JPH0761262B2 - 遺伝子操作による因子ＸＩＩＩ ａの製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、遺伝子操作による因子XIIIa の
製造方法に関するものである。凝固因子XIIIは脊椎動物
における天然の血液凝固過程における「凝固カスケ―
ド」の最終構成員である。「活性化フィブリン‐安定化
因子」、「フィブリノリガ―ゼ」或いは「血漿トランス
グルタミナ―ゼ」とも称され、及び以後「ＦXIIIa 」と
も称される因子XIIIの酵素的に活性な形態、因子XIIIa
は、分子内架橋による先在する血栓におけるフィブリン
単位の融合を触媒する〔ロ―ランド等（Lorand et el.)
メソッズ・イン・エンザィモロジ―（Methods inEnzymo
logy 80(1981), 333-341；カ―ティス等（Curtis et a
l.)Annals NewYork Academy of Sciences 1983,567-576
〕。血漿からの第XIII因子の分子量は約３００ｋＤで
ある〔ロ―ウィ等（Loewy et al.）、ジャ―ナル・オブ
・バイオロジカル・ケミストリ―（J.Biol．Chem.)236
(1961)2634 〕。活性サブユニットＦXIIIa の分子量は
約８０ｋＤである〔ボ―ン及びシュウィック（Bohn and
Schwick ）、Arzneimit-telforschung 21(1971)1432
2〕。因子XIIIの活性化に際し、トロンビンは、前駆体
から、約４ｋＤの大きさであって、３６個のアミノ酸の
公知の配列を有するペプチドを分裂する（タカギ及びド
ゥ―リトル（Takagiand DooLittle ）、バイオケミスト
リ―（Biochemistry)13(1974)750-756〕。更に、４個の
アミノ酸を有する配列が公知である〔ホルブルック等
（Holbrook etal.)、バイオケミカル・ジャ―ナル（Bio
chem.J.)135(1973)901-903 〕。

【０００２】本発明は、遺伝子操作によるヒト血液凝固
因子ＸＩＩＩａ（ＦＸＩＩＩａ）の製造方法に関するも
のである。本発明に関連するものとして、後述するよう
なこれに必要なｍＲＮＡ、それから得られるｃＤＮＡ、
このｃＤＮＡの全部或いは一部を含有するＤＮＡ構造及
びベクター、このタイプのＤＮＡで形質転換された細胞
及びこれらの細胞により発現されたポリペプチドがあ
る。又、ＦＸＩＩＩａのアミノ酸配列の部分配列、それ
により得られた特異的抗体、これらの抗体から製造され
た診断補助品、及び抗体カラム及びその様なカラムを用
いて得られたポリペプチドも本発明に関連する。本発明
は、ＦＸＩＩＩａをコードするＤＮＡ或いはＲＮＡの全
部或いは一部を含有する診断補助品、及びこのタイプの
診断補助品を用いて体液及び組織を検査する診断に利用
することもできる。更に、本発明の他の側面及びその好
ましい実施態様は以下に詳細に説明され、及び特許請求
の範囲に規定される。すなわち、本発明によるＦＸＩＩ
Ｉａの製造法は、ＦＸＩＩＩａをコードするＤＮＡを含
有するベクターによって細胞を形質転換し、該形質転換
細胞により上記ＤＮＡを発現させることを特徴とするも
のである。具体的には、上記製造法において、下記で表
わされる因子ＸＩＩＩａのアミノ酸配列をコードするＤ
ＮＡを含有するベクターによって細胞を形質転換するこ
とを特徴とするものであり、

【化９】

【化１０】

【化１１】

【化１２】 更に好ましい態様は上記ＤＮＡが下記の配列を有するこ
とを特徴とするものである。

【化１３】

【化１４】

【化１５】

【化１６】

【０００３】ＦXIIIa 断片のアミノ酸配列は、適当なプ
ロ―ブの構築のために決定されたものである。対応する
ペプチド断片は、臭化シアンを用いた蛋白質分解或いは
切断により得られた。その様な断片のアミノ酸配列につ
いての知識に基づき、一つの２０ｍｅｒ及び一つの６６
ｍｅｒの二つのオリゴヌクレオチドプロ―ブを合成し
た。２０ｍｅｒプロ―ブにおいては、次のアミノ酸配列
に対する全ての理論的に可能なコドンを考慮に入れ、 Ｍｅｔ‐Ｍｅｔ‐Ａｓｐ‐Ｉｌｅ‐Ｔｈｒ‐Ａｓｐ‐Ｔ
ｈｒ 最後のアミノ酸の場合にはコドンの第３番目の位置を省
略した。従って、この２０ｍｅｒプロ―ブは４８倍の縮
重体、即ち該アミノ酸配列をコ―ドする４８個の理論的
に可能なオリゴヌクレオチド全部の混合物である（後記
第１表参照）。６６ｍｅｒのプロ―ブは、次のアミノ酸
配列に基づき、統計学的デ―タの助けを借りて選んだ
〔レイズ（Lathe)、ジャ―ナル・オブ・モレキュラ―・
バイオロジ―（J.Molec.Biol.)183(1985) 1-12〕（後記
第２表参照） Ｔｙｒ‐Ｇｌｙ‐Ｇｌｎ‐Ｐｈｅ‐Ｇｌｕ‐Ａｓｐ‐Ｇ
ｌｙ‐ｌＬｅ‐Ｌｅｕ‐Ａｓｐ‐Ｔｈｒ‐Ｃｙｓ‐Ｌｅ
ｕ‐Ｔｙｒ‐Ｖａｌ‐Ｍｅｔ‐Ａｓｐ‐Ａｒｇ‐Ａｌａ
‐Ｇｌｎ‐Ｍｅｔ‐Ａｓｐ これらのプロ―ブを用いてｃＤＮＡバンクのスクリ―ニ
ングを行なった。ｃＤＮＡは、成熟ヒト胎盤からのｍＲ
ＮＡから調製した。なお、このｍＲＮＡを胎盤から単離
し、ｃＤＮＡをそれから調製した。ｃＤＮＡにＥｃｏＲ
Ｉ末端を付与し、ファ―ジベクタ―λｇｔ１０のＥｃｏ
ＲＩ切断部位に連結した。上記プロ―ブにより同定され
た陽性クロ―ンλｇｔ１０−１２を更に分析した（図
１）。それ自体公知の方法による配列決定の結果、ＦXI
IIa をコ―ドするＤＮＡ配列が得られた。このＤＮＡ配
列を用いたｃＤＮＡバンクの再スクリ―ニングの結果、
５′‐末端の方向及び３′‐末端の両方向に拡張するク
ロ―ンを更に単離した。

【０００４】図１はＦXIIIa をコ―ドするＤＮＡ配列の
制限地図を示す。“Ｎ”はコ―ド化領域のＮ‐末端を示
し及び“Ｃ”はＣ‐末端を示し、及び“Ａ（８９）”は
８９塩基のポリ（Ａ）配列を示す。この配列はＦXIIIa
のコ―ド化配列の全部を表わす。後記第３表は、判明し
たＤＮＡ配列（コ―ド鎖）及びそれから演繹されたλｇ
ｔ１０−１１及びλｇｔ１０−１２からのクロ―ン化ｃ
ＤＮＡ断片からのアミノ酸配列を示す。ｃＤＮＡの全長
さは、３９０５塩基対である。タカギ及びドゥ―リトル
（上掲）により見出された３６個のアミノ酸を有するＮ
‐末端配列はこの判明した配列内に存在する。この配列
は第３表においてヌクレオチド位置８８及び１９８の間
に連続線により示されている。タカギ及びドゥ―リトル
により見出された配列に加えて、このｃＤＮＡは１８７
−１８９のヌクレオチド位置においてバリンをコ―ドす
る。この４個のアミノ酸を有するホルブルック等（上
掲）により見出されたアミノ酸‐Ｇｌｙ‐Ｇｌｎ‐Ｃｙ
ｓ‐Ｔｒｐ‐は位置１０２１−１０３２におけるｃＤＮ
Ａによりコ―ドされている。この配列は同様に連続線に
より示されている。加えて、２０ｍｅｒ及び６６ｍｅｒ
オリゴヌクレオチドプロ―ブの位置は破線により示され
ている。２０ｍｅｒプロ―ブは１５０７及び１５２６の
位置の間にハイブリダイズし、６６ｍｅｒプロ―ブは７
６６及び８３１の位置の間にハイブリダイズする。本発
明に従えば、変更された生物学的特性を有する蛋白質を
コ―ドする変成された遺伝子の製造にこのコ―ド化ｃＤ
ＮＡを用いることが可能である。この目的のために、そ
れ自体公知の方法で削除、挿入及び塩基交換を行なうこ
とが可能である。宿主の選択によりＦXIIIa への変成の
性質に影響を及ぼすことも可能である。即ち、細菌にお
いてはグリコシル化がないのに対し、酵母細胞において
生ずるそれは高等真核生物におけるそれと異なる。

【０００５】ＦXIIIa のアミノ酸配列を知れば、ポリク
ロ―ナル或いはモノクロ―ナル抗体の製造に抗原として
作用することのできるアミノ酸の部分配列を通常の方法
或いは遺伝子操作により製造することが可能である。そ
の様な抗体は診断目的のみならず、それを用いてこの因
子を他の蛋白質に加えて含有する溶液からＦXIIIa を除
去することが可能である抗体カラムの製造にも使用する
ことができる。このｃＤＮＡ或いはその部分を用いて、
直截的にゲノムバンクからＦXIIIa をコ―ドするゲノム
クロ―ンを単離することも可能であり、またそれを用い
てそれを真核生物細胞内に発現することが可能であるの
みならず、更に診断情報を得ことも可能である。ＦXIII
a 欠陥は、前駆体の酵素の活性形態に転換することがで
きないことに大きく帰せられる各種症候群を生じ得る。
ＦXIIIa のｃＤＮＡについての知識によれば、今やそれ
を用いて遺伝的変成が存在するか否かを直截的に確立す
ることが可能である診断補助品の製造することが可能で
ある。即ち、本発明に従えば例えば、ウィルスその他の
蛋白質による汚染の如何なる危険性もなしに高純度の因
子XIIIa を製造することが可能である。今日まで存在し
ていた原料源としてヒト血漿或いは胎盤への依存はかく
して克服された。加えて、本発明によれば、貴重な診断
補助品及び従って遺伝的ＦXIIIa 欠陥の分析ができるよ
うになる。

【０００６】以下、本発明を具体的により詳細に説明す
る。特に断りのない限り、パ―セントは量に関連しない
場合には重量に関する。本文で説明するものの他、次の
省略を用いた： ＥＤＴＡ＝エチレンジアミン四酢酸ナトリウム ＳＤＳ ＝ドデシル硫酸ナトリウム ＤＴＴ ＝ジチオスレイト―ル ＢＳＡ ＝ウシ血清アルブミン。

【０００７】

【実施例】

例： １．ヒト胎盤からのＲＮＡの単離 ＲＮＡは成熟ヒト胎盤から得られた〔チルギン等（Chir
gwin et al.)、バイオケミストリ―（Biochemistry)18
(1979)5294-5299の方法による〕約１０ｇの胎盤組織を
液体窒素中で粉砕し、０．１Ｍのメルカプトエタノ―ル
を含有する８０mlの４Ｍグアニジニウムチオシアネ―ト
中に懸濁させ、ホモジナイザ―（Ultraturrax)中で２
０，０００rpm にて９０秒間処理した。溶解物を７００
０rpm で１５分間遠心分離し（Sorvall GSA ロ―タ
―）、２mlの１Ｍ酢酸及び６０mlの無水エタノ―ルを上
澄液に添加し、これを−２０℃で一晩沈澱させた。６０
００rpm 及び−１０℃において１０分間沈降後、核酸を
４０mlの７．５Ｍグアニジニウム塩酸塩（ｐＨ７．０）
中に完全に溶解し、１mlの１Ｍ酢酸及び２０mlの無水エ
タノ―ルの混合物で沈澱した。ＤＮＡを除去するため
に、この沈澱を半分の容量でもう一度繰返した。ＲＮＡ
を１２mlのＨ_２Ｏに溶解し、１．２mlの４Ｍ酢酸カリウ
ム及び２４mlの無水エタノ―ルの混合物で沈澱させ、沈
降させ、及び最終的に１０mlの水に再溶解した（ｇ組織
当り１ml）。

【０００８】ポリ（Ａ）を含有する胎盤ｍＲＮＡの単離 ポリ（Ａ）を含有するｍＲＮＡを単離するために、胎盤
ＲＮＡをＬｉＣｌ中の２mlパスツゥ―ルピペット内でオ
リゴ（ｄＴ）‐セルロ―スクロマトグラフィにより分別
した〔アビブ及びレ―ダ―（Aviv and Leder）、Proc.N
atl.Acad.Sci.USA 69(1973)1408-1412 〕。約５mgの胎
盤ＲＮＡを緩衝液１〔５００ｍＭＬｉＣｌ、２０ｍＭ
ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％
ＳＤＳ〕中においてカラムにかけた。ポリ（Ａ）⁺ ＲＮ
Ａはオリゴ（ｄＴ）‐セルロ―スに結合したのに対し、
ポリ（Ａ）^- ＲＮＡは再び溶出することができた。緩衝
液２〔１００ｍＭ ＬｉＣｌ、２９ｍＭ ｔｒｉｓ（ｐ
Ｈ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ＳＤＳ〕で洗
浄後、ポリ（Ａ）⁺ ＲＮＡ（胎盤ｍＲＮＡ）をカラムか
ら緩衝液３〔５ｍＭ ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ
ＥＤＴＡ、０．０５％ＳＤＳ〕で溶出した。更に精製
するために、ポリ（Ａ）⁺ ＲＮＡを緩衝液１に対して調
整し、オリゴ（ｄＴ）‐セルロ―ス上で再クロマトグラ
フィを行なった。この第２回目の精製工程の後、胎盤ポ
リ（Ａ）⁺ ＲＮＡの収率は使用ＲＮＡの約４％であっ
た。

【０００９】ヒト胎盤からのｃＤＮＡ（胎盤ｃＤＮＡ）
及び二本鎖ｃＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の合成 ｃＤＮＡ合成前に、ポリ（Ａ）を含有する胎盤ｍＲＮＡ
が完全であることのチェックを１．５％アガロ―スゲル
内で行なった。次いで４μｇの胎盤ｍＲＮＡを６５．５
μｌのＨ_２Ｏ中に溶解し、７０℃で１０分間変成し、再
び氷中で冷却した。２０μｌのＲＴ_１緩衝液〔４２℃に
おける２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．２）、２５０ｍ
Ｍ ＫＣｌ、３０ｍＭＭｇＣｌ_２）、２．５μｌの２０
ｍＭ ｄＮＴＰ（即ち全ての四つのデオキシヌクレオチ
ドトリホスフェ―ト）、１μｌの１μｇ／mlオリゴ（ｄ
Ｔ）、１μｌの１Ｍ ＤＴＴ、２μｌのＲＮＡｓｉｎ及
び８μｌの逆転写酵素（２４Ｕ／μｌ）を添加後、ｃＤ
ＮＡを１００μｌ混合物中において４２℃で９０分間合
成した。二本鎖ｃＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）は、ガブラ―及
びホフマン（Gubler andHoffmann) の方法〔ジ―ン（Ge
ne)25(1983)263-269〕により合成した。この合成は、ｃ
ＤＮＡ合成の直後に３０５．５μｌのＨ_２Ｏ、８０μｌ
のＲＴ_２緩衝液〔１００ｍＭｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、
２５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５００ｍＭＫＣｌ、５０ｍＭ
ＤＴＴ、２５０μｇ／mlＢＳＡ〕、２μｌのＲＮａｓｅ
Ｈ（２Ｕ／μｌ）、２．５μｌのＥ．ｃｏｌｉＤＮＡリ
ガ―ゼ（５Ｕ／μｌ）、５μｌの１５ｍＭ β‐ＮＡ
Ｄ、及び５μｌのＤＮＡポリメラ―ゼＩ（５Ｕ／μｌ）
を添加し、１５℃において５時間インキュベ―ションす
ることにより行なった。この反応を熱不活性化（７０
℃、３０分）により停止させた。５５μｌの２５０μＭ
ｄＮＴＰ、５５μｌの１０ｍＭ ｔｒｉｓ（ｐＨ７．
５）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１０μｇ／mlＢＳＡ、３
μｌのＴ４ＤＮＡポリメラ―ゼＩ（１Ｕ／μｌ）、２μ
ｌ ＲＮａｓｅＨ（２Ｕ／μｌ）及び２μｌのＲＮａｓ
ｅＡ（２μｇ／ml）を添加後、反応液を第２番目のＤＮ
Ａ鎖上におけるポリメラ―ゼＩの誤った合成を修正する
ために３７℃において更に３０分間インキュベ―トした
（「修復反応」）。

【００１０】ｄｓＤＮＡへのＥｃｏＲＩリンカ―の連結
及びリンカ―の開裂 胎盤ｃＤＮＡバンクを組立てるために、このｄｓＤＮＡ
にファ―ジベクタ―λｇｔ１０のＥｃｏＲＩ切断部位に
おいてそれを連結できるようにＥｃｏＲＩ末端を付与し
た〔Ｔ．マニアティス等（T.Maniatis et al.).(198
2）、モレキュラ―・クロ―ニング（Molecular Clonin
g)、実験室マニュアル、Cold SpringHarbor〕。この目
的のために、ｄｓＤＮＡを a) ｄｓＤＮＡの内部ＥｃｏＲＩ切断部位を保護するた
めにＥｃｏＲＩメチラ―ゼで処理し、 b) ＥｃｏＲＩリンカ―を付与し、それらを c) 次いでＥｃｏＲＩで開環させた。a)について： ｄｓＤＮＡのメチラ―ゼ反応は、修復反
応の直後に２５μｌの５００ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．
０）６０μｌのメチラ―ゼ緩衝液〔１００ ｍＭＮａＯ
Ａｃ（ｐＨ５．２）、２mgのＳ‐アデノシル‐Ｌ‐メチ
オニン〕及び２μｌのＥｃｏＲＩメチラ―ゼ（２０Ｕ／
μｌ）を添加し、３７℃で３０分間インキュベ―トさせ
て行なった。反応液をフェノ―ルで抽出し、ｄｓＤＮＡ
を６０μｌの４Ｍ ＮａＯＡｃ及び１３００μｌのエタ
ノ―ルで沈澱させた。ｄｓＤＮＡを２回７０％エタノ―
ルで洗浄し、エ―テルと振盪させて１回抽出し、乾燥さ
せた。b)について： このＥｃｏＲＩ‐メチル化ｄｓＤＮＡを
８８μｌのＨ_２Ｏに溶解し、１０μｌのリガ―ゼ緩衝液
〔５００ｍＭ ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、１００ｍＭ
ＭｇＣｌ_２、１００ｍＭ ＤＴＴ、１０ｍＭスペルミジ
ン、１０ｍＭ ＡＴＰ、１mg／mlＢＳＡ〕及び１μｌの
Ｔ４ＤＮＡリガ―ゼ（１０Ｕ／μｌ）を添加後、１μｌ
のＥｃｏＲＩリンカ―（０．５μｇ／μｌ）（ｐＧＧＡ
ＡＴＴＣＣ及びｐＡＧＡＡＴＴＣＴ）と１５℃において
一晩かけて連結させた。c)について： このリガ―ゼ混合物の容量を６μｌのＨ
_２Ｏ、１２μｌの１０ｘＥｃｏＲＩ緩衝液及び２μｌの
ＥｃｏＲＩ（１２０Ｕ／μｌ）で１２０μｌに調合し
た。ＥｃｏＲＩ消化は、３７℃で２時間行なった。

【００１１】酢酸カリウム勾配及びｄｓＤＮＡの大きさ
選択による未結合リンカ―の除去 ｄｓＤＮＡから全ての未結合ＥｃｏＲＩリンカ―を除去
するために、ＥｃｏＲＩ反応混合物を全部酢酸カリウム
勾配（５‐２０％ＫＯＡｃ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１μｌ
／mlエチジウムブロマイド）にかけ、それを５０，００
０rpm 及び２０℃で３時間遠心分離した（Beckman SW 6
5/ロ―タ―）。この勾配を最初の五つの画分の容量が５
００μｌで残りの全てが１００μｌとなるように下から
分別した。これらの画分を０．０１容のアクリルアミド
（２５mg／ml）及び２．５容のエタノ―ルで沈澱させ、
７０％強度のエタノ―ルで１度洗浄し、乾燥し、及びそ
れぞれを５μｌのＨ_２Ｏ中にとった。ｄｓＤＮＡの大き
さを決定するために、１μｌの各画分を１．５％アガロ
―スゲル内で分析した。更にｄｓＤＮＡの量を１μｌの
各画分について求めた。１０００ｂｐを越えるｄｓＤＮ
Ａを含有する画分を合体し、この試料を最終濃度が２７
μｇ／mlになるまで濃縮した。

【００１２】ｄｓＤＮＡのファ―ジベクタ―λｇｔ１０
中への導入及びin vitroパッケ―ジング反応 ｄｓＤＮＡのファ―ジ―ベクタ―λｇｔ１０（Vecter C
loning Systems、カリフォルニア州、サンディェゴ）の
ＥｃｏＲＩ切断部位中への導入は、４μｌリガ―ゼ混合
物（２μｌのｄｓＤＮＡ、１μｌのλｇｔ１０×Ｅｃｏ
ＲＩ（１μｇ／ml）、０．４μｌのリガ―ゼ緩衝液、
０．５μｌのＨ_２Ｏ及び０．１μｌのＴ４ＤＮＡリガ―
ゼ）中において行なった。この混合物は、１５℃で４時
間インキュベ―トした。ファ―ジベクタ―λｇｔ１０内
で胎盤ｃＤＮＡバンクを確立するために、このリガ―ゼ
混合物を次いでλ‐溶原性細胞抽出物Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎ
Ｓ４２８及びＮＳ４３３とのin vitroパッケ―ジング反
応に室温において２時間付した 〔Vecter Cloning Systems、カリフォルニア州、サンデ
ィェゴ；エンキスト及びスタ―ンバ―グ（Enquist and
Sternberg)、Methods in Enzymology 68(1979)281-298
〕。この反応は、５００μｌの懸濁媒体〔ＳＭ：０．
１Ｍ ＮａＣｌ、８ｍＭ ＭｇＳＯ_４、５０ｍＭ ｔｒ
ｉｓ（ｐＨ７．５）、０．０１％ゼラチン〕及び２滴の
クロロホルムで停止させた。

【００１３】力価の決定及び胎盤ｃＤＮＡバンクの分析 胎盤ｃＤＮＡバンクのプラ―ク形成単位 （ＰＦＵ）の数はＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２株Ｃ６００ＨＦ
Ｌのコンピテント細胞を用いて決定した：それは１×１
０^６ＰＦＵであった。約８０％のファ―ジが１０００塩
基対より大きいＤＮＡインサ―トを含有した。

【００１４】胎盤ｃＤＮＡバンクをスクリ―ニングする
ためのオリゴヌクレオチドプロ―ブ 二つのオリゴヌクレオチドプロ―ブ（２０ｍｅｒプロ―
ブ及び６６ｍｅｒプロ―ブ）を胎盤ｃＤＮＡバンクを分
析するために合成した。それらの配列は、ＦXIIIa のい
くつかの蛋白質分解及びＢｒＣＮ断片のアミノ酸初期配
列から演繹した。場合によっては重複する、従ってより
長いアミノ酸配列が見出されたが、これらによって極め
て長いプロ―ブ即ち６６ｍｅｒプロ―ブの合成が可能と
なった。２０ｍｅｒプロ―ブは、アミノ酸配列Ｍｅｔ‐
Ｍｅｔ‐Ａｓｐ‐Ｉｌｅ‐Ｔｈｒ‐Ａｓｐ‐Ｔｈｒに対
する全ての理論的に可能なコドンが考慮された通常のＤ
ＮＡプロ―ブである（末端アミノ酸Ｔｈｒの場合には
「ゆらぎ」位置と称されるコドンの第３番目は省略され
た；第１表参照）。この２０ｍｅｒプロ―ブは従って４
８倍縮重体、即ち該アミノ酸配列に対する全ての４８個
の理論的に可能なコ―ド化オリゴヌクレオチドの混合物
である。６６ｍｅｒプロ―ブの構成方法及び使用は、レ
イズ（Lathe)、J.Mol.Biol.183(1985)1-12の原則に本質
的に従った。６６ｍｅｒプロ―ブを構成するために二つ
の３９ｍｅｒプロ―ブを合成した（次の配列を有する３
９ｍｅｒＡ：５′ＴＡＴＧＧＣＣＡＧＴＴＴＧＡＧＧＡ
ＴＧＧＣＡＴＣＣＴＧＧＡＣＡＣＣＴＧＴＣＴＧ３′及
び次の配列を有する３９ｍｅｒＢ：５′ＧＴＣＣＡＴＣ
ＴＧＧＧＣＣＣＧＧＴＣＣＡＴＣＡＣＡＴＡＣＡＧＡＣ
ＡＧＧＴＧＴＣ ３′）。３９ｍｅｒＡ及び３９ｍｅｒ
Ｂは、二つの配列のハイブリダイゼ―ションの結果長い
遊離５′末端が生ずるように１２個の塩基よりなる相補
的配列を有する。これらの二つの３９ｍｅｒプロ―ブは
（２０ ｍｅｒプロ―ブと同様に）５′末端において
（γ‐³²Ｐ）‐ＡＴＰ（約１μｇのＤＮＡ、（γ‐
³²Ｐ）‐ＡＴＰ：３０００Ｃｉ／mmol、１０μＣｉ／μ
ｌ、６μｌ／４０μｌの反応混合液使用）の存在下にお
いてＴ４ポリヌクレオチドキナ―ゼで標識した。２０ｍ
ｅｒプロ―ブは１×１０^８Ｂｑ／μｇ或いは１．５×１
０^６Ｂｑ／pmolの比活性を有した。二つの３９ｍｅｒプ
ロ―ブは９５℃で５分間加熱し、混合し、及び低温室内
で４℃に徐々に冷却してハイブリダイズさせた。次い
で、約１μｇのハイブリダイズされた３９ ｍｅｒプロ
―ブをＤＮＡポリメラ―ゼＩ、クレノウ断片で（α‐³²
Ｐ）‐ｄＡＴＰ（３０００Ｃｉ／mmol、１０μＣｉ／μ
ｌ、４μｌ／５０μｌ反応混合物）を添加して処理した
〔５′→３′埋填（filling-in）反応〕。この埋填され
た６６ｍｅｒプロ―ブは１．５×１０^８Ｂｑ／μｇの比
活性を有した。これらのＤＮＡプロ―ブは−２０℃にお
いて貯蔵した。２０ｍｅｒプロ―ブは直ちに分析（スク
リ―ニング）のために用いたのに対し、６６ｍｅｒプロ
―ブは予め９５℃において５分間加熱し、次いで氷浴内
で迅速に冷却した。６６ｍｅｒプロ―ブは二つの３９ｍ
ｅｒのハイブリダイゼ―ションに引続き５′→３′埋填
反応により生成されたので、各種実験を行なうことが可
能である。一方において、ｃＤＮＡバンクを変性された
６６ｍｅｒＤＮＡプロ―ブとハイブリダイズさせること
が可能であり、他方において、次いで陽性のクロ―ンを
３９ｍｅｒＡ及びＢプロ―ブと個々にハイブリダイズさ
せることが可能である。長いプロ―ブ及び二つの短い３
９ｍｅｒプロ―ブＡ及びＢの両者とハイブリダイズする
クロ―ンが所望の配列をもつ確率は極めて高い。即ち、
以上説明した長い、複雑なオリゴヌクレオチドプロ―ブ
を構成し、部分的に相補的な短いＤＮＡプロ―ブを用い
てクロ―ンを「再スクリ―ニングする」方法は特異性の
向上を表わす。加えて、長いオリゴヌクレオチド及びそ
の部分的に相補的な短い部分オリゴヌクレオチドを用い
て向上した特異性を有するゲノムバンクをスクリ―ニン
グすることが可能である。該方法のもう一つの利点は、
より短いオリゴヌクレオチドの合成をより簡単に且つよ
り高い収率及び精度を用いて行なうことができることで
ある。二つの酵素反応、即ち1)（γ‐³²Ｐ）‐ＡＴＰ標
識付けのためのＴ４ポリヌクレオチドキナ―ゼ、及び2)
（α‐³²Ｐ）‐ｄＮＴＰの添加によるＤＮＡポリメラ―
ゼ埋填反応、の順序はより高い比活性（少なくとも１×
１０^８Ｂｑ／μｇＤＮＡ）を得ることが可能であること
を意味する。

【００１５】ＦXIIIa ‐特異的オリゴヌクレオチドによ
る胎盤ｃＤＮＡのスクリ―ニング ２０ｍｅｒプロ―ブ及び６６ｍｅｒプロ―ブを用いて、
５×１０^５ＰＦＵの胎盤ｃＤＮＡバンクをＦXIIIa をコ
―ドするｃＤＮＡ配列について調べた。これには、１
３．５cmのペトリ皿内の軟寒天中でＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１
２株Ｃ６００ＨＦＬの細胞で培養され、３７℃で６時間
インキュベ―トされた３×１０^４ＰＦＵを伴った。この
時までに生じた如何なる溶解も尚不完全であった。これ
らのプレ―トを冷蔵庫内で一晩インキュベ―トし、ファ
―ジをニトロセルロ―スフィルタ―に移した〔シュライ
ヒヤ―及びシュル（Schleicher & Schuell)、BA 85.Re
f.No.401124 〕（二重）。これらのニトロセルロ―スフ
ィルタ―及びペトリ皿を引続き割当てを行なうために注
射針で印をつけた。これらのペトリ皿はニトロセルロ―
スフィルタ―の処理の際に低温室に貯蔵した。ニトロセ
ルロ―スフィルタ―上のＤＮＡはフィルタ―を１．５Ｍ
ＮａＣｌ、０．５Ｍ ＮａＯＨを含浸させた濾紙（Wh
atman M 3)上に５分間置くことにより変性した。これら
のフィルタ―を次いで１．５Ｍ ＮａＣｌ、０．５Ｍ
ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）を用いて同一方法で再変成し、
２×ＳＳＰＥ（０．３６Ｍ ＮａＣｌ、１６ｍＭ Ｎａ
ＯＨ、２０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４、２ｍＭ ＥＤＴＡ）
で洗浄した。これらのフィルタ―を次いで８０℃で２時
間真空乾燥した。これらのフィルタ―を３×ＳＳＣ、
０．１％ＳＤＳ（２０×ＳＳＣ＝３ＭＮａＣｌ、０．３
Ｍ Ｎａクエン酸塩）で６５℃において４時間洗浄し、
６５℃において４時間予備ハイブリダイズした（予備ハ
イブリダイゼ―ション溶液；０．６Ｍ ＮａＣｌ、０．
０６Ｍｔｒｉｓ（ｐＨ８．３）、６ｍＭ ＥＤＴＡ、
０．２％非‐イオン性合成スクロ―ス重合体（ ^RＦｉｃ
ｏｌｌ）、０．２％ポリビニルピロリドン４０、０．２
％ＢＳＡ、０．１％ＳＤＳ、５０μｇ／ml変性にしん精
子ＤＮＡ）。これらのフィルタ―をおだやかに振盪しな
がらビ―カ―或いは密封ポリエチレンフィルム内でハイ
ブリダイゼ―ション溶液（にしん精子ＤＮＡのない予備
ハイブリダイゼ―ション溶液）のml当り１００，０００
〜２００，０００Ｂｑの標識オリゴヌクレオチドを添加
して一晩インキュベ―トした。２０ｍｅｒ及び３９ｍｅ
ｒプロ―ブに対するハイブリダイゼ―ション温度は４２
℃であり、６６ｍｅｒプロ―ブに対するそれは４７℃で
あった。これらのニトロセルロ―スフィルタ―は６×Ｓ
ＳＣ、０．０５Ｍピロリン酸ナトリウムで室温において
１時間及び特別のハイブリダイゼ―ション温度において
更に１時間洗浄した。これらのフィルタ―を乾燥し、一
晩オ―トラジオグラフィにかけた。二重のＸ線フィルム
の両者に生ずる信号をペトリ皿に割当て、その領域（約
５０プラ―ク）をパスツ―ルピペットの広い末端で切抜
き、ファ―ジを１mlのＳＭ緩衝液に再懸濁した。陽性フ
ァ―ジを単一クロ―ンが得られるまで３回に亘って選抜
した。合計５×１０^５ＰＦＵの胎盤ｃＤＮＡバンクを数
継代において調べた。二重フィルタ―上に１７個の信号
が確認された。より緊縮な条件下で更にスクリ―ニング
を行なったところ尚陽性である７個の信号を得た。これ
らの７個のＰＦＵのうち１個のＰＦＵのみが２０ｍｅｒ
及び６６ｍｅｒプロ―ブによるハイブリダイゼ―ション
及び３９ｍｅｒプロ―ブＡ及びＢによるハイブリダイゼ
―ションの後共に陽性の信号を示した。この以後λｇｔ
１０−１２と称される―クロ―ンはＦXIIIa をコ―ド化
し、及び内部ＥｃｏＲＩ切断部位を有する１７０４塩基
対の配列を有する。サザ―ンブロット分析は、５４０塩
基対のより小さいＥｃｏＲＩ断片は２０ｍｅｒＤＮＡプ
ロ―ブとハイブリダイズし、１１６４塩基対のより大き
い断片は６６ｍｅｒＤＮＡプロ―ブとハイブリダイズす
ることを示している。再スクリ―ニング時に、サザ―ン
ブロットから３９ｍｅｒプロ―ブＢよりも３９ｍｅｒプ
ロ―ブＡとより多くの反応があることが判明した。引続
きクロ―ンλｇｔ１０−１２の配列分析によって、６６
ｍｅｒプロ―ブの全長に亘ってＦXIIIa に見出された配
列に対して僅かに７個の不適性塩基対があるに過ぎない
ことが判った（第２表（表１））。これらの７個の不適
性塩基対は次のように分布している。即ち３９ｍｅｒＡ
プロ―ブに３個の及び３９ｍｅｒＢプロ―ブに５個の不
適性塩基対がある（一つの不適性塩基対は重複領域にあ
り、従って両者に共通である）。３９ｍｅｒＢにおける
５個の不適性塩基対は一団となっており、これがおそら
く３９ｍｅｒＢプロ―ブの場合におけるより弱いハイブ
リダイゼ―ション信号の理由であると思われる。

【００１６】ニック‐トランスレ―トされたＥｃｏＲＩ
断片による胎盤ｃＤＮＡのスクリ―ニング ５４０塩基対及び１１６４塩基対長さの二つのサブクロ
―ン化ＥｃｏＲＩ断片を市販のベクタ―ｐＵＣ８（１１
６４ｂｐ＝ｐＵＣ８−１２．１及び５４０ｂｐ＝ｐＵＣ
８−１２．２）のＥｃｏＲＩ切断部位中にクロ―ン化
し、それから調製的にＥｃｏＲＩにより単離し、及び
（α‐³²Ｐ）‐ｄＮＴＰの存在下にニック‐トランスレ
―トした。両断片の比活性は１×１０^８Ｂｑ／μｇＤＮ
Ａであった。これらの（³²Ｐ）‐標識断片を数継代にお
いて用いて胎盤ｃＤＮＡバンクの約１×１０^６個の組換
えファ―ジを調べ（ハイブリダイゼ―ション温度６５
℃）、かくして１３個のハイブリダイズするファ―ジを
確認した。これらのファ―ジは単一均質ファ―ジ標本が
得られるまで３回に亘って選抜した。各ファ―ジの２０
ml溶解物を調製し、ＤＮＡを抽出した。このＤＮＡをＥ
ｃｏＲＩで消化し、１％アガロ―スゲル上で分別した。
このゲルをサザ―ンブロット技術に対し、ニトロセルロ
―スフィル―タを標識５４０ｂｐＥｃｏＲＩ断片とハイ
ブリダイズさせた。１１個のファ―ジがハイブリダイゼ
―ション信号を示した。このニトロセルロ―スフィルタ
―を沸騰させ、ニット‐トランスレ―トされた１１６４
ｂｐＥｃｏＲＩ断片とハイブリダイズさせた。７個のフ
ァ―ジがハイブリダイゼ―ション信号を示した。ハイブ
リダイズする断片の大きさに基づいて、λｇｔ１０−１
２に対比してλｇｔ１０−２０のように５′末端方向及
びλｇｔ１０−１１のように３′末端の方向の両者に拡
張するクロ―ンを確認することが可能であった。これら
のクロ―ンを用いて完全なXIIIa ｃＤＮＡ配列を決定
することが可能であった。内部制限部位を用いることに
より或いは重複配列のハイブリダイゼ―ションにより、
存在した部分配列を組合わせることが可能であった。こ
の完全なｃＤＮＡ配列は発現ベクタ―中に連結し、適当
な原核或いは真核系内において発現することができる。

【００１７】ＤＮＡ配列分析 ファ―ジクロ―ンλｇｔ１０−１２を増殖し、ＤＮＡを
抽出した。二つのＥｃｏＲＩ断片を単離し、プラスミド
ベクタ―ｐＵＣ８のＥｃｏＲＩ部位中にクロ―ン化し
た。ｐＵＣ８−１２．１は１１６４塩基対断片を有し、
ｐＵＣ８−１２．２は５４０塩基対断片を有する。１７
０４塩基対よりなる全断片を単離するために、λｇｔ１
０−１２をＥｃｏＲＩで部分的に消化し、１７０４塩基
対バンドを単離し、ｐＩＣ１９Ｈ〔マ―シュ等（Marsh
et al.)Gene 32(1984)481-485 〕のＥｃｏＲＩ部位中に
クロ―ン化した。得られたプラスミドをｐＩＣ１９Ｈ−
１２と称する。クロ―ンｐＵＣ８−１２．１、ｐＵＣ８
−１２．２及びｐＩＣ１９Ｈ−１２のＳａｕ ３Ａ、Ａ
ｌｕＩ及びＴａｑＩ小断片をｐＵＣプラスミド及びＭ１
３ファ―ジにクロ―ン化した後関連領域をサンガ―（Sa
nger）のジデオキシ法及びマクサム及びギルバ―ト（Ma
xam and Gilbert)の化学的方法を用いて配列決定するこ
とにより、１７０４ｂｐ断片の配列を決定することが可
能であった（第３表（表２〜６））。この配列は１個の
みの開放読取枠を示し、因子XIIIa 分子の最初の５４２
個のアミノ酸をコ―ドする。クロ―ンλｇｔ１０−１２
或いはｐＩＣ１９Ｈ−１２及びクロ―ンλｇｔ１０−１
１及びλｇｔ１０−２０の制限分析は、適当な単一及び
複数消化及びスミス及びビルンスチ―ルの方法〔Smith,
H.O.and Birnstiel,M.L.、ヌクレイック・アシッズ・リ
サ―サ（Nucleic Acids Res.)3(1976)2387- 2398〕によ
る（³²Ｐ）‐標識断片の部分消化の両者により行なった
（図１）。クロ―ンλｇｔ１０−１１は２４３２ｂｐの
大きさの内部ＥｃｏＲＩ切断部位を有する断片を有す
る。この断片は３′末端における２３７ｂｐによりλｇ
ｔ１０−１２からのｃＤＮＡ断片と重複し、コ―ド化配
列の残りの５７０ｂｐプラス８９塩基のポリ（Ａ）配列
を含む非‐コ―ド化領域の１６２５ｂｐよりなる。約７
００ｂｐの大きさのｃＤＮＡ断片を有するクロ―ンλｇ
ｔ１０−２０は又５′末端にλｇｔ１０−１２よりも６
個多い塩基を有する（ＧＡＧ ＧＡＡ…）。

【００１８】２．発現されることができ、ＦXIIIa をコ
―ド化する全ｃＤＮＡを含有するクロ―ンの調製 出発クロ―ンλｇｔ１０−１１及びλｇｔ１０−１２を
用いてＦXIIIaｃＤＮＡの全コ―ド化領域を含有するプ
ラスミドを得た。部分ＥｃｏＲＩの消化の助けにより、
λｇｔ１０−１２の１７０４塩基対よりなる挿入物をｐ
ＩＣ１９Ｈ（マ―シュ等上掲）のＥｃｏＲＩ部位にクロ
―ン化した。得られたプラスミドｐＩＣ１９Ｈ−１２．
１を引続き使用した（第２図参照）。このクロ―ンλｇ
ｔ１０−１１は２４３２塩基対の大きさの挿入物を有
し、内部ＥｃｏＲＩ切断部位を有する。１２２４塩基対
の大きさであり、コ―ド化配列のＣ‐末端５７０塩基対
プラス３′非‐コ―ド化領域の６５４塩基対を有する左
側（「５‐末端」）ＥｃｏＲＩ断片を同様にｐＩＣ１９
ＨのＥｃｏＲＩ切断部位にクロ―ン化した。得られたプ
ラスミドｐＩＣ１９Ｈ−１１．１を引続き使用した（図
２）。これらのプラスミドｐＩＣ１９Ｈ−１２．１及び
ｐＩＣ１９Ｈ−１１．１はベクタ―中の同一配向におい
てＦXIIIa に対するコ―ド化領域を有し、２３７塩基対
よりなる重複領域を有する。この重複領域を用いて部分
クロ―ンｐＩＣ１９Ｈ−１２．１及びｐＩＣ１９Ｈ−１
１．１から全コ―ド化領域を有するクロ―ンを構成し
た。これは上記二つのプラスミドからのin vitroでのハ
イブリダイゼ―ション（図２）による部分的一本鎖ヘテ
ロ二重鎖分子の調製及び反応混合物のＥ．ｃｏｌｉ中へ
の形質転換を伴うものであった。細菌の修復機構（酵素
ＤＮＡポリメラ―ゼＩの３′→５′エキソヌクレア―ゼ
活性、５′→３′重合活性）を利用して、全コ―ド化領
域を有するプラスミドを得た。具体的には、これはプラ
スミドｐＩＣ１９Ｈ−１２．１（ＣｌａＩ‐消化）及び
ｐＩＣ１９Ｈ−１１．１（ＢａｍＨＩ‐消化）の各々の
１μｇのＤＮＡを混合し、エタノ―ルで沈澱するもので
あった。ＤＮＡを真空乾燥し、２０μｌのＨ_２Ｏ中にと
り、５μｌの１ＮＮａＯＨを添加後、室温において１０
分間インキュベ―トした。次いで次のものを示される順
序に従って添加した：２００μｌのＨ_２Ｏ、２５μｌの
１Ｍｔｒｉｓ．ＨＣｌ（ｐＨ８．０）及び５０μｌの
０．１Ｎ ＨＣｌ。反応混合物を６５℃で３時間イキン
ュベ―トし、エタノ―ルで沈澱させ、乾燥した。ＤＮＡ
を２０μｌのＨ_２Ｏ中に再懸濁し、公知の方法により
Ｅ．ｃｏｌｉ中に形質転換し、細胞をＬＢ‐ａｍｐプレ
―ト上に乗せて一晩インキュベ―トした。合計９６個の
アンピシリン‐耐性クロ―ンのうち、２４個のクロ―ン
をアルカリ法〔バーンボイム及びドリ―（Birnb-oim an
d Doly）、ヌクレイック・アシッヅ・リサ―チ（Nucl.A
cid Res.)7(1979)1513-1523 〕により処理し、プラスミ
ドをＨｉｎｄIII 、ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ及びＰｖｕ
IIによる制限酵素分解により特性決定した。６個のプラ
スミドが期待された制限パタ―ンを示した。これらのプ
ラスミドのうちの一つｐＦXIII−１３（図２）を詳細に
特性決定した。これは配列決定された２３７個の塩基対
重複領域を有する。ＳｔｕＩ（位置１２２５）‐Ｐｖｕ
II（位置１８７０）を伴い、このＤＮＡ配列は正確であ
ることが確認された。プラスミドｐＦXIII−１３は７８
ｂｐが５′非‐翻訳領域のものであり２１９６ｂｐが全
コ―ド領域であり、及び４１９ｂｐが３′非‐翻訳領域
のものであるＦXIIIa ｃＤＮＡの２６９３塩基対よりな
る。ｐＦXIII−１３は全ての引続く発現実験のための出
発プラスミドであった。

【００１９】３．生物学的に活性な因子XIIIa のＥ．ｃ
ｏｌｉにおける発現 a)ＦXIIIa 発現プラスミドの構成 ＦXIII−１３はｌａｃプロモ―タに関して正しい配向に
おいて、及びｌａｃＺα‐ペプチドに対して正しい読取
枠内にＦXIIIa ｃＤＮＡ挿入を有する。従って、ｐＦ
XIII−１３はＥ．ｃｏｌｉにおけるＦXIIIa 融合蛋白質
の合成を誘発することができる。この蛋白質の分子量
は、天然ＦXIIIa の７３２個のアミノ酸と共に１６個の
ベクタ―コ―ド化アミノ酸プラス５′非‐コ―ド化領域
により特定される２８個のアミノ酸よりなる。これらの
４４個の追加のアミノ酸は融合蛋白質のＮ‐末端に位置
する。この蛋白質の予想される分子量は８５，２５０Ｄ
（第４表（表７））である。ｌａｃプロモ―タの代りに
より効率的なｔｒｐ／ｌａｃハイブリッドプロモ―タを
用いる発現プラスミドを引続き構成した。このために、
ｐＫＫ２３３−２〔アマン及びブロシュウス（Amann an
d Brosius)、ジ―ン（Gene)40(1985).183-190 〕をＥｃ
ｏＲＩで切断し、Ｂａｌ３１で処理した（図３）。この
ＤＮＡを次いでＰｖｕIIで切断し、２８００塩基対の大
きさの断片をＰＡＡゲル上で精製した。この断片をＢｇ
ｌIIリンカ―（５′‐ＣＡＧＡＴＣＴＧ）の存在下にお
いて再連結した。得られたプラスミドｐＴｒｃ８９−１
（図３）をＮｃｏＩ及びＨｉｎｄIII で切断し、合成リ
ンカ― ５′ＣＡＴＧＧＡＡＴＴＣＧＡ３′ ３′ＣＴＴＡＡＧＣＴＴＣＧＡ５′ をリガ―ゼ混合物中において２８００塩基対の断片と共
にインキュベ―トした。得られたプラスミドｐＴｒｃ９
６Ａ（図３）をＥｃｏＲＩ及び ＨｉｎｄIII で切断
し、２８００塩基対の大きさの断片をゲル精製し、ｐＵ
Ｃ１８からの５５塩基対の大きさのＥｃｏＲＩ‐Ｈｉｎ
ｄIII リンカ―と連結した。得られたプラスミドはｐＴ
ｒｃ９７Ａ（図３）である。ｐＫＫ２３３‐２に対照的
に、ｐＴｒｃ９７Ａはプラスミド内で一度だけ存在する
ＮｃｏＩ部位の下流にｐＵＣ１８からのポリリンカ―を
有し、従って数多くのクロ―ニング部位を有する。ｐＦ
XIII−１３中にクロ―ン化されたＦXIIIa ｃＤＮＡ
は、ＡＴＧ開始コドンから５´側に２１塩基対離れた所
（位置６１）にＰｓｔＩ部位を有する。次のＰｓｔＩ部
位は３′未翻訳領域（位置２３９８）に位置する。２３
３７塩基対長のＰｓｔＩ断片がｐＦXIII−１３から単離
され、ｐＴｒｃ９７ＡのＳｓｔＩ部位に連結された。Ｐ
ｓｔＩ断片を所望配向に有する得られたプラスミドはｐ
ＦXIII−Ｃ４（図４）である。ｐＦXIII−Ｃ４により特
性される期待されるＦXIII分子は２２個の追加のＮ‐末
端アミノ酸を有し、それらの１５個はベクタ―‐コ―ド
化され及び７個はＦXIIIｃＤＮＡの５′非‐コ―ド化領
域により特定される。この蛋白質の予想される分子量は
８２，３８０Ｄ（第４表）である。トロンビンを用いて
３７個のアミノ‐末端アミノ酸を切断するとＦXIIIa を
活性形態に転換させる。既に活性化されたその様なＦXI
IIa 分子は治療上の興味があるので、トロンビン切断に
より短くすることのできるＦXIIIa をＥ．ｃｏｌｉ中に
おいて発現する試みがなされた。高い収率を得るため
に、クロ―ニングは短くされたＦXIIIa がＥ．ｃｏｌｉ
β‐ガラクトシダ―ゼ断片に融合したハイブリッド蛋白
質の形態で発現されるように行なわれた。ｐＦXIII−１
３からの約２７００ｂｐの大きさのＳｍａＩ‐Ｈｉｎｄ
III 断片を単離し、ＳｍａＩ及びＨｉｎｄIII で加水分
解されたｐＢＤ２ＩＣ２０Ｈ中に連結した。新たなプラ
スミドｐＭＢ２５９（図５）において、アミノ酸Ｐｒｏ
₃₇からＭｅｔ₇₃₂ のＦXIIIa に対するｃＤＮＡはβ‐ガ
ラクトシダ―ゼの３７５のアミノ末端アミノ酸に該当す
る読取枠内に位置し、それは合成された融合蛋白質から
トロンビン切断により活性ＦXIIIa を得ることが可能で
あるようにトロンビン切断部位Ａｒｇ₃₈／Ｇｌｙ₃₉を有
する。発現ベクタ―ｐＢＤ２ＩＣ２ＯＨはｌａｃプロモ
―タ―を有するｐＢＤ２〔ブロ―カ―（Broker）ジ―ン
・アナリティカル・テクノロジ―（Gene Anal.Techn.)3
(1986)53-57 〕中にＢａｍＨＩ‐ＨｉｎｄIII 断片とし
てプラスミドｐＩＣ２０Ｈ（マ―シュ等、上掲）の５８
ｂｐよりなるポリリンカ―領域を連結することにより構
成された。 b)発 現 ｐＦXIII−１３、ｐＦXIII−Ｃ４或いはｐＭＢ２５９で
形質転換された菌株Ｄ２９Ａ１のＥ．ｃｏｌｉ細胞は期
待されたＦXIIIa 蛋白質を合成する能力があることが判
明した。プラスミドｐＦXIII−１３、ｐＭＢ２５９及び
ｐＦXIII−Ｃ４によるＦXIIIの発現はＩＰＴＧを用いて
誘発することができる。ク―マシ―ブル―（Coomassie
blue）で染色されたＰＡＡゲル上のＥ．ｃｏｌｉ Ｄ２
９Ａ１（ｐＦXIII−１３）及びＤ２９Ａ１（ｐＦXIII−
Ｃ４）のＩＰＴＧ誘発後の蛋白質抽出物の比較はＦXIII
融合蛋白質の期待された分子量を示した。「４４ａａＦ
XIII融合蛋白質」の推定発現率は「２２ａａＦXIII融合
蛋白質」のそれの約５倍である。又、ｐＦXIII−１３及
びｐＦXIII−Ｃ４により特定されるＦXIIIa 分子は生物
学的活性を有することが判明した。これに対して、Ｅ．
ｃｏｌｉ Ｄ２９Ａ１対照例の抽出物中にはＦXIII活性
は見出されなかった。クロット安定性アッセイ〔カルギ
ス、ベルクマイヤ―の酵素分析法第５巻酵素３：ペプチ
ダ―ゼ、プロティナ―ゼ及びそれらの阻害剤、４００−
４１０頁（Karges,in Bergmeier,Methods of Enzymatic
Analysis,Volume 5, Enzymes 3:Peptidases,Proteinas
eand their Inhibitors,page 400-410)所収〕において
見出された活性はＥ．ｃｏｌｉ Ｄ２９Ａ１（ｐＦXIII
−１３）に対してはＥ．ｃｏｌｉ培養液（ＯＤ₂₅₀ ＝
１．５）に基づいて５μｇ／ｌであり、Ｄ２９Ａ１（ｐ
ＦXIII−Ｃ４）に対しては１５μｇ／ｌである。ＦXIII
a ‐特異的ＥＬＩＳＡにおいて見出された因子XIIIの量
はｐＦXIII−１３に対してはＥ．ｃｏｌｉ培養液に基づ
いて１．５mg／ｌであり、ｐＦXIII−Ｃ４に対しては３
５mg／ｌである。生物学的アッセイ及びＥＬＩＳＡにお
いて測定されたＦXIIIの量の間の食い違いは、Ｅ．ｃｏ
ｌｉ細胞中のＦXIIIの主たる部分（＞９０％）が生物学
的に不活性であり７Ｍ尿素のみに溶解する不溶性沈澱の
形態であるという事実に由来するものである。Ｅ．ｃｏ
ｌｉ抽出液中に存在するＦXIII分子の可溶性画分はオ―
クタロニ―試験〔Ouchterlony 、プログレス・イン・ア
ラ―ジ―（Progr.Allergy)5(1958)1〕において胎盤から
単離されたＦXIIIのそれに実質的に同一である沈澱曲線
を示す。不溶性蛋白質凝集物の形態でのＥ．ｃｏｌｉ内
の真核生物蛋白質の発現は数個の蛋白質について既に説
明されている。これらの蛋白質はその様な凝集物からカ
オトロピック剤を用いて溶出することができ、適当再変
成条件によりそれらの生物学的に活性形態に転換するこ
とができる。

【００２０】４．ＦXIIIの酵母における発現 酵母から遺伝子操作により得られる生物学的に活性なＦ
XIIIの合成はＦXIIIをコ―ドするｃＤＮＡを酵母内にお
いて自律的に複製する能力を有する発現ベクタ―中に導
入することにより達成された。組換えクロ―ンの抽出物
からＦXIII‐活性蛋白質を単離することが可能であっ
た。酵母を生育する条件及び分子生物学的方法は、ディ
ロン等〔Dillon et al.「組換えＤＮＡ方法」（Recombi
nant DNA Methodology). John Wiley &Sons,NewYork(19
85）〕及びマニアティス等（Maniatis et al. 上掲）に
説明されている。ＦXIIIｃＤＮＡは約２７００ｂｐの大
きさの ＨｉｎｄIII 断片としてベクタ―ｐＦXIII−１
３から単離され、ベクタ―ｐＡＡＨ５〔アメラ―（Amme
rer)、メソッド・オブ・エンザイモロジ―（Meth.Enzym
ol.)101(1983)192-201〕のＨｉｎｄIII 部位中にクロ―
ン化された。即ち、得られたプラスミドｐＨＢ２４０
（図６）中のＦXIIIｃＤＮＡはアルコ―ルデヒドロゲナ
―ゼの遺伝子発現信号を含有する強ＡＤＨＩプロモ―タ
の制御下にある。このプラスミドｐＭＢ２４０をパン酵
母、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cere
visiae) 、株Ｌｅｕ２−３、Ｐｅｐ４−３中にイトウ等
〔Itoh et al. ジャ―ナル・オブ・バクテリオロジ―
（J.Bacteriol.)153(1983). 163-168 〕の方法により形
質転換し、及びＬｅｕ⁺ 形質転換体をＹＮＢ最小培地上
で選択した。形質酵母細胞の一つのコロニ―を用いてＹ
ＮＢ培地を有する液体培養液に接種した。３０℃で２日
間生育後複合ＹＰＢ培地中への転移を行ない、及び更に
３日後細胞を遠心分離により取出し、１００ｍＭクエン
酸ナトリウムを含有する等張塩溶液（ｐＨ７．２）中で
ガラスビ―ズミルにより破壊した。細胞抽出物をSorval
l 高速遠心分離器内のＳＳ３４ロ―タ―内で２０，００
０rpm において４℃で１時間高速遠心分離にかけた。
Ｓ．セレビシエ（ｐＭＢ２４０）の細胞を除去した上澄
液をウェスタンブロット法により分析した。胎盤からの
ＦXIIIと同一位置に検出することのできるバンドに加え
て、約１１６，０００Ｄの蛋白質が用いられた抗‐ＦXI
II血清と特異的に反応した。これは酵母中に形成された
ＦXIIIの一部がグリゴシル化されたことを証明する。蛋
白質のグリコシル化はしばしば蛋白質、特に血漿蛋白
質、の半減期を延長する因子である。加えて、蛋白質の
側鎖は血漿蛋白質例えばアンチトロンビンIII の活性を
増大するか或いは作用の期間を延長することがある。酵
母において発現され、且つ胎盤から得られたＦXIIIとは
対照的にグリコシル化されているか或いはその他の何等
かの形で翻訳後修飾を行なったＦXIIIは、増大した活性
のために胎盤からのＦXIIIに対して利点を有し得る。細
胞を除去した上澄液をＥＬＩＳＡによりＦXIIIについて
調べ、ＦXIII濃度が酵母培養液に基づき１５０ｎｇ／ml
であることが判明した。ＦXIIIの生物学的活性は上掲の
カルゲスの方法により求められ、ＥＬＩＳＡにおいて測
定された濃度を確認した。パン酵母から得られたＦXIII
の生物学的活性は抗‐ＦXIII抗体により特異的に阻害す
ることができたので、非‐特異的ＦXIII様活性を酵母蛋
白質により除外することが可能であった。

【００２１】５．ＦXIIIa の動物細胞における発現 a)動物細胞のための発現ベクタ―の構成 発現ベクタ―ｐＳＶＡ ＳＴＯＰ１は西独特許出願Ｐ３
６ ２４ ４５３・８（このベクタ―の合成に関するこ
の出願の実施例１は抜粋して付表に再現した）に提案さ
れている。このプラスミドの他に動物細胞におけるＦXI
IIa の発現のためにベクタ―ｐＺＥＴ４（下記参照）及
びドロソフィラ（Drosophila）熱衝撃蛋白質７０プロモ
―タ〔ウルム等（Wurm et al.)、Proc.Natl.Acad. Sci.
USA 83(1986)5414-5418 〕を有するｐＳＰ６ＨＳ９を
用いた。ｐＺＥＴ４（図７）：プラスミドｐＳＶＡ Ｓ
ＴＯＰ１をＢａｍＨＩで切断し、２．６ｋｂの大きさで
ＳＶ４０初期プロモ―タ―を有するベクタ―断片を単離
した。ｐＳＶ２ｄｈｆｒ（リ―等（Lee et al.) 、ネ―
チャ―（Nature)294(1981)228-232 〕からの０．８５ｋ
ｂの大きさのＢｇｌII‐ＢａｍＨＩ断片をこの様にして
予備処理されたベクタ―中に連結し、その結果プラスミ
ドｐＺＥＴ４が得られた。ｐＳＶ２ｄｈｆｒからの０．
８５ｋｂ断片上にはエキソン‐イントロン連結からのｍ
ＲＮＡスプライス部位及びＳＶ４０ ＤＮＡからのｔ抗
原に対する遺伝子のポリアデニル化部位が位置してい
る。 b)動物細胞のためのＦXIIIa 発現ベクタ―の構築 ｐＳＶＦ１３（図８）：発現ベクタ―ｐＳＶＡ ＳＴＯ
Ｐ１をＨｉｎｄIII 及びＸｂａＩで切断した。約２．７
ｋｂの大きさのＦXIIIa ｃＤＮＡを有するｐＦXIII−１
３からのＨｉｎｄIII ‐ＸｂａＩ断片をこの様にして処
理されたベクタ―中に連結した。ｐＳＶＦ１３上のＦXI
IIa 転写単位はｍＲＮＡスプライス部位を有しない。ｐ
ＺＦ１３（図９）：約２．７ｋｂの大きさのＦXIIIa ｃ
ＤＮＡを有するＨｉｎｄIII 断片をプラスミドｐＦXIII
−１３から単離した。得られた５′突出末端を相補鎖内
にＤＮＡポリメラ―ゼＩ（クレノウ断片）で埋填するこ
とにより除去した。発現ベクタ―ｐＺＥＴ４を独特のＸ
ｂａＩ部位において切断することにより線型化した。得
られた５′突出末端を同様に相補鎖内においてＤＮＡポ
リメラ―ゼＩ（クレノウ断片）により埋填することによ
り除去した。この埋填ベクタ―と内充填ＦXIIIa ｃＤＮ
Ａ断片の連結の結果、ＦXIIIa 発現プラスミドｐＺＦ１
３が得られた。ｐＳＶＦ１３におけると同様に、ＦXIII
a ｃＤＮＡはＳＶ４０初期プロモ―タの転写制御下にあ
るが、しかし、ｍＲＮＡスプライス部位を備えている。
ｐＨＳＦ１３（図１０）：プラスミドｐＳＶＦ１３をＥ
ｃｏＲＩにより部分的に消化し、約２．９ｋｂの大きさ
のＦXIIIa ｃＤＮＡに引続き初期転写のためのＳＶ４０
ポリアデニル化部位を有する断片を単離した。この断片
を熱衝撃蛋白質７０プロモ―タの下流のプラスミドｐＳ
Ｐ６ＨＳ９の独特のＥｃｏＲＩ部位中に連結した。_{c)ＣＨＯ（支那ハムスタ―卵巣）ｄｈｆｒ} -
_{細胞の共トランスフェクションのた}

めのＤＨＦＲ発現ベクタ― ＤＨＦＲベクタ―ｐＳＶ２ｄｈｆｒ（リ―等、上掲）或
いはプロモ―タのないＤＨＦＲプラスミドｐＳＶＯＡｄ
ｈｆｒ（西独特許出願Ｐ３６ ２４４５３．８、参考例
参照）をＣＨＯ ｄｈｆｒ^- 細胞における説明されたＦ
XIIIa 発現ベクタ―による共トランスフェクションに用
いた。両ベクタ―共、マウスからのＤＨＦＲｃＤＮＡを
有する。 d)ＢＨＫ（ベビ―ハムスタ―腎臓）細胞の共トランスフ
ェクションのためのＧ４１８耐性を与えるベクタ― 説明されたＦXIIIa 発現ベクタ―をＢＨＫ細胞内でベク
タ―ｐＲＭＨ１４０〔フジャック等（Hudziak et al.)c
ell 31(1982).137-146〕で共トランスフェクションを行
なった。 e)ＣＨＯ細胞内におけるＦXIIIa の発現 プラスミドｐＺＦ１３とＤＨＦＲベクタ―ｐＳＶ２ｄｈ
ｆｒの組み合わせ及び発現プラスミドｐＳＶＦ１３とＤ
ＨＦＲベクタ―ｐＳＶＯＡｄｈｆｒの組み合わせによる
共トランスフェクションを、リン酸カルシウム沈澱法
〔グレアム及びファンデルＥｂ（Grahamandvan der Eb
）、ウイロロジ―（Virology)52 (1973 ）456-467 〕
を用いてＣＨＯ ｄｈｆｒ^- 細胞で行なった。これは５
μｇのＤＨＦＲベクタ―（ｐＳＶ２ｄｈｆｒ或いはｐＳ
ＶＯＡｄｈｆｒ）と混合され、及び共沈された２０μｇ
の特定の ＦXIIIa 発現プラスミド（ｐＺＦ１３或いは
ｐＳＶＦ１３）を伴うものであった。この共沈澱物を上
記トランスフェクションに用いた（２５cm² 培養瓶中
０．５×１０^６細胞）。３日後、細胞をトリプシン化
し、３個の６０mmのペトリ皿に移し、選択培地（グリシ
ン、ヒポキサンチン或いはチミジンを含有しない）と混
合した。これらの条件下に生残る細胞はＤＨＦＲ遺伝子
と安定なトランスフェクションを行なったもののみであ
る。トランスフェクトされた細胞のコロニ―は１−３週
間後にペトリ皿上に目に見えるようになる。この方法に
より次のトランスフェクション速度が達成された： ｐＳＶ２ｄｈｆｒ ５×１０^-5／プレ―ト ｐＳＶＯＡｄｈｆｒ １×１０^-5／プレ―ト。 個々のクロ―ンを単離し、グリシン、ヒポキサンチン或
いはチミジンを含有しない培地内で増殖した。約３ｎｇ
／mlの検出下限を有する特別のＥＬＩＳＡを用いて個々
のクロ―ンの培養上澄液及び細胞溶解物中のＦXIIIa を
検出した。培養上澄液はＥＬＩＳＡにおいてそのまま使
用した。細胞溶解物は次のようにして調製した：２５cm
² 培養瓶中の集密細胞を４０ｍＭ ｔｒｉｓ ＨＣｌ
（ｐＨ７．４）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ中で２回洗浄し、１５０μｌの０．２５Ｍ ｔｒｉ
ｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、５ｍＭ ＤＴＴ、２％グリ
セロ―ル、０．２％洗剤（Triton x 100) 中にとり、及
び３回冷凍及び解凍することにより溶解した。細胞の不
溶性成分は遠心分離により除去した。この溶解物をＥＬ
ＩＳＡに使用するために１：２．５に稀釈した。説明さ
れた検出方法をプラスミドｐＺＦ１３／ｐＳＶ２ｄｈｆ
ｒの組合わせに対して１７クロ―ンに適用して、ＦXIII
a を発現する一つのクロ―ン（ＣＨＯ５９−５−Ｃ７）
が見出された。プラスミドｐＳＶＦ１３／ｐＳＶＯＡｄ
ｈｆｒで共トランスフェクション及び１２クロ―ンの分
析後、更にＦXIIIa ‐発現クロ―ン（ＣＨＯ６０−３−
Ｃ１）が検出された。これらの両者の陽性クロ―ンを用
いて培地内及び溶解物中において同一の相対的量でＦXI
IIa を検出することが可能であった。ＦXIIIa を生成す
る系統の発現速度を定量的に求めるために次の標準的操
作を行なった：０．５×１０^６個の細胞を２５cm² 培養
瓶内の５mlの培地中で培養した。この培地は２４時間後
交換した（５ml）。更に２４時間後培地を除去し、細胞
カウント数を求め溶解物を調製した。以後に述べる全て
の発現速度（ｎｇ／１０^６細胞／２４時間）に対して試
験の終りにおける２５cm² 瓶当りの細胞カウント数は１
±０．２５×１０^６細胞数であった。次の表は、説明さ
れた方法で試験された基本クロ―ンの発現速度を示す： 細 胞 外 細 胞 内 （ng／10⁶ 細胞／24時間） （ng／10⁶ 細胞／24時間） CHO59-5-C7 １２ ９ CHO60-3-C1 １７ １３ ＳＤＳ電気泳動に続いてクロ―ンＣＨＯ５９−５−Ｃ７
及びクロ―ンＣＨＯ６０−３−Ｃ１の溶解物及び上澄液
のＦXIIIa ‐特異的免疫ブロッティングを行なったとこ
ろ、いずれの場合にもヒト胎盤から単離された蛋白質の
分子量を有する一つのバンドが反応を示した。クロ―ン
ＣＨＯ５９−５−Ｃ７を遺伝子増幅のためにメトトレキ
セ―ト（Ｍｔｘ）の増大する濃度に曝した。１０ｎＭ
Ｍｔｘの濃度及び４移動適応時間で出発し、培地中のＭ
ｔｘ濃度を５０ｎＭに増大した。次の発現速度が標準的
操作において求められた： Ｍｔｘ（nM） 細 胞 外 細 胞 内 （ng／10⁶ 細胞／24時間） （ng／10⁶ 細胞／24時間） ０ １２ ９ １０ １９ １６ ５０ ３８ ６６ f)ＢＨＫ細胞におけるＦXIIIa の発現 各々２０μｇのＦXIIIa 発現プラスミドｐＺＦ１３、ｐ
ＳＶＦ１３及びｐＨＳＦ１３をＢＨＫ細胞内において例
５e)において説明されるリン酸カルシウム沈澱法により
５μｇのＧ４１８耐性をコ―ドするプラスミドｐＲＭＨ
１４０で共トランスフェクションを行なった。３日後、
細胞をトリプシン化し、３個の６０mmペトリ皿に移し、
及び４００μｇ／mlのＧ４１８を含有する選択培地と混
合した。１２日後約２００−３００のＧ４１８耐性コロ
ニ―が各ペトリ皿に生育していた。全部のクロ―ンをト
リプシン化し、２５cm² 培養瓶中の合一したクロ―ン
（ＣＣ）（５mlの培地）として転移させた。ｐＺＦ１３
及びｐＳＶＦ１３でトランスフェクションされた細胞の
場合には、８０−１００％の集密度に到達した際にＦXI
IIa を特異的ＥＬＩＳＡを用いて培地中及び関連溶解物
中で決定した（例５e)参照）。ｐＨＳＦ１３でトランス
フェクションされ同様に８０−１００％の集密度に到達
した合一したクロ―ンを４２℃に予備加熱した新たな培
地と混合し、４２℃で１時間インキュベ―トした。培地
をもう１回３７℃で平衡化された新鮮な培地と交換した
後、細胞を３７℃で２４時間維持した。これらの培地及
び溶解物を次いで上記の如くそれらのＦXIIIa の含量に
ついて調べた。下記表は各種合一クロ―ンに対するＦXI
IIa の細胞分布をまとめて示すものである。 培地内に存在するＦXIIIa に関する発現速度は例５e)に
おいて説明した標準的操作により個々の合一クロ―ンに
対して求めた。以下に述べる全ての発現速度（ｎｇ／１
０^６細胞／２４時間）に対して試験の終りにおける２５
cm² 瓶当りの細胞カウント数は４．５±０．５×１０^６
細胞であった。 これまでに説明されたトランスフェクションされたＢＨ
Ｋ系統は生産しない或いはそれらの発現速度が異なる細
胞を含む混合物であったので、引続いてクロ―ンを単離
することにより高発現速度を有する遺伝的に均一な細胞
系統を単離する試みがなされた。この目的のためには、
特別の合一されたクロ―ンからの細胞を１細胞／ウェ
ル、２細胞／ウェル又は４細胞／ウェルの濃度でマイク
ロタイタ―プレ―ト上に置いた。１個のみのクロ―ンが
生育したウェルからの上澄液をＦXIIIa ‐特異的ＥＬＩ
ＳＡにより分析した。最高発現速度のクロ―ンを２５cm
² 培養瓶内で増殖させ、それらの発現速度を上記一般的
操作により検討した。以下の表はＢＨＫ−ＭＫ１（ｐＺ
Ｆ１３）を上記方法により単離することにより得られた
クロ―ンの発現速度を示す。 ＢＨＫ細胞系統ＭＫ１−Ｅ２を例にとり、これらの細胞
により合成されたＦXIIIa 分子が生物学的活性を有する
ことも示された。用いられたＢＨＫＭＫ１−Ｅ２系統及
び非‐トランスフェクテッドＢＨＫ系統（陰性対照例）
を１．５mlの２％グリセロ―ルを含有する０．２５Ｍ
ｔｒｉｓ．ＨＣｌ（ｐＨ７．８）にとった。これらの細
胞を３回冷凍及び解凍することにより溶解した後、Ｄｏ
ｕｎｃｅホモジナイザ―内で処理した。不溶性構成成分
を遠心分離により除去後、溶解物を生物学的活性に用い
た（例３参照）。次のＦXIIIa 活性が見出された： ＢＨＫ ＭＫ１−Ｅ２ ０．０６単位／１０^８細胞 ＢＨＫ（トランスフェ ０単位／１０^８細胞クションさ
れない） 第２表

【表１】 第３表

【表２】

【表３】

【表４】

【表５】

【表６】 第４表

【表７】

【００２２】参考例 独国特許出願Ｐ３６ ２４・４５３．８からの例１ a)動物細胞のための発現ベクタ―の構成 プラスミドｐＳＶ２ｄｈｆｒ（リ―等、上掲）をＨｉｎ
ｄIII 及びＥｃｏＲＩで切断し、ＳＶ４０初期プロモ―
タを有する２．６５ｋｂベクタ―断片を単離した。ｐＵ
Ｃ１２ＳＴＯＰ〔ブロ―カ―及びアマン（Broker and A
mann）、アプライド・マイクロバイオロジカル・バイオ
テクノロジ―（Appl.Microbiol.Biotechnol.)23(1986)2
49-296〕からの６７ｂｐ ＨｉｎｄIII ‐ＥｃｏＲＩ断
片をこの様にして予備処理されたベクタ―中に連結し、
その結果プラスミドｐＳＶ２ＳＴＯＰを得た。ｐＵＣ１
２ＳＴＯＰからの６７ｂｐ断片上には全ての三つの読取
枠内に翻訳停止コドンがある。ｐＳＶ２ＳＴＯＰをＳａ
ｃＩで線型化し、得られた３′突出末端をＤＮＡポリメ
ラ―ゼＩの３′→５′エキソヌクレア―ゼ活性を用いて
除去した。次いでＥｃｏＲＩによる消化を行なった。初
期のトランスクリプトに対するＳＶ４０ポリアデニル化
信号を有するｐＢＢ３〔Ｂ．ブラショト等（B.Bouracho
t et al.)、エンボ・ジャ―ナル（EMBO J.)1(1982)895
-900〕からの１３３ｂｐの大きさのＥｃｏＲＩ‐Ｈｐａ
Ｉ断片と連結後、発現ベクタ―ｐＳＶＡ ＳＴＯＰ１を
得ることが可能であった。このポリアデニル化部位は又
ベクタ―ｐＩＧ６（ブラコット等、上掲）からも単離す
ることができる。全く同一の方法によりＳＶ４０遺伝子
から１３３ｂｐＢａｍＨＩ‐ＨｐａＩ断片を単離し、Ｂ
ａｍＨＩ切断部位に埋填し、及びＥｃｏＲＩリンカ―を
付着することが可能である。ｐＳＶＡ ＳＴＯＰ１はこ
の様にＳＶ４０初期プロモ―タと初期のトランスクリプ
トに対してＳＶ４０ポリアデニル化信号の間に３個の独
特の制限部位（ＨｉｎｄIII ‐ＳａｌＩ‐ＸｂａＩ）を
有するクロ―ニングポリリンカ―及び全ての三つの読取
枠内に翻訳停止を有する配列を有する。 c)共トランスフェクションのためのＤＨＦＲ発現ベクタ
―の構成 共トランスフェクションに用いられるＤＨＦＲベクタ―
の出発点はプラスミドｐＭＴＶｄｈｆｒであった（リ―
等、上掲）。ｐＭＴＶｄｈｆｒはＢｇｌIIで切断し、Ｄ
ＮＡの突出５′末端をＤＮＡポリメラ―ゼＩ（クレノウ
断片）を用いて埋填した。ＥｃｏＲＩで消化後、４．４
７ｋｂの大きさの断片を単離し、ｐＢＢ３（ブラコット
等、上掲）からの１３３ｂｐＥｃｏＲＩ‐ＨｐａＩ断片
と連結させた。この新しいプラスミドｐＭＴＶＡｄｈｆ
ｒはＭＭＴＶ‐ＬＴＲ及び初期のトランスクリプトのた
めのＳＶ４０ポリアデニル化部位を側面に配置されたマ
ウスＤＨＦＲｃＤＮＡを有する。ｐＳＶＯＡｄｈｆｒは
大きさが１４５０ｂｐでＭＭＴＶ‐ＬＴＲを有するＨｉ
ｎｄIII 断片を削除することによりｐＭＴＶＡｄｈｆｒ
から得られた。ｐＭＴＶＡｄｈｆｒ或いはｐＳＶＯＡｄ
ｈｆｒはいづれもｍＲＮＡスプライス部位を有しない。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＦXIIIa をコ―ドするｃＤＮＡ（コ―ド化領域
を斜線で示す）及びこの下に単離及び特性付けられたク
ロ―ンのＤＮＡ領域を示す説明図である。

【図２】発現プラスミドｐＦXIII−１３の構成を示す説
明図である。明らかにするために、この図においては出
発プラスミドｐＩＣ１９Ｈ−１２．１及びｐＩＣ１９Ｈ
−１１．１並びにそれらの直下に位置するＤＮＡ断片は
一本鎖断片から構成された生成物ｐＦXIII−１３と同様
に二重線で表わされる。

【図３】プラスミドｐＴｒｃ９７Ａの構築を示す説明図
である。

【図４】ｐＴｒｃ９７Ａ及びｐＦXIII−１３からのｐＦ
XIII−Ｃ４の構築を示す説明図である。

【図５】ｐＦXIII−１３及び公知のプラスミドｐＩＣ２
０Ｈ及びｐＢＤ２からのｐＭＢ２５９の構築を示す説明
図である。

【図６】ｐＦXIII−１３及び公知のプラスミドｐＡＡＨ
５からのプラスミドｐＭＢ２４０の構築を示す説明図で
ある。

【図７】公知のプラスミドｐＳＶ２ｄｈｆｒ及びプラス
ミドｐＳＶＡ ＳＴＯＰ１からのｐＺＥＴ４の構築を示
す説明図である。

【図８】ｐＳＶＡＳＴＯＰ１及びｐＦXIII−１３からの
ｐＳＶＦ１３の構築を示す説明図である。

【図９】ｐＺＥＴ４及びｐＦXIII−１３からのｐＺＦ１
３の構築を示す説明図である。

【図１０】ｐＳＶＦ１３及び公知のプラスミドＳＰ６Ｈ
６９からのｐＨＳＦ１３の構築を示す説明図である。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】下記で表わされるヒト血液凝固因子ＸＩＩ
   Ｉａのアミノ酸配列をコードするＤＮＡを含有するベク
   ターによって細胞を形質転換し、該形質転換細胞により
   上記ＤＮＡを発現させることを特徴とする、ヒト血液凝
   固因子ＸＩＩＩａの製造法。 【化１】 【化２】 【化３】 【化４】
2. 【請求項２】ＤＮＡが下記の配列を有することを特徴と
   する、請求項１記載の製造法。 【化５】 【化６】 【化７】 【化８】