JPH07101994A - Ｎ−リポコルチンポリペプチドおよびその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 少なくとも１種のヒトリポコルチンを製造す
るためのＤＮＡ配列、組換ＤＮＡ分子および方法を得
る。さらに詳細には、少なくとも１種のヒトリポコルチ
ン様ポリペプチドをコードすることを特徴とするＤＮＡ
配列および組換ＤＮＡ分子に関するものであり、従っ
て、これら配列により形質転換された宿主を本発明の方
法に使用して、本発明のヒトリポコルチン様ポリペプチ
ドを製造する。 【構成】 本発明のＤＮＡ配列は、λＬＣおよびλＮＬ
ｉｐｏ２１−２のｃＤＮＡ挿入物、これらｃＤＮＡ挿入
物にハイブリッド化しかつ発現に際しヒトリポコルチン
様ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、および前記Ｄ
ＮＡ配列のいずれかにより発現に際しコードされたポリ
ペプチドを発現に際しコードするＤＮＡ配列よりなる群
から選択される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の技術分野】本発明は、少なくとも１種のヒトリ
ポコルチンを製造するためのＤＮＡ配列、組換ＤＮＡ分
子および方法に関するものである。リポコルチンはホス
ホリファーゼ抑制蛋白とも呼ばれる。本出願人は米国特
許出願第７１２，３７６号および第６９０，１４６号明
細書において、リポコルチンを意味するためにホスホリ
ファーゼ抑制蛋白という用語を使用した。さらに詳細に
は、本発明は、少なくとも１種のヒトリポコルチン様ポ
リペプチドをコードすることを特徴とするＤＮＡ配列お
よび組換ＤＮＡ分子に関するものである。従って、これ
ら配列により形質転換された宿主を本発明の方法に使用
して、本発明のヒトリポコルチン様ポリペプチドを製造
することができる。これらのポリペプチドは抗炎症活性
を有し、かつ関節炎、アレルギー症、皮膚病、眼病およ
び膠原病の治療に有用である。

【０００２】

【発明の背景】アラキドン酸は、炎症反応に関与するた
とえばプロスタグランジン、ヒドロキシ酸およびロイコ
トリンのような化合物を合成する際の先駆体となる不飽
和脂肪酸である。これは、ホスホリパーゼＡ_２活性によ
って膜の燐脂質から放出される。たとえば、グルココル
チコイドのような抗炎症剤に反応して、ある種の細胞は
インビトロにおいてホスホリパーゼＡ_２を抑制する能力
を特徴とする蛋白を放出する。従って、アラキドン酸の
生成を抑制することにより、リポコルチンはプロスタグ
ランジンおよびその他の炎症性物質の合成を阻止し、か
くして炎症を低下させる〔Ｆ．ヒラタ等、「グルココル
チコイドにより誘発されたウサギ好中球におけるホスホ
リパーゼＡ_２抑制蛋白」、プロシーディング・ナショナ
ル・アカデミー・サイエンス・ＵＳＡ、第７７巻、第５
号、第２５３３〜２５３６頁（１９８０）〕。

【０００３】今日まで、数種のホスホリパーゼＡ_２抑制
蛋白が研究されている。それらの１種（すなわち、リポ
モジュリン）は分子量約４０，０００の蛋白として特性
化されており、これは恐らく細胞中のプロテアーゼによ
り分解されて分子量約３０，０００および１５，０００
の２種の小さい活性物質となる〔Ｆ．ヒラタ等、「リポ
モジュリンに対する放射線免疫分析による数種のホスホ
リパーゼ抑制蛋白の同定」、バイオケミカル・バイオフ
ィジカル・リサーチ・コミュニケーション、第１０９
巻、第１号、第２２３〜２３０頁（１９８２）〕、他の
実験的証明は、他の２種のホスホリパーゼＡ_２抑制物
質、すなわちマクロコルチン（分子量約１５，０００）
およびレノコルチン（それぞれ分子量約１５，０００お
よび３０，０００の２種類）も、たとえばリポモジュリ
ンのような大型抑制蛋白の分解生成物であり得ることを
示唆している〔Ｊ．Ｆ．クロイクス等、「レノコルチン
の特性化および部分精製：グルココルチコイドの抗ホス
ホリパーゼ様作用を生ぜしめる腎細胞で生成される２種
のポリペプチド」、ブリティッシュ・ジャーナル・ファ
ーマコロジー、第７９巻、第３１３〜３２１頁（１９８
３）；Ｇ．Ｊ．ブラックウェル等、「マクロコルチン：
グルココルチコイドの抗ホスホリパーゼ作用を生ぜしめ
るポリペプチド」、ネイチャー、第２８７巻、第１４７
〜１４９頁（１９８０）〕。

【０００４】リポモジュリンはウサギの好中球から、マ
クロコルチンはラットのマクロファージから、またレノ
コルチンはラットの腎髄質の間質細胞からそれぞれ単離
されているが、これら３種の蛋白は同様な生物学的活性
を示し、同様な分子量を有すると共に、リポモジュリン
もしくはマクロコルチンに対するモノクローナル抗体と
の交差反応性を示す。さらに、これらは全てグルココル
チコイドによって誘発される。従って、これらのホスホ
リパーゼ抑制蛋白、すなわちリポコルチンは互いに近縁
であって、ステロイド作用の一般的な物理学的メカニズ
ムとして細胞により生産されることが示唆されている
〔Ｂ．ロスフート等、「グルココルチコイド誘発の抗ホ
スホリパーゼ蛋白、「ノコルチンの特性化」、バイオケ
ミカル・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーシ
ョン、第１１７巻、第３号、第８７８〜８８４頁（１９
８３）〕。

【０００５】さらに、最近のデータが示すところでは、
分子量１５，０００のリポモジュリンの種類がイミュー
ノジエンに反応してリンパ球により産生されかつグリコ
シル化抑制因子として作用し、ＩｇＥ−結合因子のグリ
コシル化を阻止する共にＩｇＥ反応の抑制をもたらす
〔Ｔ．ウエデ等、「ＩｇＥ−結合因子の生物学的活性の
変化：Ｉ．リポモジュリンの断片、としてのグリコシル
化抑制因子の同定」、ジャーナル・イミューノロジー、
第１３０巻、第２号、第８７８〜８８４頁（１９８
３）〕。

【０００６】リポコルチンは、その抗炎症活性の結果、
炎症経過を含む障害の治療に有用である。この種の障害
は関節炎、アレルギー症、皮膚病、眼病および膠原病を
含む。さらに、炎症を治療するこれら蛋白の使用は、現
在の抗炎症性化合物に伴う欠点をも回避する。

【０００７】現在、抗炎症治療には２種類の化合物が使
用されている。すなわち、コルチコステロイドおよび非
ステロイド系の抗炎症剤である。コルチコステロイド
は、一般にその使用に伴う著しい副作用のため一般に嫌
われている。これらの副作用は高血圧、胃腸出血、筋肉
弱化、白内障および痙攣を含む。従って、非ステロイド
系の抗炎症性化合物が好ましい。しかしながら、これら
の非ステロイドも、たとえば胃および胎盤の生理、なら
びに中枢神経系および造血系に対する悪作用のような副
作用をもたらす。さらに、ほとんどの非ステロイド系抗
炎症剤は、これら物質を生成させるための２つの経路の
一方のみ、すなわちシクロオキシゲナーゼ経路またはリ
ポオキシゲナーゼ経路のいずれかに対するその作用によ
り炎症性物質の生成を阻害する。

【０００８】これに対し、リポコルチンは上記両経路を
介して炎症性物質の生成を抑制する。さらに、リポコル
チンはステロイド作用の唯一の媒体であるため、しばし
ばコルチコステロイドの使用に伴うような副作用を生じ
ないと思われる。また、これらの抑制蛋白は細胞により
生産される天然媒体であるため、一般に多くの非ステロ
イド系抗炎症剤に伴う副作用を示さないと思われる。

【０００９】さらに、リポコルチンは、白血球の化学走
性反応を阻止することにより別の経路を介して炎症に作
用する。ｐｐ６０ｓｒｃおよびＭＴ抗原、すなわちｓｒ
ｃペプチドおよびＭＴペプチドに見られるチロシン燐酸
化部位をコードする配列を持ったある種のペプチドは、
化学吸引剤によって刺戟されるウサギ好中球の化学走性
を阻止することが示されている〔Ｆ．ヒラタ等、「Ｇｌ
ｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ
−ＧｌｕおよびＬｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ａｓ
ｎ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ
−Ｇｌｙによる白血球化学走性の阻止」、バイオケミカ
ル・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーショ
ン、第１８巻、第６３２〜６９０頁（１９８４）〕。リ
ポコルチンはそのアミノ酸配列内に同様な配列を有する
（ＧｌｕＡｓｎＧｌｕＧｌｕＧｌｎＧｌｕＴｙｒ、残基
数１５〜２１）。従って、リポコルチンは炎症組織中へ
の好中球および大食細胞の移動を抑制しまたは阻止する
ことによってこの配列を介し抗炎症作用を発揮する。

【００１０】しかしながら、現在まで、ヒトリポコルチ
ンは細胞から精製されていない。さらに、リポコルチン
の精製方法が開発されたとしても、多くの臨床および産
業用途にこれらを著量で製造し得るとは思われない。従
って、ヒトリポコルチンを臨床上有用な量で生産し得る
方法が、抗炎症治療において極めて有利であろう。

【００１１】

【発明の要点】本発明は、少なくとも１種のヒトリポコ
ルチン様ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、ならび
にこれらＤＮＡ配列により形質転換された宿主でこの種
のポリペプチドを産生させる方法を提供することにより
上記の問題を解決する。

【００１２】本発明のＤＮＡ配列は、λＬＣおよびλＮ
Ｌｉｐｏ２１−２のｃＤＮＡ挿入物、これらｃＤＮＡ挿
入物にハイブリッド化しかつ発現に際しヒトリポコルチ
ン様ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、および前記
ＤＮＡ配列のいずれかにより発現に際しコードされたポ
リペプチドを発現に際しコードするＤＮＡ配列よりなる
群から選択される。これらＤＮＡ配列を有する組換ＤＮ
Ａ分子、これらにより形質転換された宿主、およびこれ
らにより発現に際しコードされるヒトリポコルチン様ポ
リペプチドも本発明の一部である。

【００１３】本発明のＤＮＡ配列、組換ＤＮＡ分子、宿
主および方法は関節炎、アレルギー症、皮膚病、眼病お
よび膠原病、ならびに炎症経過を含むその他の病気を治
療する際に使用するためのヒトリポコルチン様ポリペプ
チドの製造を可能にする。

【００１４】本発明を充分理解し得るよう、以下詳細に
説明する。

【００１５】説明において次の用語を使用する：ヌクレオチド ：糖成分（ペントース）と燐酸と窒素含有
複素環式塩基とよりなるＤＮＡもしくはＲＮＡのモノマ
ー単位。この塩基はグリコシド炭素（ペントースの１′
炭素）を介して糖部分に結合される。塩基と糖との組合
せをヌクレオシドと呼ぶ。各ヌクレオチドはその塩基を
特徴とする。４種のＤＮＡ塩基はアデニン（「Ａ」）、
グアニン（「Ｇ」）、シトシン（「Ｃ」）およびチミン
（「Ｔ」）である。４種のＲＮＡはＡ、Ｇ、Ｃおよびウ
ラシル（「Ｕ」）である。

【００１６】ＤＮＡ配列：隣接するペントースの３′炭
素と５′炭素との間のホスホジエステル結合により互い
に連結されたヌクレオチドの線状配列である。

【００１７】コドン：ｍＲＮＡを介し、アミノ酸、翻訳
開始信号または翻訳停止信号をコードする３種のヌクレ
オチド（トリプレット）のＤＮＡ配列であって、たとえ
ばヌクレオチドトリプレットＴＴＡ、ＴＴＧ、ＣＴＴ、
ＣＴＣ、ＣＴＡおよびＣＴＧはアミノ酸、ロイシン
（「Ｌｅｕ」）をコードし、ＴＡＧ、ＴＡＡおよびＴＧ
Ａは翻訳停止信号でありかつＡＴＧは翻訳開始信号であ
る。

【００１８】読枠：ｍＲＮＡをアミノ酸配列に翻訳する
際のコドンの群であって翻訳の際に適切な読枠を維持せ
ねばならず、たとえばＤＮＡ配列ＧＣＴＧＧＴＴＧＴＡ
ＡＧは３個の読枠もしくは相として表わすことができ、
そのそれぞれは次の異なるアミノ酸配列を与える：ＧＣＴ ＧＧＴ ＴＧＴ ＡＡＧ−−Ａｌａ−Ｇｌｙ−
Ｃｙｓ−Ｌｙｓ Ｇ ＣＴＧ ＧＴＴ ＧＴＡ ＡＧ−−Ｌｅｕ−Ｖａｌ
−Ｖａｌ ＧＣ ＴＧＧ ＴＴＧ ＴＡＡ Ｇ−−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ
−（停止）ポリペプチド ：隣接するアミノ酸のα−アミノ基とカル
ボキシ基との間でペプチド結合により互いに結合された
アミノ酸の線状列である。

【００１９】ペプチターゼ：ペプチド結合を加水分解す
る酵素である。

【００２０】ゲノム：細胞もしくはウイルスの全ＤＮＡ
であって、特に物質のポリペプチドをコードする構造遺
伝子、ならびにオペレータ、プロモータおよびたとえば
シャイン−ダルガルノ配列のような配列を含むリボソー
ム結合性および相互作用性配列を含む。

【００２１】遺伝子：メッセンジャーＲＮＡ（「ｍＲＮ
Ａ」）の雛型を介し特定ポリペプチドに特徴的なアミノ
酸の配列をコードするＤＮＡ配列である。

【００２２】転写：遺伝子もしくはＤＮＡ配列からｍＲ
ＮＡを産生する過程である。

【００２３】翻訳：ｍＲＮＡからポリペプチドを産生す
る過程である。

【００２４】発現：ＤＮＡ配列もしくは遺伝子の作用を
受けてポリペプチドを産生する過程であり、これは転写
と翻訳との組合せである。

【００２５】プラスミド：完全「レプリコン」からなる
非染色体二重鎖ＤＮＡ配列であって、このプラスミドは
宿主細胞内で複製される。プラスミドが単細胞生物内に
存在すると、この生物の特徴はプラスミドのＤＮＡの結
果として変化しあるいは形質転換される。たとえば、テ
トラサイクリン耐性（Ｔｅｔ^Ｒ）に関する遺伝子を有す
るプラスミドは、テトラサイクリンに対し感受性であっ
た細胞をこれに耐性の細胞に形質転換させる。プラスミ
ドにより形質転換された細胞を「形質転換体」と呼ぶ。

【００２６】ファージもしくはバクテリオファージ：細
菌性ウイルスであって、その多くは蛋白エンベロプもし
くはコート中にカプセル化されたＤＮＡ配列よりなって
いる（「カプシド」）。

【００２７】コスミド：バクテリオファージλの凝集末
端（「ｃｏｓ」）部位を有するプラスミドである。これ
らコスミドはｃｏｓ部位が存在するためλコート蛋白中
に導入されて、適当な宿主に感染させるべく使用するこ
とができる。異質ＤＮＡの大型断片に対するその容量に
よりコスミドはクローン化ベヒクルとして有用である。

【００２８】クローン化ベヒクル：宿主細胞内で複製す
ることができ、たとえば複製コート蛋白の産生のような
ＤＮＡの本質的な生物学的機能の喪失あるいはプロモー
タもしくは結合部位の喪失を伴うことなくＤＮＡ配列を
決定可能に切断しうる１個または少数のエンドヌクレア
ーゼ認識部位を特徴とし、かつたとえばテトラサイクリ
ン耐性もしくはアンピシリン耐性などの形質転換細胞の
同定に使用するのに適した標識を有するプラスミド、フ
ァージＤＮＡまたはその他のＤＮＡ配列であり、クロー
ン化ベヒクルはしばしばベクターと呼ばれる。

【００２９】クローン化：無性増殖によって１種の生物
もしくは配列から誘導される生物もしくはＤＮＡ配列の
集団を得る過程である。

【００３０】組換ＤＮＡ分子すなわちハイブリッドＤＮ
Ａ：互いに末端結合してある種の宿主細胞に感染しかつ
そこに維持される能力を有する種々異なるゲノムからの
ＤＮＡ断片よりなる分子である。

【００３１】発現制御配列：遺伝子に作用結合された際
これら遺伝子の発現を制御するヌクレオチドの配列であ
る。これらはｌａｃ系、ｔｒｐ系、ｔａｃ系、ｔｒｃ
系、ファージλの主オペレータおよびプロモータ領域、
ｆｄコート蛋白の制御領域、ＳＶ４０の初期および後期
プロモータ、ポリオーマから誘導されたプロモータ、ア
デノウイルスおよび猿ウイルス、３−ホスホグリセレー
トキナーゼもしくはその他の糖分解酵素のプロモータ、
酵母酸ホスファターゼのプロモータ、たとえばＰｈｏ
５、酵母α−結合ファクタのプロモータ、ならびに原核
もしくは真核細胞およびそのウイルスの遺伝子の発現を
制御することが知られたその他の配列、あるいはその組
合せを包含する。哺乳動物細胞については、遺伝子をジ
ヒドロホレートレダクターゼをコードする遺伝子に結合
したＳＶ４０早期領域に対するような真核プロモータに
結合させて、シナハムスター卵細胞で選択増殖させるこ
とにより、活性転写した真核遺伝子の多数のコピーを有
する細胞ラインを生成させることができる。

【００３２】リポコルチン様ポリペプチド：リポコルチ
ンの生物学的もしくは免疫学的活性を示すポリペプチド
であり、このポリペプチドは原リポコルチンのアミノ酸
の他にさらにアミノ酸を含み、あるいは原リポコルチン
のアミノ酸全部を含まなくてもよい。さらに、これはＮ
−末端メチオニンを含むことができる。リポコルチン
は、ホスホリパーゼ阻止蛋白とも呼ばれる。

【００３３】本発明はヒトリポコルチン様ポリペプチド
をコードするＤＮＡ配列および組換ＤＮＡ分子、ならび
にこれらポリペプチドの産生方法に関するものである。

【００３４】本発明のＤＮＡ配列を分離しかつクローン
化するには各種の選択およびＤＮＡクローン化技術を潜
在的に使用しうるであろうが、本発明の一実施例におい
てはラットのホスホリパーゼＡ_２阻止蛋白に基づく選択
技術を採用した。従って、ラットの腹腔内滲出細胞の細
胞外上澄液からラットのホスホリパーゼＡ_２阻止蛋白を
精製し、この蛋白の各種断片のアミノ酸配列を決定し
た。これら蛋白配列に基づき、最小のヌクレオチド縮重
を有する精製ラット蛋白のこれら領域に対応する数種の
対応オリゴヌクレオチドＤＮＡ試料を合成した。次い
で、これら試料を使用して、ファージクローン化ベクタ
ー中に挿入されたヒト大食細胞ｃＤＮＡ配列を含有する
イー・コリ菌体からなるヒトｃＤＮＡ保存物をスクリー
ニングした。

【００３５】スクリーニングするため、プラークハイブ
リッド化スクリーニング分析を用いてオリゴヌクレオチ
ド試料をヒトｃＤＮＡ保存物にハイブリッド化し、かつ
これら多数の試料にハイブリッド化するクローンを選択
した。選択したヒトｃＤＮＡ挿入物を分離しかつプラス
ミド中へサブクローン化した後、そのヌクレオチド配列
を決定し、これらを精製ラットリポコルチンのペプチド
から得られたアミノ酸配列と比較した。この比較の結
果、分離された全クローンのヌクレオチド配列は精製さ
れたラットリポコルチンのアミノ酸配列に対し顕著な類
似性を有するアミノ酸配列をコードすることが判明した
（図１および図２と図４との比較）。分離したクローン
の少なくとも１種はヒトリポコルチンをコードする全長
配列を有することを確認した。

【００３６】本発明のｃＤＮＡ配列は、発現制御配列に
作用結合して、各種の哺乳動物またはその他の真核もし
くは原核宿主細胞で使用して、これらによりコードされ
るヒトリポコルチン様ポリペプチドを産生することがで
きる。たとえば、３７Ｋｄヒトリポコルチンを産生する
高レベルの発現ベクターを作成した。

【００３７】さらに、本発明ｃＤＮＡ配列は、リポコル
チン様ポリペプチドをコードする他の配列に対するヒト
ｃＤＮＡ保存物をスクリーニングするにも有用である。
さらに、本発明のｃＤＮＡ配列は、ヒトゲノムＤＮＡ保
存物をスクリーニングして、リポコルチン様ポリペプチ
ドをコードするヒトゲノムＤＮＡ配列を選択する試料と
しても有用である。これらのゲノム配列は、本発明の上
記ｃＤＮＡ配列と同様に、これらによりコードされる、
リポコルチン様ポリペプチドを産生するにも有用であ
る。ゲノム配列は、哺乳動物細胞を形質転換させてヒト
リポコルチン様ポリペプチドを産生するのに特に有用で
ある。

【００３８】本発明の第２実施例によれば、ヒト胎盤か
らヒトリポコルチン様ポリペプチドを分離し、このポリ
ペプチドを本発明の３７Ｋｄ組換リポコルチンに対する
構造類似性、すなわちアミノ酸同族性を示す。さらに、
この蛋白はホスホリパーゼＡ_２阻止活性をも示す。この
蛋白をＮ−リポコルチンと称する。リポコルチンおよび
Ｎ−リポコルチンは、トリプシン地図化により化学的に
規定されたそれぞれ別の蛋白である。Ｎ−リポコルチン
の各断片のアミノ酸配列を決定し、これら配列に基づき
対応のオリゴヌクレオチドＤＮＡ試料を合成した。これ
ら試料を使用して、ファージクローン化ベクター中に挿
入されたヒト胎盤ｃＤＮＡ配列を有するイー・コリ菌体
からなるヒトｃＤＮＡ保存物をスクリーニングした。こ
れら試料にハイブリッド化する数種のクローンを分離し
た。これらクローンの１種のｃＤＮＡ挿入物をプラスミ
ド中へ導入した後、このｃＤＮＡ挿入物のヌクレオチド
配列を決定した。これはＮ−リポコルチンの一部をコー
ドする。

【００３９】このｃＤＮＡ配列は、Ｎ−リポコルチン様
ポリペプチドをコードする他の配列に対するヒトｃＤＮ
Ａ保存物をスクリーニングするための試料として有用で
ある。たとえば、このｃＤＮＡ挿入物を使用して、Ｎ−
リポコルチンをコードする全長配列につき本発明のヒト
胎盤ｃＤＮＡ保存物をスクリーニングすることができ
る。あるいは、本発明の部分Ｎ−リポコルチンｃＤＮＡ
配列を得るために使用したオリゴヌクレオチド試料は、
Ｎ−リポコルチンをコードする全長配列につき胎盤保存
物を再スクリーニングするための試料としても有用であ
る。さらに、得られたＮ−リポコルチンｃＤＮＡ配列、
あるいはここに開示した試料を使用して、当業界の標準
技術により再編成したＮ−リポコルチン遺伝子および全
長遺伝子の他の部分を単離することもできる。さらに、
ｃＤＮＡ配列の試料を、全長コード配列を合成するため
のプライマとして使用することもできる。

【００４０】さらに本発明のＮ−リポコルチンｃＤＮＡ
配列は、ヒトゲノムＤＮＡ保存物をスクリーニングして
Ｎ−リポコルチン様ポリペプチドをコードするヒトゲノ
ムＤＮＡを選択するための試料としても有用である。こ
れらゲノム配列は、Ｎ−リポコルチンｃＤＮＡ配列と同
様に、これら配列で形質転換された宿主においてＮ−リ
ポコルチン様ポリペプチドを産生させるにも有用であ
る。

【００４１】本発明の他の具体例は、リポコルチン蛋白
の活性部位をより良く特定化することができかつ最適な
治療価値を有する分子の設計を可能にするような生物学
上活性なヒトリポコルチン様ポリペプチド断片の製造に
も関するものである。従って、本発明のリポコルチン様
ポリペプチドを各種のプロテアーゼで処理して、これら
断片を生成させた。さらに、組換ＤＮＡ技術により、こ
れらの生物学上活性な断片を生成させた。本発明の方法
により産生されたヒトリポコルチン様ポリペプチドは、
抗炎症剤としてあるいは抗炎症方法および治療に有用で
ある。たとえば、これらの組成物は、炎症を減少させる
のに医薬上有効な量の本発明によるリポコルチン様ポリ
ペプチドと医薬上許容しうるキャリヤとから構成するこ
とができる。この種の治療は、一般に医薬上許容しうる
方法でこれら組成物により患者を処置する方法からなっ
ている。

【００４２】方法および材料 広範な種類の宿主／クローン化ベヒクル組合せ物を、本
発明により作成したヒトリポコルチン様ポリペプチドＤ
ＮＡ配列をクローン化しまたは発現する際に使用するこ
とができる。たとえば、有用なクローン化もしくは発現
ベヒクルは染色体、非染色体および合成のＤＮＡ配列の
断片、たとえば各種公知のＳＶ４０の誘導体ならびに公
知の細菌性プラスミド、たとえばｃｏｌＥ１、ｐＣＲ
１、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９およびその誘導体を含むイ
ー・コリからのプラスミド；広範な宿主範囲のプラスミ
ド、たとえばＲＰ４、ファージＤＮＡ（たとえば、ファ
ージλの多数の誘導体、たとえばＮＭ９８９）；ならび
にその他のＤＮＡファージ、たとえばＭ１３およびフィ
ラメント状一本鎖ＤＮＡファージ、ならびにプラスミド
とファージＤＮＡとの組合せから誘導された、たとえば
ファージＤＮＡあるいはその他の発現制御配列またはた
とえば２μプラスミドもしくはその誘導体のような酵母
プラスミドを使用すべく改善したプラスミドなどのファ
ージＤＮＡで構成することができる。

【００４３】それぞれ特異性のクローン化もしくは発現
ベヒクルにおいて、各種の部位を選択して本発明のヒト
リポコルチン様ポリペプチドＤＮＡ配列を挿入すること
ができる。一般に、これらの部位は、これらを切断しか
つ当業者によく知られた制限エンドヌクレアーゼによっ
て命名される。ＤＮＡ配列をこれらの部位に挿入して組
換ＤＮＡ分子を形成させる各種の方法も周知されてい
る。これらは、たとえばｄＧ−ｄＣもしくはｄＡ−ｄＴ
末端処理、直接結合、エキソヌクレアーゼおよびポリメ
ラーゼ結合した修復反応に続く結合、あるいはＤＮＡポ
リメラーゼおよび適当な一本鎖雛型によるＤＮＡストラ
ンドの延長に続く結合を包含する。勿論、本発明に有用
なクローン化もしくは発現ベヒクルは、選択ＤＮＡ断片
を挿入するための制限エンドヌクレアーゼ部位を必要と
しないことを了解すべきである。むしろ、ベヒクルは他
の手段によって断片に結合することができる。

【００４４】さらに、各種の発現制御配列を選択して、
本発明のＤＮＡ配列を発現させることができる。これら
の発現制御配列は、たとえば、ｌａｃ系、β−ラクタマ
ーゼ系、ｔｒｐ系、ｔａｃ系、ｔｒｃ系、ファージλの
主オペレータおよびプロモータ領域、ｆｄコート蛋白の
制御領域、３−ホスホグリセレートキナーゼまたはその
他の糖分解酵素のプロモータ、酸ホスファターゼのプロ
モータ（たとえば、Ｐｈｏ５）、酵母α−結合因子のプ
ロモータ、哺乳動物細胞のプロモータ（たとえば、ＳＶ
４０早期プロモータ）、アデノウイルスの後期プロモー
タおよびメタロチオニンプロモータ、ならびに原核もし
くは真核細胞またはそのウイルスの遺伝子およびその各
種組合せの発現を制御することが知られたその他の配列
を包含する。哺乳動物細胞においては、さらに遺伝子を
ジヒドロフォレートデダクターゼに対するものへ結合し
かつ宿主支那ハムスター卵細胞に対する選択を行って、
発現単位を増幅することもできる。

【００４５】本発明のＤＮＡ配列を発現させるには、こ
れらＤＮＡ配列を発現ベクターにおける上記発現制御配
列の１つもしくはそれ以上に作用結合させる。選択した
ヒトリポコルチンＤＮＡ配列がクローン化ベヒクル中に
挿入される前または後に行いうるこの種の作用結合は、
発現制御配列がＤＮＡ配列の発現を制御しかつ促進する
ことを可能にする。

【００４６】ベクターもしくは発現ベヒクル、および特
に選択ＤＮＡ断片および本発明に使用する発現制御配列
を挿入するためにここで選択した部位は、各種の因子、
たとえば特定の制限酵素に感受性の部位の個数、発現す
べき蛋白の大きさ、たとえばベクター配列に対する開始
および停止コドンの位置などの発現特性および当業者に
知られたその他の因子によって決定される。特定のリポ
コルチン配列に対するベクター、発現制御配列および挿
入部位の選択はこれら因子の調和によって決定され、必
ずしも全ての選択が所定の場合に同等に有効であるとは
限らない。

【００４７】さらに、クローン化もしくは発現ベヒクル
の選択部位に挿入される本発明のリポコルチン様ポリペ
プチドをコードするＤＮＡ配列は、所望リポコルチンを
コードする実際の遺伝子の一部でないヌクレオチドを含
むことができ、あるいはこの蛋白に対する全遺伝子の断
片のみを含むこともできることが了解されよう。どのＤ
ＮＡ配列を使用しても形質転換宿主がリポコルチン様ポ
リペプチドを産生されることだけが必要である。たとえ
ば、本発明のリポコルチン関連ＤＮＡ配列を本発明の発
現ベクターにおける同じ読枠中で融合させて、少なくと
も１種の真核もしくは原核キャリヤ蛋白をコードするＤ
ＮＡ配列または少なくとも１種の真核もしくは原核信号
配列をコードするＤＮＡ配列、またはその組合せの少な
くとも一部とすることができる。この種の構成は所望の
リポコルチン関連ＤＮＡ配列の発現を促進し、精製を向
上させ、あるいは分泌を可能にし、好ましくは宿主細胞
からのリポコルチン様ポリペプチドの成熟を可能にす
る。あるいは、リポコルチン関連ＤＮＡ配列はＡＴＧ開
始コドンを単独であるいは他のコドンと組合せて含むこ
ともでき、成熟天然リポコルチン様ポリペプチドの第１
アミノ酸をコードする配列に直接融合させることができ
る。この種の構成は、たとえば本発明の一部であるメチ
オニルもしくはその他のペプチジル−リポコルチン様ポ
リペプチドの産生を可能にする。このＮ−末端メチオニ
ンもしくはペプチドを次いで細胞内または細胞外で各種
の公知方法により切断することができ、あるいはこのポ
リペプチドを本発明の抗炎症組成物および方法にペプチ
ドへ結合したメチオニンと共に使用することもできる。

【００４８】本発明のリポコルチン様ポリペプチドをコ
ードする配列を含んだクローン化ベヒクルまたは発現ベ
クターを本発明により使用して適当な宿主を形質転換さ
せ、ＤＮＡ配列によりコードされるリポコルチン様ポリ
ペプチドを宿主が発現するのを可能にする。

【００４９】有用なクローン化もしくは発現宿主は、た
とえば、イー・コリＷ３１１０１^Ｑ、イー・コリＪＡ２
２１、イー・コリＣ６００、イー・コリＥＤ８７６７、
イー・コリＤＨ１、イー・コリＬＥ３９２、イー・コリ
ＨＢ１０１、イー・コリＸ１７７６、イー・コリＸ２２
８２、イー・コリＭＲＣＩなどのイー・コリの菌株、な
らびにシュードモナス、バチルスおよびストレプトミセ
ス、酵母ならびにその他の真菌類の菌株、動物宿主、た
とえばＣＨＯ細胞もしくはネズミ細胞、その他の動物
（ヒトを含む）宿主、培養中の植物細胞、あるいはその
他の宿主を包含する。

【００５０】適する宿主の選択は、当業界で知られた多
くの因子によって管理される。これらは、たとえば選択
ベクターに対する適合性、ハイブリッドプラスミドによ
りコードされた蛋白の毒性、宿主細胞の酵素による蛋白
分解に対する所望蛋白の感受性、宿主細胞蛋白によって
発現される精製の際に除去困難な蛋白の汚染もしくは結
合、所望蛋白の回収の容易さ、発現特性、生物安全性お
よびコストなどを包含する。必ずしも全ての宿主ベクタ
ーの組合せが特定の組換ＤＮＡ分子のクローン化もしく
は発現に対し同等に有効でありうるとは限らないことを
理解した上で、これら因子を調和させねばならない。

【００５１】ヒトリポコルチン様ポリペプチド（これら
の宿主にて本発明にしたがい作成したもの）は、ポリペ
プチドを融合蛋白の形態（たとえば原核、真核または組
合せＮ−末端断片に結合して分泌を指示し、安定性を向
上し、精製を向上させ、あるいはＮ−末端断片の可能な
切断を向上させる）、リポコルチン様ポリペプチドの先
駆体の形態（たとえば、リポコルチン様ポリペプチド信
号配列またはその他の真核もしくは原核信号配列の全部
または一部で開始する）、成熟リポコルチン様ポリペプ
チドの形態、あるいはｍｅｔ−リポコルチン様ポリペプ
チドの形態を含むことができる。

【００５２】本発明によるポリペプチドの特に有用な一
形態あるいはその少なくとも１種の先駆体は、容易に切
断されるアミノ酸あるいはアミノ末端に結合した一連の
アミノ酸を有する成熟リポコルチン様ポリペプチドであ
る。この種の構造は、成熟リポコルチンに存在しえない
開始信号を必要とする適当な宿主で蛋白を合成し、次い
で余分のアミノ酸をインビボもしくはインビトロで切断
して成熟リポコルチン様ポリペプチドを産生することを
可能にする。この種の方法は当業界に現存する（たとえ
ば米国特許第４，３３２，８９２号、第４，３３８，３
９７号および第４，４２５，４３７号参照）。さらに、
これらポリペプチドを他の天然リポコルチンと同様にグ
リコシル化し、または脱グリコシル化し、或いは天然リ
ポコルチンとは異なるグリコシル化パターンにすること
もできる。この種のグリコシル化は宿主細胞によって生
じ、或いは特定のリポコルチンを得るよう選択した発現
後の処理によっても生ずる。

【００５３】さらに、本発明のポリペプチドは、プロテ
アーゼでの処理により或いはリポコルチン様ポリペプチ
ドをコードするＤＮＡ配列の断片の発現により、リポコ
ルチン様ポリペプチドから誘導された生物学上活性なポ
リペプチド断片をも包含する。さらに、本発明のポリペ
プチドは、本発明のＤＮＡ配列におけるコドンの幾つか
または全部につき異なるコドンを特徴とするＤＮＡ配列
により発現に際しコードされるリポコルチン様ポリペプ
チドをも包含する。これらの置換コドンは、置換された
コドンによりコードされるものと同一のアミノ酸をコー
ドすることもできるが、高収量でポリペプチドを生成す
る。或いはアミノ酸置換またはより長いもしくはより短
いリポコルチン様ポリペプチドをもたらすコドンの１つ
の置換または組合せによって、その性質を有益に変化さ
せることもできる（たとえば安定性を増大させ、溶解性
を増大させ、または治療活性を増大させる）。

【００５４】本発明を一層よく理解しうるよう以下実施
例を示す。これらの実施例は単に例示の目的であって、
本発明の範囲を決して限定するものと解釈すべきでな
い。

【００５５】

【実施例】

Ａ．ラットのホスホリパーゼＡ_２阻止蛋白の精製 雄ウイスター種のラット（２００〜２５０ｋｇ）に、
０．９％ＮａＣｌにおけるグルココルチコイド，デキサ
メタゾン燐酸（１．２５ｍｇ／ｋｇラット）０．１ｍｌ
を皮下注射して、ホスホリパーゼＡ_２阻止蛋白の産生を
誘発させた。次いで、これらのラットを注射してから１
時間後にユーサセートの心臓内注射によって殺し、かつ
腹腔を１０ｍｌの燐酸緩衝塩水（５０ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ
_４（ｐＨ７．３）、ＺＵ／ｍｌのヘパリンを含有する１
５０ｍＭのＮａＣｌ、および５０μＭのフェニルメチル
スルホニルフルオライド）で洗浄した。最高速度３０分
のインターナショナル遠心分離器での遠心分離により細
胞およびその他の粒状物質の洗浄液を清澄させた後、上
澄液を合してリポコルチンにつき分析し、その際この上
澄液と豚膵臓ホスホリパーゼＡ_２の存在下におけるオー
トクレーブ処理されたイー・コリ膜からの標識オレイン
酸の放出抑制を測定した。

【００５６】これを次のようにインビトロ分析にかけ
た：腹腔内滲出上澄液からの試料２００μｌを１．５ｍ
ｌのエッペンドルフ管において５０μｌの０．７Ｍトリ
ス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、６０ｍＭ ＣａＣｌ_２緩衝
液と氷上にて混合した。次いで、５０μｌの希釈豚膵臓
ホスホリパーゼＡ_２（カタログＮｏ．Ｐ９１３９、シグ
マ・ケミカルス社）を添加しかつ混合し、そしてこの溶
液を氷上で１時間培養した。２．５ｍｇ／ｍｌの牛血清
アルブミン（ＢＳＡ）を含有する緩衝液（７０ｍＭトリ
ス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、６ｍＭ ＣａＣｌ_２）中へ
のホスホリパーゼＡ_２懸濁物の希釈は、ホスホリパーゼ
とＢＳＡとの最終濃度がそれぞれ１００μｇ／５０μｌ
および１２５μｇ／５０μｌとなるように行った。次い
で、基質としてのオートクレーブ処理したＨ^３−オレイ
ン酸標識イー・コリ２５μｌを加え、かつ混合物を６℃
で８分間培養した（温度および培養時間は両者とも使用
するイー・コリの各バッチに応じて決定せねばならな
い）。

【００５７】基質Ｈ^３−オレイン酸標識イー・コリは次
のように作成した：イー・コリの１晩培養物をトリプト
ン培地（１％バクトトリプトン、０．５％ＮａＣｌ）中
で増殖させ、これを新たなブロスで１：２０に希釈し、
かつクレット計で菌体増殖を監視した。読みが４０にな
った際（すなわち、細胞が良好に増殖している際）、ブ
リイジ３５（ポリエチレン−２３−エーテル、シグマ・
ケミカルス社、水中の１０％溶液）の１：１００希釈物
およびＨ^３−オレイン酸（９，１０−Ｈ^３−〔Ｎ〕−オ
レイン酸、ニュー・イングランド・ヌクレア社）の１：
２００希釈物を１０ｍＣｉ／ｍｌにて添加した。５時間
後、細胞増殖が停止した際、懸濁物を１２０℃にて２０
分間オートクレーブ処理し、かつフラスコを４℃にて１
晩保存した。次いで、ＳＳ３４ロータにて４℃で１６，
０００ｒｐｍの速度で３０分間遠心分離することにより
バクテリヤをペレット化させ、かつ遊離したペレットを
１本のチューブにまとめた。バクテリヤを４回或いは上
澄液におけるカウント数が低くなるまで懸濁緩衝液
（０．７Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭＣ
ａＣｌ_２）＋０．１％ＢＳＡで洗浄した。このバクテリ
ヤを、０．２％窒化ナトリウムを含有する懸濁緩衝液中
で４℃にて貯蔵した。典型的には、２０ｍＣｉのＨ^３−
オレイン酸で標識した培養物４００ｍｌを作成した。こ
れにより標識バクテリヤにおける約７×１０^８ｃｐｍ、
すなわち約１０％の投入カウント数が得られた。分析の
各時点において、１００，０００ｃｐｍを使用し、これ
を２５μｌの容積で加えた。使用する直前にその１部を
先ず２００ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１２ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ（氷上に３０分間放置）で洗浄し、次いで
２５ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で洗浄した。

【００５８】基質（オートクレーブ処理した標識イー・
コリ）を阻止剤およびホスホリパーゼＡ_２と共に短時間
培養した後、反応を１００μｌの２Ｎ塩酸を各チューブ
に添加し、次いで１００μｌの２０ｍｇ／ｍｌの脱脂Ｂ
ＳＡ（９９％アルブミン、シグマ・ケミカルス社）を添
加して直ちに停止させた。チューブを振とうしかつ氷上
で３０分間培養した。この手順は、特定の膜からリパー
ゼ切断した生成物を抽出するのに重要である。

【００５９】次いで、イー・コリをエッペンドルフ遠心
分離器において１０，０００ｇで５分間ペレット化さ
せ、水溶液に適合したシンチレーションカクテル４ｍｌ
において各上澄液２５０μｌを計数した。この分析にお
いて、試料＋イー・コリ基質を添加ホスホリパーゼの存
在下および不存在下で培養した内部比較を用いて反復試
験した。このインビトロ分析は、腹腔内滲出液がホスホ
リパーゼ阻止活性を有することを示した。

【００６０】上記腹腔内滲出上澄液からリポコルチンを
精製するため、先ず最初にこの上澄液ヘプロテアーゼ阻
止剤を添加した。これらは典型的にはアプロチニン（２
０μｇ／ｍｌ）と大豆トリプシン抑制剤（２０μｇ／ｍ
ｌ）とＥＧＴＡ（エチレングリコール−ビス−（アミノ
エチルエーテル）−Ｎ，Ｎ′−テトラ酢酸）（０．５ｍ
Ｍ）を含んだ。滲出液を３７℃にて０．１Ｕ／ｍｌ牛腸
内アルカリホスファターゼの存在下で１時間培養し、か
つこれをアミコン装置（ＰＭ１０膜）により最終蛋白濃
度５ｍｇ／ｍｌまで限外瀘過により２倍濃縮した。次い
で、上澄液を２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．１）の
４０容量に対し４℃にて１晩透析し、かつＤＥ５２イオ
ン交換カラムクロマトグラフィー（ワットマン社、カラ
ム寸法：直径１ｃｍ×１７ｃｍ）にかけた。使用前にＤ
Ｅ５２樹脂を２５ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．１）で
平衡化させた。流過したフラクションを集め、これらを
アミコン限外瀘過装置（ＰＭ１０膜）によりさらに２５
倍濃縮した。次いで、この濃縮物を２５ｍＭトリス−Ｈ
Ｃｌにおけるゲル瀘過カラム（Ｐ１５０樹脂）（カラム
寸法：直径２．５ｃｍ×４０ｃｍ）にかけ、このカラム
フラクションを蛋白につき監視し、その際２８０ｎｍに
おける吸光値と上記のホスホリパーゼ阻止活性分析とを
用いた。３５〜４０，０００分子量におけるピーク活性
を検出した。

【００６１】これらの高活性フラクションを凍結乾燥
し、０．２％ＳＤＳを含有する２５ｍＭのトリス−ＨＣ
ｌ（ｐＨ６．８）で透析し、かつ調製用ＳＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル（主ゲル：１５％アクリルアミド、
０．０８％メチレンビスアクリルアミド；積層ゲル：
７．６％アクリルアミド、０．２１％メチレンビスアク
リルアミド）を用いて分析した。このゲル分析は４つの
主たる蛋白帯を与えた。ウエスタン・ブロット技術の変
法〔Ｈ．トウビン等、「ポリアクリルアミドゲルからニ
トロセルロース紙への蛋白の電気泳動」、プロシーディ
ング・ナショナル・アカデミー・サイエンス・ＵＳＡ、
第７６巻、第４３５０−４３５４頁（１９７９）〕にし
たがい西洋ワサビペルオキシダーゼ抗体の結合物を用い
て免疫反応物質を可視化させ、これら４種の主たるバン
ドの１個のみが蛇静脈リポコルチンに対し作成した中和
抗体と交差反応することを突き止めた。したがって、こ
のゲルの領域を切除し、電気溶出させかつ含有される蛋
白を２０％トリクロル酢酸で沈澱させ、そして蛋白を１
０，０００ｇでの２０分間の遠心分離によってペレット
化させた。ペレットを５ｍｌの−２０℃アセトンで２回
洗浄した後（各洗浄に続いて遠心分離工程を行った）、
ペレットを減圧下で乾燥させた。

【００６２】次いで、蛋白を臭化シアノゲンまたはトリ
プシンのいずれかで切断した。臭化シアノゲン切断を用
いる場合、約１００μｇの蛋白を含有するペレットを２
００ｍｇ／ｍｌの臭化シアノゲンにより暗所中で０．５
ｍｌの７０％蟻酸の存在下に２５℃にて１６時間切断し
た。次いで、反応混合物を水で１５倍希釈し、かつこれ
を凍結乾燥した。トリプシン切断を用いる場合は、先ず
ペレットを０．１ＭのＮＨ_３ＨＣＯ_３と０．１ｍＭ Ｃ
ａＣｌ_２に再懸濁し、この混合物をイオド酢酸でカルボ
キシメチル化し、次いでトリプシンと共に３７℃にて２
４時間培養した。この培養期間中、トリプシンを０時点
にて全蛋白の最終濃度１．５％になるまで、４時間後に
２．５％かつ１９時間後に３．５％になるまで３回添加
した。

【００６３】これらの切断断片を高圧液体クロマトグラ
フィーによって前記切断物から分離し、その際臭化シア
ノゲン切断生成物についてはＣ８カラム（ブラウンリー
ＲＰ−３）を使用し、またトリプシン切断生成物につい
てはＣ１８カラム（スペクトラフィジックス社）を用
い、いずれの場合にも０．１％トリフルオロ酢酸におけ
る０〜７５％のアセトントリルの濃度勾配を用いて結合
断片を溶出させた。次いでピークフラクションを、気相
配列決定装置（アプライド・ビオシステムス社、４７０
Ａ）を用いて配列分析にかけた。ＰＩＰＨ−アミノ酸
を、５μｍシアノカラム（ハイパーシル）にて高圧液体
クロマトグラフィーにより分離し、その際０．０２Ｍ酢
酸ナトリウム（ｐＨ５．７）における１５〜５５％のア
セトニトリル対メタノール（４：１）の濃度勾配を使用
した。

【００６４】図１は、精製したラットリポコルチンの臭
化シアノゲン切断により精製された断片のアミノ酸配列
を示している。６個の主たるピークのうち３個のみが独
特の配列を与えた（ＣＮＢｒ１，２および３）。これら
の配列を図１の下に示す。残余のピークのうち２個（Ｃ
ＮＢｒ５および６）は断片の混合物を含有し、したがっ
て配列決定することができず、またピーク４は人工カラ
ムであって、これからは蛋白が検出されなかった。

【００６５】図２はトリプシン切断からの断片のアミノ
酸配列を示している。トリプシン切断は４０個以上のピ
ークを与えたが、そのうち９個のフラクションのみのア
ミノ酸配列を図２に示す。ピークが２種以上のペプチド
を含有する場合、適当なフラクションを第２のクロマト
グラフ工程にかけた。Ｔ２２ａおよびＴ２２ｂは、ピー
ク２２の２種の成分から得られた配列であり、これらを
分離させ、その際ピーク２２を同じカラムであるが中性
ｐＨにて再クロマトグラフにかけた。

【００６６】Ｂ．リポコルチン蛋白配列のためのオリゴ
ヌクレオチドＤＮＡ試料の合成 ラットリポコルチンの各種領域におけるアミノ酸配列を
決定した後（図１および図２参照）、これら蛋白配列の
幾つかをコードする対応オリゴヌクレオチドＤＮＡ試料
の４種の保存物を化学合成した（図３参照）。図３に示
した４種の保存物を合成するよう決断した理由は、これ
らが最小の核酸縮重を有するラットリポコルチンの領域
に対応するからである。各アミノ酸配列につき、全ての
可能なコドンに相補的な試料の混合物を合成した。さら
に、試料がアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列に相補
的となるよう（すなわち試料が対応するよう）合成し
て、これらの試料によりｍＲＮＡ並びにＤＮＡにおける
対応の配列を識別しうるようにした。ラットリポコルチ
ンの４種の選択領域におけるアミノ酸配列は、並びにこ
れらをコードする全ての可能なヌクレオチドコドン組合
せを図３に示す。コード化縮重は次のように示される：
Ｎ＝Ｃ，Ｔ，ＡもしくはＧ；Ｒ＝ＡもしくはＧ；Ｙ＝Ｃ
もしくはＴ；かつＨ＝Ａ，ＣもしくはＴ。

【００６７】図２のトリプシン切断断片Ｔ２２ａおよび
Ｔ２４における配列から得られた２種の試料の保存物
は、それぞれ４８および２５６倍の縮合を有する２０量
体である。他の２種の試料保存物は、それぞれ６４およ
び１２８倍の縮重を有する１７量体である。これら試料
においてさらに縮重を低下させるため、各保存物をサブ
保存物に作成し、たとえばＴ２２ａの４８倍縮重２０量
体を１６の３種のサブ保存物に作成しかつ他の試料を４
種のサブ保存物に合成した。各保存物における試料を、
〔γ〕−Ｐ^３２−ＡＴＰおよびＴ４ポリヌクレオチドキ
ナーゼによってＰ ^３２で末端標識した。

【００６８】これらの合成試料が実際にヒト配列を識別
するかどうかを試験するため、Ｔ２４の４種のサブ保存
物をヒト大食細胞ラインＵ９３７からのポリ（Ａ）^＋ｍ
ＲＮＡを含有する遺伝子スクリーンフィルタにハイブリ
ッド化させ、前記細胞ラインＵ９３７はノーザンブロッ
ト技術により１０^−７ＭのＰＭＡ〔４β−ホルボール１
２βミリステート１３α−アセテート〕および１０^−５
のデキサメタゾンで誘発させたものである〔Ｈ．レーラ
ッハ等、バイオケミストリー、第１０巻、第４７４３−
４７５１頁（１９７１）〕。Ｔ２４のサブ保存物２およ
び３はｍＲＮＡにハイブリッド化し、これらは自動放射
線分析に際し１８００塩基対帯として検出された。

【００６９】Ｃ．ヒトｃＤＮＡ保存物の作成およびスク
リーニング ヒト大食細胞ラインＵ９３７から分離したポリ（Ａ）^＋
ｍＲＮＡよりヒトｃＤＮＡ保存物を作成した。このｃＤ
ＮＡ配列をλｇｔ１０中へ挿入し、かつイー・コリＣ６
００ｈｆｌ細胞で増殖させた。

【００７０】１．ヒトＵ９３７細胞からのＲＮＡの抽出 ヒト大食細胞Ｕ９３７細胞をデキサメタゾン（１０^−５
Ｍ）およびホルボールエステル（１０^−７Ｍ）と一緒に
培養して誘発させ、かつ１．２×１０９個の細胞を含有
するペレットを４８ｍｌの溶解緩衝液（０．２Ｍトリス
−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．１Ｍ ＬｉＣｌ、２５ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ、１％ＳＤＳ）＋５ｍＭバナジル錯体（ベ
セスダ・リサーチ・ラボラトリース社）中へ回動により
再懸濁させた。２４ｍｌのフェノールを添加しかつ５分
間回動して細胞を溶解させた。溶解混合物に２４ｍｌの
クロロホルムを添加し、次いで１０分間振とうした。臨
床用遠心分離器で室温にて１０分間遠心分離することに
より、有機相と水相とを分離した。水相をフェノール対
クロロホルム（１：１）で２回再抽出し、次いでクロロ
ホルムだけで２回抽出した。次いで、０．３Ｍ酢酸ナト
リウム中にて−２０℃で核酸を１晩エタノール沈澱さ
せ、そして核酸をソルバールＲＣ２Ｂ型遠心分離器（Ｓ
Ｓ３４ロータ）により１４Ｋｒｐｍで４℃にて２０分間
ペースト化させた。これらペレットを５ｍｌの０．３Ｍ
酢酸ナトリウム緩衝液に再懸濁し、かつ核酸を再び上記
と同様にエタノール沈澱させた。最終ペレットを３００
μｌのＨ_２Ｏ中に再懸濁し、かつこれを−２０℃で保存
した。このＲＮＡ調製物を、オリゴ（ｄＴ）セルロース
カラム（ＰＬバイオケミカルス社）に通してポリ（Ａ）
^＋ＲＮＡにつき濃縮した。

【００７１】２．Ｕ９３７ｃＤＮＡ−λｇｔ１０保存物
の作成 ｃＤＮＡの合成 上記のように分離した２０μｇのポリ（Ａ）^＋ｍＲＮＡ
からｃＤＮＡを合成した。ポリ（Ａ）^＋ｍＲＮＡをＨ_２
Ｏ中で５００μｇ／ｍｌまで希釈し、６５℃まで３分間
加熱し、ドライアイス−プロパノール浴中で急速冷却
し、次いでこれを解凍させた。次いで、ＲＮＡを０．１
Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３、４２℃）と０．０１Ｍ
ＭｇＣｌ_２と０．０１Ｍ ＤＴＴと１ｍＭ ｄＣＴＰ
と１ｍＭｄＧＴＰと１ｍＭ ｄＴＴＰと０．５ｍＭ ｄ
ＡＴＰと１００μＣｉ α−Ｐ^{３ ２}−ＡＴＰ（３０００
Ｃｉ／ミリモル、アメルシャム社もしくはニュー・イン
グランド・ヌクレア社）と２０μｇオリゴ（ｄＴ）
_{１２−１８}（ＰＬ−バイオケミカルス社）と０．０３Ｍ
β−メルカプトエタノールと５ｍＭバナジルリボヌク
レオシド錯体（ベセスダ・リサーチ・ラボラトリース
社）と１６９Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素（生化学・アメリカ
社）とで構成された反応混合物に加えた。反応混合物の
最終容積を２００μｌにした。この混合物を室温で２分
間かつ４４℃で６時間培養した。反応を１／１０容積の
０．５Ｍ Ｎａ_２ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の添加によっ
て停止させた。

【００７２】この反応混合物を０．１５Ｍ ＮａＯＨに
調整し、かつ混合物を３７℃にて１２時間培養し、次い
で１／１０容積の１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）お
よびＨＣｌで中和した。これをフェノール対クロロホル
ム飽和したＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ
７．０）および１ｍＭ Ｎａ_２ＥＤＴＡ）で抽出した。
水相を０．０１Ｍ（ｐＨ７．４）、０．４Ｍ ＮａＣ
ｌ、０．０１Ｍ Ｎａ_２ＥＤＴＡ、０．０５％ＳＤＳ中
にセファデックスＧ１５０の７×２５ｃｍ床を含有する
５ｍｌの無菌プラスチックピペットによってクロマトグ
ラフにかけた。末端を含まない先端ピークを集め、ｃＤ
ＮＡを２．５容積の９５％エタノールで−２０℃にて沈
澱させた。この反応は１μｇの一本鎖ｃＤＮＡを与え
た。

【００７３】二重鎖の合成 一本鎖ｃＤＮＡを２００μｌ（最終容量）の０．１Ｍ
ヘペス（ｐＨ６．９）、０．０１Ｍ ＭｇＣｌ_２、０．
００２５Ｍ ＤＴＴ、０．０７Ｍ ＫＣｌ、１ｍＭ ｄ
ＸＴＰおよび７５Ｕクレノー断片ＤＮＡポリメラーゼ１
（ベーリンガーマンハイム社）に再懸濁させ、かつ反応
混合物を１４℃にて２１時間培養した。Ｎａ_２ＥＤＴＡ
（ｐＨ８．０）を０．０１２５Ｍまで添加して反応を停
止させ、フェノール：クロロホルムで最初のｃＤＮＡ工
程におけると同様に抽出し、水相を０．０１Ｍトリス−
ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．０１
ＭＮａ_２ＥＤＴＡ、０．０５％ＳＤＳにてＧ１５０カラ
ムでクロマトグラフにかけた。再び、末端を含まない放
射性ピークを集め、ＤＮＡをエタノール沈澱させた。

【００７４】次いで、４２Ｕ逆転写酸素で得られたＤＮ
Ａを５０μｌの０．１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．
３）、０．０１Ｍ ＭｇＣｌ_２、０．０１Ｍ ＤＴＴ、
０．１ＭＫＣｌ、１ｍＭ ｄＸＴＰ、０．０３Ｍ β−
メルカプトエタノールにて３７℃で１時間培養して、二
重鎖の合成を完結させた。反応を停止させ、かつ上記と
同様に処理した。

【００７５】二重鎖合成の際に形成されたヘアピンルー
プを次のように切断した：ペレットを５０μｌの０．０
３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）、０．３Ｍ ＮａＣ
ｌ、０．００３Ｍ ＺｎＣｌ_２に再溶解させ、かつこれ
を１００ＵのＳ_１ヌクレアーゼ（シグマ社）により室温
で３０分処理した。ＥＤＴＡの添加によって反応を停止
させ、上記と同様に処理した。Ｓ_１処理後の収量は９０
０ｎｇのｄｓＤＮＡであった。

【００７６】Ｓ_１ヌクレアーゼ切断の後に平滑末端を確
保するため、ＤＮＡを０．０１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ
７．４）、０．０１Ｍ ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ ＤＴＴ、
０．０５Ｍ ＮａＣｌ、８０μＭ ｄＸＴＰおよび６０
μｌの１２．５Ｕクレノーにて１４℃で９０分間処理
し、５０：５０のフェノール対クロロホルムで抽出し、
かつＤＮＡを０．０１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．
４）、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．０１Ｍ ＥＤＴＡ、
０．０５％ＳＤＳにてＧ５０スピンカラム（１ｍｌ注射
器）でクロマトグラフにかけた。

【００７７】次いで、ｄｓＤＮＡをメチル化し、その際
ＤＮＡを最終容積３０μｌの０．１Ｍトリス−ＨＣｌ
（ｐＨ８．０）、０．０１Ｍ Ｎａ_２ＥＤＴＡ、２４μ
ｇ ＢＳＡ、０．００５Ｍ ＤＴＴ、３０μＭ Ｓ−ア
デノシルメチオニンおよび５ＵＥｃｏＲΙメチラーゼに
より３７℃で２０分間処理した。反応物を７０℃まで１
０分間加熱し、冷却し、５０：５０のフェノール対クロ
ロホルムで抽出し、かつ上記と同様にＧ５０スピンカラ
ムでクロマトグラフにかけた。

【００７８】９００ｎｇのｃＤＮＡを次の条件により燐
酸化ＥｃｏＲΙリンカ（ニュー・イングランド・ビオラ
ブス社）に結合させた：０．０５Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ７．８）、０．０１Ｍ ＭｇＣｌ_２、０．０２Ｍ Ｄ
ＴＴ、１ｍＭ ＡＴＰ、５０μｇ／ｍｌ ＢＳＡ、０．
５μｇリンカ、３００Ｕ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、最終
容積７．５μｌ、１４℃にて３２時間。

【００７９】反応物を０．１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ
７．５）、０．０５Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣ
ｌ_２、１００μｇ／ｍｌ ＢＳＡ、１２５Ｕ ＥｃｏＲ
Ι（ニュー・イングランド・ビオラブス社）に調整し、
混合物を３７℃にて２時間培養し、５０：５０のフェノ
ール対クロロホルムで抽出し、かつこのＤＮＡを上記と
同様にＧ５０スピンカラムでクロマトグラフにかけた。

【００８０】ｃＤＮＡを１００μｌの０．０１Ｍトリス
−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．１ＭＮａＣｌ、１ｍＭ
ＥＤＴＡに再溶解し、かつ同じ緩衝液で激しく洗浄した
（結合阻止剤を除去するため）１×５０ｃｍのビオゲル
Ａ５０（ビオラド社）カラムにてクロマトグラフにかけ
た。フラクションの１部をＴＢＥ緩衝液（０．０８９Ｍ
トリス−ＨＣｌ、０．０８９Ｍ硼酸及び２．５ｍＭ Ｎ
ａ_２ ＥＤＴＡ）における１％アガロースゲルで処理
し、乾燥させかつ−７０℃に１晩露出した。５００塩基
対より大きいフラクションを全て集め、ＤＮＡをエタノ
ール沈澱させて、ＥｃｏＲΙ切断されたλｇｔ１０クロ
ーン化ベクター中へクローン化させた。寸法分画カラム
により１２６ｎｇのｃＤＮＡを得、その平均寸法は約１
５００ｂｐであった。

【００８１】保存物の作成 ５μｇのＥｃｏＲΙ切断したλｇｔ１０を２０ｎｇのｃ
ＤＮＡおよびＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液と共に４２℃に
て１５分間培養してｃａｓ部位を融合させ、次いでエッ
ペンドルフ遠心分離器で５秒間遠心分離しかつＡＴＰを
１ｍＭまで添加すると共に、２４００Ｕ Ｔ４ ＤＮＡ
リガーゼ（ニュー・イングランド・ビオラブス社）を最
終容積５０μｌまで加えた〔ヒュン・ヤングおよびデー
ビス、「λｇｔ１０およびλｇｔ１１におけるｃＤＮＡ
保存物の作成およびスクリーニング」、ＤＮＡクローニ
ング：実際的方法（Ｄ．グローバー編集）。ＩＲＬプレ
ス社（オックスフォード１９８４）〕。結合物を１４℃
にて１晩培養した。λｇｔ１０ｃＤＮＡ結合混合物をア
メルシャムパッケージ混合物〔アメルシャム・パッケー
ジング・プロトコール〕を用いてファージ粒子中へ挿入
し、かつ０．５ｍｌのＳＭ緩衝液（１００ｍＭ ＮａＣ
ｌ、１０ｍＭ ＭｇＳＯ_４、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ
（ｐＨ７．５）および０．０１％ゼラチン）で希釈し
た。

【００８２】次いで、イー・コリＣ６００ｈｆｌ細胞に
これらのファージ粒子を感染させて１×１０^７の独立し
た組換体のｃＤＮＡ保存物を作成した〔Ｔ．マニアチス
等、モレキュラ・クローニング、第２３５頁（コールド
・スプリング・ハーバー １９８２）〕。

【００８３】保存物を移植しかつ増殖させるため、１ｍ
ｌの細胞および２５０μｌのパッケージ混合物を室温で
１５分間培養し、ＬＢ＋ＭｇＳＯ_４トップアガロースで
５０℃にて５０ｍｌまで希釈し、かつＬＢ Ｍｇ Ｎｕ
ｎｃプレートに移植した。これは２×１０^５プレートの
プラーク密度を示した。これらのプレートを、プラーク
がほぼ接触するまで３７℃にて約８時間培養した。

【００８４】これらプレートに５０ｍｌの冷ＳＭ緩衝液
（０．０１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．０１
Ｍ ＭｇＣｌ_２、０．１ｍＭ Ｎａ_２ＥＤＴＡ）を満た
し、かつジャイロ・ロータリー振とう機にて４℃で１晩
溶出させた。溶出液を２５０ｍｌ瓶に集め、ソルバール
ＧＳＡ型ロータにて６Ｋで１０分間遠心分離した。上澄
液を同容積の冷２０％ＰＥＧ４０００−２Ｍ ＮａＣｌ
にて氷中で３時間処理し、かつこれらファージをＲＣ−
３Ｂソルバール型遠心分離器にてＨ４０００ロータで４
Ｋにて３０分間遠心分離することによりペレット化させ
た。ファージペレットを充分に排液し、６０ｍｌＳＭ中
に再懸濁させかつＳＳ３４ロータで１０，０００ｒｐｍ
にて遠心分離することにより残骸を除去した。上澄液を
この上澄液１０ｍｌに７ｇのＣｓＣｌを添加して３．５
Ｍ ＣｓＣｌに調整した。７０．１ベックマン型ロータ
で５０，０００ｒｐｍにて１５℃で１８時間遠心分離す
ることによりファージ帯を得た。これらのファージ帯を
集めかつ４℃にて保存物として蓄えた。得られたタイタ
ーは２．２×１０^１３ＰＦＵ／ｍｌであった。

【００８５】保存物のスクリーニング 標識したオリゴヌクレオチド試料（すなわち保存物２お
よび３）を用いてリポコルチン配列につき保存物をスク
リーニングし、その際ウーのプラークハイブリッド化ス
クリーニング技術を用いた〔Ｓ．Ｌ．Ｃ．ウー、「組換
ファージスクリーニングのための敏感かつ迅速な方
法」、メソッズ・イン・エンチモロジー、第６８巻、第
３８９−３９６頁（アカデミック・プレス社 １９７
９）〕。

【００８６】Ｌブロスおよび０．２％マルトースにおけ
るＣ６００ｈｆｌ細胞の１晩培養物をペレット化し、か
つ同容積のＳＭ緩衝液に再懸濁した。０．９ｍｌの細胞
に２×１０^５ファージ粒子を室温にて１５分間予備吸着
させた。懸濁液をＬＢ＋１０ｍＭ ＭｇＳＯ_４および
０．７％アガロースにて５５℃で５０ｍｌまで希釈し、
これをＬＢ Ｍｇ Ｎｕｎｃプレートに移植した。この
種のプレート１０枚をスクリーニングした。これらプレ
ートを、プラークがほぼ接触するまで３７℃にて約８時
間培養した。次いで、プレートを４℃にて１時間冷却し
てアガロースを硬化させた。遺伝子スクリーン＋フィル
タをイー・コリＣ６００ｈｆｌの１晩培養細胞の１：１
０希釈物に室温で１０分間予備浸漬して、イー・コリ菌
体の表層により各フィルタを覆った。次いで、プラーク
保存物プレートからのλファージ粒子をこれらのバクテ
リヤ被覆したフィルタへ次のように移した：フィルタを
組換プラークを有するプレート上へ５分間載置し、次い
で持上げかつこれらフィルタをＬＢ＋１０ｍＭ ＭｇＳ
Ｏ_４で直立させたプラーク含有のプレートと共に３７℃
にて５時間培養した。

【００８７】次いで、これらのフィルタを０．５Ｎ Ｎ
ａＯＨのプールに５分間載せて溶菌し、次いで１Ｍトリ
ス−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）で中和し、１Ｍトリス−ＨＣ
ｌ（ｐＨ７．０）中に浸漬し、かつ菌体の残骸を除去し
た。

【００８８】これらフィルタを０．２％ポリビニル−ピ
ロリドン（Ｍ．Ｗ．４０，０００）、０．２％フィコー
ル（Ｍ．Ｗ．４０，０００）、０．２％牛血清アルブミ
ン、０．０５Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１Ｍ塩
化ナトリウム、０．１％ピロ燐酸ナトリウム、１％ＳＤ
Ｓ、１０％硫酸デキストリン（Ｍ．Ｗ．５００，００
０）および変性鮭の精子ＤＮＡ（≧１００μｇ／ｍｌ）
においてオリゴヌクレオチド試料２および３に対し業者
の指示にしたがってハイブリッド化させた（ニュー・イ
ングランド・ヌクレア社によるプラークスクリーニング
膜に対する指示）。自動放射線分析によってハイブリッ
ド化λ−ｃＤＮＡ配列を検出した。

【００８９】この技術により、２０個の陽性プラークを
釣上げかつ同じ試料を用いて低密度で再スクリーニング
した。

【００９０】これらクローンのＤＮＡを分離し、Ｅｃｏ
ＲＩで切断し、かつこれらをラットのリポコルチン試料
の４種の保存物とハイブリッド化し、その際サウザンブ
ロット技術を用いた〔Ｅ．Ｍ．サウザン、「ゲル電気泳
動により分離したＤＮＡ断片における特定配列の検
出」、ジャーナル・モレキュラ・バイオロジー、第９８
巻、第５０３−５１８頁（１９７５）〕。２種のクロー
ン、すなわちλ９−１１１およびλ４−２１１は、Ｔ２
４試料だけでなくＴ２２ａおよびＴ２９試料にもハイブ
リッド化した挿入ｃＤＮＡを含有した。

【００９１】これらファージのＤＮＡをＥｃｏＲＩで制
御し、かつｃＤＮＡ挿入物を分離した。クローン９−１
１１をＥｃｏＲΙで制限することにより１４００塩基対
の断片を得る一方、クローン４−２１１の制御により３
種のＥｃｏＲΙ断片、すなわち長さ１３００，３００お
よび７５塩基対を得た。これら断片の幾つかをプラスミ
ドｐＵＣ１３中へサブクローン化して組換プラスミドｐ
Ｌ９／２０（９−１１１）、ｐＬ４／１０大型（４−２
１１，１３００ｂｐ）およびｐＬ４／１０小型（４−２
１１，３００ｂｐ）を得た。次いで、これらプラスミド
をマキサム及びギルバートの方法によって配列決定した
〔Ａ．Ｍ．マキサムおよびＷ．ギルバート、「ＤＮＡの
新規な配列決定方法」、プロシーディング・ナショナル
・アカデミー・サイエンス・ＵＳＡ、第７４巻、第５６
０−５６４頁（１９７７）〕。この配列決定分析は、こ
れらクローンが精製ラットリポコルチンのアミノ酸配列
に一致するが、殆どの５′配列が欠失していると思われ
るヌクレオチド配列を含有することを示した。

【００９２】ｐＬ９／２０の４８０塩基対ＥｃｏＲＩ−
ＢｇｌＩＩ断片を試料として使用することにより、Ｕ９
３７／λｇｔ１０保存物を再スクリーニングした。陽性
の７２種を分離しかつ低密度で再スクリーニングするこ
とにより、部分的にプラークを精製した。これら陽性物
のそれぞれのＤＮＡをＨｈａＩで切断し、かつサウザン
ブロット技術〔Ｅ．Ｍ．サウザン、上記〕により分析
し、その際試料として３０オリゴヌクレオチド配列（リ
ポ１６）を使用した。リポ１６は、図４に示した配列の
塩基対８１−１１１で始まる配列に相当する。これらク
ローンのうち１４種は陽性信号を示し、かつこれらをゲ
ノム配列決定によりさらに分析し〔Ｇ．チャーチおよび
Ｗ．ギルバート、プロシーディング・ナショナル・アカ
デミー・サイエンス・ＵＳＡ、第８１巻、第１９９１頁
（１９８４）〕、その際ＤＮＡをＭｓｐＩで切断すると
共にリポ１６を試料として使用した。７種のクローンλ
Ｌ１１０，λＬ１０６，λＬ１１２，λＬＣ，λＬＨ，
λＬＮおよびλＬＤＤがリポ１６試料の配列に対し８１
塩基対の配列５′を含んでいた。

【００９３】これらのクローンは、３６３アミノ酸をコ
ードしうる中断してない開放読枠を有するｃＤＮＡ配列
を有する（図４参照）。リポコルチンに対する開始ＡＴ
Ｇコドンは、図４のヌクレオチド５２〜５４に位置する
ＡＴＧであると思われる。しかしながら、図４に示した
クローンのＤＮＡ配列は、天然リポコルチンのＮ−末端
におけるアミノ酸をコードする１個もしくはそれ以上の
コードを欠失していると思われる。これらの潜在的な欠
失コドンは、必要に応じ慣用のハイブリッド化条件を用
いてゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡの保存物からこれらの
クローン、より好ましくはこれらクローンの５′末端の
部分を試料として用いることにより分離することができ
る。次いで、全長クローンを慣用の結合技術およびリポ
コルチンコード化クローンを用いて作成することができ
る。

【００９４】図４のλＬＣはリポコルチン用の全長遺伝
子を有することが確認された。λＬＣｃＤＮＡにおける
ヌクレオチド５２−５４のＡＴＧ（図４）が最初の読枠
内のメチオニンコドンであり、したがって開始メチオン
であることを確認するため、プライマ延長によってリポ
コルチンｍＲＮＡの５′配列を決定した。λＬＣの配列
１０−３７に同族の２７オリゴヌクレオチド（リポ１
８）をＰ^３２−（γ）−ＡＴＰで標識し、かつヒト胎盤
ポリ（Ａ）^＋ＲＮＡにハイブリッド化させた。プライマ
としてのこのオリゴヌクレオチドとＡＭＶ逆転写酵素と
を用いて、リポコルチンｍＲＮＡの殆どの５′末端にお
ける６０塩基対断片を転写した。この断片をゲル精製
し、かつマキサムおよびギルバートの配列決定技術（上
記）によって配列決定した。得られた配列は、λＬＣの
配列１〜３７に同族の３７塩基対を示すと共に、リポコ
ルチンｍＲＮＡの５′末端を示すさらに２３個のヌクレ
オチドを示した。

【００９５】ｍＲＮＡが実際に２２に示したプライマ延
長よりも長く、しかも５′末端と間違えるような逆転写
酵素の強力な停止信号となる可能性を排除するため、ｍ
ＲＮＡの正確な寸法を決定した。λＬＣの配列９４〜１
２８に対し同族のオリゴヌクレオチド（リポ１７）を、
胎盤ポリ（Ａ）^＋ＲＮＡにハイブリッド化させかつＲＮ
ＡアーゼＨで切断した。ＲＮＡアーゼＨはＲＮＡをＤＮ
Ａとのハイブリッドにおいてのみ切断し、したがって明
確な切断部をｍＲＮＡ中へリポ１７がハイブリッド化し
た部位に導入する。次いで、ＲＮＡを配列決定用ゲルで
分離し、遺伝子スクリーンでブロットし、かつＰ^３２標
識したリポ１８で処理した。これによりリポコルチンｍ
ＲＮＡの５′末端の正確な寸法を決定することができ、
これはプライマ延長により得られた寸法に一致した。

【００９６】本発明のｃＤＮＡ配列をさらに利用してヒ
トゲノムコスミドもしくはファージ保存物をスクーニン
グし、ヒトリポコルチン様ポリペプチドをコードするヒ
トゲノム配列を分離することもできる。たとえば、プラ
スミドｐＬ９／２０のＥｃｏＲＩ断片を用いて部分Ｈａ
ｅＩＩＩ−ＡｌｕＩヒト肝臓保存物をスクリーニングし
（Ｒ．ローン等、「クローン化したヒトＤＮＡの保存物
からの結合δおよびβグロビン遺伝子の分離および特性
化」、セル、第１５巻、第１１５７−１１７４頁（１９
７８））かつ陽性クローンを得た。これはＮｃｏＩ−Ｐ
ｓｔＩ−切断ｐＫＫ２３３−２〔Ｅ．アマン等、「大腸
菌におけるクローン化遺伝子の制御発現に有用なハイブ
リッドＴｒｐ−Ｌａｃプロモータ」、ジーン、第２５
巻、第１６７−１７８頁（１９８３）〕とＢｇｌＩＩ−
ＰｓｔＩ並びにＮｃｉＩ−ＢｇｌＩＩ断片をｐＬ９／２
０から用いる３部分の結合により作成した（図５）（プ
ラスミドｐＬ９／２０）。

【００９７】これらのヒトｃＤＮＡおよびゲノム配列を
使用して、当業界で周知された技術により真核および原
核宿主細胞を形質転換させ、臨床的かつ産業的に有用な
量でヒトリポコルチン様ポリペプチドを産生させること
ができる。

【００９８】さらに、本発明のｃＤＮＡ配列は別のスラ
イス物から得られる大型種類のｍＲＮＡに含有されるこ
とも了解すべきである。この種のｍＲＮＡは、成熟蛋白
の他にリポコルチンに対する信号配列をコードする。

【００９９】Ｄ．イー・コリにおけるリポコルチン蛋白
の発現 プラスミドｐＫＫ２３３．ＬＩＰ．１（これはリポコル
チンコード化領域の部分配列を有する）は、図４に示し
たｐＣＵ１３のＥｃｏＲＩ部位に挿入されたλＬＣのｃ
ＤＮＡ挿入物におけるヌクレオチド６７−１３７６のＤ
ＮＡ配列を含有する。

【０１００】この結合およびその後のイー・コリ菌株Ｈ
Ｂ１０１ Ｉ^Ｑへの形質転換によって得られた形質転換
体を、Ｌブロスとアンピシリンとを含有するマイクロ測
定穴部に入れて、１晩増殖させた。次いで、１晩培養物
をＬブロス寒天とアンピシリンとのプレートにおけるニ
トロセルロースフィルタの上に４反復で複製させ、３７
℃にて約４時間培養した。次いで、これらニトロセルロ
ースをＩＰＴＧ（１０μｇ／ｍｌ）を含有するＬブロス
プレートに移して０，３０，６０もしくは１２０分間培
養し、次いでリゾチーム−洗剤で処理して、コロニーを
溶菌させ、かつ最後にラットのリポコルチンに対して作
成した交差反応血清を用いてウエスタンブロット分析を
行った。さらに、これら形質転換体をプラスミド制限地
図によって分析した。全てのウエスタン分析の陽性コロ
ニーは、予想制限断片を有するプラスミドを含有した。
陽性コロニーからのイー・コリの調製物をさらにＳＤＳ
ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析した。こ
れら調製物をラットのリポコルチンに対する抗体を用い
てウエスタンブロット分析することにより、分子量３
１，０００の切断蛋白を検出した。

【０１０１】さらに、全長ヒトリポコルチンを産生させ
るためのイー・コリにおける各種の発現ベクターを作成
した。全ては図４に示した配列において最初のメチオニ
ンから出発する完全な構成である。上記の手順により、
ラットのリポコルチンに対し作成した抗血清を用いて切
断蛋白につき発現を確認した。

【０１０２】たとえば、図６はプラスミドｐＬｉｐｔｒ
ｃ１５５Ａ、すなわちプラスミドｐＫＫ２３３−２から
得られたｔｒｃ発現ベクターを示している〔Ｅ．アマン
等、上記〕。このｐＬｉｐｔｒｃ１５５Ａはハイブリッ
ドプロモータを有し、これはｌａｃからの−１０領域と
ｔｒｐからの−３５領域とを有する。さらに、これは５
Ｓ ＲＮＡ Ｔ_１Ｔ_２ターミネータとアンピシリン耐性
を付与するβ−ラクタマーゼ遺伝子とを含有する。

【０１０３】ｐＬｉｐｔｒｃ１５５Ａは次のように作成
した：プラスミドｐＫＫ２３３−２をＮｃｏＩおよびＨ
ｉｎｄＩＩＩで制限して線状断片を得た。プラスミドｐ
Ｌ９／２０をＨｉｎｄＩＩＩで部分切断し、次いでＥｃ
ｏＲＩで完全切断し、次いで、１０９０断片をアガロー
スゲル電気泳動によって分離した。次いで、これら２種
の断片を完全切断し、かつ開始ＡＴＧコドンを有するＮ
ｃｏＩ−ＥｃｏＲＩリンカおよびヒトリポコルチンｃＤ
ＮＡにおけるＥｃｏＲＩ部位に対する５個のアミノ酸
５′をコードする配列の存在下で結合させた。

【０１０４】次いで、得られたｐＬｉｐｔｒｃ１５５Ａ
発現ベクターを用いてイー・コリ菌株ＪＡ２２１および
Ｗ３１１０Ｉ^Ｑを形質転換させ、かつ形質転換した菌株
を１ｍＭ ＩＰＴＧと３５μｇ／ｍｌアンピシリンとを
含有するＬＢ培地中で４時間増殖させて発現を誘発させ
た。形質転換宿主細胞の粗製溶解物をＳＤＳポリアクリ
ルアミドゲル分析にかけると、見掛け分子量３７Ｋｄの
１個の新たな蛋白帯を示した。ｐＬｉｐｔｒｃ１５５Ａ
で形質転換されてない菌株或いはこのプラスミドで形質
転換しているが蛋白の産生につき制御された菌株からの
比較抽出物は、この３７Ｋｄ蛋白を示さなかった。たと
えば、ＪＡ２２１宿主をｐＬｉｐｔｒｃ１５５Ａで形質
転換させると、３７Ｋｄ蛋白が全蛋白のほぼ２％になる
ことが判明した。

【０１０５】ヒトリポコルチンを発現することをさらに
証明するため、同じ溶解物をさらにラットのリポコルチ
ンに対して発生した抗体を用いてウエスタンブロット分
析にかけた。３７Ｋｄ蛋白のみがラットの蛋白に対する
抗体に免疫反応性を示した。さらに、ウエスタンブロッ
ト分析により、Ｕ９３７細胞からの天然ヒトリポコルチ
ン（抗ラット蛋白抗体に対し免疫反応性により検出され
る）は、寸法において発現した３７Ｋｄ蛋白とほぼ同じ
であり、ゲルの同じ位置に帯を有することを示した。

【０１０６】最後に、発現した蛋白の少量をＳＤＳポリ
アクリルアミドゲルから電気溶出させ、かつＮ−末端配
列分析にかけた。得られたアミノ酸配列は、図４のλＬ
ＣｃＤＮＡの予想アミノ酸配列と一致した。

【０１０７】発現されたヒトリポコルチンは、上記実施
例Ａで記載したインビトロの分析において外来性のホス
ホリパーゼＡ_２を阻止した。この阻止を、先ず粗製溶解
物を用いかつ後に発現蛋白の一層精製された調製物を用
いて検出した。フランス圧力セルで作成した粗製溶解物
の可溶性フラクションをホスホリパーゼ阻止活性につき
分析した際、下記表１に示す結果が得られた。阻止活性
は、プラスミドｐＬｉｐｔｒｃ１５５Ａを含有するイー
・コリ溶菌物には検出されたが、このプラスミドを含有
しないイー・コリからの溶菌物には活性が検出されなか
った。ゲル分析により決定した際、これら２種の抽出物
における唯一の差は阻止性フラクションに３７Ｋｄ蛋白
が存在することであった。この３７Ｋｄ蛋白は溶菌物に
おける全蛋白の１％未満であることを突き止めた。さら
に、音波処理した溶菌物を分析した際、同じ結果が得ら
れた。

【０１０８】阻止活性は可溶性の溶菌物に直接検出され
たが、イー・コリにおける３７Ｋｄ蛋白の大部分は不溶
性であり、したがって菌体をフランスプレスで溶菌させ
た後に低速度遠心分離により除去された。この不溶性蛋
白をグアニジン塩酸塩で粒状物質から抽出し、１Ｍ尿素
に対し透析し、次いで、ホスホリパーゼ阻止活性につき
分析した。この分析の結果を下記表２に示す。透析物は
１ｍｌ当り約２００Ｕの阻止活性を有した（１Ｕは１５
ｎｇのＡ_２を阻止する）。この活性が蛋白の結果であ
り、たとえば脂質のような抽出物中の他の成分によるも
のでないことを確認するため、表２で使用した溶菌物２
５μｌをトリプシンと共に培養した。下記表３に示すよ
うに、阻止活性は極めてトリプシン感受性であった。

【０１０９】

【表１】 粗製イー・コリ溶菌物におけるホスホリパーゼ阻止活性 プラスミドｐＬｉｐｔｒｃ１５５Ａを含有するまたは含
有しないイー・コリのＷ３１１０Ｉ^Ｑ菌株の培養物をＩ
ＰＴＧで誘発させ、かつフランス加圧セルで溶菌させ
た。１０，０００ｇにて２０分間遠心分離することによ
り粒状物質を除去した。可溶性フラクションをホスホリ
パーゼ阻止活性につき分析した。示した数値は、５０μ
ｌの抽出物を豚膵臓ホスホリパーゼＡ_２の１００ｎｇに
よって分析した数回の分析の平均値である。

【０１１０】 試 料 阻止％ Ａ_２のみ ０ Ａ_２＋イー・コリ，プラスミドなし ０ Ａ_２＋イー・コリ，ｔｒｃプラスミドを含有 ２４

【表２】部分精製した阻止剤の投与量反応曲線 ｐＬｉｐｔｒｃ１５５Ａで形質転換させたＪＡ２２１菌
体から回収した不溶性調製物（上記の溶菌処理を用い
る）を２５ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ６．０）における
６Ｍグアニジン塩酸塩に露出させた。粒状物質を遠心分
離（１００，０００ｇ、１時間）によって除去した。ヒ
ト３７Ｋｄ蛋白が極めて濃縮された抽出蛋白を、２５ｍ
Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ６．０）において１Ｍ尿素に対
し透析し、次いでホスホリパーゼＡ_２阻止活性につき分
析した。

【０１１１】 分析した抽出物μｌ 阻止％ ０ ０ ３ １２ １０ ２６ ３０ ５８

【表３】 阻止剤のトリプシン感受性 表２に示した部分精製調製物をトリプシンに対し室温で
１５分間露出し、次いで１００ｎｇの豚膵臓ホスホリパ
ーゼＡ_２を用いて分析した。使用した条件下において、
トリプシン処理はホスホリパーゼＡ_２活性を変化させな
かった。各試料につき２５μｌの阻止剤を分析した。

【０１１２】 試 料 トリプシンμｇ／ｍｌ 阻止％ Ａ_２のみ ０ ０ Ａ_２＋阻止剤 ０ ５４ Ａ_２＋阻止剤 １ ３ Ａ_２＋阻止剤 ３ ４ ｐＬｉｐｔｒｃ１５５Ａの他に、本発明の他の高レベル
の発現ベクターを作成した。たとえば、プラスミドｐＬ
ｉｐＰＬＴ４Ａを次のように作成した：プラスミドｐＰ
ＬＴ４ＨＴＮＦ〔ワルター・ファイエルスからの寄贈
物、このプラスミドは１９８４年１２月２７日付けでＤ
ＳＭ Ｎｏ．３１７５としてドイッチェ・ザンムルング
・ホン・ミクロオルガニスメン、ゲッチンゲン、西ドイ
ツ国に寄託したプラスミドと同一であり、かつイー・コ
リ菌株Ｃ６００の範囲内で寄託され、ｐＢＲ３２２−ｐ
Ｌ−Ｔ４−ｈＴＮＦと命名された〕を制限酵素ＣｌａＩ
およびＨｉｎｄＩＩＩで切断して線状断片を得た。プラ
スミドｐＬ９／２０をＨｉｎｄＩＩＩで部分切断し、次
いでＥｃｏＲＩにより完全切断し、次いで１３５０ｂｐ
断片をアガロースゲルから分離した。これら２種の断片
を、開始ＡＴＧを含有するＣｌａＩ−ＥｃｏＲＩリンカ
およびリポコルチンｃＤＮＡにおけるＥｃｏＲＩ部位に
対する５個のアミノ酸５′をコードする配列の存在下で
結合させた。得られた発現ベクターにおいて、Ｐ_Ｌプロ
モータはＰ_Ｌ，Ｔ４およびリポコルチンｍＲＮＡの配列
を含むハイブリッドｍＲＮＡの転写を指示する。このｍ
ＲＮＡの翻訳はヒトリポコルチンコード化配列の最初の
ＡＴＧから始まり、３７Ｋｄ蛋白を生ずる。第２のテト
ラサイクリン耐性のプラスミドｐＬｉｐＰＬＴ４を作成
し、その際ｐＢＲ３２２のテトラサイクリン耐性遺伝子
をｐＬｉｐＰＬＴ４ＡのＳｃａＩ部位に挿入した。

【０１１３】イー・コリ菌株ＭＣ１０６１およびＣ６０
０ｐＣｉ８５７をｐＬｉｐＰＬＴ４Ａで形質転換させ、
かつＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動およびウエスタ
ンブロット分析によって上記と同様に発現を決定した。
イー・コリ抽出物は、ラットのリポコルチンに対する抗
体と反応する３７Ｋｄ蛋白を示した。

【０１１４】Ｅ．酵母におけるヒトリポコルチン蛋白の
発現 更に、酵母においてヒトリポコルチンを産生させるため
の発現ベクターを作成した。図７〜９はｐＢｇ１２０の
作成を示し、これは酵母菌体を形質転換させるために使
用すると、抗ラットリポコルチン抗体を用いるウエスタ
ンブロット分析により検出されるようにヒトリポコルチ
ンを発現する。

【０１１５】ｐＢｇ１２０は次のように作成した：プラ
スミドｐＬＸＶ−１はイー・コリプラスミドｐＢＲ３２
２および酵母プラスミド２μＤＮＡからのＤＮＡ複製の
オリジンを含有する。したがって、これはイー・コリお
よび酵母の両者で複製することができる（Ｊ．アーンス
ト、私的通信）。プラスミドｐＬＸＶ−１からＢａｍＨ
Ｉ部位を除去し、その際ＢａｍＨＩで切断し、Ｓ１ヌク
レアーゼにより３７℃にて３０分間処理し、かつＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼによって再環化させた（図７）。イー・コ
リＪＡ２２１を結合混合物で形質転換させ、かつプラス
ミドｐＬＸＶ−１−ＢａｍＨＩ⁻で分離した。

【０１１６】活性遺伝子のＡＴＧ開始コドンをｐＬＸＶ
−１で再編成するため、ｐＬＸＶ−１−ＢａｍＨＩ⁻を
ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断した。活性プロ
モータを有する大きい方の断片を分離した。この断片を
ＢａｍＨＩ末端およびＨｉｎｄＩＩＩリンカと２個の合
成リンカ（リンカ９および１０）とを有するヒトα１抗
トリプシン遺伝子を含有するＤＮＡ断片と結合させた。
ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位をプラスミド
中へ挿入するにはα１抗トリプシンＤＮＡ断片のみを使
用した。α１抗トリプシンをコードする２個の制限部位
間におけるＤＮＡ配列を次いで切除し、リポコルチンＤ
ＮＡ配列で置換した。プラスミドにこの制限部位を与え
るために使用した特定配列は不適切であり、任意のＤＮ
Ａ配列をα１抗トリプシンＤＮＡの代わりに使用するこ
とができるであろう。リンカ９は２種の配列ＡＡＴＴＡ
ＡＣＡＡＴＧＧＡＡおよびＡＡＴＴＡＡＣＣＡＴＧＧＡ
Ｇの混合物であり、リンカ１０はＧＡＴＣＣＴＣＣＡＴ
ＧＧＴＴおよびＧＡＴＣＴＴＣＣＡＴＴＧＴＴの混合物
である。リンカ９および１０の両者はＥｃｏＲＩおよび
ＢａｍＨＩ付着性末端を有し、リンカ９はＮｃｏＩ制限
部位とＡＴＧ開始コドンとを有する。この結合は、Ｅｃ
ｏＲＩおよびＢａｍＨＩ制限部位の喪失をもたらした。
イー・コリＪＡ２２１をこの結合混合物で形質転換さ
せ、かつアンピシリン耐性およびカナマイシン耐性につ
き選別して、Ｋａｍ^Ｒ遺伝子内に位置するＨｉｎｄＩＩ
Ｉ部位の再生を確保した。得られたプラスミドをｐＡＰ
Ｎと呼ぶ。

【０１１７】図８は酵母発現ベクター中へのヒトリポコ
ルチンをコードするＤＮＡ配列の挿入を示している。ヒ
トリポコルチン配列を２つの部分にクローン化した。第
１に、Ｎ末端領域を酵母アクチン発現制御配列の背後に
挿入して作用結合させた。プラスミドｐＴｒｐ３２１
（Ｒ．デボス等、「ヒトインタロイキン２ｃＤＮＡの分
子クローン化およびイー・コリにおけるその発現」、ヌ
クレイック・アシッド・リサーチ、第ＩＩ巻、第４３０
７−４３２３頁（１９８３））をＣｌａＩおよびＨｉｎ
ｄＩＩＩで切断し、大きい方の断片を作成したｐＬ９／
２０ １０９０−リンカ断片に結合させた（上記、第３
４頁）。

【０１１８】上記のようにヒトリポコルチンの発現につ
きスクリーニングしてプラスミドｐＴｒｐｌｉｐを分離
した。

【０１１９】次いで、ｐＡＰＮをＮｃｏＩで切断しかつ
酵母アクチン発現制御配列を有する小さい方の断片を分
離した。この断片を、ＮｃｏＩで線状化したｐＴｒｐ−
ｌｉｐに結合させた。このプラスミドをｐｔｒｐ−ｌｉ
ｐ−ａｐｎ−ｎｃｏと呼ぶ。ｐｔｒｐ−ｌｉｐ−ａｐｎ
−ｎｃｏをＨｉｎｄＩＩＩで切断し、酵母アクチン発現
制御配列とヒトリポコルチンのＮ末端領域に対応するＤ
ＮＡ配列とを有する断片を分離した。この断片をｐＡＰ
Ｎの大きい方のＨｉｎｄＩＩＩ断片に結合させ、プラス
ミドｐＢｇ１１４を作成した。

【０１２０】ヒトリポコルチンの残余のＣ−末端断片に
対応するＤＮＡ配列をｐＬ９／２０の８００ｂｐ Ｂｇ
ｌＩＩ−ＢａｍＨＩ断片から得た（上記）、（図９）。
ｐＬ９／２０をＢｇｌＩＩおよびＢａｍＨＩで切断し、
８００ｂｐ断片を電気溶出させた。この断片を、Ｂｇｌ
ＩＩで切断されているｐＢｇ１１４に結合させた。アク
チン発現制御配列に作用結合したヒトリポコルチンをコ
ードするＤＮＡ配列を含むプラスミドｐＢｇ１２０を分
離した。

【０１２１】ｐＢｇ１２０で形質転換させた酵母の抽出
物において、３７Ｋｄ蛋白を検出し、これは形質転換さ
れていない酵母菌体或いはヒトリポコルチン遺伝子を含
有しないプラスミドで形質転換させた酵母菌体には見ら
れない。この蛋白は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動においてイー・コリで産生されたヒト３７Ｋｄ
蛋白に正確に一致した（図１０）。

【０１２２】酵母においてヒト３７Ｋｄ蛋白は、可溶性
蛋白として産生される。これは全菌体蛋白の約４％に相
当する。組換蛋白を含有する酵母培養物を２０，０００
ｐｓｉにてフランス加圧セルで溶菌させ、かつ粒状物質
を遠心分離（１０，０００ｇ、１０ｍｉｎ）にて除去
し、阻止活性の約８０％が可溶性フラクション中に回収
された。阻止活性の分布はＳＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲル分析に基づくヒト蛋白の分布に正確に相関する。酵
母で産生された組換蛋白は、封鎖アミノ末端を有する。

【０１２３】Ｆ．哺乳動物細胞におけるヒトリポコルチ
ン蛋白の発現 さらに、哺乳動物宿主においてヒトリポコルチンを産生
させるため、発現ベクターを作成した。図１１−１３は
ｐＳＶＬ９１０９の作成を示し、これはＣａＰＯ_４方法
〔Ｆ．グラハム等、ジャーナル・バイロロジー、第５２
巻、第４５５−４５６頁（１９７３）〕によりｃａｓお
よびＣＨＯ宿主細胞中に移植すると、抗ラットのリポコ
ルチン抗体を用いるウエスタンブロット分析により検出
されるようにヒトリポコルチンを発現した。移植してな
い細胞では見られない３７Ｋｄ免疫反応性蛋白を検出
し、このことはベクターがヒト阻止蛋白を産生したこと
を示している。ｐＳＶＬ９１０９を次のように作成し
た：図１１に示したように、プラスミドｐＳＶ２ｇｐｔ
〔Ｒ．ムリガン等、プロシーディング・ナショナル・ア
カデミー・サイエンス・ＵＳＡ、第７８巻、第２０７２
−２０７６頁（１９８１）〕をＰｖｕＩＩおよびＨｉｎ
ｄＩＩＩで切断し、ＳＶ４０の早期プロモータを含有す
る３４０ｂｐ断片を分離し、これを予めＥｃｏＲＩで切
断したｐＡＴ１５３に挿入し、Ｓ１処理し、次いでＨｉ
ｎｄＩＩＩで切断した。得られたプラスミドｐＡＴ．Ｓ
Ｖ２はプロモータを含有した。次いで、このプラスミド
をＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで切断した。この部
位へ小型ｔスプライス部位を含有する配列をクローン化
した。この配列を他のプラスミドｐＴＰＡ１１９から分
離し、その際ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで切断し
た。３Ｋｂ挿入物はヒト組織プラスミノーゲン活性化剤
をコードするＤＮＡ配列を小型ｔスプライス部位と共に
含有した。この配列は、１９８４年８月２１日付けでＡ
ＴＣＣ Ｎｏ．３９８０８としてアメリカン・タイプ・
カルチャー・コレクション、ロックビル・メリーランド
州に寄託したｐＴＰＡ２５ ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨ
Ｉ断片に見られるものと同等である。ＨｉｎｄＩＩＩ−
ＢａｍＨＩ３Ｋｂ断片をｐＡＴ．ＳＶ２に結合してプラ
スミドｐＡＴ．ＳＶ２．ＴＰＡを生成させた。このベク
ターはＳＶ４０早期プロモータに続いてＨｉｎｄＩＩＩ
部位とＳＶ４０小型ｔスプライス信号とを有し、その前
にＢｇｌＩＩ部位を有する。

【０１２４】次いで、ヒトリポコルチン用のコード化配
列をｐＡＴ．ＳＶ２．ＴＰＡに挿入した。ＥｃｏＲＩお
よびＨｉｎｄＩＩＩ末端を有する２９ｂｐのオリゴヌク
レオチドを合成した（図１２参照）。このオリゴヌクレ
オチドは、ヒトリポコルチンの最初の６個のアミノ酸を
コードする配列を含む。この配列をｐＵＣ９〔Ｊ．ビィ
エイラ等、ジーン、第１９巻、第２５９−２６８頁（１
９８２）〕にクローン化させ、このｐＵＣ９は予めＥｃ
ｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断してｐＬＰＯ９００
を生成させたものである。このプラスミドをＥｃｏＲＩ
で切断し、かつ牛アルカリホスファターゼで処理した。
次いで、ヒトリポコルチン用のコード化領域に相当する
ｐＬ９／２０からの１．３Ｋｂ ＥｃｏＲＩ断片をｐＬ
ＰＯ９００にクローン化した。得られたプラスミドｐＬ
ＰＯ９０５は上流にＨｉｎｄＩＩＩ部位を有するヒトリ
ポコルチン用の全コード化領域を有する（図１２参
照）。これは、遺伝子がｐＡＴ．ＳＶ２．ＴＰＡのＳＶ
４０プロモータ背後にクローン化するのに適している。

【０１２５】図１３は、ヒトリポコルチン用の遺伝子を
ｐＡＴ．ＳＶ２．ＴＰＡ中に挿入して本発明の哺乳動物
発現ベクターを生成させることを示している。ヒトリポ
コルチン配列を発現ベクター中に２つの部分でクローン
化させた。先ず最初に、Ｎ−末端領域をＳＶ４０プロモ
ータの背後に挿入し、次いでＣ−末端領域を加えた。こ
のプラスミドｐＬＰＯ９０５をＨｉｎｄＩＩＩおよびＢ
ｇｌＩＩで切断し、かつヒトリポコルチンのＮ−末端領
域を有する５６０ｂｐ断片を分離した。ｐＡＴ．ＳＶ
２．ＴＰＡをＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｇｌＩＩで切断
し、かつベクターを含有する５Ｋｂ断片を分離し、これ
はＴＰＡ配列をもたなかった。このＨｉｎｄＩＩＩ−Ｂ
ｇｌＩＩベクター中へ、ヒトリポコルチンのＮ−末端領
域を有する５６０ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−ＢｇｌＩＩ断
片を挿入してプラスミドｐＬＰＯ９０８を得た。

【０１２６】ヒトリポコルチンのＣ−末端領域は、ｐＬ
９／２０の８００ｂｐ ＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩ断片の
内部に見られる。したがって、ｐＬ９／２０をＢｇｌＩ
ＩおよびＢａｍＨＩで切断し、次いで８００ｂｐ断片を
電気溶出させた。この断片を、予めＢｇｌＩＩで切断し
たプラスミドｐＬＰＯ９０８中へ結合し、牛アルカリホ
スファターゼで処理した。このプラスミドｐＳＶＬ９１
０９を分離した。このプラスミドはＳＶ４０早期プロモ
ータの下流に全ヒトリポコルチンコード化配列を有し、
それに続いてＳＶ４０の小型ｔスプライス信号を有し
た。プラスミドｐＳＶＬ９１０９を使用して、上記と同
様にｃａｓおよびＣＨＯ宿主を形質転換させた。

【０１２７】かくして、本発明のＤＮＡ配列を用い、ヒ
トリポコルチンを生物学上活性な形態で発現する高レベ
ルの発現ベクターを作成した。

【０１２８】ここに記載した方法で作成された組換ＤＮ
Ａ配列は、インビトロ・インターナショナル・インコー
ポレーション、アン・アーバー、ミシガンの培養物託機
関に寄託した培養物で例示される。この培養物は１９８
５年１月９日付けで寄託し、次のように同定されてい
る。

【０１２９】λＬＣ：ＩＶＩ Ｎｏ．１００４２ ここに記載した方法で作成された微生物は、それぞれ１
９８５年３月１２日および１９８５年８月１４日付けで
上記寄託機関に寄託された培養物で例示され、次のよう
に同定されている： イー・コリＷ３１１０Ｉ^Ｑ（ｐＬｉｐｔｒｃ１５５
Ａ）：ＩＶＩ Ｎｏ．１００４６ Ｓ．セレビシェ３３１−１７Ａ（ｐＢｇ１２０）：ＩＶ
Ｉ Ｎｏ．１００８８ Ｇ．生物学上活性なヒトリポコルチン様ポリペプチド断
片の産生 ホスホリパーゼ阻止活性を示し、分子量３７，０００の
ヒトリポコルチンよりも小さいポリペプチド断片の産生
が極めて望ましい。それより小さいポリペプチドは、た
とえば静脈内注射でなく経皮灌流によって標的細胞へ容
易に供給される。さらに、小さいポリペプチドは３７Ｋ
ｄ蛋白よりも安定な構造を有する。たとえば、３７Ｋｄ
蛋白のＮ−末端は疎水性アミノ酸の１群を有し、これは
分子間凝集物を形成させる一方、Ｃ−末端は適当でない
ジスルフィルド結合を形成しうる４個のシスティンを有
する（図４参照）。したがって、大きい蛋白のＮ−末端
およびＣ−末端の除去は、蛋白を高濃度で産生させる際
構造上の異質性を防止することができる。さらに、生物
学上活性な断片の分離はリポコルチン分子の活性部位の
特性化をより良好にすると共に、最適な治療価値を有す
る断片の設計を可能にする。

【０１３０】本発明のこの局面にしたがって親分子から
ポリペプチド断片を生成させるために各種の方法を使用
しうるが、ここではヒトリポコルチン様ポリペプチドを
下記の実施例にしたがって制限プロテアーゼ切断にかけ
るよう選択した。先ず最初に、各プロテアーゼにつき切
断条件を最適化して、発生する断片を一般に１０個以内
の少数となし、したがって容易に単離することができ
る。最適条件は一般に次の因子によって決定される：
（１）使用するプロテアーゼの種類；（２）標的蛋白の
物理状態、すなわち変性もしくは非変性条件；（３）切
断に要する時間；（４）温度；（５）使用するプロテア
ーゼの量；および（６）ｐＨ。

【０１３１】３７Ｋｄリポコルチン様ポリペプチドを切
断するため、２種の異なるプロテアーゼを使用した。第
１の種類はペプチド結合を非特異的に加水分解する。こ
の種類は、エラスターゼおよびプロテナーゼ、Ｋプロテ
アーゼによって代表される。プロテアーゼプラスミンお
よびスロンビンで代表される第２の種類は、特定のペプ
チド結合を加水分解する。この第２の種類は、恐らくア
ミノ酸配列と切断部位の周囲の構造の両者によって標的
蛋白を識別する。さらに、トリプシン、すなわち第３の
種類のプロテアーゼを使用して、活性ペプチド断片のＣ
−末端の位置決定を行った（下記に説明）。トリプシン
は特定のアミノ酸におけるペプチド結合を加水分解す
る。この種の他のプロテアーゼは、キモトリプシンおよ
びＶ８プロテアーゼを包含する。生物学的活性を有する
断片を得ることが望ましいため、非変性条件下で切断を
行なった。

【０１３２】１．組換ヒトリポコルチンからのプラスミ
ン切断断片の産生分離および特性化 プラスミン切断のための条件を最適化させるため、イー
・コリ産生させたヒトリポコルチン様ポリペプチドの１
部（１００μｇ）を１００ｍｌの０．２Ｍトリス−ＨＣ
ｌ（ｐＨ８．０）、５ｍＭ ＥＤＴＡと０．１ｍｇ牛血
清アルブミン／ｍｌの溶液で１０μｌ（１μｇ／μｌ）
のプラスミン（カルビオヘム社）と共に室温で培養し
た。異なる時間間隔で１５μｌを抜取り、８％ＳＤＳを
含有する緩衝液５μｌを添加し、次いでこれらの部分を
５分間煮沸することにより反応を停止させた。各時点に
おける切断混合物をＳＤＳ−ゲル電気泳動によって分析
した。図１４に示した結果は、培養１時間後に、殆ど全
部の蛋白が分子量３３，０００の断片まで切断されたこ
とを示す。この３３Ｋ断片は、より長時間の培養、或い
は増加量のプラスミンの存在下のいずれにおいても切断
に対し耐性であった。

【０１３３】上記の切断条件を用いて、５００μｇのヒ
トリポコルチン様ポリペプチドを７５μｇのプラスミン
と共に１時間培養した。反応をプロテアーゼ阻止アプロ
チニン（シグマ社）２５０ＫＩＵによって停止させた。
切断試料を、０．２Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、
５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％牛血清アルブミンにより４
℃で平衡化させたバイオゲルＰ−６０カラム（１．０×
５０ｃｍ）に装填した。１．１ｍｌのフラクションを集
めた。２８０ｎｍにて監視した断片の溶出経過は２つの
蛋白ピークを示した（図１５）。各ピークからのフラク
ションの１部を高圧液体クロマトグラフィーおよびＳＤ
Ｓゲル電気泳動によって分析した。これらの結果は、ピ
ークＩが分子量３３，０００の断片を有し（リポ−Ｌと
呼ぶ）、かつピークＩＩが分子量４，０００の断片（リ
ポ−Ｓと呼ぶ）を有することを示した。

【０１３４】バイオゲルＰ−６０カラムクロマトグラフ
ィーのフラクションをホスホリパーゼＡ_２阻止活性につ
き上記と同様に分析した。活性の大部分はピークＩに関
連した（図１５）。少量の阻止活性がピークＩＩに検出
されたが、この活性は断片濃度に依存せず、恐らく膜に
対する断片の非特異的結合によって引起こされたものと
思われる。

【０１３５】さらに、逆相高圧液体クロマトグラフィー
によって０．１％トリフルオロ酢酸における０〜７５％
のアセトニトリルの濃度勾配により２種の切断生成物を
分離し、その際Ｃ_４カラムクロマトグラフィー（ビダッ
ク社）を用いた。リポ−Ｓを３８％アセトニトリルで溶
出させ、かつリポ−Ｌを４８％アセトニトリルで溶出さ
せた。

【０１３６】気相配列決定装置（アプライド・バイオシ
ステムス４７０Ａ）を用いて、順次のエドマン減成によ
りリポ−Ｌ（３３Ｋ；ピークＩ）のＮ−末端アミノ酸を
決定した。ＰＴＨ−アミノ酸を５μｍのシアノカラム
（ハイパーシル社）で高圧液体クロマトグラフィーによ
り分析し、その際０．０２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ５．７）にて１５〜５５％のアセトニトリル対メタノ
ール（４：１）の濃度勾配を用いた。リポ−ＬのＮ−末
端アミノ酸配列がＨ_２Ｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇ
ｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｖａｌであることを確認した。
リポ−ＬのＮ−末端グリシンは３７Ｋ蛋白のＧｌｙ−３
０１に対応する。

【０１３７】断片のＣ−末端アミノ酸配列を決定するた
め、３７Ｋラットのリポコルチンのトリプシン分解ペプ
チド地図（図１６）を、各断片につき作成したトリプシ
ン分解ペプチド地図と比較した。２０μｌの３７Ｋリポ
コルチン様ポリペプチド（４０μｇ）を０．２Ｍトリス
−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１ｍ
ｇ牛血清アルブミン／ｍｌにて０．２ｍｌの０．１Ｍ
ＮＨ_４ ＨＣＯ_３＋１ｍＭ ＣａＣｌ_２で希釈した。次
いで、この混合物をトリプシンと共に３７℃で２４時間
培養した。この培養期間中、トリプシンを３つの時点で
加えた。すなわち、０時間に０．５μｇ、４時間後に、
０．２５μｇかつ１９時間後に０．２５μｇ。反応混合
物へ９０％蟻酸１０μｌを添加して切断を停止させた。
同一の条件を用いてプラスミン断片を切断したが、ただ
し先ず最初に高圧液体クロマトグラフィーから精製した
断片をスピードバック濃縮装置（サバント社）で乾燥
し、かつ残渣を０．１Ｍ ＮＨ_４ＨＣＯ_３および１ｍＭ
ＣａＣｌ_２中に溶解させた。

【０１３８】トリプシン分解断片を逆相高圧液体クロマ
トグラフィーによりＣ_１８カラム（スペクトラフィジッ
クス社）にて０．１％トリフルオロ酢酸中で０〜７５％
のアセトニトリルの濃度勾配により解離させた。次い
で、各ピークフラクションのアミノ酸配列を決定した。
先ず最初に、６Ｎ ＨＣｌ中でペプチドを２４時間加水
分解しかつベックマン６３００アミノ酸分析器にて組成
を決定することにより、各ピークのアミノ酸組成を確認
した。観察された組成を３７Ｋポリペプチドからの全て
の可能な断片の配列データに基づき予想組成と比較し、
各ピークを同定した。さらに、配列分析によってピーク
の幾つかにおけるアミノ酸配列を直接に決定した。

【０１３９】断片リポ−Ｌ（図１７のＢ）の地図を３７
Ｋポリペプチド（図１６）の地図と比較することによ
り、生物学上活性なリポ−Ｌ断片が３７Ｋポリペプチド
と同じＣ−末端アミノ酸配列を有すると結論した。した
がって、このデータはＮ−末端配列データと組合せれば
リポ−Ｌが３７Ｋポリペプチドのアミノ酸残基Ｎｏ．３
０〜Ｎｏ．３４６を含有することを示す。断片リポ−Ｓ
（図１７のＡ）のペプチド地図を３７Ｋポリペプチドの
地図と比較することにより、リポ−Ｓが３７Ｋ蛋白のア
ミノ酸残基Ｎｏ．１〜Ｎｏ．２９を有すると結論され
た。

【０１４０】２．組換ヒトリポコルチンからのエラスタ
ーゼ切断断片の産生、分離および特性化 ５０μｌの３７Ｋヒトリポコルチン様ポリペプチド（７
５μｇ）、０．２Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５
ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１ｍｇ牛血清アルブミン／ｍｌを
２．５μｇ（１０ｍＭ酢酸アンモニウム中１μｇ／μ
ｌ、ｐＨ６．０）のエラスターゼ（シグマ社）で室温に
て処理した。切断生成物を異なる時間間隔で上記と同様
に分析して、エラスターゼ切断に対する条件を最適化し
た。これらの結果は、２０分間の培養が１０Ｋ〜３３Ｋ
の範囲の分子量を有する断片を生成したことを示した。

【０１４１】１５０μｇの３７Ｋポリペプチドを５μｇ
のエラスターゼと共に上記したような最適条件下で培養
し、切断したポリペプチドをＳＤＳ−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動にかけた〔Ｄ．Ａ．ハガーおよびＲ．
Ｒ．ブルゲス、アナリチカル・バイオケミストリー、第
１０９巻、第７６−８６頁（１９８０）〕。このゲルを
０．２５Ｍ ＫＣｌ、２ｍＭ ＤＴＴ中に４℃で５〜１
０分間浸漬することにより、ポリペプチドのバンドを可
視化させた。次いで、ポリペプチドのバンドを切除し、
ゲルスライス物からＫＣｌを除去し、その際各スライス
物を２ｍＭ ＤＴＴを含有する脱イオン化水中で室温に
て１０分間浸漬した。これらの断片を次いで室温にてゲ
ルから２時間溶出させ、その際０．１％ＳＤＳ、０．２
Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、
５ｍＭ ＤＴＴ、０．０１％牛血清アルブミンの溶液を
使用した。次いで、断片を含有する溶液を氷冷したアセ
トンの溶液と−７０℃にて混合し、かつ−７０℃にて３
０分間培養した。１０，０００ｒｐｍ（ＳＳ３４ロー
タ）にて４℃で１０分間遠心分離することにより沈澱物
を集め、氷冷した８０％アセトンおよび０．２Ｍトリス
−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）と５ｍＭ ＤＴＴとを含有する
２０％緩衝液で１回洗浄した。遠心分離により沈澱物を
集め、これを減圧下で５〜３０分間乾燥させた。次い
で、乾燥した粉末を０．２Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．
９）、２ｍＭ ＤＴＴ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１牛血
清アルブミンにおける６Ｍグアニジン塩酸塩に２０分間
で溶解させた。次いで、この溶液に「再編成（ｒｅｎａ
ｔｕｒａｔｉｏｎ）」緩衝液（２０％グリセリンおよび
８０％０．２Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．９）、２ｍＭ
ＤＴＴ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％牛血清アルブミ
ン）を加えた。次いで、この溶液を４℃にて１晩静置さ
せた。次いで、上記したようにホスホリパーゼＡ_２阻止
活性につき分析した。ＳＤＳ−ゲル断片の活性を図１８
に示す。断片ｅ−１，ｅ−２，ｅ−３，ｅ−４およびｅ
−５はそれぞれ分子量３３Ｋ，３０Ｋ，２７Ｋ，２０Ｋ
および１８Ｋを有し、ホスホリパーゼＡ_２阻止活性を示
した。

【０１４２】次いで、調製用ＳＤＳ−ゲル電気泳動によ
って主たる活性断片（図１８のｅ−１，ｅ−４およびｅ
−５）を精製した。ゲルを０．２５Ｍ ＨＣｌに浸漬し
てポリペプチド帯を可視化させ、かつ生物学上活性なポ
リペプチド帯を切除した。標準技術〔Ｍ．Ｗ．ハンカピ
ラー、Ｅ．ルヤン、Ｆ．オストラダーおよびＬ．Ｅ．フ
ード、メソッズ・エンチモロジー、第９１巻、第２２７
−２３６頁（１９８３）〕を用いて断片を電気溶出させ
た。

【０１４３】ｅ−１，ｅ−４およびｅ−５のＮ−末端お
よびＣ−末端アミノ酸配列を決定した。精製した断片は
全て同一のＮ−末端アミノ酸配列を示した：Ｈ_２Ｎ−Ｇ
ｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｖａ
ｌ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ。このＮ−末端グリシンは
３７Ｋ蛋白のＧｌｙ−３０に対応する。

【０１４４】図１９は、これらの精製断片のトリプシン
分解ペプチド地図を示している。これらの地図を３７Ｋ
蛋白の地図（図１６）と比較し、１８Ｋのｅ−５断片が
トリプシン分解断片Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−
Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ（３７Ｋ蛋白の残基Ｎ
ｏ．２０５−２１２）を欠如しかつすべての断片がこの
ペプチドを越えていることが判明した。このことは、切
断がこのペプチドの前で生じたことを示唆している。ペ
プチド地図は断片Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｓ
ｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ（３７Ｋ蛋白の残基Ｎ
ｏ．１７８−１８５）を含有する。したがって、この断
片のＣ−末端は３７Ｋ蛋白のＬｙｓ−１８５とＡｒｇ−
２１２との間に位置する。同様に、２０Ｋのｅ−４断片
のペプチド地図は、１８Ｋ断片に見られるすべての断片
とさらにペプチドＡｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ａ
ｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ（３７
Ｋ蛋白の残基Ｎｏ．２０５−２１４）とを含有する。し
たがって、この断片のＣ−末端は３７Ｋ蛋白のＬｙｓ−
２１４とＡｒｇ−２２８との間に存在する。３３Ｋのｅ
−１断片のＣ−末端は、３７Ｋ蛋白のＬｙｓ−３３７と
Ａｓｎ−３４６との間に位置する。

【０１４５】かくして、３７Ｋリポコルチン様ポリペプ
チドにおける少なくとも３種の生物学上活性なペプチド
断片を分離した。これら３種の断片は全て、３７Ｋポリ
ペプチドのＧｌｙ３０で始まりかつ３７Ｋ分子に沿って
異なる点で終端する同一のＮ−末端を有する。これら３
種のものは、全て全寸法のリポコルチン様ポリペプチド
のホスホリパーゼＡ_２阻止活性を示す。

【０１４６】イー・コリで産生させたヒトリポコルチン
様ポリペプチドからポリペプチド断片を生成させるため
上記方法を使用したが、これらの分子は各種の他の方法
によって生成させうることが了解されよう。たとえば、
この種の分子は、ここで用いたものとは異なるプロテア
ーゼにより或いはペプチド結合を切断しもしくは合成す
る薬剤によって生成させることもできる。さらに、これ
らの分子は、これらの断片をコードする切断ＤＮＡ配列
の発現によっても生成させることができる。しかしなが
ら、この方法は各断片につき異なる精製手順を必要と
し、かつしばしば発現ベクター中で不安定なＤＮＡ配列
を生ぜしめる。

【０１４７】Ｈ．組換ＤＮＡ技術による生物学上活性な
ヒトリポコルチン様ポリペプチド断片の生成 組換ＤＮＡ技術によりリポコルチン様ポリペプチド断片
を発生させる方法は、リポコルチンをコードするＤＮＡ
配列中へ、ＤＮＡ配列をポリペプチドとして発現する際
にポリペプチドを切断しうる（たとえば、化学的もしく
は蛋白分解的に）部位を生ぜしめるコドンを導入するこ
とである。これらのコドンは、たとえば、誘発または挿
入などの当業界で知られた各種の技術によってＤＮＡ中
へ導入することができる。たとえば、変化したリポコル
チン様ポリペプチドを宿主細胞により産生させ、未変化
の全長ポリペプチドと同様に精製し、かつ切断して所望
の断片を生ぜしめる。この手法により本発明のリポコル
チンＤＮＡ配列を変化させて、インビトロにて切断した
際ホスホリパーゼＡ_２阻止活性を示すリポコルチン様ポ
リペプチド断片を生成するような変化したポリペプチド
を産生させた。

【０１４８】本発明の１具体例によれば、リポコルチン
のＤＮＡ配列を改変させてメチオニンコドンをこの配列
中に導入することにより、変化したリポコルチン様ポリ
ペプチドをコードするＤＮＡ配列を作成した。宿主細胞
にてこの配列を発現させる際、特定アミノ酸がメチオニ
ンまたは挿入メチオニンによってポリペプチド配列に沿
った特定部位で置換されている変化したリポコルチン様
ポリペプチドを産生させた。ポリペプチドをメチオニン
残基において特異的に切断する臭化シアノゲンによって
これらの改変ポリペプチドを処理すれば、ホスホリパー
ゼＡ_２阻止活性を有するリポコルチン様ポリペプチド断
片が得られる。

【０１４９】天然ヒトリポコルチン蛋白は、上記例Ｇ
（２）に記載したような生物学上活性なエラスターゼ断
片内に含有されるメチオニン残基をアミノ酸５６及び１
２７部位に２個のみに有することを認めた。リポコルチ
ン様ポリペプチドを臭化シアノゲンで切断するとポリペ
プチドが不活化されかつこれによって全ゆる断片が生成
されるので、これらメチオニンの一方または両方が蛋白
の生物学的活性に必要であると推定した。したがって、
臭化シアノゲン処理により活性リポコルチン様ポリペプ
チド断片を生成させる予備段階は、リポコルチン蛋白の
生物学的活性を破壊することなく他のアミノ酸によって
これら２個のメチオニンを置換することを必要とする。
したがって、メチオニン５６および１２７をロイシン残
基で置換し、かつ臭化シアノゲンの処理に際し生物学的
活性なポリペプチド断片を得た。

【０１５０】リポコルチンをコードするＤＮＡ配列の誘
発によってメチオニン５６および１２７を次のように置
換した：リポコルチンをコードするＤＮＡ配列を含んだ
プラスミドｐＬｉｐｔｒｃ１５５Ａを制限酵素ＰｖｕＩ
で制限して、線状化ｐＬｉｐｔｒｃ１５５Ａ分子を生成
させた。さらに、プラスミドｐＫＫ２３３−２を制限酵
素ＮｃｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで制限し、リポコルチン
をコードするＤＮＡ配列の両側でプラスミドを切断した
（これらプラスミドの作成に関する例Ｄおよび図６参
照）。変性させかつ再融合させた際、これら２種の制限
プラスミドの混合物は約１３００塩基対の一本鎖領域に
リポコルチンをコードするＤＮＡ配列をもった離間した
ヘテロデュプレックスを与えた。変位オリゴヌクレオチ
ドリポ６０及び６１を５′末端で燐酸化し、かつ前記ヘ
テロデュプレックス混合物へ３２０倍の過剰で加えた。
リポ６０および６１はリポコルチンＤＮＡ配列の１部に
近似するＤＮＡ配列を有するが、特定のヌクレオチド変
化を有して、オリゴヌクレオチド配列の発現によりそれ
ぞれロイシン残基を有するリポコルチンのｍｅｔ１２７
およびｍｅｔ５６の置換をもたらす（図２０）。したが
って、これらのオリゴヌクレオチドは、ヘテロデュプレ
ックス分子の一本鎖領域にハイブリッド化する。ヘテロ
デュプレックス分子におけるＤＮＡギャップにＤＮＡポ
リメラーゼＩのクレノー断片を充填し、このＤＮＡをＴ
４ポリヌクレオチドキナーゼで結合させた〔モリナガ
等、バイオテクノロジー、第２巻、第６３６−６３９頁
（１９８４）〕。イー・コリ菌株ＪＡ２２１をこのＤＮ
Ａで形質転換させ、宿主細胞をＬＢ−アンピシリンプレ
ートで培養して形質転換体を選択した。

【０１５１】Ｐ^３２標識したオリゴヌクレオチドリポ６
０及び６１とのハイブリッド化による改変リポコルチン
ＤＮＡ配列を有するこれらコロニーにつき、形質転換体
を次のようにスクリーニングした：コロニーをニトロセ
ルロースフィルタに移しかつフィルタのコロニーを新た
なＬＢ−アンピシリンプレートに載置した。このプレー
トを３７℃で４時間培養した。次いで、フィルタをアン
ピシリンとクロラムフェニコール（２５０μｇ／ｍｌ）
を含有する新たなＬＢプレートへ移し、かつこのプレー
トを３７℃にて１晩培養した。コロニーを０．５Ｍ Ｎ
ａＯＨ−１．５Ｍ ＮａＣｌで溶菌させ、かつ溶菌物を
０．５Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．７）−１．５Ｍ Ｎ
ａＣｌで２回中和した。これらフィルタを減圧オーブン
中で８０℃にて２時間焼成し、２００ｍｌの６×ＳＳＰ
Ｅ（０．９Ｍ ＮａＣｌ、９０ｍＭ燐酸ナトリウム、６
ｍＭナトリウムＥＤＴＡ、ｐＨ７．０）、０．５％ＳＤ
Ｓ、１００μｇ／ｍｌ ｔＲＮＡ及び５×デンハルト溶
液において５５℃で振とうしながら数時間予備ハイブリ
ッド化した。次いで、これらフィルタを１０ｐモルのＰ
^３２標識したオリゴヌクレオチドを含有する予備ハイブ
リッド化混合物２００ｍｌ中で５５℃にて１晩ハイブリ
ッド化させた。フィルタを６×ＳＳＰＥで洗浄し、かつ
自動放射線分析によってハイブリッド化を検出した
〔Ｔ．マニアシス等、上記〕。

【０１５２】この手順によって多数の陽性クローンを分
離した。これらクローンの１種（リポ８と呼ぶ）を増殖
させ、かつそのプラスミドＤＮＡ（ｐＬｉｐｏ８と呼
ぶ）を抽出し、マキサム及びギルバートの技術（上記）
によって配列決定した。この配列決定分析は、所望のヌ
クレオチド置換、すなわちロイシンをコードするコドン
によるｍｅｔ５６および１２７をコードするＤＮＡコド
ンの置換が達成されたことを示した。

【０１５３】さらに、リポ８から発現蛋白を抽出し、か
つこの調製物を７０％蟻酸における３ｍｇ／ｍｌの臭化
シアノゲンで処理してリポコルチン様ポリペプチド断片
を生成させた。この粗製断片混合物を、上記のインビト
ロ分析によりホスホリパーゼＡ_２阻止活性につき試験し
た。野性型のリポコルチンは臭化シアノゲンによる１時
間の処理で失活されたが、断片混合物は、４時間の処理
後に活性を示した。次いで、ＳＢＳ−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動によって、この混合物から２６Ｋｄポリ
ペプチド断片を分離し（図２１および図２２）、この断
片を上記例Ｇ（２）に記載したように再編した。この精
製された断片をホスホリパーゼＡ_２活性につきインビト
ロ分析で試験し、この大きい方のリポ８の断片が生物学
的活性を示すことを突き止めた。

【０１５４】得られたリポコルチン様ポリペプチド断片
の生物学的活性に影響を及ぼすことなくｍｅｔ５６およ
び１２７を置換しうる可能性を示した後、リポコルチン
蛋白の他のアミノ酸残基をリポコルチン蛋白のアミノ酸
配列における各種の部位でメチオンまたは挿入メチオン
で置換することができた。このようにして、生物学的活
性を有する新たなリポコルチンの切断断片を分離した。
たとえば、上記した手法により、リポコルチンのアミノ
酸配列における残基１０９のロイシンをメチオニンで置
換した。変異オリゴヌクレオチドリポ６８（図２０参
照）をプラスミドｐＫＫ２３３−２及びｐＬｉｐｏ８
（これはリポ６０および６１のヌクレオチド変化以外は
図６のｐＬｉｐｔｒｃ１５５Ａと同一である）の制限に
よって生じたヘテロデュプレックスにハイブリッド化さ
せた。かくして、形質転換体リポ１１を得、これは所望
のヌクレオチド変化を有してＬｅｕ１０９をメチオニン
で置換する。ｐＬｉｐｏ１１ＤＮＡをこの形質転換体か
ら抽出し、その配列決定は所望のヌクレオチド変化が達
成されていることを示した。次いで、クローンＬｉｐｏ
１１を培養増殖させ、発現蛋白を抽出しかつ臭化シアノ
ゲンで処理して断片を生成させた。処理蛋白抽出物のＳ
ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル瀘過によって１４．６Ｋ
ｄポリペプチド断片を分離し（図２１参照）〔ビオラド
・カタログ／プライス・リストＫ、第３７頁（１９８
５）〕、この断片を生物学的活性につきインビトロ分析
で分析した。この分析は、リポ１１断片がホスホリパー
ゼＡ_２阻止活性を有することを示した。

【０１５５】同様に、オリゴヌクレオチドリポ７８（図
２０参照）を使用して、Ｌｅｕ１９８をメチオンで置換
する所望のヌクレオチド改変をもった形質転換体リポ１
５を生成させた。臭化シアノゲンによる抽出した発現蛋
白の切断に続きＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル瀘過を
行って、２０．７Ｋポリペプチド断片を精製し（図２１
参照）、次いでこれを生物学的活性につき分析した。こ
の分析は、リポ１５断片がホスホリパーゼＡ_２阻止活性
を有することを示した。

【０１５６】代案として、メチオニンをリポコルチンア
ミノ酸配列中へ残基１６９の個所で挿入し、その際、合
成オリゴヌクレオチドをリポコルチンＤＮＡ配列の制限
部位に挿入して、この部位にメチオニン用のコドンを生
成させる。ｐＬｉｐｏ８をＢｇｌＩＩで制限しかつこの
部位にオリゴヌクレオチドリポ７５および７６（図２０
参照）をＴ４リガーゼによって結合させた。これらの相
補的オリゴヌクレオチドは、プラスミド中へ挿入するた
めのＢｇｌＩＩ部位の凝集性末端に対し相補的な付着性
末端をもって作成された。イー・コリＴＡ２２１菌体を
この結合混合物へ形質転換させ、かつ形質転換体をＬＢ
−アンピシリンプレートでの増殖によって選択した。こ
れら形質転換体を、制限地図によって挿入オリゴヌクレ
オチドの正確な方向性を有するコロニーにつきスクリー
ニングした。この種の１つのコロニー（リポ９と呼ぶ）
を培養増殖させ、その発現蛋白を抽出した。粗製蛋白抽
出物を臭化シアノゲンで処理し、かつＳＤＳ−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動にかけた。１７．７Ｋｄポリペ
プチド断片が生成され、他のアミノ酸がこの配列中に導
入され、その際切断された合成オリゴヌクレオチドを挿
入させた（図２１参照）。

【０１５７】かくして、組換ＤＮＡ技術を用いて少なく
とも３種の生物学上活性なリポコルチン様ポリペプチド
断片を分離した：すなわちリポ８の２６Ｋｄ断片と、リ
ポ１１の１４．６Ｋｄ断片と、リポ１５の２０．７Ｋｄ
断片とである。しかしながら、上記の手法により他のリ
ポコルチン様ポリペプチド断片を生成させうることも了
解すべきである（たとえば、リポコルチンアミノ酸配列
に沿ったメチオニンによる他のアミノ酸の置換）。さら
に、リポコルチン様断片は、リポコルチンをコードする
ＤＮＡ配列を変化させてメチオニン以外のアミノ酸を導
入しもしくは、挿入し、変化したポリペプチドを生成さ
せて製造することもできる。次いで、このポリペプチド
を適当な酵素または薬品で切断して、生物学上活性な断
片を得ることができる（たとえば、システィンを挿入し
かつ蛋白をＮＴＣＢ、すなわち２−ニトロ−５−チオシ
アノ安息香酸で切断することもできる）。

【０１５８】Ｎ−リポコルチンをコードするＤＮＡ配列
の分離 さらに、Ｎ−リポコルチン、すなわちホスホリパーゼＡ
_２阻止活性を示し、かつ本発明により、製造される３７
Ｋｄリポコルチンと同族のアミノ酸を有するヒトリポコ
ルチン様ポリペプチドの１部をコードするヌクレオチド
配列を得た。

【０１５９】Ｉ．ヒト胎盤からのリポコルチンおよびＮ
−リポコルチンの精製 新鮮な胎盤を出産直後に氷上に載せ、６時間以内に次の
ように処理した：胎盤の表皮を除去し、立方体に切断し
かつ組織を氷冷したＰＢＳ（５０ｍＭ Ｎａ_２ＨＰ
Ｏ_４、ｐＨ７．２、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）および５％
蔗糖で３００ｍｌずつ１０回変えて、組織が桃色となり
かつ洗浄液によってもはやヘモグロビンが放出されなく
なるまで洗浄した。この洗浄した胎盤は約３５０ｇであ
った。

【０１６０】３０ｇの胎盤組織を１５０ｍｌの抽出用緩
衝液（２５ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．７）、５ｍＭ
ＥＤＴＡ、０．１ｍｇ／ｍｌアプロチン、０．１ｍｇ
／ｍｌ大豆トリプシン阻止剤および４０μＭペプスタチ
ンＡ）で洗浄し、次いでこの組織を１００ｍｌの同じ緩
衝液に懸濁させた。調製物をポリトロンによって氷上で
５〜７分間破壊し、ホモゲナイズ物をＳＳ３４ロータに
て１０，０００ｒｐｍで４℃にて１５分間遠心分離し
た。上澄液をデカントし、ポリトロンでさらに１００ｍ
ｌの抽出用緩衝液中にてペレットを破壊し、懸濁物を再
び１０，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。両抽出
物の上澄液を合しかつ処理した。

【０１６１】最初に２５ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．
７）で平衡化させた８０ｍｌカラム（ＤＥ５２、ワット
マン・リミテッド社、カラム寸法：直径２．５×１６ｃ
ｍ）にてＤＥＡＥ−セルロースクロマトグラフィーにか
けた。流化した調製物をアミコンＰＭ１０膜での限外瀘
過により１５ｍｌまで濃縮した。次いで、濃縮した調製
物をＳＳ３４ロータにて１８，０００ｇで１５分間遠心
分離した。濃縮物の見掛イオン強度は、限外瀘過からの
流過物の電導度を測定して概算した。この数値に基づ
き、濃縮物を水で希釈して２５ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ７．７）と等しい見掛イオン強度にした（１０ｍｌの
水を加えた）。次いで、この調製物を４０ｍｌカラムに
て第２のＤＥＡＥ−セルロース工程にかけ、さらにＤＥ
ＡＥ流過物を２００ｍｌ Ｐ１５０カラム（カラム寸
法：直径２．５ｃｍ×４０ｃｍ）にてゲル瀘過クロマト
グラフィーにより分画し、これも２５ｍＭトリス−ＨＣ
ｌ（ｐＨ７．７）において行なった。この溶出物の５ｍ
ｌフラクションを集め、その１部を上記例Ａに記載した
インビトロ分析によりホスホリパーゼ阻止活性につき分
析した。この分析によれば、溶出物は阻止活性を有する
単一の幅広ピークを有し、これはゲル瀘過により測定し
て４０Ｋの見掛分子量を有した。さらに、溶出物の１部
をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって特
性化した。このゲル分析は、溶出物における阻止活性が
３５Ｋｄにおける主たる蛋白帯に相当することを示し
た。ウエスタン・ブロット分析は、３５Ｋｄバンドがイ
ー・コリで産生された組換リポコルチンに対するウサギ
抗血清に免疫反応性であることを示した。

【０１６２】次いで、ゲル瀘過カラムからの溶出物をＣ
４カラム（バイダック社）での逆相高圧液体クロマトグ
ラフィー（ＨＰＬＣ）にかけ、その際０．１％トリフル
オロ酢酸中で０〜７５％のアセトニトリルの濃度勾配を
用いて結合断片を溶出させた。この溶出物は実際に２種
の３５Ｋｄ成分を有することが判明した。すなわち、６
５．８％アセトニトリルでカラムから溶出した天然ヒト
リポコルチン成分と、６５．１％アセトニトリルで溶出
したＮ−リポコルチン成分とである。天然リポコルチン
成分のみが、組換リポコルチンに対し発生した抗体に免
疫反応性であった。

【０１６３】ホスホリパーゼＡ_２阻止活性を保持するよ
うに、これら２種の成分をさらに精製するため、ゲル瀘
過カラムからの部分精製した調製物をモノＳ高解像陽イ
オンクロマトグラフィー樹脂（ＨＲ５／５、ファルマシ
ア社）にて迅速蛋白液体クロマトグラフィー（ＦＰＬ
Ｃ、ファルマシア社）にかけた。５０ｍＭのＭＥＳ緩衝
液（２−モルフォリノ−エタンスルホン酸）中ｐＨ６．
０において、両成分はモノＳカラムに結合し、ＮａＣｌ
の濃縮勾配で溶出させた。図２３は蛋白の溶出経過（２
８０ｎｍで監視した吸光度）（パネルＡ）およびモノＳ
カラムからのホスホリパーゼＡ_２阻止活性の経過（パネ
ルＢ）を示している。パネルＡにおいて、ピークＩはリ
ポコルチンに相当し、かつピークＩＩはＮ−リポコルチ
ンに相当する。ピークＩにおける物質のみが、組換リポ
コルチンに対するウサギ抗血清に免疫反応性であった。
パネルＢは、明らかにリポコルチンとＮ−リポコルチン
との両者がホスホリパーゼＡ_２阻止活性を有することを
示している。精製調製物におけるこの相対量に基づき、
ホスホリパーゼ阻止剤としての２種の蛋白の特異活性は
ほぼ同一であると推定された。

【０１６４】さらに、これら２種の蛋白をトリプシン分
解地図化によって分析した。大部分の胎盤を処理し、上
記の手順により蛋白を精製した。溶液およびカラムの寸
法および容積を適当に調節した。２種の３５Ｋｄ蛋白を
逆相ＨＰＬＣで分離した後、各精製蛋白の１００μｇを
次のようにトリプシン分解地図化分析にかけた：適当な
ＨＰＬＣフラクションを減圧化にスピード・バック・濃
縮装置（サバント社）で乾燥させ、得られたペレットを
４００μｌの０．１Ｍ重炭酸アンモニウム（ｐＨ８．
０、０．１ｍＭ ＣａＣｌ_２）中に再懸濁させ、そして
混合物をトリプシンで切断した。ＴＰＣＫ−トリプシン
（ワーシントン社、全部で５μｇ）を１００μｇの蛋白
に加え、かつ切断を３７℃にて１６時間行った。トリプ
シンは３つの等しい部分として加えた。すなわち、第１
のものは、０時間で第２のものは４時間後に、かつ第３
のものは培養１２時間後にそれぞれ加えた。この切断物
を、２０％（ｖ／ｖ）までの蟻酸によって酸性化させ
た。

【０１６５】次いで、トリプシン切断からの切断断片
を、例Ａにおいて前記したようにＣ１８カラムにて４０
℃で逆相高圧液体クロマトグラフィーにより分離させ
た。カラム溶出物は、２１４ｎｍで監視した。リポコル
チン（パネルＡ）およびＮ−リポコルチン（パネルＢ）
のトリプシン分解地図を図２４に示す。胎盤から分離さ
れた天然ヒトリポコルチンのトリプシン分解地図は、ヒ
ト大食細胞ｃＤＮＡの発現により得られた３７Ｋｄリポ
コルチンからのトリプシン分解地図と同一である。ＤＮ
Ａ配列分析は、胎盤リポコルチンと大食細胞由来のリポ
コルチンとの間の２種のアミノ酸の相違を示した。Ｎ−
リポコルチンの地図は、蛋白が独特であることを示して
いる。

【０１６６】Ｎ−リポコルチンのトリプシン分解地図か
ら得られた１１個のピークに対応する溶出フラクション
をスピード・バック・濃縮装置で濃縮し、これらを気相
配列決定装置（アプライド・バイオシステムス４７０
Ａ）を用いてアミノ末端蛋白配列分析にかけた。エドマ
ン減成の各サイクルから得られたＰＴＨアミノ酸をアプ
ライド・バイオシステムス１２０ＡのＰＴＨ分析装置に
より逆相高圧液体クロマトグラフィーで分析した。これ
らの分析から得られた配列を図２５に示す（図２５にお
ける配列の左側の「Ｔ」数値は、図面の頂部におけるカ
ラム経過で示されるピーク数に対応する）。

【０１６７】Ｎ−リポコルチンのペプチド配列は大部分
が独特であるが、幾つかは、本発明にしたがって精製さ
れたヒトリポコルチンと同様な配列を示し、このこと
は、２種の３５Ｋｄ成分（すなわち、それぞれリポコル
チンおよびＮ−リポコルチン）が同じ種類の蛋白から誘
導されうることを示唆している。図２５に示したよう
に、現在までＮ−リポコルチン分子の約１／３の主構造
を決定した。多数の断片を有するＨＰＬＣピークから得
られたこれら断片の配列は当業界で知られた技術によっ
て決定しうるので、実際に分子の５０％の主構造を決定
するのに必要なデータを与えたことになる。

【０１６８】Ｊ．Ｎ−リポコルチン蛋白配列に対するオ
リゴヌクレオチド試料の合成 ヒト胎盤からのＮ−リポコルチンにおける各種領域のア
ミノ酸配列を決定した後、これら蛋白配列の幾つかをコ
ードする対応のオリゴヌクレオチドＤＮＡ試料につき４
種の保存物を化学合成した（図２５参照）。組換リポコ
ルチンにつき例Ｂで前記したと同じ手段および手法を使
用した。Ｎ−リポコルチンの４つの選択領域に関するア
ミノ酸配列並びにこれらをコードする全ゆる可能なヌク
レオチドコドン組合せを図２６に示す。コード化縮重は
次のように示される：Ｎ＝Ｃ，Ｔ，ＡもしくはＧ；Ｒ＝
ＡもしくはＧ；Ｙ＝ＣもしくはＴ；Ｈ＝Ａ，Ｃもしくは
Ｔ；Ｐ＝ＧもしくはＣ；Ｘ＝Ａ，ＧもしくはＴ；Ｈ＝Ａ
もしくはＴ。

【０１６９】図２６に示したように、ＤＮＡ試料の４種
の保存物はそれぞれトリプシン分解断片Ｔ２０，Ｔ２
５，Ｔ２４およびＴ９のアミノ酸配列に対応する。試料
における縮重をさらに減少させるため、各保存物をサブ
保存物として作成した。断片Ｔ２０のアミノ酸配列に対
応するオリゴヌクレオチドＮＬｉｐ１〜ＮＬｉｐ３は、
１２８倍の縮重を有する２４量体である。オリゴヌクレ
オチドＮＬｉｐ４〜ＮＬｉｐ７は３２倍の縮重を有する
１８量体であり、かつ断片Ｔ２５のアミノ酸配列に対応
する。オリゴヌクレオチドＮＬｉｐ８〜ＮＬｉｐ１１は
７２倍の縮重を有する２０量体であって断片Ｔ２４のア
ミノ酸配列に対応し、またＮＬｉｐ１２〜ＮＬｉｐ１５
は１２８倍の縮重を有する１７量体であって断片Ｔ９の
アミノ酸配列に由来する。

【０１７０】これら合成試料が実際にヒト配列を識別す
るかどうかを試験するため、３種のサブ保存物ＮＬｉｐ
１，ＮＬｉｐ２およびＮＬｉｐ３を〔γ〕−Ｐ^３２−Ａ
ＴＰおよびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いてＰ
^３２で末端標識した後、ヒト胎盤からのポリ（Ａ）^＋ｍ
ＲＮＡを含有する遺伝子スクリーンフィルタにハイブリ
ッド化させ、その際ノーザンブロット技術を用いた
〔Ｈ．レーラッハ等、上記〕。サブ保存物ＮＬｉｐ１
は、リポコルチンｍＲＮＡと同じ寸法と思われる１８０
０ヌクレオチドｍＲＮＡにハイブリッド化した。

【０１７１】Ｋ．ヒト胎盤ｃＤＮＡ保存物の作成および
スクリーニング ヒト胎盤より分離したポリ（Ａ）^＋ｍＲＮＡからヒトｃ
ＤＮＡ保存物を、ヒト大食細胞ｃＤＮＡ保存物の作成に
つき例Ｃで前記したとほぼ同じ手順で作成した。しかし
ながら、この具体例においては女性胎児のヒト胎盤から
全ＲＮＡをＪ．Ｍ．シャーグイン等によって実質的に記
載されたグアニジンイソチオシアネート法によって抽出
した〔バイオケミストリー、第１８巻、第５２９４−５
２９９頁（１９７９）〕このＲＮＡ調製物を、オリゴ
（ｄｔ）−セルロースカラム（ＰＬバイオケム社）に２
回通してポリ（Ａ）^＋ＲＮＡにつき濃縮し、これを使用
して二重鎖ｃＤＮＡ配列を合成し、次いでこれをλｇｔ
１０中に挿入すると共に、イー・コリＣ６００ｈｆｌ菌
体で増殖させた。

【０１７２】ヒト胎盤ｃＤＮＡ保存物を下記するような
ニトロセルロースフィルタによって標識オリゴヌクレオ
チド試料（ＮＬｉｐ１）でスクリーニングした。Ｌブロ
スおよび０．２％マルトースにおけるＣ６００ｈｆｌ菌
体の１晩培養物をペレット化させかつ同量のＳＭ緩衝液
に再懸濁した。０．９ｍｌの菌体に２×１０^６個のファ
ージ粒子を室温で１５分間予備吸着させた。懸濁物をＬ
Ｂ＋１０ｍＭ ＭｇＳＯ_４および０．７％アガロース中
で５５℃にて５０ｍｌまで希釈し、これをＬＢプレート
＋１０ｍＭ ＭｇＳＯ_４に移植した。３０枚のこれらプ
レートをスクリーニングした。プレートを３７℃にて約
５時間培養し、次いで４℃に１時間冷却してアガロース
を硬化させた。次いで、λファージ粒子をプラーク保存
プレートからＳ＆Ｓニトロセルロースフィルタに移し、
その際フイルタを組換プラークを有するプレート上へ５
分間載置した。次いで、プレートからフイルタを持ち上
げ、フイルタ上のファージを溶菌させ、その際フイルタ
を０．５Ｎ ＮａＯＨ−１．５Ｍ ＮａＣｌの溶液上に
５分間載置し、さらに中和しかつフイルタを１Ｍトリス
−ＨＣｌ−１．５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ７．０）に浸漬し
た。次いで、フイルタを風乾しかつ８０℃にて２時間焼
成した。

【０１７３】処理したフイルタを０．２％ポリビニルピ
ロリドン（Ｍ．Ｗ．４０，０００）、０．２％フィコー
ル（Ｍ．Ｗ．４００，０００）、０．２％牛血清アルブ
ミン、０．０５Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１Ｍ
塩化ナトリウム、０．１％ピロ燐酸ナトリウム、１％Ｓ
ＤＳ、１０％硫酸デキストラン（Ｍ．Ｗ．５００，００
０）および変性鮭精子ＤＮＡ（≧１００μｇ／ｍｌ）に
おいてコロニー／プラークスクリーン（登録商標）メン
ブランに対する製造業者の指示（ニューイングランド・
ヌクレア社）にしたがいオリゴヌクレオチド試料（ＮＬ
ｉｐ１）に予備ハイブリッド化し、かつハイブリッド化
させた。自動放射線分析によってハイブリッド化するｃ
ＤＮＡ配列を検出した。

【０１７４】この技術により６種の陽性プラークを釣上
げ、かつ同じ試料を用いて低密度にて再スクリーニング
した。これらクローンのＤＮＡを分離し、このＤＮＡを
ＥｃｏＲＩで切断し、そしてサウザン・ブロット技術に
よりこれら配列をＮＬｉｐ１試料とハイブリッド化させ
た〔Ｅ．Ｍ．サウザン、上記〕。全部で６種のクローン
のｃＤＮＡ挿入物がＮＬｉｐ１試料にハイブリッド化し
た。

【０１７５】次いで、これらファージのＤＮＡをＥｃｏ
ＲＩで切断し、ｃＤＮＡ挿入物を分離した。これらクロ
ーンの１種（λ−ＮＬｉｐｏ２１−２）のＥｃｏＲＩに
よる切断は約５００塩基対断片をもたらし、これをプラ
スミドｐＵＣ９にサブクローン化してプラスミドｐＮＬ
ｉｐ１を生成させた。このプラスミドをマキサムおよび
ギルバードの方法によって配列決定した〔Ａ．Ｍ．マキ
サムおよびＷ．ギルバード、上記〕。図２７に示したよ
うに、このプラスミドは３９４塩基対のｃＤＮＡ挿入物
を有し、この挿入物はＮ−リポコルチンコード配列（３
３アミノ酸に対応する）の９９塩基対を有し、さらにポ
リ（Ａ）付加部位を含めＮ−リポコルチン３′非コード
化領域の２９５塩基対および約５０塩基対のポリ（Ａ）
末端をも有する。Ｎ−リポコルチンのＤＮＡコード化配
列はトリプシン分解断片Ｔ２０から誘導されたオリゴヌ
クレオチド試料に対応する配列（すなわちＮＬｉｐ１）
だけでなく、トリプシン分解断片Ｔ３２に対応する配列
をも含有し（図２５参照）、このことはＮ−リポコルチ
ン蛋白をコードする遺伝子の１部がクローン化されたこ
とを確認する。このｃＤＮＡ配列並びに例Ｊで記載した
オリゴヌクレオチド試料を次いで試料として使用するこ
とにより、全長Ｎ−リポコルチンをコードするＤＮＡ配
列をスクリーニングしかつ分離した。

【０１７６】クローンλＮＬｉｐｏ２１−２は蛋白の小
領域のみをコードするＮ−リポコルチンＤＮＡ配列を有
するが、リポコルチンとＮ−リポコルチンとの間の構造
類似性がこの領域に保持される。下記表４に示すよう
に、２種の蛋白におけるカルボキシル末端の最後の１７
個のアミノ酸のうち１１個は同一である。５つの相違点
のうち殆どはアミノ酸置換が保持されている。２種の蛋
白におけるホスホリパーゼＡ_２阻止活性の類似性、並び
に蛋白およびＤＮＡ配列の類似性に基づき、Ｎ−リポコ
ルチンとリポコルチンとは１群の関連蛋白であると結論
した。

【０１７７】

【表４】 リポコルチンおよびＮ−リポコルチンのＣ−末端におけ
る配列類似性 リポ：ＧｌｎＬｙｓＭｅｔＴｙｒＧｌｙＩｌｅＳｅｒＬ
ｅｕＣｙｓＧｌｎＡｌａＩｌｅＬｅｕ− Ｎ−リポ：ＬｙｓＡｒｇＬｙｓＴｙｒＧｌｙＬｙｓＳｅ
ｒＬｅｕＴｙｒＴｙｒＴｙｒＩｌｅＧｌｎ− リポ：ＡｓｐＧｌｕＴｈｒＬｙｓＧｌｙＡｓｐＴｙｒＧ
ｌｕＬｙｓＩｌｅＬｅｕＶａｌＡｌａ− Ｎ−リポ：ＧｌｎＡｓｐＴｈｒＬｙｓＧｌｙＡｓｐＴｙ
ｒＧｌｎＬｙｓＡｌａＬｅｕＬｅｕＴｙｒ− リポ：ＬｅｕＣｙｓＧｌｙＧｌｙＡｓｎ Ｎ−リポ：ＬｅｕＣｙｓＧｌｙＧｌｙＡｓｐＡｓｐ 本発明のリポコルチンおよびＮ−リポコルチンにおける
ヌクレオチド配列の比較はほぼ６０％の類似性を示して
いる（図２８参照）。

【０１７８】ここに開示した方法により作成された微生
物および組換ＤＮＡ配列は、インビトロ・インターナシ
ョナル・インコーポレイション、アン・アーバー、ミシ
ガン州のカルチャーコレクションに寄託した培養物で例
示される。この培養物は１９８６年１月８日付けで寄託
され、次のように同定されている： イー・コリ ＪＡ２２１（ｐＮＬｉｐ１）：ＩＶＩ Ｎ
ｏ．１００９３本発明により産出されたヒトリポコルチン様ポリペプチ
ドの収量および活性の向上 蛋白の産生レベルは３つの主因子によって支配される：
すなわち細胞内の遺伝子のコピー数、これら遺伝子コピ
ーを転写する効率、およびこれらを翻訳する効率であ
る。転写および翻訳（これらは一緒になって発現を構成
する）の効率は、一般に所望のコード化配列の先端に位
置するヌクレオチド配列に依存する。これらのヌクレオ
チド配列または発現制御配列は、特にＲＮＡポリメラー
ゼが互いに反応して転写を開始する位置（プロモータ配
列）およびリボソームが結合しかつｍＲＮＡ（転写の生
成物）と相互作用して翻訳を開始する部位を規定する。
必ずしも全てのこれら発現制御配列が同等の効率を有す
るとは限らない。したがって、本発明の特定リポコルチ
ンコード化配列をその隣接ヌクレオチド配列から分離し
かつこれらを他の公知の発現制御配列に融合させてより
高レベルの発現を促進すると共に、リポコルチン様ポリ
ペプチドを産生させるのが有利である。これを達成した
後、新たに作成されたＤＮＡ配列をより多いコピー数の
プラスミドまたはバクテリオファージ誘導体に挿入し
て、細胞内の遺伝子コピー数を増加させ、これによりさ
らに発現リポコルチン様ポリペプチドの収量を増大させ
ることができる。

【０１７９】上記のように、数種の発現制御配列を使用
することができる。これらはイー・コリのラクトースオ
ペロン（「ｌａｃ系」）のオペレータ、プロモータ並び
にリボソーム結合および相互作用配列（たとえば、シャ
イン−ダルガルノ配列のような配列を含む）、イー・コ
リのトリプトファン シンセターゼ系（「ｔｒｐ系」）
の対応配列、ファージλの主オペレータおよびプロモー
タ領域（上記のようなＯ_ＬＰ_ＬおよびＯ_ＲＰ_Ｒ）、フィ
ラメント状一本鎖ＤＮＡファージの制御領域、ｔａｃも
しくはｔｒｃ系、３−ホスホグリセレートキナーゼもし
くはその他の糖分解酵素のプロモータ、酸ホスファター
ゼのプロモータ（たとえば、Ｐｈｏ５）、酵母α−結合
因子のプロモータ、たとえばＳＶ４０早期および後期プ
ロモータのような哺乳動物細胞のプロモータ、アデノウ
イルス後期プロモータおよびメタロチオニンプロモー
タ、並びに原核もしくは真核細胞およびウイルスの遺伝
子の発現を制御する他の配列またはその組合せを包含す
る。

【０１８０】したがって、本発明のリポコルチン様ポリ
ペプチドの産生を向上させるには、これらポリペプチド
のＤＮＡ配列を前記と同様に作成しかつ組換ＤＮＡ分子
中へその最初の発現制御配列の近傍に挿入し、或いは上
記向上した発現制御配列の制御下に挿入することができ
る。この種の方法は当業界で公知である。

【０１８１】翻訳の効率を向上させるのに有用な他の方
法は、化学的もしくは酵素的に作成したオリゴヌクレオ
チドを本発明のリポコルチン関連ＤＮＡ配列の開始コド
ンの前に挿入すること、或いはＤＮＡ配列のＮ−末端に
おけるコドンを化学的もしくは酵素的に作成したこれら
オリゴヌクレオチドで置換することを含む。この手順に
より、ＲＮＡの一層最適な一次およびより高次の構造を
得ることができる。より詳細には、開始ＡＵＧコドンが
ヘアピンの頂部或いは他の単一鎖領域のいずれかにおけ
る容易にアクセスしうる位置（すなわち二次構造により
遮蔽されていない）で生ずるように配列を設計すること
ができる。上記シャイン−ダルガルノ断片の位置および
配列を同様に最適化することができる。メッセンジャー
ＲＮＡの一般構造（重ね構造）の重要性は既に記載され
ている。〔Ｄ．イセレンタントおよびＷ．ファイエル
ス、「ｍＲＮＡの二次構造および翻訳開始の効率」、ジ
ーン、第９巻、第１−１２頁（１９８０）〕。

【０１８２】本発明のリポコルチン様ポリペプチドの細
胞収量における増加は、さらに細胞内で使用しうる遺伝
子の個数を増加させて達成することもできる。これは、
リポコルチン遺伝子（その転写および翻訳制御要素を有
するまたは持たない）をより多いコピー数のプラスミド
中へまたは温度制御されたコピー数のプラスミド（すな
わち、プラスミドのコピー数が温度の変化の後に増加す
るような変異を有するプラスミド）中に挿入して達成す
ることができる〔Ｂ．ユーリン等、「クローン化遺伝子
およびその生産物の増殖に対する温度依存性コピー数を
有するプラスミド」、ジーン、第６巻、第９１−１０６
頁（１９７９）〕。

【０１８３】代案として、遺伝子投入量における増加
は、たとえば上記のように処理された組換ＤＮＡ遺伝子
を雛型バクテリオファージλ中へ挿入することにより、
特に簡単にはプラスミドを制限酵素で切断して線状分子
を与え、これを次いで制限ファージλクローン化ベヒク
ル（たとえば、Ｎ．Ｅ．マレー等により「インビトロ組
換体における回収を単純化させるλファージ」、モレキ
ュラー・ゼネラル・ジェネティックス、第１５０巻、第
５３−６１頁（１９７７）およびＮ．Ｅ．マレー等、
「バクテリオファージＴ４からのＤＮＡリガーゼ遺伝子
の分子クローン化」、ジャーナル・モレキュラー・バイ
オロジー、第１３２巻、第４９３−５０５頁（１９７
９）に記載された種類）と混合し、組換ＤＮＡ分子をＤ
ＮＡリガーゼとの培養により生成させて達成することが
できる。次いで、所望の組換ファージを選択し、かつこ
れを使用してイー・コリの宿主菌株をリソゲナイズす
る。

【０１８４】したがって、本発明のリポコルチン様ポリ
ペプチドをコードする配列を開示したベクターから除去
すると共に、これを他の発現ベクター中へ前記のように
挿入し、これらベクターを前記したように各種の宿主中
で使用して本発明のヒトリポコルチン様ポリペプチドの
産生を向上させうることを了解すべきである。

【０１８５】以上、本発明を多くの具体例につき説明し
たが、本発明の基本的構成を変化させて本発明の方法お
よび組成物を使用する他の具体例を与えることもでき
る。したがって、本発明の範囲は、例として上記した特
定具体例のみに限定されないことが了解されよう。

【０１８６】１９９１年６月２０日に、本明細書中で同
定した寄託をインビトロ・インターナショナル・インコ
ーポレイテッド（「ＩＶＩ」）からメリーランド州・ロ
ックビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシ
ョン（「ＡＴＣＣ」）に移転した。

【０１８７】以下にＩＶＩ寄託番号と共に相当するＡＴ
ＣＣにより割当られた寄託番号を挙げる。

【０１８８】 ＩＶＩ ＡＴＣＣ １００４２ ６８８１２ １００４６ ６８７６３ １００８８ ７４１０６ １００９３ ６８８１１

【図面の簡単な説明】

【図１】ラットのホスホリパーゼＡ_２阻止蛋白の臭化シ
アノゲン切断から得られた断片のアミノ酸配列を示す説
明図である。

【図２】ラットのホスホリパーゼＡ_２阻止蛋白のトリプ
シン切断から得られた断片のアミノ酸配列を示す説明図
である。

【図３】本発明のリポコルチンＤＮＡ配列につきスクリ
ーニングするため使用した化学合成のオリゴヌクレオチ
ドＤＮＡ試料における４種の保存物を示す説明図であ
る。

【図４】ヒトリポコルチンをコードするλＬＣのｃＤＮ
Ａ挿入物のヌクレオチド配列を示し、さらにリポコルチ
ン蛋白の予想アミノ酸配列をも示し、アミノ酸配列の下
に示した数字（たとえば１，３０および３４６）は遺伝
子のコード化配列に基づく蛋白の第１、第１３および最
後のアミノ酸を示す説明図である。

【図５】一実施例として本発明のＤＮＡ配列を発現させ
るために使用したプラスミドｐＫＫ２３３．ＬＩＰ．１
の構成を概要として示す説明図である。

【図６】一実施例で本発明のＤＮＡ配列を発現させるた
めに使用したプラスミドｐＬｉｐｔｒｃ１５５Ａの構成
を概要として示す説明図である。

【図７】本発明の一実施例に従ってヒトリポコルチンを
産生するためのプラスミドｐＢｇ１２０、すなわち酵母
発現ベクターの作成を示す説明図である。

【図８】本発明の一実施例に従ってヒトリポコルチンを
産生するためのプラスミドｐＢｇ１２０、すなわち酵母
発現ベクターの作成を示す説明図である。

【図９】本発明の一実施例に従ってヒトリポコルチンを
産生するためのプラスミドｐＢｇ１２０、すなわち酵母
発現ベクターの作成を示す説明図である。

【図１０】粗製酵母溶解物のＳＤＳ−ポリアクリルアミ
ドゲル分析を示す説明図であり、レーンａは本発明によ
りイー・コリで作成した精製ヒトリポコルチンを含み、
レーンｂはプラスミドを持たない酵母からの抽出物を含
み、レーンｄはｐＢｇ１２０を有する酵母からの抽出物
を含み、レーンｃおよびｅはヒトリポコルチンをコード
するＤＮＡ配列を持たない他のプラスミドを含有する酵
母からの抽出物を含むものである。

【図１１】本発明の一実施例によるヒトリポコルチンの
産生に関するプラスミドｐＳＶＬ９１０９、すなわち哺
乳動物発現ベクターの構成を示す説明図である。

【図１２】本発明の一実施例によるヒトリポコルチンの
産生に関するプラスミドｐＳＶＬ９１０９、すなわち哺
乳動物発現ベクターの構成を示す説明図である。

【図１３】本発明の一実施例によるヒトリポコルチンの
産生に関するプラスミドｐＳＶＬ９１０９、すなわち哺
乳動物発現ベクターの構成を示す説明図である。

【図１４】プラスミン切断したヒトリポコルチン様ポリ
ペプチドのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル分析を示
し、レーンａ−ｆはプラスミンを添加してからそれぞれ
０，５，１０，２０，４０および１２０分後に採取した
試料を示す説明図である。

【図１５】バイオゲルＰ−６０カラムクロマトグラフィ
ーによって分画した後のヒトリポコルチン様ポリペプチ
ドにおけるプラスミン断片のホスホリパーゼＡ_２阻止活
性を示す説明図である。

【図１６】ヒトリポコルチン様ポリペプチドのトリプシ
ン切断から得られた断片のアミノ酸配列を示す説明図で
ある。

【図１７】リポ−Ｓおよびリポ−Ｌのトリプシン切断か
ら得られた断片のアミノ酸配列を示す説明図である。

【図１８】ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によ
って分離した後のヒトリポコルチン様ポリペプチドにお
けるエラスターゼ断片のホスホリパーゼＡ_２阻止活性を
示す説明図である。

【図１９】ｅ−１，ｅ−４およびｅ−５のトリプシン切
断によって得られた断片のアミノ酸配列を示す説明図で
ある。

【図２０】組換ＤＮＡ技術により生物学上活性なリポコ
ルチン様ポリペプチド断片を産生させるため本発明の方
法により使用した変異オリゴヌクレオチドを示す説明図
である。

【図２１】メチオニンが位置する配列に沿った部位を数
字によって示したリポコルチンアミノ酸配列の略線図で
あり、括弧内の数字はメチオニンを導入して本発明によ
る断片を生成させ得る部位を示し、本発明の数種の断片
およびその分子量を線図の下に示す説明図である。

【図２２】リポ−８から抽出された未処理および臭化シ
アノゲン処理したヒトリポコルチン様ポリペプチドの２
６Ｋｄ断片を示すＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル分析
を示す説明図である。

【図２３】モノＳ高解像陽イオン交換クロマトグラフィ
ーにより分画した後の２８０ｎｍにおけるリポコルチン
（ピークＩ）およびＮ−リポコルチン（ピークＩＩ）の
吸光経過をパネルＡで示し、パネルＢは本発明の溶出リ
ポコルチンおよびＮ−リポコルチンのホスホリパーゼＡ
_２阻止活性を阻止％として示す説明図である。

【図２４】本発明の方法により分離されたリポコルチン
およびＮ−リポコルチン蛋白のトリプシン分解マップを
示す説明図である。

【図２５】本発明のＮ−リポコルチンのトリプシン分解
マップを示すと共に、このマップのピークとこれらピー
クに含まれるペプチド断片のアミノ酸配列との関係を示
す説明図である。

【図２６】本発明のＮ−リポコルチンＤＮＡ配列につき
スクリーニングするために使用した化学合成のオリゴヌ
クレオチドＤＮＡ試料の４種の保存物を示す説明図であ
る。

【図２７】ｐＮＬｉｐ１のｃＤＮＡ挿入物のヌクレオチ
ド配列を示す説明図である。

【図２８】本発明のリポコルチンおよびＮ−リポコルチ
ンｃＤＮＡ配列におけるヌクレオチド配列を比較した説
明図であり、図における「Ｘ」は遺伝子のコード化配列
の末端および３′非コード化配列の開始を示すものであ
る。

【図２９】図４の分図である。

【手続補正書】

【提出日】平成６年７月１２日

【手続補正１】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図４

【補正方法】変更

【補正内容】

【図４】

【手続補正２】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図２８

【補正方法】変更

【補正内容】

【図２８】

【手続補正３】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図２９

【補正方法】変更

【補正内容】

【図２９】

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ａ６１Ｋ 38/00 ＡＢＥ ＡＢＦ Ｃ１２Ｎ 1/19 7236−4Ｂ 1/21 7236−4Ｂ 5/10 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＢＦ 8412−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (31)優先権主張番号 ７７２８９２ (32)優先日 1985年９月５日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (72)発明者 ペピンスキー，アール ブレイク アメリカ合衆国、マサチューセッツ 02172、ウォータータウン、アプト ２、 パーカー ストリート 69 (72)発明者 ガーウィン，ジェフリー エル アメリカ合衆国、マサチューセッツ 01730、ベドフォード、フレッチャー ロ ード 76 (72)発明者 シンドラー，ダニエル ジー アメリカ合衆国、マサチューセッツ 02135、ブライトン、モナステリー ロー ド 36 (72)発明者 ホアン，クオ−セング アメリカ合衆国、マサチューセッツ 02173、レキシントン、スティーブンス ロード 12

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 （ａ） ホスホリパーゼＡ_２の酵素活性
   を阻害する能力 （ｂ） 次のトリプシン断片 【化１】 （ここでＸはいずれかのアミノ酸である）および （ｃ）アミノ酸配列 【化２】 からなるカルボキシ末端を特徴とするＮ−リポコルチン
   ポリペプチド。
2. 【請求項２】 （ａ） 【化３】 （ｂ） 前記（ａ）部のＤＮＡ挿入物をハイブリッド化
   しかつ前記（ａ）部のｃＤＮＡ挿入物によりコードされ
   たヒトリポコルチンのホスホリパーゼＡ_２阻害活性およ
   び免疫学的活性を有するヒトポリペプチドをコードする
   ＤＮＡ配列からなる群から選択されたＤＮＡ配列により
   コードされたヒトリポコルチン様ポリペプチドおよび （ｃ） 前記（ａ）および（ｂ）の配列によりコードさ
   れたポリペプチドをコードするＤＮＡ配列からなる群か
   ら選択されたヌクレオチド配列を含有するＤＮＡ分子に
   よりコードされたヒトリポコルチン様ポリペプチド。
3. 【請求項３】 （ａ） 【化４】 （ｂ） 前記（ａ）部のＤＮＡ挿入物をハイブリッド化
   しかつ前記（ａ）部のｃＤＮＡ挿入物によりコードされ
   たヒトリポコルチンのホスホリパーゼＡ_２阻害活性およ
   び免疫学的活性を有するヒトポリペプチドをコードする
   ＤＮＡ配列および （ｃ） 前記（ａ）および（ｂ）の配列によりコードさ
   れたポリペプチドをコードするＤＮＡ配列からなる群か
   ら選択されたＤＮＡ配列を特徴とする組換ＤＮＡ分子に
   より形質転換された宿主を培養する工程を含有するヒト
   リポコルチンのホスホリパーゼＡ_２阻害活性および免疫
   学的活性を有するヒトポリペプチドの製造方法。