JPH02476A - 宿主細胞としてのクルイベロミセス - Google Patents

宿主細胞としてのクルイベロミセス

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JPH02476A
JPH02476A JP63189551A JP18955188A JPH02476A JP H02476 A JPH02476 A JP H02476A JP 63189551 A JP63189551 A JP 63189551A JP 18955188 A JP18955188 A JP 18955188A JP H02476 A JPH02476 A JP H02476A
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kluyveromyces
dna
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ヨハネス　アー　ファン　デン　ベルグ
Ooyen Albert J J Van
アルベルト　イェー　イェー　ファン　オーイェン
Krijn Rietveld
クリン　ライトフェルト
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Gist Brocades NV
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は選択的に生育培地に分泌される、目的とするポ
リペプチドを産生ずるためのクルイベロミセス（Ｋｌｕ
ｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）の調製法及び使用法に関するも
のである。本発明は、クルイベロミセス中でのチモシン
及びその前駆体、組織プラスミノーゲ活性化因子（ｔ−
ｐ八）及びヒト血清アルブミン（ＨＳ　Ａ）の産生に存
用な配列がその例となる。
〔従来の技術〕
微生物におけるペプチド産生の明白な約束事はいくつか
の因子によりおびやかされている。そのペプチドが産生
され、その細胞竹中に維持されている多くの場合におい
て、その包含体はそのタンパク質の変性及び再生を必要
とするようになり、しばしば、一部の成功もしくは全く
成功しない結果となってしまう。
他の例では、そのペプチドは、実質的に分解してしまい
、結果的に、その収率が非常に低いばかりでなく、分離
が困難な複雑な混合物になってしまう。これらの困難さ
を克服する基本的解答として、栄養培地への、望ましい
ペプチドの分泌の可能性を研究した。用いた宿主中で全
てのタンパク質が分泌可能となるとは限らないので、分
泌の成功は限定されたものになってしまう。たとえ分泌
されたとしても、そのペプチドのプロセシングは、望ま
しいペプチドとは異なる組成そして、または、構造のも
のになってしまう場合もありうる。それゆえ、インビト
ロ及びインビボの中広に環境において、そのペプチドの
使用を許す条件下、活性のあるペプチドの効率的でかつ
、経済的産生のためのシステムを開発できるかどうかは
実質的な興味のあるところである。
（関連文献） ヨーロッパ特許出願（ＥＰＡ）００９６４３０は、外来
遺伝子のクローニング及び発現のための宿主としてクル
イベロミセスを公開している。しかし、生育培地へのタ
ンパク質の分泌の可能性についてはなんのコメントもな
い。
アスペルギラス（＾ｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　）のための
、アミログルコシダーゼのリーダー配列は、ボイル（Ｂ
ｏｙｌｅ　）等（ＥＭＢＯジャーナル（１９８４年）、
３巻、１５８Ｉ〜１５８５頁）及びイニス（Ｉｒ＋ｎ１
ｓ）等（サイエンス、（１９８５年）、２２８巻、２１
〜２６頁）により報告されている。ラクターゼプロモー
ターについては、ブレニゲ（Ｂｒｕｅｎｉｇ）等（ヌク
レイツク・アシッズ・リサーチ（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉ
ｄｓ　Ｒｅｓ、）　　（１９８４年）、１２巻、２３２
７〜２３４１頁）により報告されている。サツカロミセ
ス（５ａｃｃｈａｒｏｔｓｙｃｅｓ　）における異種タ
ンパク質の分泌を司るための、交配型の因子と関連する
シングルペプチド及び酵素インバーターゼ及びアシッド
・ホスファターゼの使用は、ＥＰ−Ａ０１２３５５及び
スミス（Ｓｍ１ｔｈ　）等（サイエンス（１９８５年）
、２２９巻、１２１９頁）により報告されている。
サツカロミセス中でのプレプロキロシン、プロキモシン
及びキモシンの産生は、メラー（Ｍｅ　ｌ　１ｏｒ）等
（ジーン（Ｇｅｎｅ）（１９８３年）、２４巻、１２１
４頁）により研究されている。プロキモシンがサツカロ
ミセスの細胞中で作られたとき、得られたプロキモシン
のうち、非常に低い割合のものしか活性化することがで
きなかった。“工業生物学の発展（口ｅｖｅｌｏｐｍｅ
ｎＬｓ　ｉｎ　ＩｎｄｕｓｔｒｉａｌＢｉｏｌｏｇｙ　
）″　（１９８５年）２６巻、７５〜８５頁のモア（Ｍ
ｏｉｒ）等、ジーン（Ｇｅｎｅ　）、（１９８３年）２
４巻、１〜１４頁のメロ−（Ｍｅｌｌｏｒ　）等、バイ
オテクノロジー・アンド・ジェネティックエンジニアリ
ング・レヴユ−（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙａｎｄ　
Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｒｅｖｉｅ
ｗｓ　）　％　３巻（１９８５年）、３７６〜４１８頁
）のキンゲスマン（に１ｎＢｓｎ＋ａｎ　）等の報告を
参照せよ。サツカロミセスにより産生された凝集したプ
ロキモシンは、このプロキモシンの可溶化のため、変性
及び再生の複雑な方法を必要とする。ＷＯ３３１０４４
１８及びＥＰ−Ａ−０１１４５０６参照。
（本発明の要約） 制御領域の転写及び翻訳制御下の、場合によっては、分
泌のためのシグナル配列を含む遺伝子、クルイベロミセ
スにおいで使用するための効果的な転写開始及び終止領
域を含む発現カセット及びクルイベロミセス宿主株を含
む、ペプチド産生システムが提供された。このカセット
は、クルイベロミセス中に、生したトランスフォーマン
トがこの発現カセットを安定して維持する条件で導入さ
れた。天然のＤＮＡ及び合成遺伝子が、目的とするペプ
チドの産生に用いることができる。
本発明に従って、クルイベロミセス・イースト細胞によ
る、ポリペプチドの効率的かつ経済的産生を可能にする
発現カセットが提供された。この発現カセットは、クル
イベロミセス宿主細胞中で機能する転写及び翻訳制御配
列及びその制御領域の転写及び翻訳コントロール下、目
的とするペプチドをコードする読み取り枠を有している
。また、この読み取り枠は、生育培地中に、ポリペプチ
ドを分泌する、クルイベロミセス宿主により認識される
リーダー配列も含んでいる。使用するクルイベロミセス
細胞は研究用又は工業用株のいずれでもよい。
この発現カセットは、５′から３′の転写の方向に、転
写及び翻訳開始制御領域、望ましくは、クルイベロミセ
スにより認識される分泌のためのシグナル配列を有する
、目的のペプチドをコードする読み取り枠及び翻訳停止
領域を含むであろう。
さらに、この発現カセットは、転写終止側′４ｎＳＲ域
を含む。この開始及び停止側？１１　ｉＩ域は、クルイ
ベロミセス中で機能し、かつ、クルイベロミセス宿主の
生育及び増殖に望ましからぬ効果を与えることなしに、
目的とするペプチドの効果的発現を提供する。
この転写及び翻訳開始制御領域は、クルイベロミセスに
対し同種のものでも異種のものでもよい。
クルイベロミセス又は、例えばセレビシアエ、シゾサツ
カロミセス、カンディダ、その他の、サツカロミセスの
ような他のイースト種、又は、例えば、アスペルギラス
、ニューロスポラ、ペニシリウム、その他のような、繊
維状菌類である他の菌類中に存在する遺伝子由来の転写
開始領域は特に興味深い。転写開始制御領域は、例えば
、アルコールデヒドロゲナーゼ、グリセルアルデヒド−
３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ホスホグルコイソ
メラーゼ、ホスホグリセレートキナーゼ、その他のよう
な、解糖系の遺伝子又は、アシッドホスファターゼ、ラ
クターゼ、グルコアミラーゼ、その他のような制御可能
遺伝子から人手できる。
多くの制御配列のどれをとっても、構成的転写が望まし
いのか、誘導型転写が望ましいのか、目的とする読み取
り枠と結合したプロモーターの効率、誘導可能な転写を
許す別のプロモーター由来のコントロール領域と強いプ
ロモーターとを結合する能力、構成の容易さ、及びそれ
に類するものによって、特別の状態にあることは望まし
いといえる。これらの制？ｉｌ　’ｐＨ域は、文献中に
十分な先例をみることができる。例えば参考のため引用
している、ＥＰ−Ａ−０１６４５６６を参照せよ。
遺伝的に修正した微生物中での異種タンパク質の分泌は
一般的に、２つの方法のうちの１つによって行なわれる
。１つは、そのリーダー配列を、そのタンパク質に対し
同種のものを使用することで、２つ目は、リーダー配列
を、宿主生物に対し同種のものを使用する。クルイベロ
ミセス中で異種タンパク質を分泌するための本発明にお
いて、特に興味ある別法は、クルイベロミセス及び目的
とするペプチドの両方に対して異種のリーダー配列、又
は、特別にデザインされた合成リーダー配列を使用して
いる。前者のリーダー配列をコードするＤＮＡは、単離
又は合成によって得られる。
従って、通常、この読み取り枠には、そのシグナル配列
が正常にコード配列の残りの部分と会合している、野生
型又は変異型遺伝子、そのシグナル配列が正常にその読
み取り枠と会合していない、ハイブリッド又はキメラ読
み取り枠又はそのシグナル配列及びその読み取り枠の残
りの部分が、好ましいコドン、便利な制限部位、新しい
アミノ酸配列及びそれに類することを提供するべく合成
された、合成配列、又はこれらの組合せが含まれるであ
ろう。使用されるシグナル配列は、α因子、インバータ
ーゼ、アミログルコシダーゼのような遺伝子、クルイベ
ロミセス、サツカロミセス、例えばニューロスポラ、ア
スペルギラスのような他の菌類及び他の真核生物により
認識され、構造遺伝子中に存在する天然もしくは野生型
のシグナル配列から入手することができる。
目的とするペプチドを、細胞周辺腔よりもむしろ栄養培
地中に分泌するシグナル配列の使用は特に興味深い。は
とんどの場合、シグナル配列は読み取り枠の５′末端に
存在する。しかし、ある状況においては、シグナル配列
が読み取り枠内部にあることが望ましい。分泌のための
内部シグナル配列の使用に関しては、米国特許第４，３
３８，３９７号及びペララ（Ｐｅｒａｒａ　）及びリン
ガフパ（Ｌｉｎｇａｐｐａ）（ジャーナル・オブ・セル
・バイオロジー（Ｊ。
Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌｏｇｙ　）　　（１９８５年）１
０１巻、２２９２〜２３０１真）の報告を参照せよ。目
的とする読み取り枠へ挿入する遺伝子は非常によく発現
される構造遺伝子、例えば、解糖系の酵素をコードする
遺伝子又はラクターゼ、アミログルコシダーゼ又はそれ
に類する非常によ（発現される、制御可能の遺伝子を含
んでいる。
至適な遺伝子発現のために、翻訳開始コドンＡＴＧ付近
のヌクレオチド配列が、イースト細胞及び動物細胞の場
合重要であることが分っている。
例えば、Ｍ、コザク（Ｋｏｚａｋ）（ミクロバイオロジ
カル・レビューズ（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｒｅｖｓ、
）（１９８３年）、４７巻、１〜４５頁）はＣＯＳ細胞
におけるインシュリンの発現に関し、こられの領域の影
客を非常によく研究した。同様に、特異的なヌクレオチ
ドが、他のものに比べ、より多く、非常によく発現され
たイーストのタンパク質中にみられ、これら遺伝子の発
現レベルに関し、これらヌクレオチドの重要な効果を示
した。
外来遺伝子の至適な遺伝子発現に対し、その開始コドン
ＡＴＧのまわりのヌクレオチド配列を修正することが重
要である。このことは、部位特異的突然変異誘発又は、
内在するクルイベロミセス遺伝子で、好ましくは、ラク
ターゼ遺伝子のように非常によく発現する遺伝子と読み
取り枠を同じくして融合することにより行なわれる。
通常、どちらの手順でも使用できるのではあるが、この
シグナルリーダーが、分泌プロセスにつづいて切断され
るのではなく、分泌プロセス中に目的とするペプチドか
ら切断される方が望ましいであろう。通常使用されるプ
ロセシングシグナルは、シグナルペプチドの加水分解的
切断を起こすペプチドシグナルを与え、目的とするペプ
チドからシグナルペプチドをプロセシングするのになお
効果的な、天然のものを修正したプロセシングシグナル
又はシグナル配列をもつ、天然のプロセシングシグナル
である。α因子（例えば、参考のため、引用した米国特
許第４．５４６，０８２号参照）、アミログルコシダー
ゼ、α−アミラーゼ、その他のような多くのプロセシン
グシグナルが配列決定され、明確にされた。ある例では
、他のペプチダーゼ認識配列が、望ましいペプチドの単
離のための切断に必要となり用いられた。これらの配列
には、各々ＫＥＸ２、子ウシエンテロキナーゼ及びイー
スト・メンブレン・ペプチダーゼにより切断を受ける、
ＫＲｌ（Ｄ）４Ｋ及びＥＡのような２塩基ペプチドがあ
る。
目的のペプチドは、宿主にとって本来のものか、又は原
核生物又は菌類、原生生物、を椎動物、無を椎動物及び
これに類するものを含む真核生物由来の異種のものであ
る。
ペプチド産生物には、ラクターゼ、α−アミラーゼ、β
−アミラーゼ、アミログルコシダーゼ、キモシン、その
他のような酵素、ホルモン、インターロイキン、サイト
キン、カチェキシン、例えば血小板誘導、上皮、骨格成
長因子等の成長因子、成長ホルモン、卵胞刺激ホルモン
、インターフロン（α〜、β−及びγ−）、因子■、■
、■、■（■−又はＣ）　、ＩＸ、　　Ｘ、　Ｘｒ又は
Ｘｌｌ　（７）ような血液因子、プラスミノーゲン活性
化因子（ｉｎ又は尿）、ヒト血清アルブミンのような血
清アルブミン、コロニー成長因子（例えば、ＧＭ）　、
エリトロボイエチン、タウマチン、インシュリン、その
他の哺乳類ペプチドが含まれる。
これらの構造遺伝子は、種々の方法で入手できる。アミ
ノ酸配列が分っている場合で、特にイースト選択的コド
ンを与えることが望ましい場合は、その構造遺伝子の一
部又は全部を合成することもできる。従って、読み取り
枠の全て、又は一部はクルイベロミセスに好ましいコド
ンを用いて、合成することができる。好ましいコドンは
、例えば解糖酵素のような、クルイベロミセス宿主によ
って大量に生産されるタンパク質中にみられるコドンに
よって決まる。配列の合成法及びそれらの合せ方は文献
中確立されたものとなっている。読み取り枠の一部を合
成する場合でかつその一部が天然のもの由来である場合
、その合成ｊＩ　ｂ５．は、２つの天然領域の間の橋渡
しとなる場合もあるし、その５′、あるいは３′末端と
なる場合もある。特に、シグナルペプチド及びそのペプ
チドをコードする読み取り枠が異なる遺伝子に由来する
場合、普通合成アダプターが用いられよう。他の例では
、種々の断片が種々の制限部位に挿入されるか、又は、
リンカ−中の配列と置換されるような場合には、リンカ
−が用いられる。
はとんどの場合、読み取り枠の一部又は全部が、天然の
ものに由来する。目的の配列を同定する方法は、個々の
状況が別の困難に出くわしてはいるが、文献中に巾広い
例が見うけられる。天然のアミノ酸配列の少なくとも一
部が既知で、ゲノム又はｃＤＮＡライブラリーを、相補
的配列で探査できる場合は、種々の技法でプローブが用
いられる。
別に、目的の遺伝子が誘導されるか、又は、細胞が同し
宿主由来であるが、異なる分化のものである場合、生産
されたメンセンジャーＲＮＡを比較することにより、転
写の差を検出することができる。
終止領域が、開始領域と同じ遺伝子の３′領域由来のこ
ともあるし、別の遺伝子由来のこともある。多くの終止
領域が知られており、同じ及び異なる属及び種由来のも
のが種々の宿主の中で満足がいくよう働くことが分って
いる。通常終止領域は、特別の性質のためというよりは
むしろ便利さの問題から、選択される。この終止領域は
、イースト遺伝子、特に、サツカロミセス又はクルイベ
ロミセス由来のものであることが好ましい。
発現カセットの開発において、制御領域及び読み取り枠
を含む種々の断片を、ライゲーション、制限、リセクシ
ョン、イン・ビトロ突然変異誘発、プライマー修復、リ
ンカ−及びアダプターの使用及びこれに類することなど
のような種々のプロセシング条件にかけられた。従って
、ヌクレオチドのトランジション、トランスバージョン
、挿入、欠失又はこれらに類するものが、制御領域そし
て、または読み取り枠中に用いられたＤＮＡに起こるか
もしれない。
発現カセットの構築の間、ＤＮＡの種々の断片が通常Ｄ
ＮＡの増殖、ＤＮＡの修飾又はその配列、リンカ−又は
これらに類するものの結合あるいは除去による操作を行
うことができる適当なりローニングベクター中にクロー
ン化されよう。通常、このベクターは、大腸菌中で少な
くとも比較的高いコピー数で複製できる。多くのベクタ
ーがクロニング用に人手でき、その中には、ｐＢＲ３２
２、ｐＡｃＹｃ１８４、ｐＵｃ７−１９、Ｍ１３、シャ
ロン４Ａ、及びこれらに類するものがある。
クローニングベクターは大腸菌中で機能する効果的な複
製システムを有することが特徴である。
またこのクローニングベクターは、少なくとも１つの、
通常はいくつかのユニークな制限部位をもち、かつまた
、多重の制限部位、特に置換のため同じ制限部位を２個
持っている。加えて、このクローニングベクターは、１
つ以上の、トランスフォーマント選択のためのマーカー
を有している。
このマーカーは通常、抗生物質、重金属、トキシン類や
これらに類するもののような細胞毒性物質に対する耐性
、独立栄養宿主の相補性又はファージに対する免疫を提
供する。ベクター及びカセットの適当な制限及び、リン
カ−の付加；テーリングによる突出部の切除又は充填に
よるプラントエンドの形成等の末端の修正によりベクタ
ーを発現カセット又はその一部に結合するための相補的
末端が与えられる。
カセットの開発におけるＤＮＡの各操作の後、そのプラ
スミドをクローン化及び単離し、かつ、望まれる場合は
、その特別のカセット成分を配列分析して、適正な配列
が得られたことを確認する。
その操作の性質に依存して、そのプラスミドから望まし
い配列を切り出し、別のベクター中に導入することもで
きるし、またそのプラスミドを制限処理したり、またそ
の発現カセット要素を適当に操作したりもできる。
いくつかの例において、そのベクターが、異なるｌＩ製
クシステム必要とする別の宿主中で複製することができ
るものであるシャトルベクターを用いることもできる。
これは２つの宿主で機能する付加的マーカーを必要とす
ることもあるし、しないこともある。そのようなマーカ
ーが必要な場合、カセット、２つの複製システム及びマ
ーカーを含むプラスミドを、１つの宿主から、必要とさ
れるように別の宿主に移す場合のベクター中にそれらを
含ませることができる。ここでの状況では、第２の複製
システムは、クルイベロミセス中で機能する複製システ
ムということになろう。用いることができる複製システ
ムは、クルイベロミセス・ドロソファララム（ｄｒｏｓ
ｏｐｈｉｌａｒｕｍ　）由来のｐＫＤＬのようなプラス
ミド、ウィルス、又は、クルイベロミセス又は他の種、
特にサツカロミセスのようなりルイヘロミセスと関連す
るものの染色体由来のものである。従って、複製システ
ムには、サツカロミセスにみられる２ミクロンプラスミ
ドの複製システム及び、例えば、セントロメア配列と合
せて用いる場合は、自己複製配列（ＡＲＳ）遺伝子又は
これに類するものが含まれる。望まれるなら、相同領域
が、クルイベロミセス宿主のゲノムへの複製カセットの
組込みを促進するよう提供される。
本発明の構築物において、高いトランスフォーメーショ
ン効率を与える、ＫＡＲ３と呼ばれるクルイベロミセス
ＤＮＡ染色体由来の配列は特に興味深い。このＫＡＲ３
遺伝子は、クルイベロＤＮＡ断片のライブラリを、高ト
ランスフォーメーション効率についてスクリーニングす
ることにより得られる。この方法において、ＫＡＲ３配
列を含み、この配列をさらに、制限、リセクション又は
プライマー修復により修正して、高いトランスフォーメ
ーション効率を与え、約２００ｂｐで、約５０００ｂｐ
以上ではなく、通常、約２００ｂｐから２０００ｂｐの
断片を与える断片が得られる。
ＫＡＲ５遺伝子の存在により、ＤＮＡマイクログラム当
り、少なくとも約１０３個の効率で、ＷＪには、ＤＮＡ
マイクログラム当り１０４あるいはそれ以上の効率で、
Ｋ、ラクチスの栄養要求株を原栄養株にトランスフオー
ムすることができる。
クローニングのための、種々のＤＮＡ構築物（プラスミ
ド及びウィルス）による大腸菌のトランスホーメーショ
ンの方法は、本発明にとって重要なものではない。接合
、トランスダクション、トランスフェクション又は、例
えば、塩化カルシウム又はリン酸仲介トランスフォーメ
ーションのようなトランスホーメーションが用いられる
。
方、イーストに対しては、はとんどの場合、従来法では
、カルシウムイオン及び約２０００から８０００、通常
４０００から７０００ダルトンのポリエチレングリコー
ルを組合せて用いるプロトプラストのトランスホーメー
ションに頼っている。
トランスホーメーションの別法では、標準イースト栄養
培地中で、クルイベロミセスを１から２５、望ましくは
４から１００Ｄ６＋ｏの密度に生育させることが含まれ
る。このクルイベロミセス細胞を収穫し、洗浄後、カオ
トロピックイオン、特にアルカリ金属イオンのリチウム
、セシウム又はルビジウムで、特に塩化物又は硫酸塩で
、より好ましくは、リチウム塩を約２ｍＭからＩＭ、好
ましくは約０．ＩＭ濃度で前処理する。細胞を、このカ
オトロピックイオンとインキュベーション後、そのＤＮ
Ａを加え、さらに、インキュベーションを、一般的には
約２０℃から３５℃の温和な温度で、約５分から約６０
分の短かい時間続ける。それからポリエチレングリコー
ルを望ましくは約２５から５０％となるように加え、全
媒体がポリエチレングリコールの：ａｗＪ液を等容量加
えることにより、望ましい最終濃度を得るようにする。
ポリエチレングリコールは、約２０００から８０００ダ
ルトン、好ましくは、約４０００から７０００ダルトン
のものを用いる。一般的にインキュベーションは、比較
的短時間、一般的には約５分から６０分間行なう。
インキュベーション媒体は約３５℃から４５℃、好まし
くは約４２℃に、約１から１０分間加熱処理を行うこと
が望ましい。
クルイベロミセスで有効なマーカー数は、サツカロミセ
スで用いられるマーカーよりも範囲が狭いけれど、選択
のためいくつかのマーカーが用いられる。カナマイシン
耐性及びアミノグリコシドＧ４１８耐性はトリプトファ
ン代謝系、特にＴＲＰＩ又はラクトース代謝系、特にＬ
ＡＣ４における遺伝子の相補性同様興味深い。
選択マーカーは便宜上、非常に望ましいが、トランスフ
オームした細胞をスクリーニングする他の操作も報告さ
れている０例えば、Ｇ、レイペン（Ｒｅ１ｐｅｎ　）等
（カレント・ジェネティクス（ＣｕｒｒｅｎｔＧｅｎｅ
ｔｉｃｓ　）　（１９８２年）、５巻、１８９〜１９３
頁）の報告参照、β−ラクタマーゼのようなインジケー
ター酵素の使用の他にトランスホームした細胞は、それ
らが生産した特異的産物によってもスクリーニングする
ことができる０例えば、キモシンの場合、その産物の合
成は、免疫学的又は酵素的方法によって測定することが
できる。
使用ベクターは、クルイベロミセス中での染色体外保持
もしくはクルイベロミセス遺伝子への組込みを起こすこ
とがある。サツカロミセス由来の２ミクロン複製システ
ムは、クルイベロミセス中の染色体外保持を提供する。
加えて、サツカロミセスＣＥＮ３のようなセントロメア
及びＡＲ３又はＫＡＲＳのような高トランスホーメーシ
ョン効率配列を組合せて用いることができる。もしクル
イベロミセスがこうむる抗体に対する耐性や相補性のよ
うに、選択的保持が可能なら、通常、ＡＲＳ様配列は染
色体外保持に十分なものである。
大規模発酵にとって、プラスミド安定性のわずかなロス
も、望まれるタンパク質の最終収率に大きく影響する。
宿主細胞、例えば、クルイベロミセスの中での組換え分
子の安定性を増すため、宿主染色体への組換え分子の組
込みが利用される。
組込みが望ましい場合、通常、宿主の染色体の配列と相
同的配列をもち、その結果、相同的組換えが起こること
が望ましい。またランダムな組込みも起こり、その結果
、相同的配列が任意であることが理解されよう。相同的
配列が使われた場合、通常その相同的配列は、少な（と
も約２００ｂｐであり、１ｏｏｏｂｐ又はそれ以上のこ
ともある。
加えて、組込みが関与している場合、その構造遺伝子の
増巾も望むことができる。増巾は、選択培地中、その宿
主が選択されるのに有利とする、望ましい構造遺伝子を
タンデムに遺伝子に与えることにより成しとげられる。
従って、ジヒドロホレート、リダクターゼ、メタロチオ
ネイン、チミジンキナーゼ、その他を発現する遺伝子は
、その遺伝子がメトトレキセートのようなトキシン、銅
及び水銀のような重金属及びこれらに類するものに対す
る保護を提供する場合、種々の宿主において、増巾のた
めに有用であることが明となった。
安定な複製を行う、目的とするベクターには、Ｋ、ラク
チス由来のＫＡＲＳベクター、例えば、Ｓ、セレビシア
エのプラスミドｙＲｐ７中のＫＡＲ３１２又はＫＡＲ３
２ＡＲＳ様配列、ラクチスのＤＮＡ断片を含むプラスミ
ド、ｐＫＡＲ５１２及びρＫＡＲ５２が含まれる。例え
ば、組込みに用いたベクターは、プラスミドＹＲｐ７を
もつＡＲ３ｌ及びＬＡＣ４遺伝子をもつに、ラクチスの
Ｘｈｏｌ　　ＤＮＡ断片のハイブリッドプラスミドｐＬ
４である。ＥＰ−Ａ−００９６４３０を参照せよ。
特に興味深いプラスミドには、２ミクロンプラスミド複
製システム、ＬＡＣ４遺伝子、Ｔｎ６０１及びクルイベ
ロミセス中に抗生物１Ｇ４１８への耐性を与えるＴｎ５
カナマイシン耐性遺伝子が含まれる（ジメふズ（Ｊｉｎ
ｅｎｅｚ）及びデービス（Ｄａｖｉｓ）、ネイチ＋　　
（Ｎａｔｕｒｅ　）　　（１９８０年）、２８７巻、８
６９〜８７１頁）。このプラスミドは、クルイベロミセ
スに自己複製能を与え、グリコース、ソルビトール及び
０．２μｇ／ｍｌの０４１８を含み、クルイベロミセス
のＧ４１８ｉ受性を妨害する高濃度のＫＣ７！を除いた
再生プレート上で、０４１８への耐性により選択するこ
とができる。望ましいプラスミドは、特にＳ、セレビシ
アエ由来のＴＲＰＩ遺伝子、特に、Ｋ、ラクチス由来の
ＬＡＣ４遺伝子及びＴｎ５由来の抗生物質Ｇ４１８に対
する耐性を与えるＫａｎ”　ｉｆｆ伝子金倉んでいる。
本ベクター及び構築物を、望ましい構造遺伝子のクロー
ニング及び発現のため適当な宿主へ導入する。トランス
ホーメーション後、通常、コロニーは、再生培地上の約
５から６日後に出現する。
選択した抗生物質を用いたとき、コロニーは、耐性株へ
の自然突然変異のないことを確認するためにスクリーニ
ングを行うべきである。本発明のプラスミド及び方法を
用いると、耐性コロニーの約５％には、プラスミドＤＮ
Ａμｇ当り、少なくとも約４個のトランスホーマントを
与える効率で、プラスミド構築物を含むことが分った。
唯一の炭素源としてラクトース及び浸透圧安定化剤とし
ての０．６Ｍ　　ＫＣｊ！を含むプレートを用いて、Ｌ
ＡＣ４遺伝子の存在に基づいて選択を行った場合、全て
の生存コロニーは、トランスホーマントであり、復帰突
然変異体ではないことが分った。約２０個のトランスホ
ーマントは温和な、例えば３０℃の温度で約４日から５
日インキュベーションすることにより得ることができる
。
宿主生物として、クルイベロミセスが異種タンパク質の
生産、例えば、酵素キモシン及びその前駆体であるプレ
プロキモシン、シュードキモシン及びプロキモシン、ヒ
ト血清アルブミン（Ｈ５Ａ）、組織プラスミノーゲン活
性化因子（ｔ−ＰＡ）及びトウマチン及びその前駆体の
生産及び抽出に通している。サツカロミセスのような、
その他の生物は、合理的な量のプロキモシンを生産する
けれども、生産されたプロキモシンを活性又は活性化可
能な形で抽出することはできない。驚くべきごとに、ク
ルイベロミセスによって生産されたプロキモシンの全量
の９０％以上が、非常に簡単な標準技術により活性のあ
る形で抽出することができることが分った。
多（のクルイベロミセス種のどれでも使用することがで
きる。工業用種が好ましいが、研究用でも工業用でも用
いることができる。工業用種とは、天然のものから単離
できる、又は、保管所又はその他の場所から入手できる
、又は、そのような株の修正、例えば突然変異によって
得られる生物由来のクルイベロミセス株を意味する。工
業用株は、遺伝子交換に対し耐性をもち、原栄養性又は
宿主株中へ導入された単一の遺伝子によって原栄養性と
されたことを特徴とし、また、通常、ペプチドの生産の
改良により選択される。使用しうろことが分っているク
ルイベロミセス種には、Ｋ、ラクチス、Ｋ、フラジリス
、Ｋ、ブルガリカス、Ｋ。
サーモトレランス、Ｋ、マルキシアヌスその他がある。
さらにクルイベロミセス生物は、ＧＲＡＳ（安全である
と一般に認められている）リストにのっているものであ
ることに注意せよ。イン・ビボで用いられるか、もしく
は正常に摂取されて、生産物の生産のためにそれらを用
いることは、特別な政治的配慮や認可は必要としない。
野生株及び変異株のクルイベロミセス、特に、クルイベ
ロミセス・ラクチス又はクルイベロミセス・フラジリス
とも宿主としれ使用できる。特に興味ある宿主には、Ｋ
、ラクチス５Ｄ１１１ａｃ４ｔｒｐ　ｌ及びに、ラクチ
ス５Ｄ６９１ａｃ４、及び野生型株Ｃｌ５Ｓ２３６０が
ある（Ｅ　Ｐ　−Ａ　−００９６４３０参照）。
プラスミドの保持のためのトランスホーマントへの淘汰
圧の維持に対し、Ｋ、ラクチスＳＤ６９Ｉａｃ　４　（
ＰＴＹ７５−ＬＡＣ４）及びに、ラクチスＳＤ６９１ａ
ｃ　４　（ｐＬ４）に対しては、グルコースの代りに２
％ラクトースを含むイーストのナイトロジェン・ヘイス
ト・メディア及びに、ラクチス５ＤＩＩ　　１ａｃ４　
ｔｒｐｌ　（ｐＫＡＲｓ１２）に対しては、２％グルコ
ースを加えたイーストのナイトロジェン・ベイスト・メ
ディア（デイフコ）のような選択培地を用いる。記述し
たトランスホーマントについては、ＥＰ−八−００９６
４３０を参照せよ。同様に、例えば６４１８等の抗生物
質耐性を８与えるプラスミドを含む株を、上記の抗生物
質を含む培地中で培養することができる。
ハイブリッドプラスミドを、望ましいタンパク質の大規
模生産に使う場合、−ａ的には、そのハイブリッドプラ
スミド由来の少なくとも実質的に全てのバクテリアＤＮ
Ａ配列を除くのに有用であるであろう。
目的の構造遺伝子の性質に依存し、発現生産物が宿主細
胞の細胞質中に維持されることもあるし、または、分泌
されることもある。細胞中に維持されるクンバク質のみ
ではなく、分泌されるものも可溶性であることが分って
きた。発現生産物が宿主細胞中に維持される場合、−殻
内には、誘導可能な転写開始領域を有し、その結果、ト
ランスボーマントが高密度にまで到達するまで、望まれ
る生産物が全くもしくはほとんど発現されないことが望
ましい。発現産物が形成するのに十分な時間後、その細
胞を例えば遠心のような従来の方法で単離し、溶解し、
そして、目的とする生産物を単離する。この生産物の性
質と使用に応じて、この溶解物を、クロマトグラフィー
、電気泳動、溶媒抽出、結晶化又はこれに頻する種々の
精製法にかける。純度は約５０％から９０％あるいはそ
れ以上の本質的な純度にまでの範囲となる。
その生産物が分泌される場合、構成及び非構成転写開始
領域の両方とも、目的とするタンパク質又はポリペプチ
ドの生産に用いた発酵プロセスに依存して用いることが
できる。その発現産物は、培養培地中に分泌され、その
培地を部分的に引き出し、望まれる産物を、例えばアフ
ィニティークロマトグラフィー又はこれに類するもので
抽出し、使った培地は棄るか又は、基本的成分を整えて
再循環させることにより連続的に生産することができる
。
この明細書に記されているすべての公表及び特許出願は
、本発明が関係する分野の熟練者のレベルに合せて示し
である。全ての公表及び特許出願は、各々個々の出願又
は特許出願が特別に及び個別に参考として引用したのと
示されたのと同程度に、参考としてここに引用している
。
次に示す例は、説明のためであり、制限を意図するもの
ではない。
（実　験） 例　　ｌ 長いラクターゼプロモーター配列を含むキモシン発現プ
ラスミドの構築 Ａ、ｐ［Ｊｃｔ’ａ　５６の構築 染色体ＤＮＡを、クルイベロミセスラクチス、ＣＢ５２
３６０株（ダス（Ｄａｓ　）及びホレンバーグ（ｌｌｏ
ｌｌｅｎｂｅｒｇ　）　、カレントジエネティクス（Ｃ
ｕｒｒｅｎｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　）、（１９８２年）
、５巻、１２３〜１２８頁）から単離し、ＸｈｏＴで切
断後、スクロース勾配上で大きさに従がい分離した。ラ
クターゼ遺伝子を含む両分を、ニトロセルロースフィル
ターへのＤＮＡのスポツティング後、プラスミドｐＫ　
１６由来のＬＡＣ４プローブを用いて検出した（ＥＰ−
Ａ−００９６４３０、例１６、Ｃ２参照）。ＬＡＣ４遺
伝子を含むＤＮＡをプラスミドｐＰＡ１５３〜２１５の
Ｓａｌ　１部位にクローン化しくアンドレオリ　（Ａｎ
ｄｒｅｏｌｉ　）　、モレキュラー・ジェネラル・ジエ
ネティクス（Ｍｏｌ。
Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、）　（１９８５年）、１９９巻
、３７２〜３８０頁）、プラスミドｐＰＡ３１を作る。
ラクターゼ遺伝子を含むｐｐΔ３１の’）（ｂａｒ断片
を、ｐ［Ｊｃ１９のＸｂａｒ部位にサブクローンして（
ヤニッシーペラン（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ　）
等、ジーン（Ｇｅｎｅ　）　　（１９８５年）、３３巻
、１０３〜１１９頁）、プラスミドｐＵＣ１ａ５６を得
た。
Ｂ、ラクターゼ遺伝子のターミネータへの６４１８耐性
遺伝子の導入 ０４１８耐性マーカーを含むターミネータ断片を、プラ
スミドｐＧＢＴｅＧ４１８から得た。ｐＧＢＴｅＧ４１
８を含む大腸菌を、１９８７年２月２６日、登録番号Ｃ
Ｂ５１８４．８７でセントラル・プリュー・ヴオア゛シ
メルカルチ＋　−（Ｃｅｎｔｒａｌ　Ｂｕｒｅａｕ　ｖ
ｏｏｒＳｃｈｉｍｅｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ　）に保管し
た。プラスミドｐＧＢＴｅＧ４１８　　（図１参照）は
、上記のように、プラスミドｐＰＡ１５３〜２１５及び
３．７ｋｂのＲａｎ　ＩＩＩＫ、ラクチスラクターゼタ
ーミネータ−断片を含む５．６ｋｂ断片（ブレニング（
Ｂｒｅｕｎ　ｉｎｇ）等、ヌクレイツク・アシンズ・リ
サーチ（Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、）（１９８４
年）、１２巻、２３１７〜２３４１頁）及びベネゼン（
Ｂｅｎｎｅ　Ｌｚｅｎ）及びホール（Ｈａｌｌ）　（ジ
ャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、
　８ｉｏ１．　Ｃｈｅｍ、　）　（１９８２年）、２５
７巻、３０１８〜３０２５頁）により報告されているの
と同様に、イースト由来のアルコール・デヒドロゲナー
ゼＩ　　（ＡＤＨ）遺伝子のプロモーターの指示下、６
４１８耐性を示すＴｎ　５ｉ１ｉ伝子（レイス（Ｒｅ１
ｓｓ　）等、ＥＭＢＯ，Ｊ　（１９８４年）、３巻、３
３１７）を含んでいる。
Ｃ，０４１８耐性遺伝子及びプロキモシンコードＤＮＡ
を含むプラスミドｐＧＢ９００の構築Ｇ４１８耐性遺伝
子（例ＩＢ参照）及びｐＧＢ１２３由来のプロキモシン
遺伝子を含む５ａｌｌ−旧ｎｄｍ断片（ＥＰ−Ａ−００
９６４３０）を含むプラスミドｐＧＢＴｅＧ４１８由来
の３．６ｋｂの１ｌｉｎｄ［［Ｉ　−Ｘｂａ　Ｉ断片を
、Ｓａｌ　Ｔ及びＸｂａ　Ｉで切断したｐｕｃＩ９とラ
イゲーションし、プラスミドｐＢＧ９００を作った。
Ｄ、プラスミドｐＧＢ９０１の構築（図２参照）プラス
ミドｐＧＢ９０１を次に示す４つの断片をライゲーショ
ンすることで構築した。
（１１ｐＵｃＩａ５６から単離したラクターゼＡＴＧ開
始コドンからおよそ−９０の部位までのラクターゼプロ
モーターを含む３．６　ｋｂのＸｂａ　Ｉ　　Ｈａｅ　
ＩＩ断片。
＋２）　　ＥＰ−Ａ−００９６４３０の例１６．Ｃ２で
報告されているように、Ｂａｔ　３１実験で−２６の位
置にライゲーションされた、上記のＨｅａ　Ｕ部位から
Ｓａｔ　１部位にまたがるＨａｅ　ＩＩ　−５ａＩ　Ｉ
　％片。
しかし、この実験においては、Ｓａｌ　Ｉ　リンカ−の
みを用いた。この断片の配列は、 ５　’　　ＴＴＡＡＣＡＣＴＴＧＡＡＡ丁丁　丁ＡＧＧ
ＡＡＡＧＡＧ　　ＣＡＧＡＡＴＴＴＧＧＣＡＡＡＡＡＡ
ＡＡＴ　　ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ　　ＴＡＡＡＣＡＣＧ
　　３　　’３　’　ＣＧＣＧＡＡＴＴＧ　ＴＧＡＡＣ
ＴＴＴＡＡ　　ＡＴＣＣＴＴＴＣＴＣＧＴＣＴＴＡＡＡ
ＣＣＧＴＴＴＴＴＴＴＴＡ　　ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ　
　ＡＴＴＴＧＴＧＣＡＧ　　ＣＴ　　５　’である。
（３）プロキモシン及びｃＧＢ９００由来のＧ４１８含
む５．１ｋｂのＳａｌ　Ｉ−Ｘｂａ　Ｉ断片（例１ｃ参
照）。
（４）　　Ｘｂａ　Ｉで切断したｐＵｃ１９゜プラスミ
ド構築の間、Ｈｅａ　ＩＩ部位由来のＣＧ配列が偶発的
に除去され、これにより、この部位に旧ｎｄ　ｍ部位が
生じた。
プロキモシンコードＤＮＡはプラスミドｐＧＢ９０１中
に存在する。このことで、各々、ｐＧＢ１３１．１２２
又は１２５由来のＳａｌ　ｌ−Ｂｇｌ　　ＩＩ断片を用
いて、プレプロキモシン、シュードシモシン又はキモシ
ンＤＮＡを有するプラスミドを容易に転換できる（ＥＰ
−Ａ−００９６４３０参照）。
例２ クルイベロミセスラクチストランスホーマントからのプ
ロキモシンの分泌 クルイベロミセスにおけるプロキモシンの合成を指示す
るため、Ｋ、ラクチス５ＤＩＩ及びＣＢ５２３６０株を
トランスホームするのにプラスミドｐＧＢ９０１を用い
同様の結果を得た。基本的にトランスホーメーションは
、本来のプラスミドＤＮＡ又は、制限エンドヌクレアー
ゼで切断したプラスミドＤＮＡを用いることにより、例
４及びＥＰ−Ａ−００９６４３０に報告されている方法
により行った。後者の場合、プロモーター領域を切断す
る、例えば、Ｓａｃ　Ｉｔ、　Ｎｄｅ　１．　Ｓｎａ　
Ｂｌ又はＳｐｅ　１ターミネータ−領域を切断する、例
えば、Ｅｃｏ　ＲＶ又はプロモーター及びターミネータ
領域の両方を切断する制限エンドヌクレアーゼが用いら
れた。
Ｋ、ラクチスＣＢ５２３６０株を、６．７％のイースト
ナイトロゲンベース（デイフコ）２．５ｍｊ２を含むＹ
ＥＰＤ培地（１％イーストイクストラクト、２％ペプト
ン、２％グルコース）ｌｏｏｍｌ中で、ＯＤ、１゜が約
７となるように生育させた。
その細胞を培養物１０ｒａＩｌを遠心して収穫し、ＴＥ
バッファ　（１０ｍＭトリス−塩酸、ＰＨ７，５，０，
１ｍＭＥＤＴＡ）で洗浄後、１ｍｌのＴＥバッファに再
懸濁した。等容量の０，２Ｍ酢酸リチウムを加え、その
混合物を、振盪浴上で３０　’Ｃ１時間インキュベート
した。
プラスミドρＧＢ９０１　　（６５μｇ）を、ラクター
ゼプロモーター中の唯一のＳａｃ　１１部位で切断し、
エタノール沈殿後、１５μβのＴＥバッファに溶かした
。このＤＮＡｉＡｒＭ物を、１００μｌのブレインキュ
ベート細胞に加え、３０分間イン；トユベーションをつ
づけた。それから７０％ＰＥＧ４０００等容量を加え、
この混合物を同温度で１時間インキュベートした後、４
２℃、５分間のヒ−トショソクを与えた。さらに、ＹＥ
ＰＤ培地１培地１卆ｐえ、その細胞を、３０℃の振盪浴
中で、１．５時間インキュベートした。１１　後に、そ
の細胞を遠心により収穫し、３００μｌのＹＥＰＤに：
調眉後、０４１８を含まない１５ｍｊ２のＹＥＰＤ寒天
で重層した（使用１時間前）、３００．ｃｚｇ／ｍ１の
Ｇ４１８を含む１５ｍｌのＹＥＰＤ−寒天を含む寒天プ
レート上にブレーティングした。コロニーを３０℃、３
日間で生長させた。Ｋ、ラクチス５ＤＩＩ株も、ｉ！沢
プレート中の初！１ＪＩＧ４１８濃度を１５０μｇ／ｍ
（ｌとする以外は同様の方法でトランスホームした。１
つの実験においては、ＣＢ５２３６０のトランスホーマ
ントを、２０％ガラクトースを含むＹＥＰ培地中、３０
℃で生育させた。
６０時間後、細胞と培地を遠心により分離した。
細胞をガラスピーズで処理して破壊した。培養培地及び
細胞抽出物を、キモシン活性を検定する前にｐＨ２で処
理した（ホルトマン（Ｈｏｌｔｍａｎ　）、メソッズ・
イン・エンザイモロジー（１９７０）、１９巻、４２１
〜４２６頁参照）。
細胞を遠心で培地から分離し、できた上清をＩＭ　　Ｈ
２ＳＯ４を添加することにより、ｐＨ２にまで酸性化し
、室温で２時間インキュベートした。それからこの溶液
を２Ｍ１−リスベースを加えることにより、ｐＨ６に中
和する。この適当な希釈物５０ｔｔｌを１０ｍＭ　　Ｃ
ａＣｊ！、中、１２％の脱脂ドライミルクの懸濁液に溶
かし、クロットが生ずるまで３７℃でインキヱベートす
る。キモシン活性ｌユニットは、これらの条件下、１０
分間でクロットを形成するのに必要な活性キモシン量と
定義される。タンパク質のシグナル配列をプロキモシン
に与えていないにもかかわらず、Ｋ、ラクチスによるプ
ロキモシンの生産と分泌により、この上清には、ミルク
凝固活性が含まれていた。生産された全プロキモシンの
約３０〜６０％は、上述のミルク凝固検定法により測定
されたように、培地中に見い出された。Ｋ、ラクチス５
ＤＩＩを用いたときも同様の結果が得られた。
例　　３ キモシン生産の増加を示すラクターゼ−キモシン融合タ
ンパク質 種々Ｓｎａ　８ｌ−５ａｌ　ｒ断片を取ることにより（
ＢＰ−Ａ−００９６４３０の例１６．２　Ｃで報告され
ているのと同様であるが、単一のＳａｔ　Ｉ　リンカ−
しか用いていないＢａｌ　３１実験から）、ラクターゼ
及びキモシンの融合体を含むｐＧＢ９０１変異体が得ら
れた（表１）。ラクターゼＤＮＡ及びリンカ−配列によ
り与えられる余計なアミノ酸は、酸で処理することによ
り、プロキモシンのプロ配列とともに除去される。ラク
ターゼコード配列由来の４個のアミノ酸を含む融合体（
ρＧＢ９０２　）は、キモシン生産号の増加を示す結果
が観察された。
表　　１゜ ｐＧＢ９０１及びｐＧＢ９０２におけるラクターゼプロ
モーター及びプロキモシンの結合部のヌクレオチド配列 １万Ｊ９０１ ラクターゼプロモーター プロキモシン タンパク質合成は、ボックスで囲んだＡＴＧコドンから
開始する。
例　　４ クルイベロミセストランスホーマントによるプレプロキ
モシンの発現 ｐＧＢ９０２のポリリンカーから５ａｌ１部位（例３参
照）を便宜上除去する。ｐＧＢ９０２を５ａｌｌで部分
消化し、さらにＢａ１３１（ベーリンガ−（［ｌｏｅｈ
ｒｉｎｇｅｒ）社）と短かい時間インキュベーションす
る。線状断片をアガロースゲルから単離し、連結した後
大腸菌にトランスホームする。正しいプラスミドｐＧＢ
９０３が得られる。制限分析により、このプラスミドも
、ポリリンカーから除かれたＸｂａ　Ｉ及び旧ｎｄ１１
１部位をもつことが示された。
プレプロキモシン遺伝子を含み、発現するプラスミドを
構築するため、プラスミドｐＧＢ９０３を制限エンドヌ
クレアーゼＳａ目及び８ｇＪ　ｆｆでｔｌＪ　化する。
そのｌ　ｌｋｂのＤＮＡ断片をアガロースゲルから、エ
レクトロエリューションにより単離する。同様に、プレ
プロキモシン遺伝子（ＥＰ−Ａ００９６４３０、例１６
参照）を含むｐＧＢ　１２４プラスミドを消化し、プレ
プロキモシン遺伝子のＮ末端部分を含むＱ、　３　ｋ　
ｂのＳａｌ　Ｉ−Ｂｇｌ■断片を単離する。
この１　ｌｋｂ及びＱ、　３　ｋ　ｂのＤＮＡ断片を混
合し、ＤＮＡリガーゼでライゲーションした後、大腸菌
にトランスホームする。ラクターゼ遺伝子の小部分に融
合したプレプロキモシン遺伝子を含むプラスミドｐＧＢ
９０４が単離された（表２）。
表２ ｐＧＢ９０４中のラクターゼプロモーター及びプレプロ
キモシンの結合部のヌクレオチド配列タンパク質合成は
、ボックスで囲こまれたへＴＧコドンから開始する。
Ｋ、ラクチスＣＢ５２３６０株を、Ｓａｃ　［１で線状
化したｐＧＢ９０４でトランスホームした。このトラン
スホーマントを選択し、生育した後、例２で述べたよう
にキモシン活性を検定した。次に示す表３で、ｐＧＢ９
０２　（例３参照）及びρＧＢ９０４でトランスホーム
したに、ラクチスＣＢ５２３６０株細胞によるプロキモ
シン分泌を比較している。（プロ）キモシン生産は、Ｏ
Ｄｌ、１０が２００の細胞１ミリリットル当りの任意ユ
ニットで表わしである。
表　　３ ｐＧＢ９０２及びｐＧＢ９０４でトランスホームしたに
、ラクチス細胞によるプローＮ（ジノの分泌。
ＧＢ９０２ トランスホーマント　上清　ペレット １　　　　　３．２　　　＜０．４ ２　　　　　１．３　　　＜０．４ ３　　　　　７．１　　　１，４ ４　　　　　４．４　　　０．６６ ＧＢ９０４ 上清　ペレット ２２．４　　１．７ ３３．３　　３．０ ２８．０　　２．３ ５３．８　　５．８ 例５ 異種リーダー配列を用いたクルイベロミセスによるプロ
キモシンの分泌 Ａ、アミログルコシダーゼリーダー配列の化学合成と、
このリーダー配列を含むプラスミドの構築 アスペルギラスアワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ａ
ｗａｍｏｒｉ）由来のアミログルコシダーゼ（Ａ　Ｃ）
のリーダー配列は、アイニス（Ｉｎｎｉｓ）等（サイエ
ンス、（１９８５年）、２２８Ｓ、２１〜２６頁）によ
り報告されている。このタンパク質配列に基づき、プロ
キモシン遺伝子の直前にこのリーダー配列が挿入できる
ようオリゴヌクレオチドを誘４した（図３参照）。
オリゴヌクレオチドは、アプライド・バイオシステムズ
のＤＮＡ合成機を用いて合成した。オリゴヌクレオチド
は、変性ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動と、その
ゲルからのエレクトロエリューションにより精製した。
プラスミドｐＧＢ９０３　（例４参照）を、唯一のＳａ
ｌ１部位で切断した。このオリゴヌクレオチドを２ＸＳ
ＳＣ中１時間６５℃、５０℃及び３７℃で各々ハイブリ
ダイズさせる。オリゴヌクレオチドはマルチマーの生成
を防ぐよう、５′末端にリン酸基をもっていない。その
ＤＮＡをＴ４ポリヌクレオチドリガーゼを用い、Ｓａｌ
１部位に連結する。このライゲーション混合物を大腸菌
ＨＢＩＯｌにトランスホームする。２４ケのコロニを培
養し、そのプラスミドＤＮＡを単離した。１つのプラス
ミドｐＧＢ９Ｑ５は、制限酵素分析により、正しい方向
でオリゴヌクレオチドを有していることが示された。プ
ラスミドｐＧＢ９０５でに、ラクチスＣＢ５２３６０を
トランスホームした０例２で報告した操作により（プロ
）キモシンの生産を分析した。　ＯＤ、１６２００の細
胞ｌ１１１当りの任意ユニットで（プロ）キモシン生産
結果を表４に示した。
表　　４ ｐＧＢ９０２及びｐＧＢ９０５でトラシスホームしたに
、ラクチス細胞によるプロキモシンの分泌ＧＢ９０２ 上清　ペレット ３．２　　　＜０．４ １．３　　　＜０．４ ７．１　　　１．４ ４．４　　　０．６６ ＧＢ９０５ 上清　ペレット ６０．６　　　＜０．４ ５６．４　　　＜０．４ ５６．７　　　＜０．４ ５７．６　　　＜０．４ Ｂ、新しい合成リーダー配列の化学合成及びこの新しい
合成リーダー配列を含むプラスミドの構どの既知のリー
ダー配列とも異なる配列をもつ合成リーダー配列を合成
する。このリーダー列を用い、合成された全てのプロキ
モシンが以下に示すようにクルイベロミセスにより分泌
された。この合成リーダー配列は、シグナル配列切断部
位の６から＋２の位置にしばしば出現するアミノ酸を用
いて考案された（ボン・ヘイン（Ｖｏｎ　ｌ１ｅｙｎｅ
）、ヨーロソピアン・ジャーナル・オブバイオケミスト
リ−（Ｅｕｒ、　Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　）、　＜１９
８３年）、１３３巻、１７〜２１頁）。しばしば出現す
るイーストのコドンも使用し、また外来ヌクレオチドが
ＡＴＧ配列の直前に組込まれ、ｐＧＢ９０２中の２６個
のヌクレオチドの欠失を補っている。使用したオリゴヌ
クレオチド及び生成したリーダー配列を図５に示した。
この合成リーダー配列ＤＮＡはアプライド・バイオシス
テムズ社のＤＮＡ合成機を用いて合成した。生成したオ
リゴヌクレオチドをＴＢＥバッフｙ　　（５０ｍＭ）リ
ス、５０ｍＭホウ酸、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８，３）と
７Ｍ尿素を含む４０ｃｍ長、ｌ鳳鳳厚のポリアクリルア
ミド′を用い、フ゛ロモフェノールブルーマーカーがゲ
ル長の２／３にまで移動するまで泳動した。このＤＮＡ
を可視化し、ゲルから溶出し、エタノールで沈殿させた
。
またｐＧＢ９０１から、ｐＵｃ１９のポリリンカーから
生ずるＳａｌ　１部位の周辺の欠失を持つ誘導体を作っ
た。これは、ｐＧＢ９０３由来の０．５ｋｂの５ｎａｉ
ｌ　−Ｂｇｌ　Ｕ断片を、ｐｃ８９０１由来の対応する
断片で置き換えることにより行なわれる。
このプラスミドを唯一のＳａｌ１部位で切断する。
オリゴヌクレオチドを２ＸＳＳＣＸＳＳＣ同各１５°Ｃ
１５０℃、及び３７℃でハイブリダイズする。このＤＮ
ＡをＴ４ポリヌクレオチドリガーゼを用い、Ｓａｌ１部
位にライゲーションする。さらにこのプラスミドで大腸
菌のＨＢＩＯＩをトランスホームする。得られたコロニ
ーのうち、２４個を培養し、そのプラスミドＤＮＡを単
離した。このプラスミドのうちの１つ、ｐＧＢ９０６は
制限酵素消化により正しい方向でオリゴヌクレオチドを
含むことが示された。ｐＣＢ９０６でトランスホームし
たに、ラクチスＣＢ５２３６０は、生産したプロキモシ
ンの９５％以上を分泌する。
Ｃ，ｐＧＢ９０５でトランスホームしたに、ラクチスに
より生産されるキモシンタンパク質の分析 に、ラクチスＣＢ５２３６０　　（ｐＧＢ９０５）トラ
ンスホーマントを３０℃で３日間生育させ、その試料を
、培養液の上清から採集する。タンパク質試料をレムリ
（Ｌａｅ＋＋＋ｍｌｉ　）　　（ネイチャー（１９７０
年）、２２７巻、６８０〜６８５頁）の方法に従いポリ
アクリルアミドゲルを用いて電気泳動する。タンパク質
は、トウビン（Ｔｏｗｂｉｎ）等（プロシーディング・
イン・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス（Ｐ
ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　５ｃｉ）　。
ＵＳＡ、　　（１９７９年）、７６巻：　４３５０〜４
３５４頁）の方法に従がい、ニトロセルロースフィルタ
ー上にブロッティングした。
このフィルターを、キモシンに対するポリクローナル抗
血清とインキュベートしくＣｈｒ、ハンセン）、ついで
、パーオキシダーゼ（アマージャム社）に結合したロバ
の抗ウサギ抗体そして、最後に、４０％メタノールを含
むバッファ溶液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐ）１７．
５，０．９％ＮａＣｌり中の０、６　Ｂ／ｍ　１４−ク
ロロナフトール及び０．０１５％過酸化水素とインキュ
ベーションすることにより、キモシンタンパク質を検出
した。ＡＧシグナル配列により分泌されたプロキモシン
は、この検定法で説明されているように（図５）、ｐＨ
２の処理後、正しく切断される。同様の結果が、Ｋ、ラ
クチスＣＢ５２３６０　　（ｐＧＢ９０６））ランスホ
ーマントについても得られている。
例６ 効率的分泌のための、サツ力ロミセスセレビシアエα因
子配列を含むプラスミドの構築Ａ、サン力ロミセスα因
子発現プラスミド１、　プラスミドの構築 ｐＤＭｌｏｏ−ＰＣ，出発物質は、プラスミドｐＧＢ１
６３である（ＥＰ−Ａ−００９６４３０、例１６．ＣＩ
参照ａ、プラスミドｐＧ８１６３をＢａｍＨｌで消化し
、Ｘｂａ　Ｉ　−ＢａｍＨＩのα因子リーダープロキモ
シンアダプターにライゲーションする。
できた混合部をさらにＰｓｔｒで処理し、プローα−因
子プロセシング部位及びプロキモシンのＮ末端領域をコ
ードする９６ｂｐ断片を単離する。子ウシプロキモシン
をコードするｔｑｏｏｂｐの断片をプラスミドｐＪｓ１
１１から単離し、ついでＰｓ口及び５ａｌｌで消化する
。プラスミドｐＪＳ１１１は、ＡＤＨ−２プロモーター
及びグルクルアルデヒド３−ホスフェート（ＧＡＰＤＨ
）ターミネータ−の制御下、ｐＧ８１６３由来のプロキ
モシン遺伝子を含むｐ　Ｂ　Ｒ３２２＝ｉ体である。
取り出された１９００ｂｐのＰｓＬＩ　　５ａｌｌ断片
は、プロキモシン及びＧＡＰＤＨターミネータ−を含ん
でいる。イーストのＣ，ＡＰＤＨ４９ｉｉ１伝子プロモ
ーター及び転写ターミネーターについては、基本的にト
ラビス（Ｔｒａｖｉｓ）　（ジャーナル・オブ・バイオ
ロジカル・ケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｌ
ｌ、）（１９８５年）２６０年；４３８４〜４３８９頁
）により報告されている。ＧＡＰＤＨプロモーターＳ、
セルビシアエα囚子リーダー及びＸｂａ　Ｉ及び５ａｉ
ｌに隣接するヒト−インターフェロンの合成遺伝子、及
びα因子ターミネ−ターの融合体を含むプラスミドｐＤ
Ｍ１００をＸｂａ　Ｉ及びＳａｌ　１で消化し、ついで
アルカリホスファターゼで処理し、さらに、上で述べた
９６ｂｐ及び１９００ｂｐの断片にライゲーションする
。α因子リーダー及びターミネータ−は基本的にブレイ
ク（Ｂａｒｋｅ）　　（プロシーディング・イン・ナシ
ョナル・アカデミ−・オプサイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎ
ａｔｌ、Ａｃａｄ、　５ｃｉ）　　Ｕ　Ｓ　Ａ　。
（１９８４年）８１巻、４６４２〜４６４６頁）により
報告されたものである。生じたプラスミドｐＤＭ１００
−ＰＣを４１離し、またこれは、ＧＡＰＤＨプロモータ
ー、α因子リーダー及びプロキモシン遺伝子の融合体を
含んでいた。［ｌａ…Ｈの完全な配列を図６に示した。
イーストのトランスホーマントの選択を行うため、２つ
のプラスミド、ｐＫＳｌｏｏ及びｐＡＢ３００を構築し
た。
ｐＫＳ１００ｉプラスミドｐＫＳ１００は、Ｓ、セレビ
シアエＬＩＲＡ３遺伝子を含むＹＥＪ）２４由来の１１
７０ｂｐのｌ１ｉｎｄｌ［［断片をｐＤＭｌｏＯＰＣに
挿入することにより構築した。
ｐＡＢ３００；プラスミドｐＡＢ３００は、Ｋ、ラクチ
スＬＡＣ４遺伝子の３′領域及びＧ４１８耐性マーカー
を含むｐＧ８９０１由来の、３５００ｂｐの旧ｎｄＩ［
［５ａｌｌ断片を、ｐＤＭｌ　００−ＰＣに挿入するこ
とにより構築した。
ｐＤＭｌｏｏ−ＰＣ中のＧＡＰＤＨ／α囚子／プロキモ
シンＢａｍＨＩ挿入物を、図６に示した。
２、に、ラクチス及びＳ、セレビシアエのトランスホー
メーションブラスミドｐＫＳｌｏｏを、そのプロキモシ
ンコード領域中のＢｇＩｎ部位で消化し、Ｋ、ラクチス
、ＫＲＮ２０１−６株をトランスホームするのに用いた
。この株は、ｌａｃ　４遺伝子がｐＧＢ９０１由来のＬ
ＡＣ４プロモーター・プロキモシン遺伝子融合体に置換
えた２ＵＶ２１株（土、圏虹４ｙＬＩ、肛虹３（ｋｉｌ
’））の誘導体である。ｐＫＳｌｏｏの組込みは、）Ｉ
Ｉ込まれたプロキモシンコード領域を標的としている。
またプラスミドｐＫＳ１００もＳ、セレビシアエ、八Ｂ
　１１０株（α、ｕｒａ　３、ｆｅｎ　３、ｈｎｓ　４
、ｐａｐ４−３、（ａｉｒ”））をトランスホームする
のに用いられ、この場合は、Ｇ　Ａ　Ｐ　Ｄ　Ｉ（遺伝
子の：３′領域のＳａｃ　Ｕ部位が標的とされる。
生したトランスホーマントを、液体ＹＥＰＤ培地中、飽
和するまで生育させ、その培養上清、及び細胞溶解物を
、ｐＨ２で活性化後、キモシン活性の検定を行った。以
下の表５にまとめた結果に示されているとおり、Ｋ、ラ
クチス・トランスホーマントは、効率よくプロキモシン
を培地中に分泌する一方、Ｓ、セレビシアエ・トランス
ホーマントは、生産したプロキモシンのほんの一部しか
分泌しなかった。
表　　５ に、ラクチス及びＳ、セレビシアエ・トランスホーマン
ト中におけるプロキモシンの生産ＢＩ１０ ＜０．２５ ＜１．０ ＡＢＩＩＯ：：ｐｋＳｌｏｏ ＫＲＮ２０１−６ １５．５　　　　　　　　２．３ ＜０．２５　　　　　　４．０ プラスミドｐＡＢ３００は、Ｋ、　　ラフ−５−ス、２
ＵＶ２１株をＧ４１８耐性とするようトランスホームす
るのに用いられ、ＬＡＣ４遺伝子の３′領域のＥｃｏＲ
Ｖ部位が組込みの標的とされた。これらのトランスホー
マントは表６に示されるように、プロキモシンを効率よ
く培地中に分泌することが分った。
表　　６ α因子／プロキモシン融合体からのプロキモシンの分泌 １１Ｖ２１ 〈２ ＫＲＮ２０１−６ 〈２ ＫＩＩＮ２０１６　　　　ｐＫＳ１００ｆ３．ＬＡＣ４
プロモーター／α囚子リーダす／プＬトトモシン融合体
の構築 この融合体を作るため、２つの中間プラスミドを１．７
築した。プラスミドｐＤＭ１００−ＰＣをＰｓＬＩで部
分消化し、α因子リーダーの一部をコー１するＳａｌ　
ｌ　−Ｐｓｔ　ｌアダプター及びＬＡＣ４遺伝子の５′
側領域の２６ｂｐとライゲーションし、さらに１１ｉｎ
ｄｌ［ｌで消化する。この混合物から、１５００ｂｐの
断片を単離し、１Ｉｉｎｄ［ｌ及び５ａｌｌで消化した
ｐＵｃ１８にクローン化し、ｐＫＳ１０２を作る。
合成大腸菌１ａｃオペレータを、ｐＫＳ１０２中のα因
子リーターコード配列のすぐ５′側にあるＳａｌ１部位
にライゲーションし、プラスミド１０３を作る。これは
、ＬＡＣ４プロモーター／α囚子リーダー／プロ；トモ
シン融合体が大腸菌に対し毒性をもつから行なわれる。
ｐＫ３１０３由来の４９０ｂｐのＳａｌ　Ｉ　−Ｂｇｌ
　ＩＩ断片を単離し、Ｓａｌ　［−Ｂａｌｌで消化した
ｐＪＤ１５Ｒにライゲーションする。プラスミドｐＤＪ
１５Ｒは、ｐＤＪ　１５を作るための充填による、ｐＵ
ｃ１９ポリリンカー中にあるＳａｌ１部位の欠失と、ａ
ａｏｏｂｐのＸｂａ　Ｉ断片の逆方向の再クローニング
により、ｐＧＢ９０１から誘導される。
この反応から、プラスミドｐＫＳ１０５を単離する。こ
れらのプラスミドを図７に示す。
プラスミドｐＫＳ１０５を、組込みトランスホーメーシ
ョンの標的部位として、ＬＡＣ４５’領域中のＳａｃ■
部位を用い、Ｋ、ラクチスＣＢ５２３６０株をトランス
ホームして、これを０４１８耐性とする。ＯＤ６．。２
００の細胞１ｍｊｌ’当りのユニット数でキモシン生産
を表わしたものを以下の表７に示す。
表７ ｐＫＳ１０５”でトランスホームしたに、ラクチス細胞
によるブロモキシンの分泌 トランスホーマント　　　上清　　ベレットＩ　　　　
　　　　　Ｉｌｌ　　　　３．３２　　　　　　　１４
７　　　４．５ ３　　　　　　　１２４　　　３．７ ４　　　　　　　１２５　　　３．０ °−１−モシン活性は、培養物１ｆｆ１７！当りの相対
ユニットで表わされている。
例　　７ 効率的分泌のためのクルイベロミセス・ラクチスα因子
配列を含むプラスミドの構築 Ａ、に、　　ラクチスα因子シグナル配列の単離と使用 培俣物上清の生物学的検定は、テスター株として、Ｓ、
セレビシアエＭａｔ　、　　ａ　　ｓｓＬ　２−３ＲＣ
６８７株を用いて、従来法に従って（シュリアス（Ｊｕ
ｌｉｕｓ　）等セル（Ｃｅｌｌ）　　（１９８３年）、
３２巻、８３９頁）行った。Ｋ、ラクチスＣＢ　Ｓ　１
４１（α）株ヲ、０．５％グルコース、硫酸アンモニウ
ムを含まない、０．１７％のイースト・ナイトロジエン
・ベース（デイフコ）、及び０．００２％の硫酸アンモ
ニウムを含む培地中で生育させる。遠心により細胞を除
去した後、その培養上清に酢酸を、０、１　Ｍとなるよ
うに加え、さらに、その上清をバイオ・レックス７０　
（バイオラド社）のカラムに通す。そのカラムを０．１
Ｍの酢酸で洗浄し、つづいて、α因子を、８０％エタノ
ール／１０ｍＭＨＣｌで？容出する。その？容出物を乾
燥するまでエバポレートし、その後、０．１％トリフル
オロ酢酸（ＴＦＡ）／２０％アセトニトリルに？容かし
、逆相ＨＰＬｃガードカラムにかける。このカラムを、
０．１％ＴＦＡと、２０％、４０％、６０％及び８０％
のアセトニトリルを含む’ｔ８　？（ｌで段階的に洗浄
する。α因子活性を含む６０％画分を、分析用のＣｌ８
ＨＰＬＣカラムにかけ、０．１％Ｔ　Ｆ　Ａ　Ｌｉ）２
０％から８０％のアセトニトリル勾配で？容出する。フ
ラクションを収穫し、α因子活性を検定する。α因子活
性を含む両分を乾燥し、アミノ酸配列分析にかける。
Ｂ、プラスミドライブラリーのハイブリダイゼーション
スクリーニング オリゴヌクレオチドのプールを、ｒ−（”Ｐ〕Ａ　ＴＰ
と、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いてラヘルする
。これらのオリゴヌクレオチドプローブ次に示すハイブ
リダイゼーション溶液中、４２°Ｃでサウザンフロット
、又はバクテリアコロニーを採るのに用いる。４ＸＳＳ
Ｃ１５０ｍＭＩ（１１□Ｐ　Ｏａ　ｐｌ＋　７．１％ザ
ルコシル、１０％硫酸デキストラン、２００μｇ／ｒａ
ｌの超音波処理した変性サケ精子ＤＮＡ、フィルターを
２ＸＳＳＣ１０、１％ＳＤＳを用い、４２°Ｃで洗浄す
る。Ｋ、ラクチス５Ｄ１１株（ａ、　江ＬＩ　　Ｉａｃ
４）由来のゲノムＤＮＡの５ａｎ３ＡＩによる限定消化
により生ずる挿入物を含み５０００ｂｐ以上の断片を精
製するための、大きさによる分画を行った、ベクターｐ
Ｊｓ１０９におけるプラスミドライブラリーを、１００
μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むし寒天の８０１ｍプレ
ート当り、５００〜２０００個のコロニーの密度で大腸
菌８８１０１株のトランスポーマントをブレーティング
することにより、これらプローブを用いてスクリーニン
グを行った。
Ｄ　Ｎ　Ａ　ヲコロニーからニトロセルロースフィルタ
ー上に移し、これらのフィルターに先に述べたようにハ
イブリダイズさせた。フィルター上のハイブリダイゼー
ションシグナルの領域に対応するもとのプレート上の領
域をつり上げ、再ブレーティングを行ない、ハイブリダ
イゼーションによる再テストをすることにより、ハイブ
リダイズ配列を含むプラスミドを存する単一のコロニー
を単にｔした。陽性のコロニーをさらに小培養によって
精製したＤＮＡのサウザンブロノト分析によりテストし
た。
ハイブリダイゼーション陽性コロニーから精製したプラ
スミドを、種々の制限酵素で消化し、生じた断片を、Ｄ
ＮＡの配列分析に適した大きさの制限断片を同定するた
め、同様のハイブリダイゼーションプローブを用いて、
サウザンプロット分析により解析した。このようにして
同定された断片を、アガロースゲル電気泳動により精製
し、適当なＭＰ１８及びＭＰ１９ベクターにクローン化
した。そして、ＤＮＡ配列分析を行った。
Ｃ，クルイベロミセスα因子の単離 に、ラクチスα因子の最初の６個のアミノ酸は、Ｓ、セ
レビシアエのものと、６個の残基が等しい点で服定され
た相同性を有する。この配列を以下に示す。
Ｔｒｐ−５ｅｒ−Ｔｒｐ−ｒｌｅ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ａ
ｒｇ−１’ｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｉｎこのタンパク質配列は
、図８に示されるように、対応する構造遺伝子に対し、
その構造遺伝子に相補的であると思われる一部のオリゴ
ヌクレオチドをデサインするのに用いられる。α因子ペ
プチドの一部をコードする全ての可能なコドンを含むオ
リゴヌクレオチドが、９６及び４８種の分子の２つのプ
ールとして合成された。
これら２つのプールを、ｒ−（”Ｐ）ＡＴＰ及びＴ４ポ
リヌクレオチドキナーゼを用いて、放射性ラベルし、各
々、Ｋ、ラクチスＤＮＡの制限消化物のサウザン・ブロ
ア）のプローブとしで用いた。プール＃２はいくつかの
異なる消化物中のある昨−の断片に対しては強いハイブ
リダイゼーションを示したが、第２の断片に対しては、
非常に弱いハイブリダイゼーションを示した。従ってプ
ール２がＫ．ラクチスのゲノムＤＮＡのプラスミド・ラ
イブラリーをスクリーニングするのに選らばれた。
プラスミドライブラリーをスクリーニングするためのこ
れらプローブの使用により、多くのハイブリダイジング
・クローンが単離された。これらクローンのうちの１つ
、αｆＫ１８ｂのＤＮＡ配列の解析はそれがＳ、セルビ
シアエのα因子ペプチドの前駆体に強い相同性をもつ、
１つのα因子関連ペプチドをコードすることを示した。
そのハイブリダイジング領域は約１０００ｂｐのＰｓｔ
ｌ　−ＥｃｏＲＩ断片上に位置していた。この断片の配
列を図９に示した。Ｋ、ラクチス前駆体はＮ−結合炭水
化物鎖の付加に対して、わずか２個の部位しか含んでい
なかった。さらに、Ｋ、ラクチス・リピートのスペーサ
ーは、Ｓ、セレビシアエ・リピートのものよりも長く、
またＳ、セルビシアにみられるＧｌｕ／ＡＩａ−Ｐｒｏ
配列ではな（Ｘ−Ａ１ａ／Ｐｒｏパターンをもつ、より
多様性のある配列を示している。ＤＮＡ配列の比較によ
り、コード領域を通して高い相同性が示された。
Ｄ、プラスミドの構築 一連のプラスミド（図１０に示す）を、強いプロモータ
ーの転写コントロール下で発現されるブ［１；１−モシ
ンにに、ラクチスのα因子リーダーを融合させるため構
築した。
ｐＡＢ３０７；αｆ　１８ｂ由来の６７３ｂｐのＳｓｐ
　Ｉ　−ＥｃｏＲＩ断片（図９）をクレノー酵素による
ＥｃｏＲＩの突出部の充填及びそのプラントエンドへの
８ｇＩｎリンカ−の付加により修正した。さらに、この
断片を、Ｓ、セレビシアエのグリセルアルデヒド−３−
ボスフェート・デビドロゲナーゼ遺伝子（ＧＡＰＤＨ）
のプロモーター及びターミネータ−領域を結ぶ、Ｂｇ１
１１部位に挿入した。このカセットをＢａｎ＋　ＨＩ断
片としてｐｕｃｔａにクローン化し、ｐＡＢ３０７を作
った。−ｐＡＢ３０９；α−リーダー及び子ウシのブロ
モキシンをコードする配列の融合を行った。まず、ｐＡ
Ｂ３０７をＮｃｏ　Ｉで消化し、その粘着末端を、ムン
グ・ピーンヌクレアーゼで処理することによりプラント
化した。その生成物を５ａｌｌでさらに消化した。これ
に対し、プロキモシンをコードする配列及び、Ｓ、セレ
ビシアエの転写終止領域を含む、２０００ｂｐのＥｃｏ
Ｒシー５ａｌｌ断片をライゲーションした。この断片は
Ｘｂａ　［−ＢａｌＩＨＩアダプターが、Ｓ、セルビシ
アエＧ　Ａ　Ｐ　Ｄ　Ｈ転写終止領域に融合したプロキ
モシンｃＤＮΔを含む断片の５′端に与えられているプ
ラスミドｐＪｓ１１１から誘導した。このライゲーショ
ン混合物は、大腸菌のＨＢ　１０１株をトランスホーム
するのに用い、プラスミドｐＡＢ３０９を含むトランス
ホーマントを単離した。この融合物の結合部位付近の配
列を図１１に示し、そして、ｐＡＢ３０９の全ＢａｍＨ
Ｅ　−５ａｌ　Ｉ挿入物を図１２に示した。
ｐＡＢ３１２；に、　　ラクチスのトランスホーメーシ
ョンのため、ｐＧ８９０１由来の３５６０ｂρのｌ１ｉ
ｎｄ［［Ｉ断片をｐＡＢ３０９に挿入し、プラスミドｐ
ＡＢ３１２を作った。この旧ｎｄｌｌｌ断片は、に。
ラクチスＬＡＣ４遺伝子の３′領域及びバクテリアの０
４１８耐性構造遺伝子へのＳ、セレビシアエＡ　Ｄ　Ｈ
１プロモーターの融合物を含んでいる。
ｐＡＢ３１３及びｐＡＢ３１４　；　１９００ｂｐのＳ
ａｃ　ｌ−１１ｉｎｄｌ［ＩをｐＡＢ３０９から隼離し
、ＭＰ１９にクローン化した（ヤニソシューペランＹａ
ｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ）等、ジーン（１９８５年）
、３３巻、１０３頁）−末鎖ファージＤＮＡを調製し、
図１３に示した２つのオリゴヌクレオチドプライマーの
うちの１つを用いたイン・ビトロ突然変異誘発のための
テンプレートとして用いた。Ｍ１３ファージＭＰ　１９
／αｋｌｌ、５及びＭＰ１９／αｋ　１２．２を各々プ
ライマー＃１及びプライマー＃２を用いて調製した。
それらのファージから２本ＩＡ　ＲＦ　　Ｄ　Ｎ　Ａを
調製し、各々から１１００ｂｐのＳａｃ　Ｉ　−５ｔｕ
　Ｉ断片をｆｌ［した。これらの断片をｐＡ８３１２由
来の７１００ＭのＳａｃ　Ｉ　−５ｔｕ　ｒ断片にライ
ゲーションした。図１３に示した配列の修正をもつプラ
スミドｐＡＢ３１３及びｐＡＢ３１４が隼乱された。
巳、クルイベロミセスのトランスホーメーションプラス
ミドｐＡＢ３１２をＥｃｏＲＶ　Ｔ：消化しくＫ。
ラクチスゲノムのＬ　Ａ　Ｃｄ　Ｈ域に対する組込みの
標的となる）、これを用いて、Ｌ、ラクチス２ＵＶ２１
株（ａ　　ｕｒａ　３　」１１ａｃ　４　（Ｋｉピ〕）
をトランスホームしてＧ４１８耐性とした。プラスミド
ｐＡＢ３１３及びｐＡＢ３１４を、２ＵＶ２１株の０４
１８耐性へのトランスホームに使用した。トランスホー
マント２ＵＶ２１　：　：　ｐＡＢ３１２．２ＵＶ２１
　：　：　ｐＡＢ３１３及び２Ｕν：：ｐＡ１３３１４
の培養を行ない、その培養液上清の上述のようなキモシ
ン活性検定を行なった。非トランスホームコントロール
株と同様に、これらのトランスホーマンＩ・の多くを１
％イースト・イクストラクト、２％ペプトン、２％グル
コース、０．１７％イースト・ナイ［・ロジン・ベース
、５０μｇ／ｍｅのトリプトファン及び５０μｇ　／　
ｍ　ｆ！のウラシルを含む、１ｍｌの培地中で３６時間
増殖させた。その培養液上清を、酸活性化後、キモシン
活性について検定した。全てのトランスホーマントは、
活性化可能なキモシンを分泌することが分った。その結
果を表８に示す。
表　　８ クルイベロミセスにおけるプロキモシンの分泌て分泌さ
れる主要な物質種を市ＵｉＳ　Ｄ　Ｓポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動により精製し、ガス相アミノ酸配列分析
にかけた。これら物質種のＮ末端配列を以下に示す。
２ＵＶ２１　　　２ＵＶ２１　　　　　　　　　　　　
　　＜　２ＫＲＮ３０３−１　　　２ＵＶ２１　　　　
　　ｐＡＢ３１２　　　　　　　　　　　　２５６ＫＲ
Ｎ３０４−４　　２ＵＶ２１　　　　ｐＡＢ３１３　　
　　　　　　１７５ＫＲＮ３０５−２　　２ＵＶ２１　
　　　ｐＡＢ３１４　　　　　　　　２０６各々のトラ
ンスホーマントは、トリクロロ酢酸沈殿化培養液上清の
ＳＯＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって判断す
ると、単一のプロキモシン関連物質を分泌することが分
った。ｐＡＢ３１２トランスホーマントにより分泌され
る、プロキモシン関連タンパク質は電気泳動の移動度か
ら測定すると、ｐＡＢ３１３及びｐＡＢ３１４によって
分泌されるものより、やや高い分子量のものであるらし
い。
Ｋｒ？Ｎ３０３−１及びＫＲＮ３０４−４によっＧｌｕ
−ΔＩａ−Ａｓｐ−八１ａ−５ｅｒへ旧ｓ−１１５−１
１ｉｓ−八１ａ−Ｇｌｕ−１１ｅＴｈｒ−Ａｒｇ−１１
ｅ−Ｐｒ。
八Ｉａ−Ｇｌｕ−１１ｅ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−１１ｅこれ
らの結果はＫＲＮ３０３−１によって分泌されるプロキ
モシン関連物質種がアミノ末端スペーサー配列のプロセ
シングを受けず、一方、ＫＲＮ３０４−４由来の物質種
は、従来の成Ｗ１プロキモシンアミノ末端を有している
ことを示している。
例　　８ アミログリコシダーゼのシグナル配列を用いたクルイベ
ロミセス・ラクチスによるｔ−ＰＡの分泌。
Ａ０組織型プラスミノーゲン′活性化四子のｃＤＮＡの
クローニング組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−
ＰＡ）をコードするｃＤＮＡを、ベニ力（Ｐｅｎｎｉｃ
ａ）等（ネイチャー　　（１９８３年）、３０１巻、２
１４頁）の方法と同様にして、得た。
ＤＮＡ配列分析及び制限地図により、この１−ＰＡｃＤ
ＮＡ正当性が保証された。発現実験のため、その成熱タ
ンパク質のほぼ完全なコード領域及び３′側の非コード
領域を含む２．０　ｋ　ｂのＢｇ１■断片（ベニ力（Ｐ
ｅｎｎ　１ｃａ）等参照）を用いた。
Ｂ、ｐＵＣ１９へのＧ４１８耐性マーカーの導入ヘネゼ
ン（Ｂｅｎｎｅ　ｔｚｅｎ）及びホール（Ｈａｌｌ）　
（ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（
Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、）　　（１９８２年）、
２５７巻、３０１８頁）により報告されているのと同様
に、Ｓ、セレビシアエ由来のアルコールデヒドロゲナー
ゼＩ　　（ＡＤＨＩ）プロモーターの指示下、６４１８
への耐性を与える、Ｔｎ５遺伝子（レイス（Ｒｓｉｓｓ
）等、ＥＭＢＯ，Ｊ　（１９８４年）、３巻、３３１７
頁）を、ｐＵｃ１９のＳｍａ　［部位に挿入する（ヤニ
ノシュ・ペラン（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ）等、
ジーン（１９８５年）３３巻、１０３頁）。得られたプ
ラスミドｐＵｃ０４１８を図１４に示す。
ｐＵｃ０４１８を含む大腸菌は、１９８７年、１２月４
日、ＣＢ５８７２．８７という登録番号で、セントラル
・プリュー・ボア・シメルカルチャー（Ｃｅｎｔｒａａ
ｌ、　Ｂｕｒｅａｕ　ｖｏｏｒ　Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕ
ｌｔｕｒｅｓ）に保管した。
Ｃ，ｐＧＢｔＰＡｌの構築 わずかなりローニングステソブで、次にあける要素のも
のを含むｐＢＧＬＰＡｌを構築した（図１５及び表９参
照）； ｆｉｌ　Ｘｂａ　Ｉ及び旧ｎｄｎｌで切断したｐＵｃＧ
４１８（上記） （２）　　ラフダーゼプロモーターを含むｐＧ８９０１
由来のＸｂａ　Ｉ　−５ａｔ　Ｉ断片 （３）　　アスペルギラス・アワモリ由来のアミログル
コシダーゼのシグナル配列をコードする合成りＮＡ　（
アイニス（Ｉｎｎｉｓ）等、サイエンス（１９８５年）
、２２８巻、２１頁）。開始コドン直前の配列は、ラク
クーゼプロモーター断片の終りに５ａ１１部位ができず
、さらに、ラクターゼ遺伝子の５′非コード領域の一部
を含むように選んだ。
（４１ｔ　−Ｐ　Ａ　　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａの２．　Ｏｋ　
ｂＢｇｌ　ＩＩ断片（上記）、 （５）　　ラクターゼ遺伝子の３′非コード領域の一部
を含む合成りＮＡ。
く ト Ｄ、クルイベロミセス・ラクチスのトランスホーメーシ
ョン及びそのトランスホーマントの分析ｐＧＢ　Ｌ　Ｐ
Ａ　Ｉによるに、ラクチスＣＢ　Ｓ　２３６０株のトラ
ンスホーメーションを例２に述べたように行った。その
トランスホーマント及びコントロールのＣＢ５２３６０
株をＹＥＰＤ培地中３０℃で約６４時間増殖させた。細
胞を遠心により培養Ｉａ地から分離した。その細胞を、
０Ｄ６１６が３００となるように生理学的塩溶液に再懸
濁し、ガラスピースとともに、ポルテックスミキサーの
最高速度で３分間処理することで破壊した。細胞破片は
遠心により取り除いた。
ワレン（Ｗａｌｌｅｎ）等の方法に従う（ハイオヒム・
ハイオフィズ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ、八ｃｔａ）（１９８２年）、７１９巻、３１８頁
）クロット分解検定法をマイクロタイタープレート中で
行った。１５ｍＭリン酸バッフｙ　　（ｐＨ７，３）　
、０．２ＣＵ　／　ｍ　１プラスミノーゲン、１．５　
ｍｇ／ｍ　！！フィブリノーゲン及び０．０４％ゼラチ
ンを含む溶液を作った。マイクロタイタープレートの各
ウェルへ、１０μｌトロンビン（１３，９Ｎ　Ｉ　Ｈユ
ニット／ｍｌ＞２５μｌ試料及び６５μｐプラスミノー
ゲン／フイブリノーゲン溶液を入れ混合した。その反応
は、ＯＤ４．。を３０分毎に測定することにより追跡し
た。メラノーマ細胞（カビビトラｌ、（Ｋａｂｉ　Ｖｉ
ｔｒｕｎ＋）由来のｔ−ＰＡを各マイクロタイタープレ
ート内の較正曲線を作るのに用いた。
表１０は、１０個のトランスホーマントの典型的分析結
果を示している。ｔ−ＰＡは、ｐＧＢｔＰＡＩでトラン
スホームしたに、ラクチスの培養培地中に存在すること
を示している。
表１０ ｐＧＢ　ｔ　ＰＡ　１でトランスホームしたＣ　Ｂ　Ｓ
　２３６０及びＣＢ５２３６０山来の培養物のクロット
分解検定法。
トランスホーマント　　　上清中のｔ−ＰＡ活性１　　
　　　　　　　４０μｇ／１ ２　　　　　　　　　６μｇ／ｊ２ ３　　　　　　　　　〈３μｇ／１ ４　　　　　　　　　〈３μｇ／Ｉ！ ＣＩＩＳ　２３６０　１　＠） ｃｌｌｓ　　２３６０２°） ＣＢＳ　　２３６０３　’） ＣＢＳ　　２３６０４°） ＣＢＳ　　２３６０５°） ２５μｇ／Ｉ！ ３μｇ／Ｉ！ ３μｇ／ｌ 〈３μｇ／７！ ３μｇ／Ｉｔ 〈３μｇ／ｅ 〈３μｇ／ｌ く３μｇ／ｌ 〈３μｇ／ｌ く３μｇ／ｌ 〈３μｇ／ｌ いくつかの細胞抽出物において、わずかなｔＩ）Δ活性
（く３μｇ／ｌ）がみられた。
グラネリービペルノ（Ｇｒａｎｅｌｌｉ−Ｐｉｐｅｒｎ
ｏ）及びレイヒ（Ｒｅｉｃｈ）　　（ジャーナル・オブ
・エクスペリメンタル・メディシン（Ｊ、　Ｅｘｐ、　
Ｐｌｅｄ、）　（１９７８年）１４８巻、２２３頁）の
方法に従って、プラスミノーゲン／フィブリン−アガロ
ースゲルを重層した５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで
分析を行った。ＣＢ５２３６０及びｐＧＢｔＰＡｌでト
ランスホームしたＣＢ５２３６０の培養物の上清２００
μｌをエタノールで沈殿化し、その沈殿を、２０μｌの
サンプルバッファ　（６２，５ｍＭトリス−Ｈ（ｌｐｌ
＋６．８．２％ドデシル硫酸ナトリウム、１０％グリセ
ロール、ブロモフェノール・ブルー）中に再懸濁する。
その試料を前煮沸処理することなしに、ゲルの上にのせ
る。その結果（図１６に示す）は、Ｋ、ラクチスによる
、ヒトＬ−ＰＡの分泌を示している。さらに、はとんど
の分泌物質はグリコジル化されていることは明白である
。
またｔ−ＰＡの分泌は、ヒトのＬ−ＰＡに対するモノク
ローナル抗体（バイオプール社から人手したＥＳＰ５）
を用いたＥＬ　Ｉ　ＳＡ法及び発色性活性検定（カビビ
トラム（Ｋａｂｉ　Ｖｉｔｒｕｍ）の市販テスト）によ
り確認された。
例９ ヒトの血清アルブミン由来のシグナル配列を用いたクル
イベロミセス・ラクチスによるｔ−ＰＡの分泌Ａ、ｐＧ
ＢｔＰＡ２の構築 わずかなりロニーングステノプで、次に示す要素を含む
ｐＧＢ　ｔ　ＰＡ２を構築した（図１７及び表１１参照
）； （１１Ｘｂａ　Ｉ及び旧ｎｄｌｌｌで切断したｐＵｃＧ
、ＩＩＢ、（２）　　ラクターゼプロモーターを含むｐ
ＧＢ９０１山来のＸｂａ　Ｉ　−５ａｌ　Ｉ断片、（３
）ヒト血清アルブミンのプレプロ領域をコードする合成
りＮＡ、 （４１Ｌ　−Ｐ　Ａ　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ由来の２．　Ｏｋ
　ｂのＢｇｌ［＋断片（例８参照）、 （５１ラクターゼ遺伝子の３′非コード領域の一部を含
む合成りＮＡ。
Ｂ、に、ラクチスのトランスホーメーション及びこのト
ランスホーマントの分析 ｐＧＢ　Ｌ　ＰＡ２によるＣＢ５２３６０のトランスホ
ーメーションを例８に述べたように行った。
このトランスホーマント及びコントロール株を先の例に
示したように増殖し、処理した。クロット分解検定法の
結果を表１２にまとめた。
表１２ ＣＢ５２３６０及びｐＧＢ　ｔ　ＰＡ２でトランスホー
ムしたＣＢ５２３６０の培養物のクロット分解検定法 ２５μｇ／６ ２５μｇ／ｌ 〈３μｇ／ｌ く３μｇ／１ ６μｇ／７！ １２μｇ／ｌ く３μｇ／７！ ＣＢＳ　２３６０　１　’　） ＣＢＳ　２３６０２　”　） Ｃ８Ｓ　２３６０３　”） 〈３μｇ／ｌ く３μｇ／ｌ！ く３μｇ／（１ 〈３μｇ／ｌ く３μｇ／ｌ く３μｇ／ｌ いくつかの細胞抽出物には、わずかなｔ−ＰＡ活性（く
３μｇ／ｌ）がみられた。
例１０ クルイベロミセス・ラクチスによるヒト血清アルブミン
の分泌 Ａ、ＨＳＡｃＤＮＡの合成及びクローニングヒトの血清
アルブミンをコードするｃＤＮＡを、オカヤマ（Ｏｋａ
ｙａｍａ）及びバーブ（Ｂｅｒｇ）　（モレキュラー・
セルラー・バイオロジー（Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉ
ｏｌ、）（１９８２年）、２巻、１６１頁）の方法に従
がい、ヒトの肝臓から調製したｍＲＮＡを用いて調製し
た。ｃＤＮＡを、ｐＢＲ３２２から誘導したベクター中
にクローニングし、大腸菌にトランスホームした。この
トランスホーマントのスクリーニングは、ローン（Ｌａ
ｗｎ）等のＨＳＡ　　ｃＤＮＡクローンの配列に基づく
オリゴデオキシリボヌクレオチドを用いて行った（ヌク
レイツク・アシソズ・リザーチ（Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄ
　Ｒｅｓ、）　　（１９８１年）９巻、６１０３頁）。
選１尺されたｃ　ＤＮＡクローンを部分的に配列決定を
行ない、ローン（Ｌａｗｎ）等の配列と比較した。この
ことは、プレプロＩ　Ｓ　Ａコード領域の最初の５個の
ヌクレオチドが欠けているが、コード領域の９〜１５番
のヌクレオチド部位の１１ｓｔ１１部位はなお存在して
いることを明らかにした。このＢｓＬＥ１１部位及び３
′非コード領域中の１１ｉｎｄｌ１１部位（ローン（Ｌ
ａｗｎ）等、上記）を、発現ベクターへのサブクローニ
ングに用いた。
Ｂ、ｐＧＢＨＳＡ１の構築 わずかなりローニングステップで、次に示す要素を含む
ｐ　Ｇ　Ｂ　ＨＳ　Ａ　１を構築した；（１）　　Ｘｂ
ａ　Ｉ及び旧ｎｄ［ｌＩで切断したｐＵｃＧ４１８（例
８参照）、 （２１ｐＧＢ９０１由来のＸｂａ　Ｉ　−５ａｌ　Ｉ断
片（例１参照）、 （３）　　ラクターゼ遺伝子の３′非コード領域の一部
を含む、合成り　Ｎ　Ａ　（Ｓａｌ　ｒ−１１ｉｎｄｌ
ｌｌ断片）。
この断片の配列を表１３に示す。
Ｃ，ｐＧＢＨＳＡ２の構築 ｐＧＢＨ５Ａ１を５ａｉ１及びＥｃｏＲＶで切断し、合
成りＮＡを挿入した； ＴＣＧＡＣＡＡＡＡＡＴＧＡＡＧＴＧＧＧＴＡＡＣＣＡ
ＴＣＧＡＴＡＧＧＣＣＴＡＣＴＧＧＧＣＴＣＧＡＧＡＴ
ＣＧＴＴＴＴＴＡＣＴＴＣＡＣＣＣＡＴＴＧＧＴＡＧＣ
ＴＡＴＣＣＧＧＡＴＧＡＣＣＣＧＡＧＣＴＣＴＡＧ下線
のＡＴＧコドンは、最終的発現構築物中の開始コドンを
示している（ｐＧＢＨＳＡ３、以下参照）。
生じたプラスミドをｐＧＢＨＳＡ２と命名した。
Ｄ、ｐＧＢＨ５Ａ３の構築 ＨＳＡ　　ｃＤＮＡ−クローンを旧ｎｄｕＩで切断し、
その粘着末端をクレノーＤＮＡポリメラーゼ■を用いて
充填した。つづいて、そのＤＮＡを、Ｂｓ　ｔＥ■で切
断し、そしてＨＳＡコード領域の全んと全部を含む、Ｂ
ｓｔＥＩＩ−旧ｎｄＩＩ（充填）断片を精製した。ｐＧ
ＢＨＳＡ２をＸｈｏ　Ｉで消化し、その粘着末端を、ク
レノーＤＮＡポリメラーゼ■で充填し、そして、Ｂｓｔ
ＥＩｒによる消化を行った。生成したベクターにおいて
は、ＩＳＡコード断片（ＢｓｔＥｆｆ　−ＨｉｎｄＩＩ
　（充填））が挿入されている。得られたプラスミドｐ
ＧＢＨ５Ａ３を図１８に示す。
Ｅ、クルイベロミセス・ラクチスのトランスホーメーシ
ョン及びそのトランスホーマントの分析に、ラクチス２
３６０株のｐＧＢＨ５Ａ３によるトランスホーメーショ
ンを例２で述べたように行った。そのトランスホーマン
ト及びコントロールＣＢ５２３６０株を、’／ＥＰＤ培
地中、３０°Ｃで約６４時間増殖する。この細胞を、遠
心により培養培地から分離する。３０ｔｊｌの試料を上
清から取り、レムリ（Ｌａｅｍｎｌｉ）　（ネイチャー
　（Ｎａｔｕｒｅ）、２２７巻、６８０真（１９７０年
））の方法に従がい、１０％ポリアクリルアミドゲルに
よる電気泳動で分析した０図１９に示した結果は、ＨＳ
Ａが、ｐＧＢＨＳＡ３でトランスホームしたに、ラクチ
ス細胞から培養培地中に分泌されていることが示してい
る。また、他のタンパク質の分泌は、ＨＳＡ生産細胞に
おいては、減少するという指差も与えられている。
上述の結果は、クルイベロミセス株中での外来遺伝子の
効率的で籠便な発現を行うことができることを示してい
る。さらに、クルイベロミセス株は、プロキモシンに関
する結果で示されているように、巾広いタンパク質の、
非常に効率的分泌及びプロセシングに特に有効であるよ
うだ。クルイヘロミセス中での効果的プロモーターの制
御下、外来遺伝子の誘導及び望ましいところの、外来遺
伝子の転移、特に分泌を提供するシグナル配列への結合
を可能とする構築物及びベクターが提供された。従って
、活性型又は活性化可能な巾広い外来タンパク質の商業
的生産のための発酵システムが提供されたことになる。
次にあげる生物は、１９８７年、６月３０日、アメリカ
ン・タイプカルチャー・コレクションに保管された；２
ＵＶ２１、ＡＴＣＣ受理番号２０８５５１ＫＲＮ２０１
−６、ＡＴＣＣ受理番号２０８５４；ＨＢ１０１ｐＡＢ
３０７．ＡＴＣＣ受理番号６７４５４；ＨＢＩＯ１ｐＡ
Ｂ３１２、ＡＴＣＣ受理番号６７４５５゜ これまで述べてきた発明は、理解を明白とするため説明
や例により、詳細に記述してきたが、添付した請求範囲
の範囲内で、ある種の変化や修正を行なうことができる
ことは明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
図１は、プラスミドｐＧＢＴｅ４１８の図である。 図２は、プラスミドｐＧＢ９０１の図である。 図３は、アミログルコシダーゼのシグナル配列を基にし
し得たシグナル配列のための合成オリゴヌクレオチドの
記述である。 図４は、合成シグナル配列の記述である。 ｒｆ！Ｊ５はに、ラクチス（Ｉａｃｔｉｓ）によるプロ
キモシンの分泌を示す、イムノプロー／　）のためのポ
リアクリルアミドゲル電気泳動写真である。 図６は、Ｓ、セレビシアエ（ｃｅｒｅｖ＋５ｉａｅ）の
α因子及びプロキモシンの融合ペプチド及び転写制御領
域を含む、ｐＤＭ１００Ｐｃ由来の全Ｂａｍ旧挿入物の
配列である。 図７は、プラスミドｐＫＳ　１０５の制限地図である。 図８は、Ｋ、ラクチスα因子ＤＮＡを同定するのに用い
るオリゴヌクレオチドをデヂインするのに用いた戦略を
示している。 図９は、Ｋ、ラクチスα因子をコードするＤＮＡ断片の
完全な配列である。 図１０は、α因子シグナル配列及びプロキモシン構造遺
伝子の融合体の発現に用いるプラスミドの記述である。 図１１は、α因子／プロキモシン融合体の結合お付近の
配列を示している。 図１２は、ｐＡＢ３０９のＢａｍＨ１／Ｓａｔ　ｌ　挿
入物の配列である。 図１３は、Ｋ、ラクチスα因子リーダーＤＮＡの突然変
異誘発のためのプライマー配列を表わしている。 図１４；ま、プラスミドｐＵｃＧ４１８の図である。 図１５は、プラスミドｐＧＢ　ｔＰＡ　ｌの図である。 図１６は、Ｋ、ラクチスによるヒトｔ−ＰＡの分泌を示
す、プラスミノーゲン／フィブリン−アガロースゲルと
重ねた５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動写真で
ある。 図１７は、プラスミドｐＧＢｔ　ＰＡ２の図である。 図１８は、プラスミドｐ　Ｇ　Ｂ　ＨＳ　Ａ　３の図で
ある。 図１９は、Ｋ、ラクチスによるＲＡＳの分泌を示す、１
０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動写真を示す。 第 図 レーン１： レーン２： レーン３： 未処理 ２時間処理 ６時間処理 一慴、１１ ／１Ｈ，＋；Ｈ吃 第 図 プライマー１ ニスペーサ−削除 プライマ−２＝スペーサー削除＋Ｂｓ５ＨＩＩ部位Ｂｓ
５Ｈ工工 第 図 ＨｉｎｄＩＩ［ 第 図 第 図 レーン２ ：　ＣＢ５２３６０培養液の上澄液を用しまたサンプル
図 ２Ｉθｋ（Ｌ ＋＋０ｋｄ− ６８ｋｄ−１９ レーン１ ：マーカータンパク質含有 レーン４ ；形質転換株の上澄液からのサンプル

Claims (29)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ
    ）宿主細胞中で目的とするポリペプチドを製造する方法
    であって、該目的とするポリペプチドをコードするＤＮ
    Ａ配列を上記宿主細胞に導入し、上記ＤＮＡ配列を含む
    上記宿主細胞を培養培地中で培養し、それにより上記目
    的とするポリペプチド又はその一部分を培養培地中に分
    泌させることを含む上記方法。
  2. （２）ＤＮＡ配列が、宿主細胞中に導入され、かつ、転
    写方向に、宿主細胞中で機能し得る転写開始制御領域、
    目的とするポリペプチドをコードする上記ＤＮＡ配列お
    よび宿主細胞中で機能し得る転写終了制御領域を含むＤ
    ＮＡ構築物の一部を形成する、請求項（１）記載の方法
    。
  3. （３）宿主細胞に対して、又は目的とするポリペプチド
    に対して、又は宿主細胞及び目的とするポリペプチドに
    対して異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）であるシング
    ル配列をリーディングフレーム中のＤＮＡ配列の５′末
    端に連結し、それにより上記目的とするポリペプチドが
    上記宿主細胞によって分泌される、請求項（１）又は（
    ２）記載の方法。
  4. （４）目的とするポリペプチドが酵素である、請求項（
    １）〜（３）のいずれか一項に記載の方法。
  5. （５）酵素がチモシン（ｃｈｉｍｏｓｉｎ）又はその前
    駆体である請求項（４）記載の方法。
  6. （６）酵素がティシュープラスミノーゲンアクチベータ
    ー（ｔ−ＰＡ）又はその突然変異体である、請求項（４
    ）記載の方法。
  7. （７）目的とするポリペプチドがヒト血清アルブミン（
    ＨＳＡ）である請求項（１）〜（３）のいずれか一項に
    記載の方法。
  8. （８）宿主細胞がクルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏ
    ｍｙｃｅｓ）の工業株（ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　ｓｔｒ
    ａｉｎ）である請求項（１）〜（７）のいずれか一項に
    記載の方法。
  9. （９）宿主細胞がＫ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）又
    はＫ．フラジリス（Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ）である請求
    項（１）〜（８）のいずれか一項に記載の方法。
  10. （１０）ＤＮＡ構築物がさらに少なくとも１つの選択マ
    ーカー、ＤＮＡ配列の自律複製のための複製システム、
    又は形質転換効率増進配列を含む請求項（２）記載の方
    法。
  11. （１１）複製システムが自律複製配列（ＡＲＳ）である
    請求項（１０）記載の方法。
  12. （１２）自律複製配列がクルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖ
    ｅｒｏ−ｍｙｃｅｓ）自律複製配列（ＫＡＲＳ）である
    請求項（１１）記載の方法。
  13. （１３）選択マーカーがＧ４１８耐性である請求項（１
    ０）記載の方法。
  14. （１４）外来遺伝子の形質転換及び発現、並びに上記遺
    伝子のよりコードされたポリペプチドの分泌又は該ポリ
    ペプチドの一部分の分泌のための宿主としてのクルイベ
    ロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）の使用。
  15. （１５）転写方向に、宿主細胞中で機能し得る転写開始
    制御領域、目的とするポリペプチドをコードするＤＮＡ
    配列をリーディングフレーム中で連結させた宿主細胞中
    で機能し得るシングル配列、及び宿主細胞中で機能し得
    る転写終了制御領域を含む発現カセットを含む形質転換
    されたクルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ
    ）ホスト細胞。
  16. （１６）シングル配列が宿主細胞に対して、又は目的と
    するポリペプチドに対して、又は宿主細胞及び目的とす
    るポリペプチドに対して異種（ｈｅｔｅｒｏ−ｌｏｇｏ
    ｕｓ）である請求項（１５）記載の細胞。
  17. （１７）シングル配列がサッカロミセス・セレビシアエ
    （Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
    ）からのα−ファクターシングル配列である請求項（１
    ６）記載の細胞。
  18. （１８）シングル配列がアスペルギルス・アワモリ（Ａ
    ｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ａｗａｍｏｒｉ）からのアミロ
    グルコシダーゼシングル配列である請求項（１６）記載
    の細胞。
  19. （１９）目的とするポリペプチドがチモシン又はその前
    駆体、又はｔ−ＰＡ又はＨＳＡである請求項（１５）〜
    （１８）のいずれか一項に記載の細胞。
  20. （２０）発現カセットに少なくとも１つの選択マーカー
    、ＤＮＡ配列の自律複製のための複数システム、又は形
    質転換増進配列が連結している請求項（１５）〜（１９
    ）のいずれか一項に記載の細胞。
  21. （２１）複製システムが自律複製配列（ＡＲＳ）である
    請求項（２０）記載の細胞。
  22. （２２）自律複製配列がクルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖ
    ｅｒｏ−ｍｙｃｅｓ）自律複製配列（ＫＡＲＳ）である
    請求項（２１）記載の細胞。
  23. （２３）選択マーカーがＧ４１８耐性である請求項（２
    ０）〜（２２）のいずれか一項記載の細胞。
  24. （２４）転写方向に、宿主細胞中で機能し得る転写開始
    制御領域；目的とするポリペプチドをコードするＤＮＡ
    配列とリーディングフレーム中で連結している、宿主細
    胞中で機能し得るシングル配列；及び宿主細胞中で機能
    し得る転写終了制御領域を含むクルイベロミセス（Ｋｌ
    ｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）宿主細胞中で用いるためのＤ
    ＮＡ構築物。
  25. （２５）シングル配列が宿主細胞に対して、又は目的と
    するポリペプチドに対して、又は宿主細胞及び目的とす
    るポリペプチドに対して異種 （ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）であるＤＮＡ構築物。
  26. （２６）少なくとも１つの選択マーカー、ＤＮＡ構築物
    の自律複製のための複製システム、又は形質転換効率増
    進配列をさらに含む請求項（２４）又は（２５）記載の
    ＤＮＡ構築物。
  27. （２７）シングル配列及び目的とするポリペプチドをコ
    ードするＤＮＡ配列がクルイベロミセス （Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）中で発現した遺伝子と
    リーディングフレーム中で融合されている請求項（２４
    ）〜（２６）のいずれか一項記載のＤＮＡ構築物。
  28. （２８）ＤＮＡ構築物がラクターゼ遺伝子のＮ末端の少
    なくとも４つのアミノ酸をコードする第２のＤＮＡ配列
    と融合されているＤＮＡ構築物。
  29. （２９）プラスミドｐＫＳ１０５、ｐＧＢ９０１、ｐＧ
    ＢＴＰＡ１及びｐＧＢＨＳＡ３。（３０）目的とするポ
    リペプチド、又はその一部分が培養培地から単離される
    請求項（１）〜（１３）のいずれか一項に記載の方法。
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