない。突然変異体ＤＨＦＲはＭＴＸに
対して耐性であるので、宿主細胞それ自身がＭＴＸ感受
性であるときには、ＭＴＸ含有培地を選択手段として用
いることができる。ＭＴＸを吸収しうる真核生物細胞の
ほとんどはメトトレキセート感受性であるようである。 このような有用なセルラインの１つは、ＣＨＯライン、
すなわちＣＨＯ−に、１ （ＡＴＣＣＮｏ、ＣＣＬ６１
）である。 組み換えを椎動物細胞培養物中でＬＣＡＴを合成するの
に適用するのに適したその他の方法、ベクターおよび宿
主細胞は、ゲシング等ＣＭ−Ｊ。 Ｇｅｔｈｉｎｇ ｅｔ ａｌ。、Ｎａｔｕｒｅ、 ２９
３．６２０−６２５（−’１９８１ ） 〕、マンティ
等ＣＮ、 Ｍａｎｔｅｉ ｅｔ ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ
、 ２８１．４０−４６ ］およびレビンソン等（Ａ、
Ｌｅｖｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ、、ＥＰ １１７，０
６ＯＡおよび１１７．０５８Ａ）が開示している。 非ヒト組み換え宿主あるいは真核微生物中においてヒ１
−ＬＣＡＴを発現させると、組換え細胞培養物の加工に
より、天然のグリコジル化を伴なっていないヒトＬＣＡ
Ｔが生産物として得られる。 原核生物性ＬＣＡＴは完全に非グリコジル化産物である
。 上記のベクターで形質転換された宿主細胞は、ＬＣＡＴ
が培養物中に蓄積されるまで栄養培地中で培養される。 コレステロールあるいはその池の脂質を含有する培地中
で宿主細胞を培養するのが好都合であろう。ＬＣＡＴは
、脂質と相互作用する他の触媒性因子と同様（２３−２
７）、′界面の″脂質結合部位、および伸長した直線状
の疎水性アミノ酸配列を含むその他の領域を数個呑含有
する。コレステロールおよび／または脂質の代謝に順応
あるいは適合しつる宿主細胞（たとえばコレステロール
あるいは脂質の存在下で増殖しうる原核あるいは真核微
生物を、ＬＣＡＴ等の親油性酵素の発現および／または
分泌がよりうまく行なわれるように適応させてもよい。 ＬＣＡＴは、それが直接発現されるとき、すｉわち分泌
リーダーがないときには細胞内に存在し、従って屈折体
生成物あるいは溶菌した細胞の可溶性抽出物をＬＣＡＴ
活性について検定することができる。ＬＣＡＴが分泌さ
れているときには、既知の方法によって培養物培地ある
いはべりプラスミック液を回収する。ＬＣＡＴ検定はよ
く知られている（後記実施例５を参照〕。血清あるいは
血漿からＬＣＡＴを精製するための自体既知の方法によ
って、回収抽出物あるいは培地からＬＣＡＴを精製する
（後記実施例１を参照〕。 ＬＣＡＴは薬学的に許容しうる非毒性塩、たとえば酸付
加塩または金属錯体（たとえば亜鉛、鉄などとの錯体で
あり、これらは本発明の目的にとっては塩とみなされる
）の形で投与される。このような酸付加塩の例は、塩酸
塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩、マレイン酸塩、
酢酸塩、クエン酸塩、安息香酸塩、フハク酸塩、リンゴ
酸塩、アスコルビン酸塩、酒石酸塩などである。等張食
塩水、リン酸緩衝液などに加えて静脈内投与するのが適
当である。 Ｌ ＣＡ、 Ｔは医師の指示に従って投与されるべきで
あり、その医薬組成物は通常、常用の薬学的に許容しう
る担体と有効量の酵素を含有する。その投与量は、ＬＣ
ＡＴを投与する目的（こよって異なるが、通常は、患者
の血漿ＬＣＡＴを、正常な採取血漿中のＬＣＡＴ活性の
少なくとも約２５優にするのに十分な投与レベルである
。ＬＣＡＴを、アポリポタンパク質Ａ−ＩあるいはＤな
どのアポタンパク質と同時に投与してもよい。 ＬＣＡＴは、移動可能であるか、または皮膚接着性であ
る持続放出物質から投与されるのが望ましい。ＬＣＡＴ
用に適する系の例には、Ｌ−グルタミン酸とガンマし一
グルタミン酸エチルのコポリマー〔シトマン等（Ｕ、
Ｓｉｄｍａｎ ｅｔ ａｌ−）、パイオポリマーズ（Ｂ
ｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ） 、 ２２（１）、５４７〜５
５６（１９８３）：］、ポリ（２−ヒドロキシエチル−
メタクリル酸）〔ランガー等（Ｒ，Ｌａｎｇｅｒ ｅｔ
ａｌ。 〕、ジャーナル・オブ・バイオメディカル・マテリアル
・リサーチ（Ｊ、 Ｂｉｏｍｅｄ、 Ｍａｔｅｒ、 Ｒ
ｅ５−）、とも、１６７〜２７７ （１９８１）および
ランガー、ケミッシエΦテクニーク（Ｃｈｅｍ、 Ｔｅ
ｃｈ、、 ）、旦、９８−１−５ （１９８２） ］、
］エチレンー酢酸ビニルランが−等、同上〕、またはポ
リ−Ｄ−１−）−３−ヒドロキシ酪酸（Ｅ Ｐ １３３
，９８８Ａ）が含まれる。この物質は皮下に移動される
か、または皮膚あるいは粘膜と接触させて用いられる。 λフアージクローンであるであるという事実ニもかかわ
らず１ｐ″と称される後記のｃ ＤＮＡクローンを除い
て、プラスミドは、小文字ｐを最初に、そして／または
大文字、そして／または数字を次に並べることによって
表わされる。本発明における出発プラスミドは、市販品
を利用するか、非制限的な供給源から一般的に入手する
か、あるいは入手可能なプラスミドから公知の方法に従
って構築することができる。さらに、その他の等価なプ
ラスミドが当分野で知られており、これらは当業者によ
（知られている。 ＤＮＡの１消化′とは、ＤＮＡ中のある場所だけに作用
する酵素でＤＮＡを触媒的に切断することを指す。この
ような酵素を制限酵素と呼び、それぞれの酵素が特異性
を示す部位を制限部位と称する。本発明に用いる種々の
制限酵素類は市販品を利用することができ、その反応条
件、補因子およびその他の必要条件は、酵素供給元が確
立したものを用いた。通常、制限酵素は、それぞれの制
限酵素を最初に得た微生物を表わす大文字とこれに続く
文字、およびこれに続く特定の酵素を表わす数字からな
る略語で表わされる。一般的には、緩衝液約２０μｅ中
、プラスミドまたはＤＮＡフラグメント約１μｇに対し
て、酵素約２単位を用いる。特定のＩＬ限酵素のための
適当な緩衝液および基質量は製造元が指定している。イ
ンキュベーション時間は通常３７℃で約１時間であるが
、供給元の指示に従って変えてもよい。インキュベーシ
ョンの後、タンパク質をフェノールおよびクロロホルム
で抽出して除去し、消化した核酸をエタノールで沈殿さ
せて水性画分から回収する。制限酵素による消化に次い
で、まれに、末端５′リン酸エステルの細菌性アルカリ
ホスファターゼ加水分解ヲ行なって、ＤＮＡフラグメン
トの制限切断末端２つが、閉じたループを形成し、ある
いは１環化“することにより制限部位への他のＤＮＡフ
ラグメントの挿入か妨げられることを防止する。特に記
載がなければ、プラスミドの消化に次いで５′末端脱リ
ン酸化は行なわない。脱リン酸化のための試薬および方
法は常用のものである〔マニアテイス等（Ｔ、 Ｍａｎ
ｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ、）、モレキュラー・クローニ
ング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｒｎｉｎｇ）、１３
３〜１３４（１９８２）〕。 制限消化物からの特定のＤＮＡフラグメントの１回収“
または１単離′七は、電気泳動によってポリアクリルア
ミドまたはアガロースゲル上で消化物を分離し、既知の
分子量のマーカーＤＮＡフラグメントの移動度と比較し
て所望のフラグメントを同定し、所望のフラグメントを
含有スるゲル部分を取り出し、次いで、このゲルからＤ
ＮＡを分離するこきを意味する。この方法は一般的に知
られている。たとえば、ロラン等（Ｒ，Ｌａｗｎ ｅｔ
ａｌ、、ヌクレイツク−アシツズ・リサーチ（ＮＬＩＣ
１−ｅｉｃ Ａｃ ｉｄｓ Ｒｅｓ、 ）、Ｖ、６１０
３〜６１１４（１９８１）〕およびゲーデル等ＣＤ、Ｇ
ｏｅｄｄｅｌ ｅｔ ａＬ、、ヌクレイツク・アシツズ
・リサーチ、８．４０５１（１９８０）コを参照。 １サザ一ン分析′とは、既知の標識化オリゴヌクレオチ
ドまたはＤＮＡフラグメントと雑種形成（ハイブリダイ
ゼーションクさせることによって、消化物またはＤＮＡ
を含有する組成物中のＤＮＡ配列の存在を確稈する方法
である。本明細書中においては特に記載がなければ、サ
ザーン分析とは、サザーンの方法ＣＥ、 ５ｏｕｔｈｅ
ｒｎ、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー
（Ｊ、Ｍｏ １．Ｂ ｉ ｏ ｌ−人並、５０３〜５１
７（１９７５）］によって１１％アガロースで消化物を
分離し、変性し、ニトロセルロースに移し、そしてマニ
アティス等ＣＴ、Ｍａｎｉａｔ １ｓｅｔ ａｌ、、セ
ル（Ｃａｌｌ）、−匹、６８７−７０１（１９７８）〕
の開示のようにして雑種形成させることを意味する。１
ノ一ザン′分析とは、変性剤（たとえば６％ホルムアル
デヒド〕を含有するアガロースゲルでＲＮＡを電気泳動
し、次いでニトロセルロースに移シ、そして同じくマニ
アテイス等の開示のようにして雑種形成させることによ
って行なわれるｍＲＮＡのための雑種形成法である。 ゛形質転換″とは、ＤＮＡが染色体外要素または染色体
への組み込み体゛として複製しうるように、ＤＮＡを生
物中番こ導入することを意味する。Ｅ。 コリを形質転換するための適当な方法はマンデル等ＣＭ
ａｎｄｅｌ ｅｔ ａｌ、、ジャーナル・オプ・モレキ
ュラー・バイオロジー、５３，１５４（１９７０））の
Ｃａ ＣＣ２法である。 １ライゲーシヨン１とは、２つの２本鎖核酸フラグメン
ト間にホスホジエステル結合を形成させる過程を意味す
る（マニアテイス等、同上、１４６頁〕。特に記載がな
ければ、はぼ等モル量のライゲートしようとするＤＮＡ
フラグメント０．５μｆあたり’ｌ’４ＤＮＡリガーゼ
（″リガーゼ′）１０単位を用い、既知の緩衝液および
条件を用いてライゲーションを行なうことができる。 形質転換体からのＤＮＡの１調製“とは、微生物培養物
からプラスミドＤＮＡを単離することを意味する。特に
記載がなければ、マニアテイス等（同上、９０頁〕のア
ルカＩＪ／ＳＤＳ法を用いることができる。 １オリゴヌクレオチド′とは、既知の方法によって化学
的に合成され、次いでポリアクリルアミドゲルで精製さ
れた短い１本鎖あるいは２本鎖ポリデオキシヌクレオチ
ドである。 引用した文献のすべてを、後記の参照文献の項に挙げる
。 以下に実施例を挙げ、本発明をさらに詳しく説明する。 実施例１ ヒ１−ＬＣＡＴの精製および配列決定レシチ
ン−コレステロールアシルトランスフェラーゼ（Ｊ、Ｃ
ＡＴ）を、既知の方法（１０）の改良法により、正常な
ヒト血漿Ｃ５００ｒｒｔｌ）から精製した。 ＮａＢｒ溶液（１，２４ダ／ｍｌ）中で血漿をプレパラ
ティブ遠心することにより、ｄｌ、２１〜１．２５９／
ｒｎｅのフラクションを単離した。これを、３ＭのＮａ
Ｃ１，１ｍＭのＥＤＴＡ （ｐ Ｈ７，４）で平衡化し
たフェニルアガロース〔ファーマシア（ＰＡｒｍａｃｉ
ａバＵｐｐｓａｌａ。 スウェーデン〕のカラム（２，５Ｘ２０ｃｍ）にかけた
。３ＭＮａＣ１！−１０ｍＭトリス−ＨＣｌ！（ｐＨ７
，４）溶液５００ｍ１で洗浄した後、溶出液の０Ｄ２８
ｏ が０．０５以下になるまで、このフェニルアガロ
ース支持体をざらにＯ，１５ＭのＮａＣ１−’ｒ’Ｊス
緩衝液で洗浄した。残存する吸着タンパク質を蒸留水で
溶離し、１０ｍＭのトリス−ＨＣｆｆ（ｐＨ７，４）で
平衡化したＤ Ｅ Ａ、 Ｅ−セルロース（ＤＥ−５２
、ワットマン（Ｗｈａ ｔｍａｎ） ］ のカラムに
かけた。このカラムをＮａＣ１！の勾配溶液Ｃｌ０ｍＭ
トリス−ＨＣＪ（ｐＨ７，４）中０−０．３ＭのＮａＣ
Ｊ溶液〕溶液能した。 Ｌ ＣＡ Ｔを含有するフラクションを、蒸留水で平衡
化シタヒドロキシルアパタイト〔バイオラッド（Ｂｉｏ
ｒａｄ）、ヒドロキシルアパタイトＨＴ）のカラム（１
，５Ｘ４ｃｍ）に入れ、０．１５ Ｍ ＮａＣｌ中に０
〜５ｍＭリーンへ酸ナトリウム（ｐＨ６，８）を加えた
勾配溶液で溶離した。ＬＣＡＴを含有するフラクション
を集めた。これらのカラムフラクションを免疫親和カラ
ムＣＣＮＢｒ法によってアガロースに共有結合させたア
ポリポタンパク質Ｄ（アポＤ）に特異的なポリクローナ
ル抗体を含有する〕にかけることによって、必要ならす
べての残存アポＤを除去した。銀染色によって測定され
うる勾配ゲル電気泳動によって、この最終生成物が純粋
であると判断した。 アミノ酸分析は、ニンヒドリン検出法を用いるベックマ
ン（Ｂｅｃ）ｃｍａｎ） −６３００アミノ酸分析機で
行なった。１１０℃ の共沸ＨＣＩ！中で２４時間ペプ
チドを加水分解した。ＮＦ２−末端配列決定は天然のＬ
ＣＡＴについて、試薬としてトリメチルアミン、フェニ
ルインチオシアネートおよびトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ
）を用い、標準的な気／液相配列決定機で行なった。抽
出されたアニリノチアゾリノンアミノ酸誘導体は、２５
％ＴＦＡ水溶液で自動的にフェニルチオヒダントインア
ミノ酸に変換すれ、ベック、マン・ウルトラスフイア−
・オクチル・カラム（Ｂｅｃｋｍａｎ ｕｌｔｒａｓｐ
ｈｅｒｅ ｏｃｔｙｌｃｏｌｕｍｎ）で分離された。気
／液相配列決定機または改良型ベックマン・モデル８９
０Ｂ配列決定機でトリプシンペプチドを配列決定した。 ＬＣＡＴのトリプシン消化は、０．１Ｍ）リス（ｐＨ８
，０）中０．０１％ツイーン２０を用い、３７℃で１８
時間、酵素二基質比を１：２０にして行なった。この消
化物を、ジンクローム（Ｓｙｎｃｈｒｏｍ） ＲＰ −
４カラム（４，６＋ｕ＋Ｘ １０ Ｃ１１月とかけた。 溶離溶媒は、０．１％ＴＦＡ水溶液（溶媒１）および０
．０７％ＴＦＡの１−プロパツール溶液（溶媒２）であ
る。１％の溶媒１から５０％の溶媒２までの直線勾配を
用い、スペクトラ・フィジックス（Ｓｐｅｃｔｒａ Ｐ
ｈｙｓｉｃｓ）ＳＰ８０００ＨＰＬＣを用い、流速を１
．０ａｅ／分にし、２５℃でペプチドを溶離した。この
溶離液を、ウォーターズ・アソシエーテス（Ｗａｔｅｒ
ｓＡｓｓｏｃ １ａｔｅｓＪモデル４４０吸収検知機に
よって、２１４および２８０ ｎｍにおける吸収につい
てモニターした。 実施例２ ｃＤＮＡクローニング 完全長さの１．ＣＡＴのｃＤＮＡを単離するための一般
的な方法を、実施例１で行なったヒトＬｃＡＴの制限ア
ミノ酸配列の決定から始めた（第２ａ図参照〕。本発明
者等は特に、無傷のタンパク質（ヒト血漿から単離され
るような〕のアミノ末端、およびＬＣＡＴのトリプシン
消化由来の３種の内部ペプチドフラグメントから４種類
の伸長した、有用なペプチド配列を得た。これらのペプ
チド配列のい（つかを用いて、適当な配列のための１つ
の可能なコドン選択を示す１本のオリゴヌクレオチドプ
ローブを設計し、合成した。これらのＤＮＡプローブを
用いて、我々は、ヒト成人肝臓ｆｆｌライブラリーから
外見上完全な長さのＬＣＡＴのｃＤＮＡクローンを得た
（完全な長さとは、完全なタンパク質をコードしている
、ＬＣＡＴのｍＲＮＡ部分であると本明細書中では定義
する〕。ｃＤＮＡクローンか完全ｒｊｍＲＮＡの５′お
よび３′末端を含有していないこともあるので、我々は
ｃＤＮＡクローニングに次いで、Ｌ、 ＣＡ ＴのｃＤ
ＮＡクローンの末端と重なり合うゲノム性クローンの単
離およびＤＮＡ配列決定を行なった。これにより、ＬＣ
ＡＴのｍＲＮＡの大きさおよび配列についての本発明者
等の解釈を立証することができた。 逆転写酵素を用い、既知の方法により、ヒト成人肝臓Ｒ
ＮＡから２重鎖ｃＤＮＡを調製し、Ｓ１処理した後、既
に開示されているようにして（１１）、≦ａｌＩ、Ｓｓ
ｔ ｒ 、 、Ｘｈｏ ｒおよび印改ＲＩ突出末端の制
限部位を含有する合成オリゴヌクレオチドにライゲート
した。このＤＮＡをλｇｔ １０ （Ｄ ＥｃｏＲＩ
部位に挿入した（１１．１２）。実施例１で決定したア
ミノ酸配列数個に基づいてヌクレオチドプローブを調製
し、放射性リンを用いて末端標識化した。 この操作を以下に挙げる第１表にまとめる。 ペプチド配列決定（第１列〕により、表中の唯一の１長
い′オリゴヌクレオチドプローブを合成した。実際のプ
ローブはこれらの配列の逆相補体であり、これらをＲＮ
ＡならびにＤＮＡとの雑種形成に用いることができる。 対応するＬＣＡＴのｃＤＮＡ配列をそれぞれの下段に示
した。ｃＤＮＡによってコードされているアミノ酸は、
２つの例において、ペプチドの配列決定から予想される
ものとは異なっていた〔（）で示す〕。 ｃＤＮＡ（＞５００ｂｐ）を含むλフアージライブラリ
ー（〜１．５Ｘ１０６ｐ ｆ ｕ ）を、報告（１２，
２９）のようにしてλｇｔｌＯにおいて調製した。 λｇｔｌｏにおける、オリゴＣ−ｄＴ）プライマー処理
したヒト成人肝臓ｃＤＮＡライブラリーからのファージ
約２００万を、４０個の１５ＣＩｌベトリブレートで増
殖させ、これらから３重に複製したニトロセルロースフ
ィルターを調製シた。コノフィルターを、０．７５Ｍの
ＮａＣ１，７５ｍＭクエン酸三ナトリウム、５０ｍＭリ
ン酸ナトリウム（ｐＨ６，８）５×デンハルト（Ｄｅｎ
ｈａｒｄｔ ）溶液、２０％ホルムアミド、１０％硫酸
デキストランおよび２０μｇ／Ｌｌの煮沸して超音波処
理した鮭精子ＤＮＡ中、４２℃で一晩、別々の３２ｐ−
末端標識化オリゴヌクレオチドプローブと雑種形成させ
、０．１５ＭのＮａ（Ｊ、１５ ｍ Ｍクエン酸三ナト
リウム、０．１％ＮａＤｏｄＳＯ４中、４３℃で２時間
洗浄した。極めて強く雑種形成する複製ポジ（陽性）体
１９個が、ＬＣＡＴ、４プローブと雑種形成させたフィ
ルター、ならびにＬ ＣＡ Ｔ、３プローブおよびＬＣ
ＡＴ、５プローブの両者と雑種形成させたフィルターで
観察された。 これらの同一雑種形成溶液におけるサザーンプロットは
、〜１０の独立したバンドを現わし、ノーザンプロット
は、１８Ｓより小さい雑種形５１１２ＲＮＡを現わした
。分離したプローブによる再スクリーニングに際し、取
り出したプラーク領域１９個の内、１５個はＬＣＡＴ、
４と、１２個はＬＣＡＴ、３と、そして４個はＬＣＡＴ
、１（アミノ末端タンパク質配列に基づくプローブ）と
再雑種形成した。 アミノ末端プローブと雑種形成したこの４個のファージ
は完全長さのｃＤＮＡクローンのための最良の候補であ
り、次いでプラーク精製し、ＤＮＡ配列決定により分析
した（元のクローンからのＤＮＡフラグメントでライブ
ラリーを再プローブすることによって後に回収された第
５番目のｃＤＮＡクローンと共に〕。ジデオキシ鎖成長
停止によってＤＮＡ配列決定するためＭ１３ファージベ
クターにフラグメントをサブクローンした（１３）。本
明細書の配列のすべては、両ＤＮＡ鎖の独立した分析か
ら得た。λカロン３０におけるヒトゲノム性ライブラリ
ー（１４）を、常法によってｃＤＮＡクローンの制限フ
ラグメントでスクリーニングした。 実Ｊ
【酒」ユ ＬＣＡＴのｃＤＮＡのＤＮＡ配列配列決
定されたＬＣＡＴのｃＤＮＡクローン５個の大きさ、お
よびＬＣＡＴのｍＲＮＡの推定構造を第１図に示す。Ｌ
ＣＡＴのｃＤＮＡのＤＮＡ配列およびその翻訳化配列を
第２図に示す。このＬＣＡＴのｃＤＮＡクローン５個す
べてのＤＮＡ配列は類似しており、図示したＬＣＡＴの
ｍＲＮＡの大きさ、およびボＩＪ ＬＡ）尾部の長さに
おいてのみ異なっていた。最も長いクローン２個（ｐＬ
４およびｐＬ１２，１については完全に配列決定し、一
方、ｐＬ２．１０および１９についてはＣ反応のみを行
なった。クローンｐＬ２．４．１０および１９は同じ位
置に長さの異なる（５０〜９０ｂ）ポＩＪ ｔＡ）尾部
を含有するが、ｐＬ１２はポ１月Ｎ尾部に至る後部を有
していなかった。クローンｐＬ４およびｐＬ１２は５′
末端側に最も長く延びていた。この両者は、成熟Ｌ Ｃ
ＡＴのアミノ末端配列の前にある、疎水性リーダー配列
であることが明らかな配列のためのコドンおよびメチオ
ニン開始コドンを含有し、これらのクローンは５′非翻
訳化配列の短い領域だけを含有していた。独立したクロ
ーンｐＬ４およびｐＬ１２のＤＮＡ配列は対応する〜１
．４００ ｂ ｐ全体にわたって同一であり、クローニ
ングおよび配列決定法の正しさを確認するのに有用であ
った。 ｃＤＮＡの５′ 末端は、メチオニン開始コドン、およ
びこれに連続して続くオープン・リーディング・フレー
ム（４４０アミノ酸のポリペプチドをコードしている〕
を含有する。最初の２４残基は疎水性アミノ酸の中核部
を含有し、アミノ末端分泌シグナルペプチドを表わすと
思われる。次いで、血漿から精製されたものと同じＬＣ
ＡＴタンパク質のアミン末端配列（ｐｈｅ −ｔｒｐ
−１ｅｕで始まる〕がこれに続く。この成熟タンパク質
はアミノ酸４１６個を含有し、その計算分子量は４７，
０９０である。ＬＣＡＴは、ＳＤＳポリアクリルアミド
ゲル上をＭｒ〜６３，０００ の位置に移動する糖タ
ンパク質であることが知られている。先の報告者は、炭
水化物含量が２５チであり、推定ポリペプチド分子量が
約４５，０００であると概算した（２）。翻訳されたＤ
ＮＡ配列によって４つの可能なＮ−結合グリコシル化部
位（ａｓｎ −Ｘ −ｓｅｒ、 ａｓｎ −Ｘ −ｔｈ
ｒ〕が予想される。これらの部位の内の１つ（残基２７
２）におけるグリコジル化は、ペプチドの配列決定過程
において見い出された。その他のグリコジル化可能部位
は確認されないままである。 ヌクレオチド１２−１４ （第２ａ図〕のメチオニンコ
ドンによりプレータンパク質の翻訳が開始されるものと
推定される。このＡＴＧには、真核生物性ｍＲＮＡの翻
訳開始点近くのコンセンサス配列と同様に、Ｇが続き、
３ヌクレオチド上流にはＧか先行する（３０）。我々が
特徴づけたｃＤＮＡクローンはいずれも、ｍＲＮＡの完
全す５′非翻訳比領域を含有しない。ＬＣＡＴのｃＤＮ
Ａクローン１２でプローブされたヒト肝臓ポＩ月Ａ＋＋
ＲＮ Ａ（７）ノーザン・プロット・ハイブリダイゼー
ションは、１５５０±５０塩基の雑種形成バンドを１個
だけ示す。 このことは、ＬＣＡＴのｍＲＮＡが約１００塩基の５′
非翻訳化配列を含有することを示唆する。ゲノム性クロ
ーンの分析はこの推定を支持するが、これについては後
記をこ記載する。 ｃＤＮＡクローン配列の３′末端は２３ヌクレオチドか
らなる異常に短い３′非翻訳化領域を示す。実に、通常
のポリアデニル化シグナルＡＡＴＡＡＡ にのシグナル
は真核生物性ポＩＪ ｔＡ、）部位の前に２０〜３０ヌ
クレオチドを置＜ （１９，ｌ 〕は、カルボキシ末端
グルタミン（ＧＡＡ）のコドン中、および翻訳停止コド
ンＴＡＡ 中に部分的に含有されている。 我々が分析した別個のポ１月Ａ）を含有するクローン４
個のすべては同じ部位にボＵ ｔＡ）尾部を有していた
。メーザ／プロット分析は、より長いＲＮＡ種が多数存
在することを示さず、従って、この位置がポリアデニル
化の主な部位であることを示唆した。 実施例４ ＬＣＡＴゲノム性クローンのＤＮＡ配列 ＬＣＡＴのｃＤＮＡクローンの５′末端が不完全であり
、３′末端が通常のものとは異なるので、我々はゲノム
ＤＮＡの対応する領域を単離し、分析した。ファージス
カロン３０ （１４）中のヒトゲノムＤＮＡの３ａｕ３
Ａ部分消化ライブラＩＪ−Ｆ、ｐＬ１２から単離した３
′および５′末端Ｓｓｔ Ｉフラグメントゲルでスクリ
ーニングした。雑種形成するクローン５個が回収され、
そのすべてが、制限マツピングおよび雑種形成実験によ
る決定において、完全なｃＤＮＡコード化配列を含有す
るように思われた。これらのゲノムクローンの内４の１
つから得たファージＤＮＡ、すなわちλＬ１ を、５
またはそれ以下の塩基を認識するい（つかの制限酵素で
切断し、サザーンプロットし、末端プローブで雑種形成
した。両プローブが長さ一４００ｂｐＱ〜ｕＩフラグメ
ントと雑種形成した。この範囲の大きさのＡｌｕ Ｉ消
化したλＬＩＤＮＡをゲル単離し、バクテリオファージ
Ｍ１３中にクローンした。末端ジ■Ｉプローブと雑種形
成するプラークを単離し、ジデオ牛ソ配列決定にかけ、
Ｌ ＣＡ、 ＴのｃＤＮＡの５′および３′末端と重な
り合うゲノムフラグメント配列を得た（第２ｂ図〕。 このゲノム配列は、プレタンパク質の転写を開始すると
推定されるメチオニンコドンの５′側に２６７ ｂｐに
わたって伸びている。この領域にはＡＴＧコドンは見い
出されないが、３つのリーディングフレームすべてに停
止コドンが見い出される。３′側ゲノム配列は停止コド
ンを超えて１５４ｂｐにわたって伸びており、ｃＤＮＡ
クローンから推定されるポリアデニル化部位および短い
３′非翻訳化領域の配列と一致する。その他のＡＡＴＡ
ＡＡ配列およびこのポリアデニル化シグナルの認識され
た変異体のどちらも、ｃＤＮＡクローン中のポリＡ）部
位を超えてｌ ３４ ｂｐにわたって伸びるこのゲノム
領域中には見い出されない。 実施例５ ＣＯ５−７細胞におけるクローン化ＬＣＡ
Ｔ遺伝子の発現 完全長さのＬＣＡＴのｃＤＮＡをクローンｐＬ ４およ
びｐＬｌ ２から組立て、ＳＶ４０の複製起源および初
期プロモーターを含有する発現プラスミドに挿入し、Ｌ
ＣＡＴをコードしている配列を発現させた。ｃＤＮＡク
ローンｐＬ１２を旦」ＲＩ およびＰｓｔｒで消化し
、Ｉ、ＣＡＴのｃＤＮＡの５′部分を含有する〜１００
０ｂｐフラグメントをゲル単離した。 ｃＤＮＡの３′部分を含有する、ｐＬ４の一５ｏｏｂｐ
α四ＲＩ／ｂ」Ｉフラグメントを同様にして単離した。 これら２種の７ラグメントをｐＵＣ８にュー・イングラ
ンド・バイオ・ラブダ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉ
。 ＬａｂＳ）〕のＥｃ ｏＲＩ部位にライゲートし、内部
のＰｓｔＩ部位の所で融合させて完全なＬＣＡＴコード
化領域を得た。この中間体組み換えプラスミドを腔ＲＩ
で消化し、約１５００ｂｐ のＬＣＡＴのｃＤＮＡフラ
グメントを単離した。 プラスミドｐｇＤｔｒｕｎｃＤＨＦＲ（１６） は、
ＳＶ４０の複製起源および初期プロモーターを含有し、
ｇＤタンパク質をコードしているｃＤＮＡからの単純庖
疹ウィルスｇＤタンパク質の合成、を導く。また、この
出発プラスミドは、ＤＨＦＲ遺伝子を発現させる第２の
ＳＶ４０プロモーター、ならびにＥ。 コリ中での薬物選択および複製のためのｐＭＬ （３５
）配列をも含有する。従って、このプラスミドはＥ。 コリならびに哺乳動物組織培養物細胞において増殖しう
るシャトルベクターとして働く。ｐ ｇＤ ｔｎｍｃＤ
ＨＦＲをＥｃｏＲＩ で消化し、ベクターフラグメン
トを単離した。次いで、このベクターフラグメントを単
独で単離した１５００ｂｐフラグメントにライゲートし
、このライゲーション混合物を用いてＥ、コリ２９４（
ＡＴＣＣ３１，４４６）細胞を形質転換した。 Ｔ遺伝子についてプローブした。△形成陽性のコロニー
を回収し、そのプラスミドをｐＳＶＬＣＡＴ、１と命名
した。このプラスミドを第３図に示す。 ６０朋の皿あたり１．５Ｘ１０６細胞の密度のＣＯ５７
（サル腎臓〕細胞を入れ、血清を含有しない最少イーグ
ル（Ｅａｇｌｅ、ｌ培地ですすぎ、同一培地中で、３７
℃、７０％ＣＯ２で５時間、プラスミドＩ）ＳＶＬＣＡ
Ｔ（４μｇ／Ｌｌ）オヨびＤ Ｅ Ａ Ｅ （２００ｔ
ｔ９／１ｌ）（Ｊｌ）でトランスフェクションし、血清
を含有しない増殖培地ですすぎ、血清を含有しない増殖
培地２．５ｍｅ中で６０時間増殖させた。血清を含有し
ない増殖培地とは、５〜／罰インシユリンおよび１０■
／ｒｎｌ トランスフェリンを追加した培地Ｆ−１２で
ある。上清を取り、直ちに検定した。これらの条件下で
のトランスフェクションの効率は２０％であった（ヘル
ペスｇＤ表面タンパク質を含有するプラスミドとの同時
形質転換を行い、ｇＤタンパク質を免疫螢光検定するこ
とによる〕。ＣＯ５７細胞の対照培養物を、ｐｓＶＬｃ
ＡＴ、Ｉ ＤＮＡ を含有しないことを除き、同一の
トランスフェクションおよび増殖のプロトコールにかけ
た。この時点においては、メトトレキセート選別による
ＬＣＡＴ発現の選別または増幅の試みを全く行なわなか
った（これは最大量のＬＣＡＴ発現にとって好ましいも
のではあるかっ。 既に報告されているようにして（１０）、培養物上清を
ＬＣＡＴ活性について検定した。簡単に説明すると、卵
レクチン、再精製したばかりの１，２−３Ｈ−コレステ
ロール〔二ニー・イングランド・ニューフレアー（Ｎｅ
ｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ）コおよび遊離コ
レステロール（重量比８／１）の蒸留水中懸濁液から、
フレンチ・プレツシングＣＦ ｒ ｅ ｎ ｃ ｈｐｒ
ｅｓｓｉｎｇ）によって単一壁の小胞を調製した。 コレステロールの比活性は１．２ Ｘ １０５ｄｐｒｒ
１／／μダでアッタ。小胞（１００μｆコレステロール
／ｍｌ ）ヲ、アポＡ −Ｉ Ｃ１００μダ／ｍｅ）
とともに３７℃で６０分間インキュベートした。この活
性化された小胞を、０．１５ＭのＮａＣ１，１０ｍＭ
）リス−ＨＣ１（ｐＨ７，４）中の１０％（Ｗ／Ｖ）再
結晶ヒトアルブミンの等容量と混合した。培養培地の一
部を総検定容量０．４ ｒｒｔｅに加え、混合物を３７
℃で６０分間インキュベートした。等容量のメタノール
を加えることによってこの反応を停止させ、次いで標識
化したコレステリルエステルをクロロホルムで抽出した
。このクロロホルム相の一部を、シリカゲル層に適用し
ヘキサン／ジエチルエーテル／酢酸（ｖ／ｖ／ｖ ：
８３／１６／１）で展開して分画した。コレステリルエ
ステル放射線活性ハ液体シンチレーションスペクトルに
よって測定した。活性を、時間あたりの培養培地（ｍｅ
） ｊｃついての合成コレステロールエステル量（ピ
コモル）で表わす。 ３つの独立した実験において、トランスフェクションさ
れた細胞培地中のＬＣＡＴ活性は、平均４±１．９ｐモ
ルｍｌ！−１ｈ−１（３つのトランスフエクション二６
．５．１．９および３．６ｐモルａｌ！−１ｈ’；細胞
密度は２番目の実験において多少低い〕であり、一方同
一の条件下で培養された対照細胞培地中の活性は０．５
±０．４ｐモルｒｎｌ’ｈ−１であった。 １．５ｍＭのＤＴＮＢ、すなわち既知のＩ、ＣＡ’Ｔ阻
害剤（３１）が検定培地中に含有されているとき、また
はアポＡ−Ｉが存在しないときには、培地中に活性は全
く検出されなかった。これらのデータは、プラスミドｐ
ＳＶＬＣＡ７．１によってトランスフェクションした後
に、ＬＣＡＴの培養物培地中への出現が誘起されること
、およびこの活性体がその補助因子依存性およびスルフ
ヒドリル試薬ニよる阻害の点で血漿酵素の性質を有して
いることを示している。このことは、このクローン化ｃ
ＤＮＡがＬＣＡＴをコードしており、これが組み換えＤ
ＮＡ由来の産生物としてヘテロローガスな細胞中で発現
されるということを証明す′るものである。 引用文献 １、 フィールディング等（Ｆｉｅｌｄｉｎｇ、Ｃ，Ｊ
、ａｎｄＦｉｅｌｄｉｎｇ、Ｐ、Ｅ、 ）、メデイシナ
ル・クリニックス・オブ・ノース・アメリカ（Ｍｅｄ、
Ｃ１１ｎｉｃｓ Ｈ，！ｍ−）並、３６３〜３７３（１
９８０）。 ２、チュン等（Ｃｈｕｎｇ、 Ｊ 、 、Ａｂａｎｏ
、Ｄ、Ａ、 、Ｆｌｅｓｓ 。 Ｇ、Ｍ、、ａｎｄ ５ｃａｎｕ、Ａ、Ｍ、）、ジャーナ
／Ｌ／−オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、Ｂ
ｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）、謙工、７４５６−７４６４（１
９７９）。 ３、 トイ等（Ｄｏｉ、Ｙ、ａｎｄ Ｎ１５ｈｉｄａ、
Ｔ、入ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ
ー（Ｊ。 Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ−人２５８．５８４１−５８４６（
１９８３）。 ４、 オースガ等（○ｓｕｇａ、Ｔ、ａｎｄ Ｐｏｒｔ
ｍａｎ、Ｏ，Ｗ−）。 アメリカン・ジャーナル・オプ・フイジオロジー（Ａｍ
、Ｊ、Ｐｈｙｓｉｏｌ、）、２２０．７３５−７４１（
１９７０）。 ５、パースロー等（ｄｅ Ｐａｒｓｃａｕ、Ｌ、ａｎｄ
Ｆｉｅｌｄ −ｉｎｇ、Ｐ、Ｅ、）、ジャーナル・オ
ブ・リピッド・リサーチ（Ｊ、Ｌｉｐ、Ｒｅｓ、）、
２５．７２１−７２８（１９８４，ｌ。 ６、フィールディング等（Ｆｉｅｌｄｉｎｇ、Ｃ−Ｊ−
，５ｈｏｒｅ。 Ｖ、Ｇ、ａｎｄ Ｆｉｅｌｄｉｎｇ、Ｐ、Ｅ−）、バイ
オケミカル・アンド・バイオケミカル・アンド・バイオ
フィジカル・リサーチ・コミュニケーション（Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ。 Ｂｉｏｐｈｙｓ 、Ｒｅｓ 、Ｃｏｒｒｍ、） 、４６
．１４９３−１４９８（１９７２）。 ７、 フィールディング等（Ｆｉｅｌｄｉｎｇ、Ｃ，Ｊ
、ａｎｄＦｉｅｌｄｉｎｇ、Ｐ、ＥＪ、プロシーディ
ンゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエ
ンシーズ・米国（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ
ｉ 、ＵＳＡ）、坦、３９１１−３９１４（１９８１）
。 ８、 デービス等（Ｄａｖｉｓ、Ｒ，Ａ、、Ｈａ１ｇｅ
ｒｕｄ＋Ｐ−ｔＤｕｅｌａｎｄ、Ｓ、、ａｎｄ Ｄｒｅ
ｖｏｎ＋Ｃ，Ａ−）、バイオキミカ・工・バイオロジカ
ル ｐｈｙｓ、Ａｃｔａ、Ｊ、シ醪−１４１０−４１４（１
９８２，）。 ９、 ブロムセット等（Ｇｌｏｍｓｅｔ、Ｊ、Ａ、ａｎ
ｄ Ｎｏｖｕｍ。 Ｋ、Ｒ，）、Ａｄｖ、Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ、、 １１．
１−６５（１９７３）。 １０、アｏン等（ＡｒｏｎｗＬ−ｙＪｏｎｅｓｔＳ、、
ａｎｄ Ｆｉｅｌｄｉｎｇ、Ｃ，Ｊ、）、ジャーナル・
オブ・バイオロジカル、ケミストリー（Ｊ 、 Ｂｉｏ
ｌ、Ｃｈｅｍ、）、２５３．７２２０−７２２６（１９
７８）。 １１、ウルリツチ等（ｕｌｌｒｉｃｈ、Ａ、ｅｔ ａｌ
−人ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、３０９．４１８−４
２５（１９８４）。 １２、ヒュイン等（Ｈｕｙｎｈ 、Ｔ、 、Ｙｏｕｎｇ
、Ｒ，、ａｎｄ Ｄａｖｉｓ。 Ｒ，入プラクティカル・アブローチーズ・イン・バイオ
ケミストリー（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ
ｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅ−ｍｉｓｔｒｙ） 、グロー
バー編（Ｇｒｏｖｅｒ、Ｄ、、 ＩＲＬ、０ｘｆｏｒｄ
。 １９８４）。 １３、メシング等（Ｊｖｋｓｓｉｎｇ、 Ｊ 、 、
Ｃｒｅａ、 Ｒ，、ａｎｄ ｓｅｅｂｕｒｇ。 Ｐ、Ｈ，）、ヌクレイツク・アシツズ・リサーチ（Ｎｕ
ｃｌ。 Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、）旦、３０９−３２１（１９８１
）。 １４、ウッド等ＣｗｏＯｄ、Ｗふ−ｅｔ ａｔ−）、ネ
イチャー（Ｊ’１１ａｔｕ−・ｒｅ）、■、３３０−３
３７（１９８４）。 １５、デフハルト（Ｄｅｎｈａｒｄｔ、 Ｏ−）、バイ
オケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コ
ミュニケーション（Ｂｉｏｃｈｅｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ
、 Ｒｅｓ、 Ｃａｍｕｎ 、 ）、旦、６４１−６４
６ （１９６６）。 １６、ラスキー等（’Ｌａ５ｋｙ、 Ｌ、Ａ、 ｅｔ
ａｈ）、バイオテクノロジー（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｙ）、ス、５２７−５３２（１９８４）。 】７．マクカッチャン等（ＭＣｕｔｃｈａｎ、 Ｊ 、
Ｈ，ａｎｄ ｐａｇａｎｏ。 Ｊ、）、ジャーナル・オブ・ナショナル・キャンサー・
インスチチュート（Ｊ−Ｎａｔｌ、 Ｃａｎｃｅｒ Ｉ
ｎ５ｔ、）、鮭、３５１−３５７（１９６８）。 １８、チａ７等（Ｃｈｏｎｇ、 Ｋ、Ｓ−ｔ Ｊａｈａ
ｎｉ 、Ｍ、＊ Ｈａｒａ、 Ｓ−＋ａｎｄ Ｌａｃｋ
ｏ、 Ａ、Ｇ、）、カナディアン・ジャーナ／Ｌｚ−オ
ブ・バイオケミストリー−アンド・セル・バイオロジー
（Ｃａｎ、 Ｊ 、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、 Ｃｅ１ｌ Ｂ
ｉｏｌ、 ）、６１．８７５−８８１（１９８３）。 】９．ブラウトフット等（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ、 Ｎ、
ａｎｄ Ｂｒｃｗｎｌｅｅ。 Ｇ、）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、可、３５９−３
６２（１９８１，Ｊ２０、アンダーソン等（Ａｎｄｅｒ
ｓｏｎ、 Ｓ、 ａｎｄ Ｋｉｎｇｓｔｏｎ。 １、Ｂ、）、プロシーディンゲス・オブ・ナショナル・
アカデミ−・オブ・サイエンシーズ・米国（Ｐｒｏｃ。 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ 、 ＵＳＡ）、弱、
６８３６−６８４２ （１９８３）。 ２１、ウルリツチ等（Ｕｌ １ｒｉｃｈ、 Ａ、 ｅｔ
ａｌ 、） 、ＥＭＢＯ−ジャーナル（ＥＭＢＯＪ、
、ｌ、３．３６１−３６４（１９８４）。 ２２、トイ等（Ｄｏｉ 、 Ｙ、 ａｎｄ Ｎ１５ｈｉ
ｄａ＋ ’ｒ、 ）、フェデレーション・プロシーディ
ンゲス（Ｆｅｄ、 Ｐｒｏｃ、）、観、１６９５（１９
８１）。 ２３・ プジク等（Ｐｕｊｉｋ、 Ｗ、Ｃ，、Ｖｅｒｈ
ｉ ｊ、 Ｈ，Ｍ、 ａｎｄ ｄｅＨａａｓ、 Ｇ、Ｈ
−）、バイオキミカ・工・バイオフィシ力・アクタ（Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ、 Ａｃｔａ、）、４
９２．２５４−２５９（１９７７）。 ２４、ガロ等（ｄｅ Ｃａｒｏ、 Ｊ、 ｅｔ ａｌ、
大バイオキミカ・工・バイオフィシ力・アクタ（Ｂｉｏ
ｃｈｅｒｎ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ 。 ｋｔａ、）、世、１２９−１３８（１９８１）。 ２５、アケリオド°等（Ａｋｅｒｙｏｄ、 Ｒ，ｅｔ
ａｌ、 ）、ユーロビアン・ジャーナル・オブ・バイオ
ケミストリー（Ｅｕｒ、 Ｊ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、）、
−リ」−１３８５−３９１（１９８１）。 ２６、ロアード等（Ｒｏｕａｒｄ 、 Ｍ、 ｅ ｔ
ａ １ 、） 、バイオキミカ・工・バイオロジー・ア
クタ（Ｂｉｏｃｈａｎ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ。 Ａｃｔａ、）、５町、２２７−２３５ （１９７８）。 ２７、ドチャーテイー等（ＤＯｃｈｅｒｔｙ、んＪ、Ｐ
、 ｅｔ ａｌ、）、ヌクレイツク・アシッズ・リサー
チ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、）、１３．１
８９１−１９０３（１９８５）。 詔、アルベロ等（Ａｌｂｅｒｏ ｅｔ ａｔ、）、Ｊ
、 Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎ５ｔ、 。 す、１４１−１４８（１９８１）。 ２９、ウルリッチ等（Ｕｌｌｒｉｃｈ、Ａ、、 ｅｔ
ａｌ、）、ネイチャー （Ｎａｔｕｒｅ）、３０９，４
１８−４２５（１９８４Ｊ。 ３０、コザーク（Ｋｏｚａｋ、 Ｍ、）、ヌクレイツク
・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ、 Ａｃ１ｄｓ、 Ｒ
ｅｓ、Ｊ、８ 、１２７−１４２ （１９８０）。 ３１、ストツケ等（Ｓｔｏｋｋｅ、 Ｋ、Ｔ、 ｅｔ
ａＬ） 、スヵンジナピアン・ジャーナル・オブ・クリ
ニカル・アンド・ラボラトリ−・インベスチゲーション
（Ｓｃａｎｄ、 Ｊ。 Ｃ１１ｎ、 Ｌａｂ、 Ｉｎｖｅｓｔ、）、η、２ｌ−
２７（１９７］）。 ３２、カン等（Ｋａｎ、Ｙ、部射、）、プロシーディン
ゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエン
シース・米国（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、
Ｓｃｉ、 ＵＳＡ） 、７５．５６３１−５６３５（１
９７８）。 ３３・ホトスティン等（Ｂｏｔｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ
、バ アメリカン・ジャーナルφオブ・ヒユーマン・
ゼネティックス（／’ｍ−Ｊ 、Ｆｈｍ、 Ｇｅｎｅｔ
、）、３２．３１４Ｃ１９８０）。 ３４、マニアティス等％ｎ１ａｔｉｓ ｅｔ ａＬ）
、モレキュラー・クローニング（Ｒ／ｂｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ）、１００−１０１（１９８２）。 ３５、ラスキー等（Ｌｕｓｋｙ ｅｔ ａｌ 、） 、
ネイチャー（ｌＪａｔｕｒｅ）、４覧し、 ７９（１９
８１） 。
定されたＬＣＡＴのｃＤＮＡクローン５個の大きさ、お
よびＬＣＡＴのｍＲＮＡの推定構造を第１図に示す。Ｌ
ＣＡＴのｃＤＮＡのＤＮＡ配列およびその翻訳化配列を
第２図に示す。このＬＣＡＴのｃＤＮＡクローン５個す
べてのＤＮＡ配列は類似しており、図示したＬＣＡＴの
ｍＲＮＡの大きさ、およびボＩＪ ＬＡ）尾部の長さに
おいてのみ異なっていた。最も長いクローン２個（ｐＬ
４およびｐＬ１２，１については完全に配列決定し、一
方、ｐＬ２．１０および１９についてはＣ反応のみを行
なった。クローンｐＬ２．４．１０および１９は同じ位
置に長さの異なる（５０〜９０ｂ）ポＩＪ ｔＡ）尾部
を含有するが、ｐＬ１２はポ１月Ｎ尾部に至る後部を有
していなかった。クローンｐＬ４およびｐＬ１２は５′
末端側に最も長く延びていた。この両者は、成熟Ｌ Ｃ
ＡＴのアミノ末端配列の前にある、疎水性リーダー配列
であることが明らかな配列のためのコドンおよびメチオ
ニン開始コドンを含有し、これらのクローンは５′非翻
訳化配列の短い領域だけを含有していた。独立したクロ
ーンｐＬ４およびｐＬ１２のＤＮＡ配列は対応する〜１
．４００ ｂ ｐ全体にわたって同一であり、クローニ
ングおよび配列決定法の正しさを確認するのに有用であ
った。 ｃＤＮＡの５′ 末端は、メチオニン開始コドン、およ
びこれに連続して続くオープン・リーディング・フレー
ム（４４０アミノ酸のポリペプチドをコードしている〕
を含有する。最初の２４残基は疎水性アミノ酸の中核部
を含有し、アミノ末端分泌シグナルペプチドを表わすと
思われる。次いで、血漿から精製されたものと同じＬＣ
ＡＴタンパク質のアミン末端配列（ｐｈｅ −ｔｒｐ
−１ｅｕで始まる〕がこれに続く。この成熟タンパク質
はアミノ酸４１６個を含有し、その計算分子量は４７，
０９０である。ＬＣＡＴは、ＳＤＳポリアクリルアミド
ゲル上をＭｒ〜６３，０００ の位置に移動する糖タ
ンパク質であることが知られている。先の報告者は、炭
水化物含量が２５チであり、推定ポリペプチド分子量が
約４５，０００であると概算した（２）。翻訳されたＤ
ＮＡ配列によって４つの可能なＮ−結合グリコシル化部
位（ａｓｎ −Ｘ −ｓｅｒ、 ａｓｎ −Ｘ −ｔｈ
ｒ〕が予想される。これらの部位の内の１つ（残基２７
２）におけるグリコジル化は、ペプチドの配列決定過程
において見い出された。その他のグリコジル化可能部位
は確認されないままである。 ヌクレオチド１２−１４ （第２ａ図〕のメチオニンコ
ドンによりプレータンパク質の翻訳が開始されるものと
推定される。このＡＴＧには、真核生物性ｍＲＮＡの翻
訳開始点近くのコンセンサス配列と同様に、Ｇが続き、
３ヌクレオチド上流にはＧか先行する（３０）。我々が
特徴づけたｃＤＮＡクローンはいずれも、ｍＲＮＡの完
全す５′非翻訳比領域を含有しない。ＬＣＡＴのｃＤＮ
Ａクローン１２でプローブされたヒト肝臓ポＩ月Ａ＋＋
ＲＮ Ａ（７）ノーザン・プロット・ハイブリダイゼー
ションは、１５５０±５０塩基の雑種形成バンドを１個
だけ示す。 このことは、ＬＣＡＴのｍＲＮＡが約１００塩基の５′
非翻訳化配列を含有することを示唆する。ゲノム性クロ
ーンの分析はこの推定を支持するが、これについては後
記をこ記載する。 ｃＤＮＡクローン配列の３′末端は２３ヌクレオチドか
らなる異常に短い３′非翻訳化領域を示す。実に、通常
のポリアデニル化シグナルＡＡＴＡＡＡ にのシグナル
は真核生物性ポＩＪ ｔＡ、）部位の前に２０〜３０ヌ
クレオチドを置＜ （１９，ｌ 〕は、カルボキシ末端
グルタミン（ＧＡＡ）のコドン中、および翻訳停止コド
ンＴＡＡ 中に部分的に含有されている。 我々が分析した別個のポ１月Ａ）を含有するクローン４
個のすべては同じ部位にボＵ ｔＡ）尾部を有していた
。メーザ／プロット分析は、より長いＲＮＡ種が多数存
在することを示さず、従って、この位置がポリアデニル
化の主な部位であることを示唆した。 実施例４ ＬＣＡＴゲノム性クローンのＤＮＡ配列 ＬＣＡＴのｃＤＮＡクローンの５′末端が不完全であり
、３′末端が通常のものとは異なるので、我々はゲノム
ＤＮＡの対応する領域を単離し、分析した。ファージス
カロン３０ （１４）中のヒトゲノムＤＮＡの３ａｕ３
Ａ部分消化ライブラＩＪ−Ｆ、ｐＬ１２から単離した３
′および５′末端Ｓｓｔ Ｉフラグメントゲルでスクリ
ーニングした。雑種形成するクローン５個が回収され、
そのすべてが、制限マツピングおよび雑種形成実験によ
る決定において、完全なｃＤＮＡコード化配列を含有す
るように思われた。これらのゲノムクローンの内４の１
つから得たファージＤＮＡ、すなわちλＬ１ を、５
またはそれ以下の塩基を認識するい（つかの制限酵素で
切断し、サザーンプロットし、末端プローブで雑種形成
した。両プローブが長さ一４００ｂｐＱ〜ｕＩフラグメ
ントと雑種形成した。この範囲の大きさのＡｌｕ Ｉ消
化したλＬＩＤＮＡをゲル単離し、バクテリオファージ
Ｍ１３中にクローンした。末端ジ■Ｉプローブと雑種形
成するプラークを単離し、ジデオ牛ソ配列決定にかけ、
Ｌ ＣＡ、 ＴのｃＤＮＡの５′および３′末端と重な
り合うゲノムフラグメント配列を得た（第２ｂ図〕。 このゲノム配列は、プレタンパク質の転写を開始すると
推定されるメチオニンコドンの５′側に２６７ ｂｐに
わたって伸びている。この領域にはＡＴＧコドンは見い
出されないが、３つのリーディングフレームすべてに停
止コドンが見い出される。３′側ゲノム配列は停止コド
ンを超えて１５４ｂｐにわたって伸びており、ｃＤＮＡ
クローンから推定されるポリアデニル化部位および短い
３′非翻訳化領域の配列と一致する。その他のＡＡＴＡ
ＡＡ配列およびこのポリアデニル化シグナルの認識され
た変異体のどちらも、ｃＤＮＡクローン中のポリＡ）部
位を超えてｌ ３４ ｂｐにわたって伸びるこのゲノム
領域中には見い出されない。 実施例５ ＣＯ５−７細胞におけるクローン化ＬＣＡ
Ｔ遺伝子の発現 完全長さのＬＣＡＴのｃＤＮＡをクローンｐＬ ４およ
びｐＬｌ ２から組立て、ＳＶ４０の複製起源および初
期プロモーターを含有する発現プラスミドに挿入し、Ｌ
ＣＡＴをコードしている配列を発現させた。ｃＤＮＡク
ローンｐＬ１２を旦」ＲＩ およびＰｓｔｒで消化し
、Ｉ、ＣＡＴのｃＤＮＡの５′部分を含有する〜１００
０ｂｐフラグメントをゲル単離した。 ｃＤＮＡの３′部分を含有する、ｐＬ４の一５ｏｏｂｐ
α四ＲＩ／ｂ」Ｉフラグメントを同様にして単離した。 これら２種の７ラグメントをｐＵＣ８にュー・イングラ
ンド・バイオ・ラブダ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉ
。 ＬａｂＳ）〕のＥｃ ｏＲＩ部位にライゲートし、内部
のＰｓｔＩ部位の所で融合させて完全なＬＣＡＴコード
化領域を得た。この中間体組み換えプラスミドを腔ＲＩ
で消化し、約１５００ｂｐ のＬＣＡＴのｃＤＮＡフラ
グメントを単離した。 プラスミドｐｇＤｔｒｕｎｃＤＨＦＲ（１６） は、
ＳＶ４０の複製起源および初期プロモーターを含有し、
ｇＤタンパク質をコードしているｃＤＮＡからの単純庖
疹ウィルスｇＤタンパク質の合成、を導く。また、この
出発プラスミドは、ＤＨＦＲ遺伝子を発現させる第２の
ＳＶ４０プロモーター、ならびにＥ。 コリ中での薬物選択および複製のためのｐＭＬ （３５
）配列をも含有する。従って、このプラスミドはＥ。 コリならびに哺乳動物組織培養物細胞において増殖しう
るシャトルベクターとして働く。ｐ ｇＤ ｔｎｍｃＤ
ＨＦＲをＥｃｏＲＩ で消化し、ベクターフラグメン
トを単離した。次いで、このベクターフラグメントを単
独で単離した１５００ｂｐフラグメントにライゲートし
、このライゲーション混合物を用いてＥ、コリ２９４（
ＡＴＣＣ３１，４４６）細胞を形質転換した。 Ｔ遺伝子についてプローブした。△形成陽性のコロニー
を回収し、そのプラスミドをｐＳＶＬＣＡＴ、１と命名
した。このプラスミドを第３図に示す。 ６０朋の皿あたり１．５Ｘ１０６細胞の密度のＣＯ５７
（サル腎臓〕細胞を入れ、血清を含有しない最少イーグ
ル（Ｅａｇｌｅ、ｌ培地ですすぎ、同一培地中で、３７
℃、７０％ＣＯ２で５時間、プラスミドＩ）ＳＶＬＣＡ
Ｔ（４μｇ／Ｌｌ）オヨびＤ Ｅ Ａ Ｅ （２００ｔ
ｔ９／１ｌ）（Ｊｌ）でトランスフェクションし、血清
を含有しない増殖培地ですすぎ、血清を含有しない増殖
培地２．５ｍｅ中で６０時間増殖させた。血清を含有し
ない増殖培地とは、５〜／罰インシユリンおよび１０■
／ｒｎｌ トランスフェリンを追加した培地Ｆ−１２で
ある。上清を取り、直ちに検定した。これらの条件下で
のトランスフェクションの効率は２０％であった（ヘル
ペスｇＤ表面タンパク質を含有するプラスミドとの同時
形質転換を行い、ｇＤタンパク質を免疫螢光検定するこ
とによる〕。ＣＯ５７細胞の対照培養物を、ｐｓＶＬｃ
ＡＴ、Ｉ ＤＮＡ を含有しないことを除き、同一の
トランスフェクションおよび増殖のプロトコールにかけ
た。この時点においては、メトトレキセート選別による
ＬＣＡＴ発現の選別または増幅の試みを全く行なわなか
った（これは最大量のＬＣＡＴ発現にとって好ましいも
のではあるかっ。 既に報告されているようにして（１０）、培養物上清を
ＬＣＡＴ活性について検定した。簡単に説明すると、卵
レクチン、再精製したばかりの１，２−３Ｈ−コレステ
ロール〔二ニー・イングランド・ニューフレアー（Ｎｅ
ｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ）コおよび遊離コ
レステロール（重量比８／１）の蒸留水中懸濁液から、
フレンチ・プレツシングＣＦ ｒ ｅ ｎ ｃ ｈｐｒ
ｅｓｓｉｎｇ）によって単一壁の小胞を調製した。 コレステロールの比活性は１．２ Ｘ １０５ｄｐｒｒ
１／／μダでアッタ。小胞（１００μｆコレステロール
／ｍｌ ）ヲ、アポＡ −Ｉ Ｃ１００μダ／ｍｅ）
とともに３７℃で６０分間インキュベートした。この活
性化された小胞を、０．１５ＭのＮａＣ１，１０ｍＭ
）リス−ＨＣ１（ｐＨ７，４）中の１０％（Ｗ／Ｖ）再
結晶ヒトアルブミンの等容量と混合した。培養培地の一
部を総検定容量０．４ ｒｒｔｅに加え、混合物を３７
℃で６０分間インキュベートした。等容量のメタノール
を加えることによってこの反応を停止させ、次いで標識
化したコレステリルエステルをクロロホルムで抽出した
。このクロロホルム相の一部を、シリカゲル層に適用し
ヘキサン／ジエチルエーテル／酢酸（ｖ／ｖ／ｖ ：
８３／１６／１）で展開して分画した。コレステリルエ
ステル放射線活性ハ液体シンチレーションスペクトルに
よって測定した。活性を、時間あたりの培養培地（ｍｅ
） ｊｃついての合成コレステロールエステル量（ピ
コモル）で表わす。 ３つの独立した実験において、トランスフェクションさ
れた細胞培地中のＬＣＡＴ活性は、平均４±１．９ｐモ
ルｍｌ！−１ｈ−１（３つのトランスフエクション二６
．５．１．９および３．６ｐモルａｌ！−１ｈ’；細胞
密度は２番目の実験において多少低い〕であり、一方同
一の条件下で培養された対照細胞培地中の活性は０．５
±０．４ｐモルｒｎｌ’ｈ−１であった。 １．５ｍＭのＤＴＮＢ、すなわち既知のＩ、ＣＡ’Ｔ阻
害剤（３１）が検定培地中に含有されているとき、また
はアポＡ−Ｉが存在しないときには、培地中に活性は全
く検出されなかった。これらのデータは、プラスミドｐ
ＳＶＬＣＡ７．１によってトランスフェクションした後
に、ＬＣＡＴの培養物培地中への出現が誘起されること
、およびこの活性体がその補助因子依存性およびスルフ
ヒドリル試薬ニよる阻害の点で血漿酵素の性質を有して
いることを示している。このことは、このクローン化ｃ
ＤＮＡがＬＣＡＴをコードしており、これが組み換えＤ
ＮＡ由来の産生物としてヘテロローガスな細胞中で発現
されるということを証明す′るものである。 引用文献 １、 フィールディング等（Ｆｉｅｌｄｉｎｇ、Ｃ，Ｊ
、ａｎｄＦｉｅｌｄｉｎｇ、Ｐ、Ｅ、 ）、メデイシナ
ル・クリニックス・オブ・ノース・アメリカ（Ｍｅｄ、
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バー編（Ｇｒｏｖｅｒ、Ｄ、、 ＩＲＬ、０ｘｆｏｒｄ
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６２（１９８１，Ｊ２０、アンダーソン等（Ａｎｄｅｒ
ｓｏｎ、 Ｓ、 ａｎｄ Ｋｉｎｇｓｔｏｎ。 １、Ｂ、）、プロシーディンゲス・オブ・ナショナル・
アカデミ−・オブ・サイエンシーズ・米国（Ｐｒｏｃ。 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ 、 ＵＳＡ）、弱、
６８３６−６８４２ （１９８３）。 ２１、ウルリツチ等（Ｕｌ １ｒｉｃｈ、 Ａ、 ｅｔ
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、ｌ、３．３６１−３６４（１９８４）。 ２２、トイ等（Ｄｏｉ 、 Ｙ、 ａｎｄ Ｎ１５ｈｉ
ｄａ＋ ’ｒ、 ）、フェデレーション・プロシーディ
ンゲス（Ｆｅｄ、 Ｐｒｏｃ、）、観、１６９５（１９
８１）。 ２３・ プジク等（Ｐｕｊｉｋ、 Ｗ、Ｃ，、Ｖｅｒｈ
ｉ ｊ、 Ｈ，Ｍ、 ａｎｄ ｄｅＨａａｓ、 Ｇ、Ｈ
−）、バイオキミカ・工・バイオフィシ力・アクタ（Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ、 Ａｃｔａ、）、４
９２．２５４−２５９（１９７７）。 ２４、ガロ等（ｄｅ Ｃａｒｏ、 Ｊ、 ｅｔ ａｌ、
大バイオキミカ・工・バイオフィシ力・アクタ（Ｂｉｏ
ｃｈｅｒｎ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ 。 ｋｔａ、）、世、１２９−１３８（１９８１）。 ２５、アケリオド°等（Ａｋｅｒｙｏｄ、 Ｒ，ｅｔ
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クタ（Ｂｉｏｃｈａｎ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ。 Ａｃｔａ、）、５町、２２７−２３５ （１９７８）。 ２７、ドチャーテイー等（ＤＯｃｈｅｒｔｙ、んＪ、Ｐ
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チ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、）、１３．１
８９１−１９０３（１９８５）。 詔、アルベロ等（Ａｌｂｅｒｏ ｅｔ ａｔ、）、Ｊ
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・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ、 Ａｃ１ｄｓ、 Ｒ
ｅｓ、Ｊ、８ 、１２７−１４２ （１９８０）。 ３１、ストツケ等（Ｓｔｏｋｋｅ、 Ｋ、Ｔ、 ｅｔ
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ニカル・アンド・ラボラトリ−・インベスチゲーション
（Ｓｃａｎｄ、 Ｊ。 Ｃ１１ｎ、 Ｌａｂ、 Ｉｎｖｅｓｔ、）、η、２ｌ−
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ゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエン
シース・米国（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、
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ゼネティックス（／’ｍ−Ｊ 、Ｆｈｍ、 Ｇｅｎｅｔ
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、モレキュラー・クローニング（Ｒ／ｂｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ）、１００−１０１（１９８２）。 ３５、ラスキー等（Ｌｕｓｋｙ ｅｔ ａｌ 、） 、
ネイチャー（ｌＪａｔｕｒｅ）、４覧し、 ７９（１９
８１） 。
第１図は、ヒト・レシチン−コレステロールアシルトラ
ンスフェラーゼ（ヒトＬＣＡＴ）のｒｒＲＮＡ。 ｃＤＮＡクローンおよびゲノム性クローンの位置、およ
び制限酵素部位を示す模式図であり、第２図のａは、天
然のヒトＬｃＡＴのｃＤＮＡをコードしているｃＤＮＡ
のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す模式図で
あり、第２図のｂは、それぞれｃＤＮＡの５′および３
′末端と重なり合うバタテリオファージ・ラムダクロー
ン由来のゲノム性配列を示す模式図であり、第３図は、
ＬＣＡＴの発現ベクターｐｓＶＬｃＡＴ、１の制限部位
および機能地図を示す模式図である。 第２図 ち′フランキンクネ・よひ゛゛非＠訳 １０１ ＣＡＧＧＣＣＣＡＧＡ ＧＣＣＧＧＣＴＣ
ＣＣＴＧＡＧＧＣＴＧＴＧ ＣＣＣＣｍＣＣＧ Ｇ
ＣＡＡＴＣ丁ＣＴＧ２０１ ＴＣＣＣＡＣＴＣＣＣＡＣ
ＡＣＣＡＧＡＴＡ ＡＧＧＡＣＡＧＣＣＣＡＧＴＧＣＣ
ＧＣＴＴ ＴＣＴＣＴＧＧＣＡＧ３′７ラソ＋〉グネ゛
よン非餉１択 １３９４ ＴＡＧＡＧＴＣＣＣＡ ＣＡＣＴＡＧＧＴ
Ｔｒ ＣＡＣＴＣＣＴＣＡＣＣＡＧＣＣＡＣＡＧＧ Ｃ
ＴＣＡＧＴＧＣＴＩ（ｂ）
ンスフェラーゼ（ヒトＬＣＡＴ）のｒｒＲＮＡ。 ｃＤＮＡクローンおよびゲノム性クローンの位置、およ
び制限酵素部位を示す模式図であり、第２図のａは、天
然のヒトＬｃＡＴのｃＤＮＡをコードしているｃＤＮＡ
のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す模式図で
あり、第２図のｂは、それぞれｃＤＮＡの５′および３
′末端と重なり合うバタテリオファージ・ラムダクロー
ン由来のゲノム性配列を示す模式図であり、第３図は、
ＬＣＡＴの発現ベクターｐｓＶＬｃＡＴ、１の制限部位
および機能地図を示す模式図である。 第２図 ち′フランキンクネ・よひ゛゛非＠訳 １０１ ＣＡＧＧＣＣＣＡＧＡ ＧＣＣＧＧＣＴＣ
ＣＣＴＧＡＧＧＣＴＧＴＧ ＣＣＣＣｍＣＣＧ Ｇ
ＣＡＡＴＣ丁ＣＴＧ２０１ ＴＣＣＣＡＣＴＣＣＣＡＣ
ＡＣＣＡＧＡＴＡ ＡＧＧＡＣＡＧＣＣＣＡＧＴＧＣＣ
ＧＣＴＴ ＴＣＴＣＴＧＧＣＡＧ３′７ラソ＋〉グネ゛
よン非餉１択 １３９４ ＴＡＧＡＧＴＣＣＣＡ ＣＡＣＴＡＧＧＴ
Ｔｒ ＣＡＣＴＣＣＴＣＡＣＣＡＧＣＣＡＣＡＧＧ Ｃ
ＴＣＡＧＴＧＣＴＩ（ｂ）
Claims (41)
- （１）レシチン−コレステロールアシルトランスフェラ
ーゼを製造するための方法であつて、 ａ）レシチン−コレステロールアシルトランスフェラー
ゼをコードしている核酸を含有するベクターを作成し、 ｂ）該ベクターで宿主細胞培養物を形質転換することか
らなる方法。 - （２）第（１）項記載の製造方法であつて、ｃ）工程ｂ
）で得た形質転換体を培養して培養物中にレシチン−コ
レステロールアシルトランスフェラーゼを蓄積させ、 ｄ）該培養物からレシチン−コレステロールアシルトラ
ンスフェラーゼを回収することをさらに含有してなる方
法。 - （３）宿主細胞がヒト以外の高等真核細胞であり、核酸
がヒト・レシチン−コレステロールアシルトランスフェ
ラーゼをコードするものである第（１）項記載の方法。 - （４）宿主細胞がＣｏｓ７サル腎細胞である第（３）項
記載の方法。 - （５）レシチン、コレステロールアシルトランスフェラ
ーゼをコードしている核酸がプロモーターの転写制御下
にあるものである第（２）項記載の方法。 - （６）プロモーターがウィルス性プロモーターである第
（５）項記載の方法。 - （７）ベクターが表現型選択遺伝子を含有するものであ
る第（１）項記載の方法。 - （８）宿主細胞が原核生物または真核微生物である第（
１）項記載の方法。 - （９）宿主細胞が、炭素源としてコレステロールを利用
することができる原核生物または真核微生物である第（
１）項記載の方法。 - （１０）宿主細胞をコレステロール含有培地で培養する
第（１）項記載の方法。 - （１１）レシチン−コレステロールアシルトランスフェ
ラーゼをコードしている核酸が、宿主細胞によつて認識
される分泌シグナル配列をコードしている核酸に対して
適切なリーディング・フレーム内に５′ライゲートされ
ているものである第（１）項記載の方法。 - （１２）分泌シグナル配列がウィルス性シグナルである
か、または宿主細胞に対してホモローガスである第（１
）項記載の方法。 - （１３）レシチン−コレステロールアシルトランスフェ
ラーゼをコードしている核酸を含有する組成物であつて
、レシチン−コレステロールアシルトランスフェラーゼ
をコードしている核酸の供給源たる動物種のその他のタ
ンパク質をコードしている核酸を全く含有しない組成物
。 - （１４）レシチン−コレステロールアシルトランスフェ
ラーゼをコードしているＤＮＡであつて、イントロンを
含有しないＤＮＡ。 - （１５）レシチン−コレステロールアシルトランスフェ
ラーゼをコードしているＤＮＡであつて、レシチン−コ
レステロールアシルトランスフェラーゼをコードしてい
るＤＮＡの供給源たる動物種のその他のタンパク質をコ
ードしている５′あるいは３′フランキング領域を全く
含有しないＤＮＡ。 - （１６）核酸が、複製しうるベクターをさらに含有する
ものである第（１３）項記載の組成物。 - （１７）複製しうるベクターをさらに含有する第（１４
）項記載のＤＮＡ。 - （１８）レシチン−コレステロールアシルトランスフェ
ラーゼをコードしている核酸の転写を制御するためのプ
ロモーターをさらに含有する第（１６）項記載のベクタ
ー。 - （１９）プロモーターがウィルス性プロモーターである
第（１８）項記載のベクター。 - （２０）転写エンハンサーをさらに含有する第（１６）
項記載のベクター。 - （２１）レシチン−コレステロールアシルトランスフェ
ラーゼをコードしているゲノムＤＮＡあるいはｍＲＮＡ
ではない第（１６）項記載の核酸と雑種化しうる核酸。 - （２２）レシチン−コレステロールアシルトランスフェ
ラーゼをコードしている複製可能なベクターで形質転換
した宿主細胞。 - （２３）レシチン−コレステロールアシルトランスフェ
ラーゼを発現する第（２２）項記載の宿主細胞。 - （２４）レシチン−コレステロールアシルトランスフェ
ラーゼを分泌する第（２３）項記載の宿主細胞。 - （２５）原核生物または高等真核生物である第（２２）
項記載の宿主細胞。 - （２６）ホモローガスではないレシチン−コレステロー
ルアシルトランスフェラーゼを含有する細胞培養物。 - （２７）レシチン−コレステロールアシルトランスフェ
ラーゼが細胞内にある第（２６）項記載の細胞培養物。 - （２８）アミノ酸配列： 【アミノ酸配列があります】 で示される完全なレシチン−コレステロールアシルトラ
ンスフェラーゼのアミノ酸配列を有し、アミノ酸が挿入
、削除あるいは置換されているレシチン−コレステロー
ルアシルトランスフェラーゼ。 - （２９）レシチン−コレステロールアシルトランスフェ
ラーゼの前配列がＰｈｅ＿１のＮ末端に挿入されており
、かつレシチン−コレステロールアシルトランスフェラ
ーゼが細胞を含んでいないものである第（２８）項記載
のレシチン−コレステロールアシルトランスフェラーゼ
。 - （３０）【アミノ酸配列があります】レシチン−コレス
テロールアシルトランスフェラーゼ、 【アミノ酸配列があります】レシチン−コレステロール
アシルトランスフェラーゼ、 【アミノ酸配列があります】レシチン−コレステロール
アシルトランスフェラーゼ、 【アミノ酸配列があります】レシチン−コレステロール
アシルトランスフェラーゼ、 【アミノ酸配列があります】レシチン−コレステロール
アシルトランスフェラーゼ、 【アミノ酸配列があります】レシチン−コレステロール
アシルトランスフェラーゼ、 【アミノ酸配列があります】レシチン−コレステロール
アシルトランスフェラーゼ、 【アミノ酸配列があります】レシチン−コレステロール
アシルトランスフェラーゼ、 【アミノ酸配列があります】レシチン−コレステロール
アシルトランスフェラーゼ、 【アミノ酸配列があります】レシチン−コレステロール
アシルトランスフェラーゼ、 【アミノ酸配列があります】レシチン−コレステロール
アシルトランスフェラーゼ、 【アミノ酸配列があります】レシチン−コレステロール
アシルトランスフェラーゼ、 【アミノ酸配列があります】レシチン−コレステロール
アシルトランスフェラーゼ、 【アミノ酸配列があります】レシチン−コレステロール
アシルトランスフェラーゼ、 【アミノ酸配列があります】レシチン−コレステロール
アシルトランスフェラーゼ、 【アミノ酸配列があります】レシチン−コレステロール
アシルトランスフェラーゼ、 【アミノ酸配列があります】レシチン−コレステロール
アシルトランスフェラーゼ、 【アミノ酸配列があります】レシチン−コレステロール
アシルトランスフェラーゼ、 【アミノ酸配列があります】レシチン−コレステロール
アシルトランスフェラーゼ、 【アミノ酸配列があります】レシチン−コレステロール
アシルトランスフェラーゼ、 【アミノ酸配列があります】レシチン−コレステロール
アシルトランスフェラーゼ、 【アミノ酸配列があります】レシチン−コレステロール
アシルトランスフェラーゼ、 【アミノ酸配列があります】レシチン−コレステロール
アシルトランスフェラーゼ、または【アミノ酸配列があ
ります】レシチン−コレステロールアシルトランスフェ
ラーゼである第６項記載のレシチン−コレステロールア
シルトランスフェラーゼ。 - （３１）アルギニンあるいはリジン残基が、削除されて
いるかまたはアルギニンあるいはリジン以外の他の残基
で置換されている第（２８）項記載のレシチン−コレス
テロールアシルトランスフェラーゼ。 - （３２）プロリン残基がアルギニンあるいはリジン残基
の下流に隣接して挿入されている第（２８）項記載のレ
シチン−コレステロールアシルトランスフェラーゼ。 - （３３）システイン残基が、削除されているかまたは他
の残基で置換されている第（２８）項記載のレシチン−
コレステロールアシルトランスフェラーゼ。 - （３４）置換された残基がＴｒｐ、ＨｉｓまたはＧｌｎ
である第（３１）項記載のレシチン−コレステロールア
シルトランスフェラーゼ。 - （３５）グリコシル化部位が不活性化されている第（２
８）項記載のレシチン−コレステロールアシルトランス
フェラーゼ。 - （３６）置換、挿入または削除が、残基約１１４および
２５６を含め、その間の位置で為されている第（２８）
項記載のレシチン−コレステロールアシルトランスフェ
ラーゼ。 - （３７）置換、挿入または削除が、残基約３６２および
４１６を含め、その間の位置で為されている第（２８）
項記載のレシチン−コレステロールアシルトランスフェ
ラーゼ。 - （３８）レシチン−コレステロールアシルトランスフェ
ラーゼに関連する核酸プローブに結合しうるフラグメン
トの決定方法であつて、ＤＮＡの被験試料を制限酵素で
消化してＤＮＡフラグメント群を作成し、どのフラグメ
ントが該プローブと結合しうるかを決定することからな
る方法。 - （３９）核酸プローブが、レシチン−コレステロールア
シルトランスフェラーゼ構造遺伝子の一部であるか、ま
たはレシチン−コレステロールアシルトランスフェラー
ゼ遺伝子に接している約５０００ｂｐの範囲内にある第
（３８）項記載の方法。 - （４０）プローブが約１０〜５０ヌクレオチドの長さで
ある第（３８）項記載の方法。 - （４１）レシチン−コレステロールアシルトランスフェ
ラーゼに関連する核酸のフラグメントであつて予め決定
し、標識化したフラグメント。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/796,473 US5049488A (en) | 1985-11-08 | 1985-11-08 | Method and nucleic acid for the preparation of lecithin:cholesterol acyltransferase |
| US796473 | 1985-11-08 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62111682A true JPS62111682A (ja) | 1987-05-22 |
Family
ID=25168273
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61266493A Pending JPS62111682A (ja) | 1985-11-08 | 1986-11-07 | レシチン−コレステロ−ルアシルトランスフエラ−ゼの製造方法およびその製造用核酸 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5049488A (ja) |
| EP (1) | EP0222591B1 (ja) |
| JP (1) | JPS62111682A (ja) |
| AT (1) | ATE86662T1 (ja) |
| DE (1) | DE3687948T2 (ja) |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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