FI107939B - Kluyveromyces isäntäkantana - Google Patents

Kluyveromyces isäntäkantana Download PDF

Info

Publication number
FI107939B
FI107939B FI883540A FI883540A FI107939B FI 107939 B FI107939 B FI 107939B FI 883540 A FI883540 A FI 883540A FI 883540 A FI883540 A FI 883540A FI 107939 B FI107939 B FI 107939B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
sequence
host cell
dna
gene
desired polypeptide
Prior art date
Application number
FI883540A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI883540A0 (fi
FI883540A (fi
Inventor
Den Berg Johannes A Van
Krijn Rietveld
Ooyen Albert J J Van
Original Assignee
Dsm Nv
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=22144683&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=FI107939(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from US07/078,539 external-priority patent/US4943529A/en
Application filed by Dsm Nv filed Critical Dsm Nv
Publication of FI883540A0 publication Critical patent/FI883540A0/fi
Publication of FI883540A publication Critical patent/FI883540A/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI107939B publication Critical patent/FI107939B/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2411—Amylases
    • C12N9/2428—Glucan 1,4-alpha-glucosidase (3.2.1.3), i.e. glucoamylase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/76—Albumins
    • C07K14/765—Serum albumin, e.g. HSA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C12N15/625—DNA sequences coding for fusion proteins containing a sequence coding for a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6456—Plasminogen activators
    • C12N9/6459—Plasminogen activators t-plasminogen activator (3.4.21.68), i.e. tPA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6478—Aspartic endopeptidases (3.4.23)
    • C12N9/6481—Pepsins (3.4.23.1; 3.4.23.2; 3.4.23.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01003—Glucan 1,4-alpha-glucosidase (3.2.1.3), i.e. glucoamylase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01108—Lactase (3.2.1.108)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21069—Protein C activated (3.4.21.69)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/036—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif targeting to the medium outside of the cell, e.g. type III secretion

Description

107939
Kluyver omyce s isäntäkantana - Kluyveromyces säsom värdstam
Keksintö koskee Kluyveromyces-hiivan valmistamista ja käyttöä haluttujen polypeptidien tuottamiseen mielellään siten, että ne erittyvät kasvualustaan. Keksintöä valaistaan esimerkkisekvensseillä, joita voidaan käyttää kymosiinin ja sen prekursorien, plasminogeenin kudosakti-vaattorin (t-PA) ja ihmisen seerumialbumiinin (HSA) tuottamiseen Kluyveromyces-hiivassa.
Monet seikat ovat sumentaneet sitä lupaavaa mahdollisuutta, joka liittyy peptidien tuottamiseen mikro-organismeilla. Useissa tapauksissa, kun on tuotettu peptidiä ja se on jäänyt sytoplasmaan, on tuloksena ollut sulkeuma-proteiineja, jotka vaativat proteiinin denaturointia ja renaturointia, jolloin tulos on usein ollut vain osittain tai vähäisessä määrin onnistunut. Joskus taas peptidi on hajonnut osittain niin, että saannot ovat jääneet pieniksi ja on saa.tumonimutkaisia seoksia, joiden erottami-nen on vaikeata. Mahdollisena ratkaisuna näihin ongelmiin on tutkittu sitä, että haluttu peptidi saataisiin eritty- j”·. mään ravinnealustaan. Erittymisen aikaansaaminen on onnis- » « · *!*.* tunut vain jossain määrin, koska on käynyt niin, että ·. ; kaikki proteiinit eivät ole voineet erittyä käytetyssä • · · '·*♦' isännässä. Vaikka peptidi erittyisikin, saattaa pepti- din prosessoituminen johtaa tuotteeseen, joka koostumukseltaan ja/tai konformaatioltaan eroaa halutusta peptidistä. Näin ollen on olemassa suurta mielenkiintoa sellaisten systeemien kehittämistä kohtaan, joilla voitaisiin :Y: tuottaa aktiivisia peptidejä tehokkaasti ja taloudellises- .·.*. ti olosuhteissa, jotka mahdollistavat peptidien käytön • ; mitä erilaisimmissa tilanteissa sekä in vitro että in vivo.
’·**' Eurooppalaisessa patenttihakemuksessa (EPÄ) 0096430 selostetaan Kluyveromyces-hiivan käyttöä vierai- 2 107939 den geenien kloonauksessa ja ilmentämisessä. Mitään mainintaa ei kuitenkaan ole kyvystä saada proteiineja erittymään kasvualustaan.
Aspergillus-homeen amyloglukosidaasin johtosekvens-siä on selostettu julkaisuissa Boyle et ai., EMBO J. (1984) _3:1581-1585 ja Innis et ai., Science (1985) 228:21-26♦ Laktaasin promoottoreita on selostettu julkaisussa Bruenig et ai., Nucleic Acids Res. (1984) JL2:2327-2341. Patenttijulkaisussa EP-A-0123544 ja julkaisussa Smith et ai., Science (1985) 229:1219 on selostettu parittelutyyppiseen o<-tekijään ja invertaasi- ja happofosfataasientsyymiin liittyvien signaalipeptidien käyttöä heterologisten proteiinien erittämiseen Saccharomyces-hiivassa♦
Mellor et ai. (Gene (1983) 24:1-14) ovat tutkineet preprokymosiinin, prokymosiinin ja kymosiinin tuottamista
Saccharomyces-hiivassa. Kun prokymosiinia valmistuu
Saccharomyces-hiivassa solunsisäisesti, on vain pieni osuus saadusta prokymosiinista aktivoitavissa. Ks. Moir et ai., Developments in industrial Biology (1985) 26:75- 85; Mellor et ai,., Gene (1983) Z4:l-4; Kingsman et ai.
.···. teoksessa Biotechnology and Genetic Engineering Reviews • * ”1 Voi. 3 (1985) 376-418. Saccharomyces-hiivassa tuotettu !*; aggregoitunut prokymosiini vaati monimutkaisia denatu- rointi- ja renaturointimenetelmiä prokymosiinin liuotta-• ·' miseen. Ks. julkaisuja WO 83/04418 ja EP-A-0114506.
:.v Huomattakoon, että termit signaalisekvenssi (engl.
signal sequence) ja johtosekvenssi (engl. leader sequence), niinkuin niitä tässä selostuksessa on käytetty, ovat toistensa synonyymejä.
Esillä oleva keksintö tarjoaa peptidientuotantosys-.·.·. teemejä, jotka käsittävät Kluyveromyces-isäntäkannan ja ilmentämiskasetin, joka sisältää tehokkaasti toimivat transkriptionaloitusalueen ja transkriptionlopetusalueen Kluyveromyces-hiivassa käytettäviksi sekä geenin, joka mahdollisesti sisältää signaalisekvenssin erittymistä varten, säätelyalueiden transkriptionaalisessa ja luennal-lisessa säätelyssä. Kulloinenkin kasetti sijoitetaan • ♦ 3 107939
Kluyveromyces-isäntäkantaan sellaisia olosuhteita käyttäen, että ilm artämiskasetti säilyy aikaansaadussa transforman-tissa stabiilisti. Haluttujen peptidien tuottamiseen voidaan käyttää luonnosta peräisin olevaa DNA:ta tai synteettistä geeniä.
Kuva 1 on kaavioesitys plasmidista pGBTe418.
Kuva 2 on kaavioesitys plasmidista pGB901.
Kuva 3 esittää signaalisekvenssin syntetisoituja oligonukleotideja, jotka on sopeutettu., amyloglukosidaa-sin signaalisekvenssin mukaan.
Kuva 4 esittää synteettistä signaalisekvenssiä.
Kuva 5 esittää immunoblottaustulosta, josta ilmenee K. lactiksen prokymosiinineritys.
Kuva 6 esittää plasmidin pDMIOOPC koko BamHI-liitän-näistä, joka kattaa cerevisiaen teki jän ja prokymosii- nin muodostaman fuusioproteiinin ja transkriptionsäätely-alueet.
Kuva 7 esittää plasmidin pKS105 restriktiokarttaa.
Kuva 8 esittää strategiaa, jonka avulla suunniteltiin K. lactiksen -tekijän DNA:n tunnistamiseen käytetyt oligo-: nukleotidikoettimet.
··· Kuva 9 esittää K_;_ lactiksen 0(-tekijää koodittavan • · « · : .·. DNA-fragmentin täydellistä sekvenssiä.
:v. Kuva 10 esittää plasmideja, joita käytettiin öc-teki- jän signaalisekvenssin ja prokymosiinin rakennegeenin • · · !! fuusion ilmentämiseen.
• « · '·’·* Kuva 11 esittää ^-tekijä/prokymosiinifuusioiden liitoskohtien sekvenssejä.
Kuva 12 esittää plasmidin pAB309 BamHI/Sali-liitännäisen sekvenssiä.
:V: Kuva 13 esittää K.lactiksent<-tekijän johto-DNA:n mutatoinnissa käytettyjä alukkeita.
’ ! Kuva 14 on kaavioesitys plasmidista pUCG418.
Kuva 15 on kaavioesitys plasmidista pGBtPAl.
*φ [ Kuva 16 esittää lactiksen aikaansaamaa ihmisen t-PA:n erittymistä, kun analysointi on suoritettu SDS- • · « * • · · • · ♦ 4 107939 polyakryyliamidigeelillä, joka on peitetty plasminogee'ni/fib-riiniagaroosigeelillä.
Kuva 17 on kaavioesitys plasmidista pGBtPA2.
Kuva 18 on kaavioesitys plasmidista pGBHSA3.
Kuva 19 esittää K;_ lactiksen aikaansaamaa HSA: n erittymistä,, kun analysointi on suoritettu 10-prosentti-sessa polyakryyliamidigeelissä.
Esillä oleva keksintö tarjoaa ilmentämiskasetteja, jotka sallivat polypeptidien tehokkaan ja taloudellisen tuottamisen Kluyveromyces-hiivasoluilla, Ilmentämiskasetit sisältävät transkription- ja luennansäätelysekvenssit, jotka toimivat Kluyveromyces-isäntäsolussa, sekä avoimen lukuvaiheistuksen, joka koodittaa haluttua peptidiä, transkription- ja luennansäätelysekvenssien ohjauksessa. Avoin lukuvaiheistus saattaa sisältää Kluyveromyces-isäntäkannan tunnistaman johtosekvenssin, joka saa aikaan polypeptidin erittymisen kasvualustaan. Käytetyt Kluyveromyces-solut voivat olla joko laboratorio- tai teollisuuskantoja.
Ilmentämiskasetti sisältää 5'-3'-transkriptiosuunnas-sa transkription- ja luennanaloitusalueen, avoimen luku-:*[[: vaiheistuksen, joka koodittaa haluttua peptidiä, ja jossa ♦♦♦ mielellään on Kluyveromyces-hiivan tunnistama signaalisek- • · · · : venssi erittymistä varten, ja luennanlopetusalueen. Ilmen- »·« « tämiskasetti sisältää vielä transkription lopetuksen • · säätelyalueen. Aloitusta ja lopetusta säätelevät alueet • · · ! ! ovat toimivia Kluyveromyces-hiivassa ja tekevät mahdolli- ** · seksi halutun peptidin tehokkaan ilmentymisen ilman Kluy- veromyces-isännän elinkykyyn ja proliferaatioon kohdistuvia ei-toivottuja vaikutuksia.
Transkription- ja luennanaloituksen säätelyalue '•/•S voi olla Kluyveromyces-hiivalle homologinen tai heterolo- ginen. Erityisen mielenkiintoisia tässä suhteessa ovat • · sellaisten geenien transkriptionanitusalueet, jotka ovat • · . läsnä Kluyveromyces-hiivassa tai muissa hiivalajeissa, *.) joista mainittakoon Saccharomyces, esimerkiksi cerevisiae,
Schizosaccharomyces, Candida, jne., tai muissa homeissa, • · • · · • »« • · 5 107939 joista mainittakoon rihmasienet Aspergillus, Neurospora, Penicillium, jne. Transkriptionaloituksen säätelyalue voidaan saada esimerkiksi glykolyyttisen reitin geenistä, joista mainittakoon alkoholidehydrogenaasi, glyseraldehydi-3- fosfaattidehydrogenaasi, fosfoglukoisomeraasi, fosfogly-seraattikinaasi jne., tai säädeltävästä geenistä, joista mainittakoon happofosfataasi, laktaasi, glukoamylaasi jne.
Mikä tahansa lukuisista säätelysekvensseistä saattaa olla edullinen jossakin tietyssä tilanteessa riippuen siitä, tarvitaanko konstitutiivinen vai indusoitavissa oleva transkriptio, promoottorin erityisestä tehokkuudesta kyseisen lukuvaiheistuksen yhteydessä, mahdollisuudesta liittää voimakas promoottori eri promoottorin säätelyalueeseen, joka mahdollistaa indusoitavan transkription, rakentamisen helppoudesta tai muusta sellaisesta. Näistä säätelyalueista löytyy runsaasti kirjallisuustietoja.
Ks. esimerkiksi patenttijulkaisua EP-A-0164566, joka sisällytetään tähän viitteeksi.
Heterologisten proteiinien erittyminen geneettisesti muunnetuista mikro-organismeista saadaan yleensä aikaan * ♦ *...* kahdesta menetelmästä jompaa kumpaa käyttäen. Ensimmäisessä on johtosekvenssi homologinen proteiinille ja toisessa ·,· | on johtosekvenssi homologinen isäntäorganismille. Muita vaihtoehtoja, jotka ovat erityisen mielenkiintoisia esillä olevan keksinnön kannalta heterologisten proteiinien • «
erittämiseksi Kluyveromyces-hiivasta, ovat sellaisen johto-sekvenssin käyttö, joka on heterologinen sekä Kluyveromyces-hiivalle että mielenkiinnon kohteena olevalle peptidille, tai synteettisen erityisesti suunnitellun johtosekvenssin käyttö. Ensinmainittua johtosekvenssiä koodittava DNA
• · · .*·*·’ voidaan saada eristämällä tai synteettisesti valmistamalla.
• · ·.·.· Näin ollen sisältää avoin lukuvaiheistus tavallisesti • · . villityyppisen tai mutatoidun geenin, jossa signaalisekvenssi on koodittavan sekvenssin muuhun osaan normaalisti liitty- • · ^ · · vä, tai kyseesssä on yhdistelmälukuvaiheistus tai kimeerinen • · · n · « · » • · · 6 107939 lukuvaiheistus, jossa signaalisekvenssi ei ole normaalisti avoimen lukuvaiheistuksen muuhun osaan liittyvä, tai kyseessä on synteettinen sekvenssi, jossa signaalisekvenssi ja avoimen lukuvaiheistuksen muu osa syntetisoidaan, jotta saadaan aikaan edulliset kodonit, edulliset restriktiokohdat, uusia aminohapposekvenssejä tms., tai kysesesä voi olla joku näiden mahdollisuuksien yhdistelmä. Käytettäviksi soveltuvat signaalisekvenssit voidaan saada geeneistä, kuten o(.-tekijän geenistä, invertaasin geenistä, amylogluko-sidaasin geenistä tai rakennegeeneissä läsnä olevista luontaisista tai villityyppisistä signaalisekvensseistä, jotka Kluyveromyces, Saccharomyces, muut sienet, esimerkiksi Neurospora ja Aspergillus, ja muut eukaryootit tunnistavat.
Erityisen mielenkiinnon kohteena on sellaisen signaa-lisekvenssin käyttö, joka mahdollistaa halutun peptidin erittymisen ravinnealustaan eikä periplasmiseen tilaan. Useimmiten on signaalisekvenssi avoimen lukuvaiheistuksen 5'-päässä. Joissakin tilanteissa saattaa kuitenkin olla toivottavaa, että signaalisekvenssi on avoimen lukuvaiheistuksen sisällä. Erittymisen aikaansaamiseen tarkoitettu-jen sisäisten signaalisekvenssien käytössä kehoitetaan • · · .·· tutustumaan USA:n patenttijulkaisuun no. 4 338 397 ja • · · · : .·. julkaisuun Perara ja Lingappa, J. Cell Biology (1985) :v. 101:2292-2301. Geenejä, joihin haluttu avoin lukuvai- • « I heistus voidaan sijoittaa ovat mm. voimakkaasti ilmentyvät *. ! konstitutiiviset geenit, kuten glykolyyttisen reitin ent- * * · *·*·* syymejä koodittavat geenit, ja voimakkaasti ilmentyvät säädeltävissä olevat geenit, kuten laktaasi, amylogluko-sidaasi tms.
Geenien optimaalisen imentymisen kannalta ovat ::: luennanaloituskodonia ATG ympäröivät nukleotidisekvenssit osoittautuneet tärkeiksi hiivasoluissa ja eläinsoluissa.
♦ « '1 Esimerkiksi M. Kozak (Microbiol. Revs. (1983) 47:1-45, on tutkinut laajasti näiden alueiden vaikutusta insulii- \ * nin ilmentymiseen COS-soluissa. Vastaavasti löytyy tietty- :***: jä nukleotideja useammin voimakkaasti ilmentyvistä hiivan • • · • · · • · ♦ • · 7 107939 proteiineista kuin muista, mikä viittaa siihen, että näillä nukleotideilla on tärkeä vaikutus näiden geenien ilmen-tymistasoon.
Eksogeenisten geenien optimaalisen ilmentymisen aikaansaamiseksi on tärkeätä muuntaa aloituskodonin ympärillä olevia nukleotidisekvenssejä. Tämä voidaan tehdä kohdemutatoinnilla tai liittämällä eksogeeninen geeni lukuvaiheistukseen endogeenisen Kluyveromyces-geenin kanssa, joka mielellään on voimakkaasti ilmentyvä geeni, kuten laktaasigeeni.
Tavallisesti on toivottavaa aikaansaada signaali-tai johtosekvenssin irtoaminen halutusta peptidistä erittymisen aikana eikä vasta erittymisen jälkeen, vaikka näillä kummallakin vaihtoehdolla voi olla käyttöä.Tavallisesti on käytetty prosessointisignaali signaalisekvens-sin kanssa luonnostaan esiintyvä prosessointisignaali tai kyseessä on prosessointisignaali, joka on muunnettu luonnostaan esiintyvästä, mutta joka edelleen toimii niin, että syntyy peptidisignaali ja tapahtuu signaalipeptidin ja prosessointisignaalipeptidin hydrolyyttinen lohkeaminen halutusta peptidistä. Erilaisia prosessointisignaaleja »·* on sekvenssoitu ja määritelty ja niistä mainittakoon <K~ : .·. tekijän prosessointisignaali.. (ks. esimerkiksi USA:n • · · *.IV patenttijulkaisu no. 4 546 081, joka sisällytetään tähän *. * viitteeksi), amyloglukosidaasin prosessointisignaali, • · · *·*·’ oC-amylaasin prosessointisignaali jne. Joissakin tapauk- *·*·* sissa voidaan käyttää muita peptidaasin tunnistamia sek venssejä, jotka saattavat vaatia myöhempää katkaisua, jotta haluttu peptidi saadaan eristetyksi. Näitä sekvenssejä ovat mm. kaksiemäksiset peptidit, esimerkiksi KR, (D) .K ja EA, joiden katkaisijoina toimivat vastaavasti KEX2, naudan enterokinaasi ja hiivan kalvopeptidaasi.
« · * ; Haluttu peptidi voi olla isännälle luontainen tai ’ heterologinen ja se voi olla johdettu prokaryoottisesta * * tai eukaryoottisesta lähteestä ja eukaryoottisia lähteitä • · ·*·*: saattavat olla homeet, alkueliöt, selkärankaiset, selkä- « ♦ .·.: rangattomat tms. Tuotetut peptidit voivat olla entsyy- * · 8 107939 mejä, joista mainittakoon laktaasi, cX-amylaasi, /0-amylaasi, amyloglukosidaasi, kymosiini jne., nisäkkäiden peptidejä, joista mainittakocnhormonit, interleukiinit, sytokiinit, kakeksiini, kasvutekijät, esim. verihiutaleista johdettu, epidermaalinen luurankoperäinen jne., kasvuhormoni, follikkelia stimuloiva hormoni, interferonit («-, /3- ja f~-), veren tekijät, kuten tekijät V, VI, VII, VIII (vW tai c), IX, X, XI tai XII, plasminogeenin aktivaattori (kudoksen tai virtsan), seerumin albumiini, esim. ihmisen seerumin albumiini, pesäkkeitä kasvattava tekijä (esim.
GM), erytropoietiini, taumatiini, insuliini jne.
Nämä rakennegeenit voidaan saada monin eri tavoin.
Jos aminohapposekvenssi tunnetaan, voidaan rakennegeeni syntetisoida kokonaan tai osaksi, erityisesti, jos on toivottavaa saada aikaan hiivalle edullisia kodoneja.
Näin ollen voidaan koko lukuvaiheistus tai vain osa siistä syntetisoida käyttäen Kluyveromyces-sienen kannalta edullisia kodoneja. Edulliset kodonit voidaan määrittää niiden kodonien perusteella, joita löytyy Kluyveromyces-isännän suurimpina määrinä tuottamista proteiineista, esim. glyko- ;**’· lyyttisistä entsyymeistä. Kirjallisuudesta löytyy paljon »»· tietoja sekvenssien syntetisointimenetelmistä ja sekvens-
• •M
; ,·. sien yhteenliittämisestä. Jos avoimen lukuvaiheistuksen » · * “V osa syntetisoidaan ja osa johdetaan luonnonlähteistä, • · *. ' voi syntetisoitu osa toimia siltana kahden luonnossa » · · *‘Y esiintyvän osan välillä tai se voi muodostaa 31-pään tai • · · *·*·’ 5'-pään. Erityisesti, jos signaalisekvenssi ja peptidiä koodittava avoin lukuvaiheistus on johdettu eri geenistä,, käytetään yleisesti synteettisiä adaptereita. Joskus taas voidaan käyttää kytkijöitä niin, että eri fragmentit voidaan sijoittaa eri restriktiokohtiin tai voidaan suorit- • · .*.*. taa korvaaminen kytkijän sekvenssillä.
• · • ; Yleensä jokin osa avoimesta lukuvaiheistuksesta tai koko avoin lukuvaiheistus on luonnonlähteestä. Halut- • * tujen sekvenssien tunnistusmenetelmistä löytyy runsaasti « · •V. esimerkkejä kirjallisuudesta, mutta yksittäisissä tilanteis- • « • · ♦ · · • *♦ $ · 9 107939 sa kyllä saatetaan kohdata eriasteisia vaikeuksia. Usein käytetään koettimia, jos ainakin osa luonnossa esiintyvästä aminohapposekvenssistä tunnetaan, ja tällöin voidaan perimäkirjastoja tai cDNA-kirjastoja seuloa komplementaaristen sekvenssien esiintymisen suhteen. Vaihtoehtoisesti voidaan havaita tiettyyn suuntaan tapahtuvaa transkriptiota, jos haluttu geeni voidaan indusoida, tai jos solut ovat samasta isännästä, mutta edustavat eri erilaistumis-suuntaa, jolloin verrataan tuotettuja mRNA-laatuja toisiinsa. Myös muista menetelmistä on olemassa esimerkkejä.
Lopetusalue voidaan saada sen geenin 3'-alueesta, josa aloitusalue saatiin, tai eri geenistä. Ennestään tunnetaan suuri määrä lopetusalueita ja niiden on havaittu toimivan tyydyttävästi erilaisissa isännissä, jotka voivat kuulua samaan tai eri sukuun tai lajiin. Lopetussekvenssi tavallisesti valitaan enemmänkin mukavuussyistä kuin jonkin tietyn ominaisuuden vuoksi. Lopetusalue on edullista johtaa jostakin hiivageenistä, erityisesti Saccharomyces- tai Kluyveromyces-geenistä.
Ilmentämiskasettia kehitettäessä voidaan eri frag- ;***. mentit, jotka kattavat säätelyalueet ja avoimen lukuvaiheis- • · * tuksen, alistaa erilaisiin prosessointiolosuhteisiin, j"·. kuten yhteenliittämiseen, restriktiokatkaisuun, uudelleen- • « · paloitteluun, in vitro-mutatointiin, alukkeella tapahtu-• ♦ ♦ ..... .
· vaan korjaukseen, kytkijöiden ja adapterieden käyttöön • · · ***** tms. Näin voidaan säätelyalueissa ja/tai lukuvaiheistuk- *.*.* sessa käytettyyn DNA:hän kohdistaa nukleotidienvaihtoja, -transversioita, -insertioita, -deleetioita tms.
Ilmentämiskasetin rakentamisen aikana kloonataan eri DNA-fragmentit tavallisesti sopivaan kloonausvektoriin, ;Vj joka mahdollistaa DNA:n monistamisen, DNA:n muuntamisen • · .*.·. tai muokkaamisen liittämällä tai poistamalla sekvenssejä, • · •; kytkijöitä tms. Normaalisti tähän tarkoitukseen käyte- ‘ * tyt vektorit kykenevät replikoituinaan E. colissa ainakin • *" ' suhteellisen korkean kopiomäärän tuottavina. Kloonausta • · «*·*j varten on helposti saatavissa monia vektoreita, kuten » * • · • · · • M » · 10 107939 pBR322, PACYC184, pUC7-19, M13, Charon 4A tms.
Kloonausvektoreille on tunnusomaista se, että niissä on tehokas, E. colissa toimiva replikoitumissysteemi. Kloonausvektorissa on tavallisesti vähintään yksi ainutlaatuinen restriktiokohta, mutta tavallisesti ainutlaatuisia restriktiokohtia on useita ja ne voivat myös sisältää useita restriktiokohtia, erityisesti kaksi samaa restriktiokohtaa substituointia varten. Lisäksi on kloonausvektorissa yksi tai useampia merkkejä, jotka mahdollistavat transformanttien valinnan. Merkit tavallisesti antavat vastustuskyvyn sytotoksisille aineille, kuten antibiooteille, raskasmetalleille, toksiineille tms., täydentävät auksotrofista isäntää tai antavat immuniteetin faagia vastaan. Kun vektori ja kasetti katkaistaan tarvittavalla restriktiokatkaisulla ja tarpeen mukaan muokataan päät syömällä taaksepäin tai täyttämällä yli ulottuvat päät, jotta saadaan aikaan tasaiset päät, lisätään kytkijöitä tai hännitetään, jotta saadaan komplementaariset päät, voidaan vektori liittää ilmentämiskaset-tiin tai sen osaan.
I · *·* Kasetin rakentamisessa suoritetun jokaisen DNA:nmuok- kausvaiheen jälkeen plasmidi kloonataan ja eristetään • · · '··'· : ja tarvittaessa kyseinen kasetin komponentti sekvenssoidaan, : jotta voidaan olla varmoja, että on saatu aikaan oikea sekvenssi. Käsittelytoimenpiteen: luonteesta riippuen :: : voidaan haluttu sekvenssi leikata irti plasmidista ja sijoittaa eri vektoriin tai plasmidi voidaan restriktiokatkaista ja ilmentämiskasettikomponent- tia muokata, miten kulloinkin on sopivaa.
'•S' Joissakin tapauksissa käytetään sukkulavektoria, ! ’ jolloinvektori kykenee replikoitumaan eri isännissä, jotka ’•Λ vaativat erilaisen replikoitumissysteemin. Tämä saattaa *:**: vaatia, mutta saattaa myös olla vaatimatta lisämerkkejä, ·:··· jotka toimivat kyseisissä kahdessa isännässä. Kun tällai- ..Y siä merkkejä tarvitaan, ne voivat sisältyä vektoriin, • « · *. *. jolloin plasmidi, joka sisältää kasetin, kyseiset kaksi « · t « · 11 107939 replikaatiosysteemiä ja merkin(merkit), voidaan siirtää tarpeen mukaan yhdestä isännästä toiseen- Esillä olevan keksinnön tilanteessa on toinen replikaatiosysteemi sellainen, joka toimii Kluyveromyces-hiivassa. Käytettävät replikaatiosysteemit voivat olla johdettuja plasmideista, joista mainittakoon esimerkiksi Kluyveromyces drosophila-rumin pKDl, viruksista tai Kluyveromyces-hiivan tai muiden lajien kromosomista, erityisesti Kluyveromyces-hiivaan yhteydessä olevasta, kuten Saccharomyces-hiivasta. Niinpä ovat sopivia replikaatiosysteemejä Saccharomyces-hiivasta löytyvä 2 mikronin plasmidi ja autonomisesti replikoituva sekvenssigeeni (ARS), esimerkiksi yhdessä sentromeeri-sekvenssin kanssa käytettynä, tms. Haluttaessa voidaan mukaan sisällyttää homologia-alueita, jotta edesautetaan ilmentämiskasetin integroitumista Kluyveromyces-isännän perimään.
Erityisen tärkeä on esillä olevan keksinnön mukaisissa rakenteissa Kluyveromyces-kromosomi-DNA:sta johdettu sekvenssi nimeltään KARS, joka saa aikaan korkean trans- ... formoitumisfrekvenssin. KARS-geeni voidaan saada esiin • · **"' seulomalla Kluyveromyces-DNA-fragmenttikirjasto lisäänty- « « · ···· neen transformointitehokkuuden perusteella. Tällä tavalla • · : voidaan saada fragmentteja, jotka sisältävät KARS-sek- • · · • venssin, ja joita fragmentteja voidaan edelleen muokata ::: restriktiokatkaisuilla, uudelleenpaloitteluilla tai aluk- keella tapahtuvilla korjauksilla, jolloin saadaan noin 200 ep:n, mutta korkeintaan noin 5000 ep:n ja tavallisimmin noin 200 - 2000 ep:n fragmentti, joka antaa suuremman transformointitehokkuuden. KARS-geenin läsnäolo voi . . saada aikaan sen, että auksotrofinen K^_ lactis-laji trans- ; ; formoituu prototrofiseksi frekvenssillä, joka on vähintään : 3 • · noin 10 per mikrogramma DNA:ta, ja tavallisesti frekvens- 4 *:··: sillä, joka on 10 per mikrogramma tai suurempi.
:··: Tapa, jolla E. coli transformoidaan kloonaustar- koituksessa eri DNA-rakenteilla (plasmidit ja virukset), \ ** ei ole kriittinen esillä olevan keksinnön kannalta. Voi- 12 107939 daan käyttää konjugointia, transdusointia, transfek-tointia tai transformointia , esim. kalsiumkloridin tai fosfaatin avulla suoritettua transformointia. Sitä vastoin on hiivan transformointi tähän mennessä yleensä suoritettu transformoimalla protoplastit käyttämällä apuna kalsiumionien ja polyetyleeniglykolin yhdistelmää, jolloin polyetyleeniglykolin molekyylimassa on ollut noin 2000 - 8000, tavallisesti 4000 - 7000 daltonia.
Vaihtoehtoisessa transformointimenetelmässä kasvatetaan Kluyveromyces-hiivaa hiivan standardiravinnealus-tassa tiheyteen 1-25, mielellään tiheyteen 4-10 ODg^^. Tämän jälkeen Kluyveromyces-solut otetaan talteen, pestään ja esikäsitellään kaotrooppisilla ioneilla, erityisesti alkalimetalli-ioneilla litium, keesium tai rubidium, jotka ovat erityisesti kloridin tai sulfaatin muodossa, mutta erityisesti litiumsuoloilla, pitoisuuksina noin 2 mmol/1 - 1 mol/1, erityisesti noin 0,1 mol/1. Kun solujaoaa.^ inkuboitu kaotrooppisen(ten) ionin(ien) kanssa, lisätään DNA ja inkubointia jatketaan lyhyt aika kohtalaisessa ... lämpötilassa, yleensä välillä noin 20 - 35°C, noin 5 - • · *··;' 60 minuuttia. Sitten lisätään polyetyleeniglykolia, mie- ··.: lellään pitoisuuteen noin 25 - 50 %, jolloin koko väli- • · : aine voidaan laimentaa lisäämällä sama tilavuus polyetylee- • I » • nikonsentraattia niin, että tuloksena on haluttu lopulli-nen konsentraatio. Polyetyleeniglykolin molekyylimassa on noin 2000 - 8000 daltonia, mielellään noin 4000 -7000 daltonia. Tavallisesti inkuboidaan suhteellisen lyhyt aika, yleensä noin 5-60 minuuttia. Mielellään inkubointiseokselle suoritetaan vielä 1-10 minuutin .. lämpökäsittely noin 35 - 45°C:ssa, mielellään noin 42°C:ssa.
• · *
Valinnassa voidaan käyttää mitä tahansa käyttökelpois- • » · ta merkkiä, mutta Kluyveromyces-hiivassa käytettäviksi ·:*·: sopivia merkkejä on lukumäärältään vähemmän kuin Saccaharo- ·;··| myces-hiivassa käytettäväksi sopivia. Mielellään käyte- ..Y tään resistenssiä kanamysiinin ja amyloglykosidin G418 • ·* suhteen sekä tryptofaanin aineenvaihduntareitin täyden- • · * • · · 13 107939 täjägeeniä, erityisesti TRPl:tä, tai laktoosin aineenvaih-duntareitin täydentäjägeeniä, erityisesti LAC4:ää.
Vaikka valintamerkin käyttö onkin erittäin edullista, tunnetaan ennestään myös muita tansformoituneiden solujen esiinseulontamenetelmiä. Ks. esimerkiksi G. Reipen et ai. , Current Genetics (1982) J5:189-193. Transformoituneet solut voidaan seuloa esiin indikaattorientsyymiä, kuten β-laktamaasia käyttäen tai niiden valmistamien erityisten tuotteiden perusteella. Esimerkiksi kymosiinin ollessa kyseesssä voidaan tuotteen syntetisoituminen määrittää immunologisella tai entsymaattisella menetelmällä Käytetty vektori saattaa kyetä pysymään yllä Kluy-veromyces-hiivassa kromosominulkopuolisesti tai se saattaa integroitua Kluyveromyces-geeniin. On havaittu, että Saccharomyces-hiivan 2 mikronin plasmidin replikaatiosys-teemi saa aikaan säilymisen Kluyveromyces-hiivassa kromosominulkopuolisesti. Voidaan myös käyttää sentromeerin, kuten Saccharomyces CEN3:n, ja korkean transformointifrek-venssin omaavan sekvenssin, kuten ARS:n tai KARS:n. yhdis-... telmää. Jos käytetään-valintapaineeseen perustuvaa py- ’···* syvyyttä, kuten täydennystä tai antibioottiresistenssiä, joille Kluyveromyces on altis, riittävät ARS:n kaltaiset * · i.i : sekvenssit tavallisesti kromosominulkopuoliseen ylläpysy- • *.· miseen.
Suurimittakaavaisessa fermentoinnissa vaikuttaa jo ;Y; pieni plasmidin stabiilisuuden menetys halutun tuotteen saantoon suuresti. Jotta saataisiin lisätyksi yhdistelmä-molekyylien stabiilisuutta isäntäsoluissa, esimerkiksi Kluyveromyces-hiivassa, voidaan käyttää yhdistelmämole- , . kyylien integrointia isännän kromosomiin.
• · ·
Jos halutaan integroitumisen tapahtuvan, on yleensä *J·’ toivottavaa, että mukana on isännän kromosomille homolo- ·;··· ginen sekvenssi niin, että voi tapahtua homologinen integ- ...·; roituminen. Huomattakoon, että esiintyy myös satunnaista integroitumista, joten homologinen sekvenssi ei ole vält- * · · ·’ tämätön. Jos käytetään homologista sekvenssiä, on sen • · · • · · « « 14 107939 pituus tavallisesti vähintään noin 200 ep, mutta pituus voi olla 1000 ep tai enemmänkin. Lisäksi, jos kyseessä on integroituminen, saattaa rakennegeenin monistuminen olla toivottavaa. Monistuminen on saatu aikaan tuomalla halutun rakennegeenh viereen geeni, joka antaa isännälle valintaedun valintapaineen sisältävässä alustassa. Näin ollen on geeni, joka ilmentää dihydrofolaattireduktaasia, metallotioneiinejä, tymidiinikinaasia tms., osoittautunut hyödylliseksi eri isännissä antamaan monistumisen, sillä geeni antaa suojan toksiinille, kuten metotreksaatille, raskasmetalleille, kuten kuparille tai elohopealle, tms:lie.
Mielenkiinnon kohteina olevia vektoreita, jotka aikaansaavat stabiilin replikoitumisen, ovat mm. K- lactik- sesta peräisin olevat KARS-vektorit, esimerkiksi pKARS12 ja pKARS2, jotka plasmidit sisältävät KARSI2- tai KARS2- sekvenssin sisältävän lactis-DNA-fragmentin S. cerevi- siae-plasmidissa YRp7. Integroitumiseen käytetty vektori on esimerkiksi pL4, joka on yhdistelmäplasmidi, joka ... koostuu ARSI:n sisältävästä plasmidista YRp7 ja K. lactik- • · *··;* sen XhoI-DNA-fragmentista, jossa on LAC4-geeni. Ks. julkai- sua EP-A 0096430.
♦ · : Erityisen edullisia ovat plasmidit, joissa on 2 mik- •« · • '.· ronin plasmidin replikaatiosysteemi, LAC4-geeni, Tn601- ja Tn5-kanamysiiniresistenssigeeni, joka myös antaa :Y: Kluyveromyces-hiivalle vastustuskyvyn G418-anti- • · biootin suhteen (Jimenez ja Davis, Nature (1980) 287:869-871). Tämä plasmidi saa aikaan autonomisen replikoitumisen Kluyveromyces-hiivassa ja se voidaan valita G418-resistens- . . sin perusteella regenerointimaljoissa, jotka sisältävät • « ♦ glukoosia, sorbitolia ja 0,2 jig/ml G418:aa, kun samalla vältetään korkeita KCl-pitoisuuksia, jotka häiritsevät ·;♦·· Kluyveromyces-hiivan G418-herkkyyttä. Edulliset plasmi- ··.·· dit sisältävät TRPl-geenin, erityisesti cerevisiaesta ,.Y peräisin olevan, LAC4-geenin, erityisesti K^_ lactiksesta peräisin o ig/an Kan -geenin, joka antaa vastustuskyvyn * · · • · · • ♦ 15 107939 G418-antibiootin suhteen ja on peräisin Tn5:stä, tms:n.'
Kyseiset vektorit ja rakenteet sijoitetaan sopivaan isäntään kloonausta ja haluttujen rakennegeenien ilmentämistä varten. Transformoitumisen jälkeen ilmestyy pesäkkeitä regenerointialustaan tavallisesti noin 5-6 vuorokauden kuluessa. Kun valinnan perusteena käytetään antibioottia, pitäisi pesäkkeet seuloa, jotta voidaan olla varmoja siitä, ettei vastustuskykyisessä kannassa ole tapahtunut spontaania mutaatiota. Kun käytettiin esillä olevan keksinnön mukaisia plasmideja ja menetelmiä, havait- · tiin noin 5 %:n vastustuskykyisistä pesäkkeistä sisältävän plasmidirakenteen, mikä merkitsi vähintään noin 4 transfor-manttia per jig plasmidi-DNA:ta. Kun valinta perustui LAC4-geenin läsnäoloon ja käytettiin maljoja, joissa oli laktoosi ainoana hiililähteenä ja 0,6 mol/1 kaliumkloridia osmoottisena stabiloijana, havaittiin kaikkien elossa olevien pesäkkeiden olevan transformantteja eikä spontaaneja palautumia. Noin 20 transformanttia saatiin, kun inkuboitiin noin 4-5 vuorokautta kohtalaisessa lämpötilassa, esim.
30°C: ssa.
• · · • · *···* Isäntäorqanismina on Kluyveromyces erittäin sopiva heterologisten proteiinien tuottamiseen, kuten esimerkiksi • · : seuraavien tuottamiseen ja uuttamiseen: kymosiinientsyymi \ **: ja sen prekursorit preprokymosiini, pseudokymosiini ja :V: prokymosiini, ihmisen seerumin albumiini (HSA), plasmino- • · geenin kudosaktivaattori (t-PA) ja taumatiini ja sen pre- • · kursorimuodot. Vaikka muut organismit, kuten Saccharomyces, tuottavatkin prokymosiinia järkevinä määrinä, ei tuotettua prokymosiinia voida uuttaa aktiivisessa tai aktivoitavissa . . olevassa muodossa. Esillä olevan keksinnön tekijät ovat I · * ';*·* havainneet, että Kluyveromyces-hiivan tuottamasta prokymo- • · · *.*.* siinista yli 90 % voidaan uuttaa aktiivisessa muodossa • · ·;··· hyvin yksinkertaisia standardimenetelmiä käyttäen.
Voidaan käyttää mitä tahansa lukuisista Kluyveromy-ces-lajeista. Voidaan käyttää joko laboratorio- tai teolli- • · · : ·* suuskantoja, mielellään teollisuuskantoja. Teollisuus- • · • * · • · · 16 107939 kannoilla tarkoitetaan Kluyveromyces-kantoja, jotka on voitu eristää luonnosta tai saada talletuslaitoksista tai muista lähteistä tai muuntamalla, esimerkiksi muta-toimalla, tällaisia kantoja. Teollisuuskannoille on ominaista vastustuskyky geneettiselle vaihdolle, prototro-fisuus tai isäntäkantaan tuodulla geenillä aikaansaatu prototrofisuus ja yleensä parempi peptidientuotantokyky. Kluyveromyces-lajeista,jotka saattavat olla käyttökel-pisia mainittakoon K. lactis, K. fragilis, K. bulgaricus, K. thermotolerans, K. marxianus jne. Huomattakoon lisäksi, että Klyveroroyces-organismit ovat GRAS-listalla (Generally Recognized As Safe). Niiden käyttö sellaisten tuotteiden tuottamiseen, jotka käytetään in vivo tai nautitaan suun kautta, ei normaalisti vaadi erityistä hallituksen määräämää tarkastusta ja hyväksymistä.
Isäntinä voidaan käyttää sekä villityyppisiä että mutatoituja Kluyveromyces-hiivoja ja erityisesti mainittakoon Kluyveromyces lactis ja Kluyveromyces fragilis. Erityisen sopivia ovat K_;_ lactis SD11 lac4 trpl ja K.
... lactis SD69 lac4 ja villityyppinen kanta CBS 2360 (ks.
julkaisua EP-A-0096430 ) .
*
Jotta saataisiin aikaan valintapaine niin, että » « ·,: · plasmidi pysyy yllä transformantissa, voidaan käyttää it * j ’valintaravinnealustoja, kuten hiivan typpiperusalustaa, ;V: jossa on 2 % laktoosia glukoosin tilalla, kun kyseessä • · ·*·'· on K. lactis SD69 lac4 (PTY75-LAC4) tai K. lactis • · SD69 lac4 (pL4), ja hiivan typpiperusalustaa (Difco), jossa on 2 % glukoosia, kun kyseessä on K. lactis SD11 lac4 trpl (pKARS12). Ks. transformantteja, jotka on mainittu . . julkaisussa EP-A-0096430. Vastaavasti voidaan antibioot- ♦ · « * ·* tiresistenssin, esimerkiksi G418-resistenssin, antavan Φ * 9 ’«]·* plasmidin sisältäviä kantoja kasvattaa ravinnealustassa, ··♦·· joka sisältää mainittua antibioottia.
Kun yhdistelmäplasmideja käytetään halutun proteii- .// nin suurimittaiseen teollisuustuotantoon, on yleensä hyö- • * » • ♦' dyllistä poistaa yhdistelmäplasmideista kaikki bakteeri- » ♦ ♦ • «·> « · 17 107939 peräiset DNA-sekvenssit ainakin oleellisesti ottaen kokonaan.
Rakennegeenin luonteesta riippuen voi ilmentymis-tuote jäädä isäntäsolun sytoplasmaan tai erittyä. On havaittu, että solun sisälle jäävien proteiinien lisäksi ovat myös erittyneet liukoisia. Jos halutaan, että ilmen-tym iäiuote jää isäntäsoluun, on yleensä toivottavaa, että transkriptionaloitusalue on indusoitavissa, jotta haluttua tuotetta ilmentyy vain vähän tai ei lainkaan, ennenkuin transformantti on saavuttanut halutun kasvutiheyden. Kun on kulunut riittävästi aikaa ilmentymästuotteen muodostumiselle, voidaan solut eristää tavanomaisin menetelmin, esimerkiksi sentrifugoimalla, ja lysoida ja haluttu tuote eristää. Tuotteen luonteesta ja käytöstä riippuen voidaan iysaatti puhdistaa erilaisilla menetelmillä, kuten käyttämällä kromatografiaa, elektroforeesia, uuttoa liuottimilla, kiteytystä tms. Saavutettu puhtausaste voi olla noin 50 % - 90 % tai korkeampi tai oleellisesti ottaen täydellinen.
Jos tuotteen halutaan erittyvän, voidaan käyttää .·*·. konstitutiivisia tai ei-konstitutiivisiä transkription- aloitusalueita riippuen halutun proteiinin tai polypep-tidin tuotantoon käytetystä fermentointimenetelmästä.
• · ·
Ilmentymistuote voidaan saada erittymään kasvualustaan • ja tuotetta voidaan tuottaa jatkuvasti siten, että osa » « * *·'* kasvualustasta johdetaan pois ja haluttu tuote uutetaan, :.·.· esimerkiksi af f initeettikromatograf iällä tms: 11a, ja käytetty alusta heitetään pois tai palautetaan kiertoon sen, jälkeen kun oleelliset ravinteet on täydennetty.
Kaikki tässä selostuksessa mainitut julkaisut ja .·.'. patenttihakemukset edustavat alalla vallitsevaa teknii- kan tasoa, johon esillä oleva keksintö liittyy. Kaikki » · · * ’·*. julkaisut ja patenttihakemukset, joihin tässä selostuk- ’ ' sessa viitataan, on tarkoitettu viitejulkaisuiksi aivan kuin jokaisesta olisi erillinen maininta tässä mielessä.
Keksintöä valaistaan, mutta ei rajoiteta seuraavil- 18 107939 la esimerkeillä.
Esimerkki 1
Sellaisten kymosiininilmentämisplasmidien rakentaminen, jotka sisältävät pitkän laktaasinpromoottorisekvenssin A. Plasmidin pUCla56 rakentaminen
Kluyveromyces laetis-kannasta CBS 2360 (Das ja Hollen-berg, Current Genetics (1982) _5:123-128) eristettiin kromo-somaalinen DNA ja se katkaistiin XhoI:llä ja erotettiin koon mukaan sakkaroosigradientissa. Laktaasigeenin sisältävät jakeet havaittiin plasmidista pK16 saadulla LAC4-koettimella sen jälkeen, kun DNA oli täplitetty nitrosel-luloosakalvolle (ks. julkaisua EP-A-0096430, esimerkki 16.C2). LAC4-geenin sisältävä DNA kloonattiin plasmidin ΡΡΑ153-215 (Andreoli, Mol. Gen. Genet. (1985) 199:372-380) Sali-kohtaan ja saatiin plasmidi pPA31. Plasmidin pPA31 Xbal-fragmentti, joka sisälsi laktaasigeenin, alakloonat-tiin plasmidin pUC.19 Xbal-kohtaan (Yanisch-Perron et ai., Gene (1985) 3_3:103-119) ja saatiin plasmidi pUCla56.
·*· B. G418-resistenssigeenin sijoittaminen laktaasigeenin ‘ ·*· terminaattoriin • · · - ---- -- — • G418-resistenssimerkin sisältävä terminaattorifrag- mentti saatiin plasmidista pGBTeG418. Plasmidin pGBTeG418 sisältävä E_^_ coli on talletettu Centraal Bureau voor Schimmelcultures-kokoelmiin numerolla CBS 184.87 26. helmikuuta, 1987. Plasmidi pGBTeG418 (ks. kuva 1) sisältää edellä kuvatun plasmidin pPAl53-215 ja 5,6 ke:n frag-.. mentin, jossa on 3,7 ke:n BamHI-laktaasinterminaattori- ; ; fragmentti, joka on saatu Κ^_ lactiksesta (Breuning et ai. , '·'·[ Nuci. Acids. Res .(1984 ) 1_2: 2327-2341) , ja Tn5-geeni (Reiss ·;·*: et ai., EMBO J. (1984) 3^:3317), joka antaa G418-resis- ·;··· tenssin hiivan alkoholidehydrogenaasi I:n (ADH) pro- ..Y moottorin ohjauksessa, joka on samanlainen kuin julkai- \ ·* sussa Bennetzen ja Hall, J. Biol. Chem. (1982) 257:3018- 19 107939 3025 on selostettu.
C. Plasmidin pGB900 rakentaminen, joka sisältää G418-resistenssigeenin ja prokymosiinia koodattavan DNA:n
Plasmidista pGBTeG418 saatu 3,6 ke:n Hindlll-Xbal-fragmentti, joka sisälsi G418-resistenssigeenin (ks. esimerkki IB), ja plasmidista pGB123 (ks. julkaisua EP-A-0096430) saatu Sall-Hindlll-fragmentti, joka sisälsi pro-kymosiinigeenin, liitettiin plasmidiin pUC19, joka oli katkaistu Sali:llä ja Xbal:llä. Näin saatiin plasmidi pGB900.
D. Plasmidin pGB901 rakentaminen (ks. kuva 2)
Plasmidi pGB901 rakenneltiin liittämällä yhteen seuraavat neljä fragmenttia: (1) Plasmidista pUCla56 eristetty 3,6 ke:n Xbal-Haell-fragmentti, joka sisältää laktaasin promoottorin noin asemaan -90 asti laktaasin aloituskodonista ATG laskien.
.···. (2) Haell-Sall-fragmentti, joka ulottuu edellä • · —— mainitusta Haell-kohdasta Sali-kohtaan, joka liitettiin asemaan -26 samoin kuin julkaisun EP-A-0096430 esimerkin ;;·/ 16.C2 Bal31 -kokeessa on selostettu. Nyt esillä olevas- : * sa kokeessa käytettiin kuitenkin vain Sali-kytkiiää. Tämän fragmentin sekvenssi on seuraava: 5· TTAAC ACTTGAAATT TAGGAAAGAG CAGAATTTGG CAAAAAAAAT AAAAAAAAAA TAAACACC 3· 3· CGCGAATTC TGAACTTTAA ATCCTTTCTC CTCTTAAACC βΤΤΤΤΤΤΤΤΑ TTTTTTTTTT ATTTGTGCAC CT 5« (3) Plasmidin pGB900 5,1 ke:n Sall-Xbal-fragmentti, joka sisältää prokymosiinin ja G418:n (ks. esimerkki 1C).
(4) Xbal: llä katkaistu plasmidi pUC19.
Plasmidin rakentamisen aikana Haell-kohdan CG-sek- venssi poistui tahattomasti ja tähän asemaan syntyi Hindi II-kohta.
Plasmidissa pGB901 on läsnä prokymosiinia koodittava • · DNA. Tämä voidaan helposti muuntaa plasmideiksi, joissa on 20 107939 preprokymosiini-, pseudokymosiini- tai kymosiini-DNA käyttämällä vastaavasti plasmideista pGB 131, 122 ja 124 saatuja SalI-BglII-fragmentteja (ks. julkaisua EP-A-0096430).
Esimerkki 2
Prokymosiinin erittäminen Kluyveromyces lactis-transfor-manteilla
Jotta saataisiin aikaan prokymosiinin synteesi Kluy-veromyces-hiivassa, transformoitiin K. lactis-kannat SD11 ja CBS 2360 plasmidilla pGB901 samanlaisin tuloksin. Trans-formointi suoritettiin oleellisesti samoin, kuin julkaisun EP-A-0096430 esimerkeissä 4 ja 14 on selostettu käyttämällä ehjää plasmidi-DNA:ta tai restriktioendonuk-leaaseilla katkaistua plasmidi-DNA:ta. Viimeksimainitussa tapauksessa käytettiin restriktioendonukleaaseja, jotka katkaisevat promoottorialueella (esim. SacII, Ndel, SnaBI tai Spel) tai terminaattorialueelia (esim. EcoRV) tai sekä promoottori- että terminaattorialueelia katkaisevia.
.···. K. lactis-kantaa CBS2360 kasvatettiin 100 mlrssa YEPD-alustaa (1 % hiivauutetta, 2 % peptonia, 2 % glukoo-siä), joka sisälsi 2,5 ml 6,7 %:sta hiivan typpiperusalus-taa (Difco), tiheyteen ODg1Q no^-n 7. Solut sentrifugoitiin * talteen 10 mlrsta viljelmää, pestiin TE-puskurilla (10 *·'·* mM Tris-HCl pH 7,5, 0,1 mM EDTA) ja uudelleensuspendoitiin 1 ml:aan TE-puskuria. Lisättiin sama tilavuus 0,2 M litiumasetaattia ja saatua seosta inkuboitiin 1 tunti 30 °C:ssa ravistelevassa vesihauteessa. Plasmidi pGB901 (15 |ig) katkaistiin ainoasta SacII-kohdastaan, joka on laktaasipromoottorissa, saostettiin etanolilla ja uudel- • · leensuspendoitiin 15 y_il:aan TE-puskuria. Tämä DNA-val-miste lisättiin 100 piiraan esi-inkuboituja soluja ja inku-’ ‘ bointia jatkettiin 30 minuuttia. Sitten lisättiin sama *·**· tilavuus 70 %:sta PEG 4000-liuosta ja saatua seosta in- kuboitiin 1 tunti samassa lämpötilassa ja sen jälkeen • * • · • · • · · 21 107939 annettiin 5 minuutin lämpöisku 42°C:ssa. Sitten lisättiin 1 ml YEPD-alustaa ja soluja inkuboitiin 1,5 tuntia ravistelevassa vesihauteessa, jonka lämpötila oli 30°C. Lopuksi solut sentrifugoitiin talteen, uudelleensuspendoitiin 300 ^il:aan YEPD-alustaa ja levitettiin agarmaljoihin, jotka sisälsivät 15 ml YEPD-agaria, jossa oli 300 yq/ml G418:aa, ja jotka oli peitetty (1 tuntia ennen käyttöä) 15 ml:11a YEPD-agaria, jossa ei ollut G418:aa. Pesäkkeitä kasvatettiin 3 vuorokautta 30°C:ssa. K. lactis-kanta SD11 transformoitiin samalla tavoin, mutta nyt oli alkuperäinen G418-konsentraatio valintamaljoissa 150 ug/ml. Kokeista yhdessä kasvatettiin CBS 2360-transformantteja 30°C:ssa YEPD-alustassa, joka sisälsi 2 % galaktoosia.
60 tunnin kuluttua solut ja alusta erotettiin toisistaan sentrifugoimalla. Solut rikottiin lasihelmien kanssa käsittelemällä. Kasvualustan ja solu-uutteen pH säädettiin arvoon 2 ennen kymosiiniaktiivisuuden määrittämistä (ks. Foltman, Methods in Enzymology (1970) 19:421-426).
Solut poistettiin viljelmistä sentrifugoimalla ja saatujen emäliuosten pH säädettiin arvoon 2 lisäämällä ·*“: 1 M ^SO^-liuosta ja inkuboitiin 2 tuntia huoneenlämpöti- lassa. Sitten liuokset neutraloitiin pH-arvoon 6 lisää- M·· : .·. mällä 2 M Tris-emäsliuosta. 50 pl tarvittavaa laimennosta |!V lisättiin suspensioon, jossa oli 12 % rasvatonta maito- • · o . . jauhetta 10 mM CaCl_:ssa, 3a inkuboitiin 37 C:ssa, kunnes
» · % A
muodostui hyytymä. Kymosiiniaktiivisuusyksikkö määrite!- * ♦ · ’·*·* lään sellaiseksi määräksi aktiivista kymosiinia, joka tarvitaan tuottamaan hyytymä 10 minuutissa näissä olosuhteissa. Emäliuos sisälsi maitoa hyydyttävää aktiivisuutta, joka johtui K. laetis-transformanttien prokymosiinintuo- :Y: tannosta ja -erityksestä, vaikkei prokymosiiniin oltu « · lisätty signaalisekvenssiä proteiinin erittymistä varten.
' *. Noin 30 - 60 % tuotetusta kokonaisprokymosiinimäärästä löytyi ravinnealustasta, kun määritys suoritettiin edellä-* ’ mainitulla maidonkoagulointikokeella. Samanlaisia tulok- siä saatiin käytettäessä K. lactis-kantaa SD11.
22 107939
Esimerkki 3
Laktaasi-kymosiinifuusioproteiinit, joilla saavutetaan suurempi kymosiinintuotanto
Kun otettiin erilaisia SnaBI-Sall-fragmentteja (Bal31-kokeesta, joka oli samanlainen kuin julkaisun EP-A-0096430 esimerkissä 16.C2 kuvattu, mutta nyt käytettiin vain yhtä Sali-kytkijää), saatiin pGB901-variantte-ja, jotka sisälsivät laktaasiproteiinin ja kymosiinipro-teiinin välisen fuusion (taulukko 1). Laktaasi-DNA:n ja kytkijäsekvenssien tuomat ylimääräiset aminohapot voidaan poistaa yhdessä prokymosiinin pro-sekvenssin kanssa happokäsittelyllä. Havaittiin, että fuusio, joka sisälsi 4 aminohappoa laktaasia koodittavasta sekvenssistä (pGB902), johti suurempaan kymosiinintuotantoon.
Taulukko 1
Laktaasipromoottorin ja prokymosiinin välisen liitoskohdan nukleotidisekvenssi plasmideissa pGB901 ja pGB902 BSMQl • ***j laktaasipromoottori prokymosiini • ♦ * <-1 _Γ " I_Il_I1—^1 I *
Sali EcoRI
# · * • · • · pGB902 laktaasi prokymosiini <- |->
ATG TCTTGCCTCGTCGACGAATTCATGGCTGAG
o:= L-1 I_Il_I
:Λ: Sali EcoRI
• · • · « ♦ · • · '·**· Proteiinisynteesi alkaa ympäröidystä ATG-kodonista.
• · • · · * · · • · • · • · • · * • · 23 107939
Esimerkki 4
Preprokymosiinin ilmentäminen Kluyveromyces-transforman-teissa
Plasmidin pGB902 monikytkijän Sali-kohta (ks. esimerkki 3) poistettiin mukavuussyistä. pGB902 katkaistiin osittain Sali:liä ja sen jälkeen inkuboitiin lyhyesti Ball:n (Boehringer) kanssa. Lineaariset fragmentit eristettiin agaroosigeelistä, suoritettiin yhteenliittäminen ja E^_ colin transformointi. Näin saatiin oikea plasmidi pGB903. Restriktioanalyysi osoitti, että tässä plasmi-dissa oli monikytkijästä poistunut myös Xbal-kohta ja HindiII-kohta.
Jotta saataisiin rakennetuksiplasmidi, joka sisältää preprokymosiinia koodittavan sekvenssin ja ilmentää sitä, plasmidi pGB903 katkaistiin restriktioendonukleaaseilla Sali ja Bglll. 11 ke:n DNA-fragmentti eristettiin aga roosigeelistä elektroeluutiolla. Vastaavasti plasmidi PGB124, joka sisältää preprokymosiinigeenin (ks. julkaisua EP-A-0096430, esimerkki 16) katkaistiin ja 0,3 ke:n Sall-BglII-fragmentti, joka sisälsi preprokymosiinigeenin • · · ·...* N-pään osan, eristettiin.
..*·* Näin saadut 11 ke: n ja 0,3 ke: n DNA-f ragmentti sekoile : tettiin keskenään, liitettiin yhteen DNA-ligaasin avulla :*·*: ja suoritettiin E. colin transformointi. Eristettiin • · plasmidi pGB904, joka sisälsi preprokymosiinigeenin liit- « · .·.·. tyneenä pieneen osaan laktaasigeeniä (taulukko 2).
• · · * ·
Taulukko 2
Laktaasipromoottorin ja preprokymosiinin välisen liitoskohdan nukleotidisekvenssi plasmidissa pGB904 • · PGB904 - * · * » ♦ « · ♦ V. laktaasi preprokynosiini i r *
·:·*: ATG TCTTGCCTCGTCGACGAATTCATG
L-J L_Jl_I
* *
*·.*: Sali EcoRI
• · · • · 24 107939
Proteiinisynteesi alkaa ympäröidystä ATG-kodonista.
K. lactis CBS 2360-solut transformoitiin plasmidilla pGB904, joka oli linearisoitu SacII:11a. Transformantit valittiin, kasvatettiin ja kymosiiniaktiivisuus määritettiin esimerkissä 2 kuvatulla tavalla. Seuraavassa taulukossa 3 on esitetty K. lactis CBS-236Q-solujen prokymo-siininerityksen vertailu, kun solut on transformoitu vastaavasti plasmidilla pGB902 (ks. esimerkki 3) ja plasmidilla pGB904. (Pro)kymosiinintuotanto on ilmoitettu mielivaltaisina yksiköinä per ml soluja, kun ODg^Q-tiheys oli 200.
Taulukko 3 K. lactis-solujen prokymosiinineritys, kun ne olivat transformoituneet vastaavasti plasmidilla pGB902 ja plasmidilla PGB904 pGB902 pGB904 transformantti supernatantti pelletti supernatantti pelletti • «k IM" 1'' '' - — —T “ “ :w.: 1 3.2 <0.4 22.4 1.7 2 1.3 <0.4 33.3 3.0 I,:*: 3 7.1 1.4 28.0 2.3 4 4.4 0.66 53.8 5.8 • » • · I I » • · ♦ — — —- - - - — - - - - — . -... ----- • · • · • · · • · * • ·
Esimerkki 5
Kluyveromyces-hiivan prokymosiinineritys, kun käytetään heteroloqisia johtosekvenssejä • · k « « '·*·* A. Amyloglukosidaasin johtosekvenssin kemiallinen syn- ·.*.* teesi ia mainitun johtosekvenssin sisältäviän plasmidin φ · rakentaminen « · -------------- *ϊ**ί Aspergillus awamorin amyloglukosidaasin (AG) johto- • ·|·t sekvenssi on julkaistu julkaisussa Innis et ai., Science • · (1985) 228:21-26. Proteiinin aminohappojärjestyksen pe- » · · • · · » · 25 107939 rusteella johdettiin oligonukleotidit niin, että johto-sekvenssi voitiin sijoittaa prokymosiinigeenin eteen (ks. kuva 3).
Oligonukleotidit syntetisoitiin Applied Biosystems-DNA-syntetisaattorilla. Oligonukleotidit puhdistettiin elektroforeesilla käyttämällä denaturoivaa polyakryyli-amidigeeliä ja sen jälkeen suoritettiin elektroeluointi geelistä.
Plasmidi pGB903 (ks. esimerkki 4) katkaistiin ainoasta Sali-kohdastaan. Oligonukleotidit hybridisoitiin 65°C:ssa, 50°C:ssa ja 37°C:ssa pitämällä kussakin lämpötilassa 1 tunti 2xSSC-liuoksessa. Oligonukleotideissa ei ollut fosfaattia 5'-päässä, jotta vältettiin multimee-rien muodostus. DNA liitettiin Sali-kohtaan käyttämällä T4-polynukleotidikinaasia. Yhteenliittämisseoksella transformoitiin E. coli HB101. Pesäkkeistä 24 viljeltiin ja plasmidi-DNA eristettiin. Yhdellä plasmideista, pGB905:llä, osoitettiin restriktioanalyysin perusteella olevan oligonukleotidit oikeassa suunnassa. Plasmidi pGB905 siirrettiin transformoinnilla K. lactis-kantaan : CBS_2360. (Pro)kymosiinituotanto analysoitiin esimerkissä ··· 2 selostettuna menetelmällä. Seuraavassa taulukossa ···· \ 4 on esitetty (pro)kymosiinin tuotannon tulokset mielival- • · « · täisinä yksiköinä per ml soluja ODg^Q-soiutiheydessä 200.
t · • · · · « • · 26 107939
Taulukko 4 K. lactis-solujen prokymosiinineritys, kun solut oli vastaavasti transformitu plasmidilla pGB902 ja plasmidilla PGB905 pGB902 pGB905 transformantti supernatantti pelletti supernatantti pelletti 1. 3.2 <0.4 60.6 <0.4 2. 1.3 <0.4 56.4 <0.4 3. 7.1 1.4 56.7 <0.4 4. 4.4 0.66 57.6 <0.4 B. Uuden synteettisen johtosekvenssin kemiallinen synteesi ja tämän uuden synteettisen johtosekvenssin sisältävän plasmidin rakentaminen
Valmistettiin synteettinen johtosekvenssi, jonka : ] : nukleotidijärjestys poikkeaa kaikista ennestään tunnetuis- ··· ta johtosekvensseistä. Tätä johtosekvenssiä käyttämällä « · « · : saatiin kaikkiKluyveromyces-hiivan syntetisoima prokymosii- ni erittymään, kuten seuraavassa osoitetaan.
• [. · Tämä synteettinen johtosekvenssi rakennettiin käyttä- I ! mällä signaalisekvenssin katkaisukohdan asemien - 6 - ’**·' + 2 välillä usein esiintyviä aminohappoja (Von Heyne,
Eur. J. Biochem. ( 1983) 133: 17-21) . Myös käytettiin usein hiivoissa esiintyviä kodoneja ja ATG-sekvenssin eteen sijoitettiin ylimääräisiä nukleotideja korvaamaan plasmi-dissa pGB902 esiintyvä 26 nukleotidin deleetio. Näin saadussa johtosekvenssissä käytetyt oligonukleotidit on esitetty kuvassa 4.
. Tämän synteettisen johtosekvenssin DNA syntetisoi- \ | tiin käyttämällä Applied Biosystems-DNA-syntetisaattoria.
:***: Saatuja oligonukleotideja ajettiin polyakryyliamidigeelis- 27 107939 sä, jonka pituus oli 40 cm ja paksuus 1 mm, ja joka sisälsi TBE-puskuria (50 mM Tris, 50 mM boraatti ja 1 mM EDTA, pH 8,3) ja 7 mol/1 ureaa, kunnes Bromophenol Blue-merkki oli edennyt 2/3 geelin pituudesta. DNA tehtiin näkyväksi, eluoitiin geelistä ja saostettiin etanolilla.
Valmistettiin myös pGB901-johdannainen, jossa oli deleetio pUCl9:n monikytkijästä peräisin olevan Sali-kohdan ympärillä. Valmistus suoritettiin siten, että plasmidin pGB903 0,5 ke:n SnaBI-Bglll-fragmentti korvattiin plasmidin pGB901 vastaavalla fragmentilla. Näin saatu plasmidi katkaistiin ainoasta Sali-kohdastaan. Oli-gonukleotidit emäspariutettiin 65°C:ssa, 50°C:ssa ja 37°C: ssa pitämällä 1 tunti kussakin lämpötilassa 2xSSC-liuok-sessa. DNA liitettiin Sali-kohtaan käyttämällä T4-poly-nukleotidikinaasia. Sitten E. coli HB101 transformoitiin plasmidilla. Saaduista pesäkkeistä 24 viljeltiin ja plas-midi-DNA eristettiin. Restriktioentsyymikatkaisulla osoitettiin, että yhdessä plasmideista, pGB906:ssa, olivat oligonukleotidit oikeassa suunnassa. Havaittiin, että plasmidilla pGB906 transformoitunut K. lactis CBS 2360 « · · eritti yli 95 % tuottamastaan prokymosiinista.
• · « • · · · 28 107939 naftolin (0,6 mg/ml) ja vetyperoksidin (0,015 %) kanssa puskuriliuoksessa (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,9 % NaCl), joka sisälsi 40 % metanolia. Kuten tämä määritys osoittaa, AG-signaalisekvenssin erittämä prokymosiini katkeaa oikealla tavalla, kun suoritetaan käsittely pH-arvossa 2 (kuva 5). Samanlaiset tulokset saatiin K. lactis CBS 2360 (pGB906)-transformanteille.
Esimerkki 6
Saccharomyces cerevisiaen «X-tekijän sekvenssin sisältävien plasmidien rakentaminen tehokasta erittämistä varten A. Saccharomyces-hiivan Q(-tekijänilmentämisplasmidit 1. Plasmidien rakentaminen pDMlOO-PC: Lähtömateriaali oli plasmidi pGB163 (ks. julkaisua EP-A-0096430, esimerkki 16.Cl). Plasmidi pGB163 katkaistiin BamHI:llä ja liitettiin Xbal-BamHI, c<-tekijän johtosekvenssi-prokymosiiniadapteriin. Sitten näin saatu seos käsiteltiin PstI:llä ja 96 ep:n fragmentti, ... joka koodittaa pro-o^-tekijän prosessointikohtaa ja pro- • « kymosiinin N-pään aluetta, eristettiin. 1900 ep:n frag- • · « ···; mentti, joka koodittaa naudan prokymosiinia, eristettiin • · · · plasmidista pJSlll, kun oli ensin katkaistu PstI: llä ja • · · : '.· Sällillä. Plasmidi pJSlll on pBR322-johdannainen, joka sisältää prokymosiinigeenin plasmidista pGBl63 ADH-2-pro- :V: moottorin ja glyseraldehydi-3-fosfaatin (GAPDH) terminaat- * · torin säätelyn alaisuudessa. Irroitettu 1900 ep:n Pstl-Sall-fragmentti sisältää prokymosiinigeenin ja GAPDH-terminaattorin. Hiivan GAPDH 49-geenin promoottori ja transkription terminaattori ovat oleellisesti ottaen samat il kuin julkaisussa Travis, J. Biol. Chem. (1985) 260:4384- **.*. 4389 on selostettu.
*:**: Plasmidi pDMIOO, joka sisältää GAPDH-promoottorin, ·;··; S_. cerevisiaen 0( -tekijän johtosekvenssin ja ihmisen interferonin synteettisen geenin fuusion vieressään • · · *. *. Xbal-kohta ja Sali-kohta ja -tekijän terminaattori, *· *· katkaistiin Xbal: llä ja Sali: llä, käsiteltiin emäsfosfa- 29 107939 taasilla ja liitettiin sen jälkeen edellä mainittuihin 96 ep:n ja 1900 ep:n fragmentteihin. «/-tekijän johtosek-venssi ja terminaattori ovat oleellisesti ottaen samat kuin julkaisussa Brake, Proc. Natl. Acad. Sei USA (1984) 8JL: 4642-4646 on selostettu. Näin saatu plasmidi pDMl00-PC eristettiin ja se sisälsi GAPDH-promoottorin, «/-tekijän johtosekvenssin ja prokymosiinigeenin fuusion. BamHI-liitännäisen täydellinen sekvenssi on esitetty kuvassa 6.
Jotta voitaisiin suorittaa hiivatransformanttien valinta, rakennettiin kaksi plasmidia, pKSlOO ja pAB300.
pKSlOO: Plasmidi pKSlOO rakennettiin sijoittamalla plasmidiin pDMl00-PC 1170 ep:n HindiII-fragmentti YEp24: stä, joka fragmentti sisälsi S. cerevisiaen URA3-geenin.
pAB300: Plasmidi pAB300 rakennettiin sijoittamalla plasmidiin pDMl00-PC 3500 ep:n HindiII-Sali-fragmentti plasmidista pGB901, joka fragmentti sisälsi K_. lactis-LAC 4-geenin 3'-alueen ja G418-resistenssimerkkigeenin. Kuvassa 6 on esitetty plasmidin pDM100-PC GAPDH/^-teki-jä/prokymosiini-BamHI-liitännäinen.
« · 2. K. lactiksen ja S. cerevisiaen transformointi • · • · » :·'· : Plasmidi pKSlOO katkaistiin prokymosiinia kooditta- ! .* valla alueella olevasta Bglll-kohdasta ja tuotteella trans- formoitiin K. lactis-kanta KRN201-6. Tämä kanta on kannan : : : 2UV21 (a lac4 trpl ura3 (kil°)) johdannainen, jossa lac4- geeni on korvattu plasmidin pGB901 LAC4-promoottori-pro-kymosiinigeenifuusiolla. Plasmidin pKSlOO integroituminen kohdistuu näin ollen integroituun prokymosiinia koo-dittavaan alueeseen. Plasmidilla pKSlOO transformoitiin ! ! myös S. cerevisiae-kanta AB110 (o< ura3 leu2 his4 pep4-3 */. (cir°)), jolloin kohdistus tapahtui .**·*·: GAPDH-geenin 3 '-alueella olevaan SagII-kohtaan.
*:·*: Näin saatuja transformantteja kasvatettiin kylläs- tymispisteeseen asti nestemäisessä YEPD-alustassa ja • · *, viljelmien emäliuoksista ja solulysaateista määritettiin « · · • · * 30 107939 kymosiiniaktiivisuus pH-arvossa 2 suoritetun aktivoinnin jälkeen. Taulukossa 5 esitetystä tulosten yhteenvedosta ilmenee, että K. lactis-transformantit erittivät prokymo-siinia tehokkaasti ravinnealustaan, kun taas S. cerevi-siae- transformantit erittivät vain pienen osan tuottamastaan prokymosiinista.
Taulukko 5
Prokymosiinin tuotanto K. lactis- ja S. cerevisiae-trans-formanteissa
Kymosiiniaktiivisuus
Kanta (suhteellista yksikköä/ml viljel mää)
Solu- Viljelmän super- uute , natantti AB110 <0.25 <1.0 AB110::pKS100 15.5 2.3 KRN201-6 <0.25 <1.0 KRN201-6::pKS100 12.0 333.0 • 1 • · ·
• · · ........ 11 " 1 " I - I- - ' I
• · · · » · • 1 · • · · · • · · • Y Plasmidilla pAB300 transformoitiin K. lactis-kanta 2UV21 G418-resistentiksi kohdistamalla integroituminen :Y: LAC4-geenin 3'-alueen EcoRV-kohtaan. Näiden transformant- tien havaittiin myös erittävän prokymosiinia tehokkaasti ravinnealustaan, kuten seuraavasta taulukosta 6 ilmenee.
• · • · · * · · • · « « * 1 1 • » · • · « • · » · • · · 31 107939
Taulukko 6 <*-tekilä/prokymosiinifuusioiden aikaansaama prokymosiinin erittyminen — ,. — .... ....... »-1 — —
Isäntä- Transformoiva Erittynyt kymosiiniaktiivisuus kanta plasmidi (suhteellista yksikköä/ml viljelmää) 2UV21 - <2 KRN201-6 - <2 KRN201-6 pKSlOO 385 2UV21 pAB300 294 B. LAC4-promoottori/o<-teki jän johtosekvenssi/prokymosiini-fuusioiden rakentaminen
Jotta tämä fuusio saataisiin aikaan, rakennettiin kaksi väliplasmidia. Plasmidi pDM100-PC katkaistiin osittain Pstlrllä, liitettiin Sali-PstI-adapteriin, joka ,···. koodittaa -tekijän johtosekvenssin osaa ja kattaa 26 « * ’*·. ep:a LAC4-geenin 5'-alueelta, ja sen jälkeen katkais- tiin HindIII:lla. Tästä seoksesta eristettiin 1500 ep:n • « · I;·/ fragmentti ja se kloonattiin HindiII: 11a ja Sali; llä kat- • · · • ·* kaistuun plasmidiin pUCl8,jolloin saatiin pKS102.
• · \v Synteettinen E. colin lac-operaattori liitettiin • · v.: Sali-kohtaan, joka oli plasmidissa pKS102 aivan o;-tekijän johtosekvenssiä koodittavan alueen 5'-pään vieressä, jolloin saatiin plasmidi pKS103. Tänä tehtiin siksi, että LAC4-promoottori/<X-tekijän johtosekvenssi/prokymosii- nifuusio saattaa olla toksinen E. colille.
• · · 1 t·.·, Plasmidin pKS103 490 ke:n Sall-Bglll-fragmentti • · · *.*. eristettiin ja liitettiin Sall-Bglll-katkaistuun plasmidiin pJD15R. Plasmidi pJD15R on johdettu plasmidista pGB901 poistamalla Sali-kohta täyttämällä pUC19-monikytkijästä, • · jolloin saatiin pJDl5, ja uudelleenkloonaamalla tämän < · • · .·. : jälkeen 8800 ep:n Xbal-fragmentti vastakkaiseen suuntaan.
• · 32 107939 Tästä reaktiosta eristettiin plasmidi pKS105. Nämä plas-midit on esitetty kuvassa 7.
Tämän jälkeen plasmidilla pKS105 transformoitiin K. lactis-kanta CBS 2360 G418-resistentiksi käyttämällä LAC4:n 5'-alueella olevaa SacII-kohtaa kohdistuskohtana, koska kyseessä oli integratiivinen transformointi. Kymo-siinintuotanto on ilmoitettu yksiköinä per ml soluja, kun optinen ODg^o ^00, ks. alla olevaa taulukkoa 7.
Taulukko 7
Plasmidilla pKS105* transformoituneiden K. lactis-solujen prokymosiinineritys
Transformantti__Supernatantti__Pelletti 1 111 3.3 2 147 4.5 3 124 3.7 4 125 3.0 :**[: * Kymosiiniaktiivisuus suhteellisina yksiköinä/ml viljel- ··· mää m* 9 · « » · III »Il « :·.·. Esimerkki 7 • ·
Kluyveromyces lactiksen -tekijän sekvenssin sisältävien I ^ plasmidien rakentaminen tehokkaan erittymisen aikaansaami- ’*’· seksi A. K. lactiksen ek-tekijän signaalisekvenssin eristäminen ja käyttö
Viljelmien emäliuosten biologiset määritykset suori-tettiin julkaisussa Julius et ai., Cell (1983) 32; 839 • · « kuvatulla tavalla käyttämällä koetuskantana (engl. tester) *·**· S. cerevisiae Mat a sst2- 3-kantaa RC687. K. laet is-kantaa *!*” CBS 141(«<) kasvatettiin ravinnealustässä, jossa oli 0,5 • · % glukoosia, 0,17 % hiivan typpiperusalustaa ilman ammonium- • * sulfaattia (Difco) ja 0,002 % ammoniumsulfaattia. Solut • · · • · 33 107939 sentrifugoitiin pois ja viljelmän emäliuokseen lisättiin etikkahappoa pitoisuuteen 0,1 mol/1 ja sen jälkeen emä-liuos laskettiin Bio-Rex 70-pylvään (Biorad) läpi. Pylväs pestiin 0,1 M etikkahapolla ja sen jälkeen o<-tekijä eluoitiin 80 %:sella etanolilla, jossa oli 10 mM HC1. Eluaatti haihdutettiin kuiviin ja jäännös liuotettiin liuokseen, jossa oli 0,1 % trifluorietikkahappoa (TFA) ja 20 % asetonitriiliä, ja saatu liuos sijoitettiin kään-teisfaasi-HPLC-suojakolonniin. Kolonni pestiin vaiheittain liuoksilla, jotka sisälsivät 0,1 % trifluorietikkahappoa ja 20 %, 40 %, 60 % ja 80 % asetonitriiliä. 60 %:n jae, joka sisälsi 0< -tekijäaktiivisuuden, sijoitettiin sen jälkeen analyyttiseen C-18 HPLC-pylvääseen ja eluoitiin gradientilla, jossa oli 20 % - 80 % asetonitriiliä 0,1 %:sessa trifluorietikkahapossa. Kerättiin jakeet ja niistä analysotiin C< -teki j äaktiivisuus. 0( -teki j äaktiivisuutta sisältävät jakeet kuivattiin ja niille suoritettiin aminohapposekvenssin määritys.
B. Plasmidikirjastojen seulonta hybridisoinnilla • · · • · o *··;* Oligonukleotidierät leimattiin käyttämällä γ-( ύΔΈ>) - « · * •••ϊ ATP:tä ja T4-polynukleotidikinaasia. Näillä oligonukleoti- • * : dikoettimilla tutkittiin Southern-blotit tai bakteeripe- • ‘.i säkkeet 42 C:ssa seuraavassa hybridisointiliuoksessa: 4xSSC, 50 mM K^PO^ pH 7, 1 % sarkosyyliä, 10 % dekstraa-nisulfaattia, 200 yag/ml sonikoitua, denaturoitua lohen sperman DNA:ta. Kalvot pestiin 42°C:ssa liuoksessa, jossa oli 2xSSC:tä ja 0,1 % SDS:ää.
Vektoriin pJS109 tehty plasmidikirjasto, joka sisäl- .. si liitännäiset, jotka oli saatu katkaisemalla K. lactis- • * · “ '" kannan SD11 (a trpl lac4) perimä-DNA rajoitetusti Sau3AI: i t **’·| llä ja fraktioimalla koon mukaan >5000 ep:n fragmenttien *;··: puhdistamiseksi, seulottiin näillä koettimilla maljäämällä ·;··* E. coli-kannan HB101 transformantit tiheydessä 500 - 2000 pesäkettä per 80 mm:n malja ja käyttämällä L-agaria, joka » « · \ sisälsi ampisilliiniä 100 jiq/ml. DNA siirrettiin pesäk- • · · • · 34 107939 keistä nitroselluloosakalvoille ja nämä kalvot hybri-disoitiin edelläkuvatulla tavalla. Alkuperäisistä maljoista poimittiin alueet, jotka vastasivat kalvojen hybri-disoituneita alueita, ja poimitut pesäkkeet maljättiin ja hybridisoitiin uudestaan, jotta saatiin erilleen yksittäiset pesäkkeet, joiden plasmidissa oli hvbridisoituvia sekvenssejä. Positiiviset pesäkkeet jatkotestattiin vielä suorittamalla pienistä viljelmistä puhdistetulle DNA:lie Southern-blot-analyysi.
Hybridisoinnissa positiivisiksi osoittautuneiden pesäkkeiden plasmidit katkaistiin erilaisilla restriktio-entsyymeillä ja syntyneet fragmentit analysoitiin Southern-blot-analyysillä samoja hybridisointikoettimia käyttäen, jotta saatiin esiin sopivankokoiset restriktiofragmentit DNA-sekvenssianalyysiä varten. Näin tunnistetut fragmentit puhdistettiin agaroosigeelielektroforeesilla ja kloonattiin sopivaan MP18- tai MP19-vektoriin. Sen jälkeen suoritettiin DNA:n sekvenssianalyysi.
C. Kluyveromyces-b(-teki1än eristäminen ·...· K. lactis-^-tekijän ensimmäiset 10 aminohappoa osoit- >t*·' tivat selvää homologiaa S. cerevisiaen vastaavan kanssa : siten, että oli 6 identtistä tähdettä. Tämä sekvenssi ·*·': oli seuraava: • · .·.·. Trp-Ser-Trp-Ile-Thr-Leu-Arg-Pro-Gly-Gln • « · « · Tämän proteiiniosan perusteella suunniteltiin joukko oligonukleotideja niin, että ne päätelmien perusteella olivat komplementaarisia vastaavalle rakennegeenille, jotta saatiin vastaava rakennegeeni, kuten kuvassa 8 on esitetty. Oligonukleotidivaihtoehdot, jotka sisälsivät ·.·.' kaikki mahdolliset o<-tekijäpeptidin osa-alueen kodonit, syntetisoitiin kahtena eränä, joissa oli vastaavasti ....: 96 ja 48 erilaista molekyyliä.
Nämä kaksi erää leimattiin radioaktiivisesti käyttä- , 32 .. mällä jj~-( P)-ATP:tä ja T4-polynukleotidikinaasia ja kutakin : *.· käytettiin koettimena K. lactis-DNA:n restriktiokatkaisu- • · • · · • «« • · 35 107939 tuotteen Southern-blottauksessa. Erä nro. 2 antoi voimakkaan hybridisaation yhden fragmentin kanssa ja paljon heikomman hybridisaation toisen fragmentin kanssa useissa eri katkaisuissa. Näin ollen erä 2 valittiin K. lactis-perimä-DNA:n plasmidikirjastojen seulontaan
Kun näitä koettimia käytettiin plasmidikirjastojen seulontaan, saatiin eristetyksi useita hybridisoituvia klooneja. Kun yhdelle näistä klooneista, o(fkl8b:lle, suoritettiin DNA-sekvenssin analyysi, havaittiin, että se koodittaa cx-tekijälle sukua olevaa peptidiä, joka on suuressa määrin samanlainen kuin s. cerevisiaen <K~teki jäpeptidin prekursori. Hybridisoituva alue paikannettiin noin 1000 ep:n Pstl-EcoRI-fragmenttiin. Tämän fragmentin sekvenssi on esitetty kuvassa 9. K. lactis-pre-kursori sisältää vain 2 kohtaa, joihin voi sijoittua typpeen liittyvä hiilihydraattiketju. Lisäksi K. lactik- sessa toistuvien alueiden välialueet ovat pitempiä kuin S_. cerevisiaen toistuvien alueiden välialueet ja lisäksi niissä sekvenssi vaihtelee enemmän kaavion X-Ala/Pro mukaan, kun taas S_. cerevisiaen sekvenssi on paremminkin .***: Giu/Ala-Pro. DNA-sekvenssien välinen vertailu osoitti • » · .:. suurta homologia-astetta koko koodattavalla alueella.
·»·· • · • · · • · · HV D. Plasmidien rakentaminen • · · 111 • · • · .·.*. Rakennettiin sarja plasmideja (esitetty kuvassa • · · 10), jotta saatiin aikaan K. lactiksen °<-tekijän johtosek- • · · venssin ja prokymosiinin fuusio ilmentymään voimakkaan promoottorin säätelyn alaisena.
pAB307: ctffkl8b:n 673 ep:n SspI-EcoRI-fragmentin (kuva 9) yli ulottuva EcoRI-säie täytettiin Klenow-entsyy- min avulla ja tasaisiin päihin lisättiin Bglll-kytkijä.
Sitten tämä fragmentti sijoitettiin Bglll-kohtaan, joka liitti yhteen S. cerevisiaen glyseraldehydi-3-fosfaatti- ____: dehydrogenaasigeenin (GAPDH) promoottorialuetta ja ter- • · . . minaattorialuetta. Tämä kasetti kloonattiin plasmidin • · · : V pUC18 BamHI-fragmenttiin, jolloin saatiin plasmidi pAB307.
36 107939 pAB309: Sitten suoritettiin o(-johtosekvenssin ja naudan prokymosiinin sekvenssien yhteenliittäminen.
Ensin pAB307 katkaistiin Ncol:llä ja kohesiiviset päät tehtiin tasaisiksi mung-pavun nukleaasilla käsittelemällä. Sitten näin saatu tuote katkaistiin Sali:llä. Sitten tähän fragmenttiin liitettiin 2000 ep:n EcoRV-Sali-fragmentti, joka sisälsi prokymosiinia koodittavan sekvenssin ja S. cerevisiaen transkriptionlopetusalueen. Tämä fragmentti saatiin plasmidista pJSlll, jossa Xbal-BamHI-adapteri oli liitettynä sellaisen fragmentin 5'-päähän, joka sisälsi prokymosiinin cDNA:n liittyneenä S. cerevisiaen GAPDHrn transkriptionlopetusalueeseen. Saadulla yhteenliit-tämisseoksella transformoitiin E. coli-kanta HB101 ja eristettiin transformantti, jossa oli plasmidi pAB309.
Tämän yhdistelmän liitoskohdan ympärillä olevat sekvenssit on esitetty kuvassa 11 ja plasmidin pAB309 sisältämän koko BamHI-Sali-liitännäisen sekvenssi on esitetty kuvassa 12.
pAB312: Jotta saataisiin aikaan K. lactis-kantojen transformoituminen, sijoitettiin plasmidista pGB901 saatu 3560 ep:n HindiII-fragmentti plasmidiin pAB309, jolloin • · · .:. saatiin plasmidi pAB312. HindiII-fragmentti sisältää m·1 ; K. lactiksen LAC4-qeenin 3 ' -alueen ja fuusion, jossa S.
J!V cerevisiaen ADHl-promoottori on liittyneenä bakteeripe- • · *. ; räiseen G418-resist.enssirakennegeeniin.
pAB313 ja pAB314: Plasmidista pAB309 eristettiin '··1 1900 ep:n SacI-HindiII-fragmentti ja se kloonattiin MP19:ään (Yanisch-Perron et ai., Gene (1985) 33:103). Valmistettiin yksisäikeinen fagi-DNA, jota käytettiin temp-laattina in vitro-mutatoinnissa yhden oligonukleotidialukkeen kanssa, joka oli toinen kuvassa 13 esitetyistä. Vai- • 1 mistettiin M13-fagitMP/ö(kll. 5 ja MP19/fckl2.2 käyttämällä •; vastaavasti alukkeita nro. 1 ja 2.
Kustakin näistä fageista valmistettiin kaksisäi-keinen RF DNA ja kummastakin eristettiin 1100 ep:n • · ·’·1; SacI-StuI-fragmentti. Nämä fragmentit liitettiin plas- • « · 1 « · · 37 107939 midista pAB312 saatuun 7100 ep:n SacI-Stul-fragmenttiin vastaavasti. Saadut plasmidit pAB313 ja pAB314 eristettiin ja niiden sekvenssien erot on esitetty kuvassa 13.
E. Kluyveromyces-hiivan transformointi
Plasmidi pAB312 katkaistiin EcoRV:llä (jotta integroituminen saatiin kohdistetuksi K. laetis-perimän LAC4-alueeseen) ja sen jälkeen sillä transformoitiin K. lactis-kanta 2UV21 (a ura3 trpl lac4 (kil°)) G418-resis-tentiksi. Plasmideilla pAB313 ja pAB314 transformoitiin kanta 2UV21 G418-resistenteiksi. Transformanteista 2UV21::pAB312, 2UV21::pAB313 ja 2UV21::pAB314 kasvatettiin viljelmät ja viljelmien emäliuoksista määritettiin kymosii-niaktiivisuus edellä kuvatul]a tavalla.
Useita näistä transformanteista sekä trans-formoima-tonta kontrollikantaa kasvatettiin 36 tuntia 1 ml:ssa alustaa, jossa oli 1 % hiivauutetta, 2 % peptonia, 2 % glukoosia, 0,17 % hiivan typpiperusalustaa, 50 jig/ml tryp-tofaania ja 50 |ig/ml urasiilia. Sitten viljelmien emä-liuoksista analysoitiin kymosiiniaktiivisuus, kun oli • · · ensin ensin suoritettu aktivointi hapolla. Kaikkien näi- ·;· den transformanttien havaittiin erittävän aktivoitavissa • · · · • olevaa kymosiinia. Saadut tulokset on esitetty seuraa-« · » » vassa taulukossa 8.
• · • · * · « · «
III
· Taulukko 8
• 1 · I
• · ·
Kluyveromyces-hiivan prokymosiinineritys
Kanta Isäntä Plasmidi Kymosiiniaktiivisuus (suhteellista _yksikköä/ml viljelmää) · 2UV21 2UV21 - <2 V.: KRN303-1 2UV21 pAB312 256 KRN304-4 2UV21 pAB313 175 • « KRN305-2 2UV21 pAB314 206 • · 1 ^________^_________^ 11 · • · · • 1 « · • · • 1 1 » · · • · 38 107939
Kunkin transformantin havaittiin erittävän yhtä prokymosiinille sukua olevaa lajia, kun arvioitiin suorittamalla SDS-polyakryyiiamidigeelielektroforeesi trikloo-rietikkahapolla saostetuille viljelmien emäliuoksille. Plasmidin pAB312 erittämä prokymosiinille sukua oleva proteiini näytti olevan molekyylimassaltaan hieman suurempi kuin pAB313- ja pAB314-transformantin erittämät, kun määritys suoritettiin elektroforeettisen liikkuvuuden perusteella.
KRN303-l:n ja KRN304-4:n erittämät päälajit puhdistettiin preparatiivisella SDS-polyakryyliamidigeelielektro-foreesilla ja sen jälkeen niille suoritettiin aminohappo-järjestyksen määritys kaasufaasissa. Näiden lajien N-pään sekvenssit ovat seuraavat: KRN-303-1 15 10 15
Glu-Ala-Asp-Ala-Ser-His-His-Met-Ala-Glu-Ile-Thr-Arg-Ile-Pro KRN304-4 .·*·. 1 5 • t *’! Ala-Glu-Ile-Thr-Arg-Ile • · · ^ • · · · • · • · · • · « "V Näistä tuloksista ilmenee, ettei KRN303-l:n erittä- • · · •\ ·’ mässä prokymosiinille sukua olevassa lajissa ole tapahtu- • « · ’·*·* nut aminopään välikesekvenssissä prosessoitumista, mutta » · *.·.* sen sijaan KRN304-4:n erittämässä lajissa on aito kypsän prokymosiinin aminopää.
Esimerkki 8 t-PA:n erittyminen Kluyveromyces lactiksen toimesta amylo- ♦ · glukosidaasin signaalisekvenssiä käyttäen • ♦ A. Kudostyyppisen plasminoqeenin aktivaattorin cDNA:n • · kloonaus • ·
Kudostyyppistä plasminogeenin aktivaattoria (t-PA) *, *, koodittava cDNA saatiin samoin kuin julkaisussa Pennica et • · · • · · • · 39 107939 ai., Nature (1983) 301:214 on selostettu. DNA:n sekvens-sointi ja restriktiokartoitus varmistivat t-PA:n cDNA:n aitouden. Ilmentämistutkimuksissa käytettiin 2,0 ke:n Bglll-fragmenttia (ks. Pennica et ai.), joka kattoi lähes täydellisen kypsää proteiinia koodittavan alueen 3a koo-dittamattoman 3'-alueen.
B. G418-resistenssimerkkigeenin sijoittaminen plasmi-diin pUC19 DNA-fragmentti, joka sisälsi Tn5-geenin (Reiss et ai. , EMBO J. (1984) .3:3317), joka antaa vastustuskyvyn G418:n suhteen S. cerevisiaen alkoholidehydrogenaasi I:n (ADHI) promoottorin ohjauksessa ollen samanlainen kuin julkaisussa Bennetzen ja Hall, J. Biol. Chem. (1982) 257:3018 on selostettu, sijoitettiin plasmidin pUC19 Smal-kohtaan (Yanisch-Perron et ai., Gene (1985) 3_3 :103). Näin saatu plasmidi, pUCG418, on esitetty kuvassa 14. E. coli, joka sisältää plasmidin pUCG418, talletettiin Centraal Bureau voor Sthimmelcultures-kokoelmiin 4. joulukuuta, 1987, ja sille annettiin tällöin kokoelma-: I numero CBS 872.87.
»1· ·»·
(tM
• j1; C. Plasmidin pGBtPAl rakentaminen IM I «« · • 1/· Muutaman kloonausvaiheen kautta rakennettiin plasmidi :Y: pGBtPAl (ks. kyös kuvaa 15 ja taulukkoa 9), joka sisältää :Yt seuraavat elementit: • · (1) pUCG418 (ks. edellä) katkaistuna Xbal:llä ja Hindlll:11a, (2) Xbal-Sali-fragmentti, joka sisältää laktaasin promoottorin, plasmidista pGB901; « · « **;’ (3) Synteettinen DNA, joka koodittaa Aspergillus » 1 1 *·'·1 awamorin amyloglukosidaasin signaalisekvenssiä (Innis ':··· et ai., Science (1985) 228:21) . Aloituskodonin edessä ....· oleva sekvenssi valittiin, jotta laktaasipromoottorifrag- „.V mentin takana oleva Sali-kohta poistui, ja lisäksi mukana
1 » I
• · • · · 1 · · • M • · 40 107939 on osa iaktaasigeenin koodittamattomasta 5'-alueesta; (4) t-PA:n cDNA:n 2,0 ke:n BqllI-fragmentti (ks. edellä),- (5) synteettinen DNA, joka kattaa osan laktaasigee-nin koodittamattomasta 3'-alueesta.
Taulukko 9
Plasmidin pGBtPAl kaavioesitys
XMI
..........PUCG418..........TCTAGA..... ρϊοηοΜ?έίί ......
...........GTCGATCATCGAGAACTGAAAGATATGTCTTGCCTTATGTCTTTCAGA
TCCCTACTAGCTCTATCCGGTCTAGTTTGTACTGGTCTAGCTAACGTTATCTCCAAGAG Sali Balll Bqlll
VV V
AGTCGACAGATCT.........t-PA cDNA......AGATCTGATATGAATTTATACT
4 · • · ·
•:. TAGATAAGTATGTACTTAGATAAGTATGTACTTACAGGTATATTTCTATGAGATACTGA
Hindin
: ’·1 TGTATACATGCATGATAATATTTAAAGCTT
• ·
Proteiinisynteesi alkaa alleviivatusta ATG-kodonista.
D. Kluyveromyces lactiksen transformointi ja transfor-manttien analysointi ^ K. lactis-kannan CBS 2360 transf ormointi plasmidilla pGBtPAl suoritettiin esimerkissä 2 kuvatulla tavalla.
Transformantteja ja kontrollikantaa CBS 2360 kasvatettiin ·:·1: YEPD-alustassa noin 64 tuntia 30°C:ssa. Solut sentri- fugoitiin erilleen viljelmän ravinneliemestä. Solut uudel- *. leensuspendoitiinfysiologiseen suolaliuokseen optiseen • · · 41 107939 tiheyteen ODg1Q = 300 ja rikottiin ravistelemalla lasihel-mien kanssa 3 minuuttia Vortex-ravistelijassa maksiminopeudella. Rikkoutuneet solunosat poistettiin sentrifugoi-malla.
Mikrotiterlevyissä suoritettiin hyytymänliuotusmää-ritys julkaisussa Wallen et ai., Biochim. Biophys. Acta (1982) 719:318 selostetulla tavalla. Valmistettiin liuos, joka sisälsi 15 mM fosfaattipuskuria (pH 7,3), 0,2 CU/ml plasminogeenia, 1,5 mg/ml fibrinogeeniä ja 0,04 % liivatetta. Jokaiseen koloon laitettiin 10 ^ul trombiinia (13,9 NIH-yksikköä/ml), 25 ;ul näytettä ja 65 ^il plasmino-geeni/fibrinogeeniliuosta, jotka sekoitettiin keskenään. Reaktiota seurattiin mittaamalla OD^g-arvo 30 minuutin välein. Jokaiselle mikrotiterlevylle tehtiin kalibrointi-käyrä melanoomasolujen t-PA:n (Kabi Vitrum) avulla.
Taulukossa 10 on esitetty kymmenen transformantin tyypilliset analyysitulokset. Voitiin osoittaa, että t-PA:ta löytyi plasmidilla pGBtPAl transformoituneen K. lactiksen kasvualustasta.
• · » « » • · · • · · • · • · · • · ♦ 1 • · · 42 107939
Taulukko 10 CBS 2360-viljelmien ja plasmidilla pGBtPAl transformoituneiden CBS 2360-viljelmien hyytymienliuotusmääritys transformantti supernatantin t-PA-aktiivisuus 1 40 μg/l 2 6 Mg/l 3 <3 Mg/l 4 <3 μg/l 5 25 μg/l 6 3 Mg/l 7 3 Mg/1 8 <3 Mg/i 9 3 Mg/i 10 <3 Mg/i CBS 2360 1°) <3 Mg/1 CBS 2360 2°) <3 μg/l CBS 2360 3‘) <3 Mg/1 CBS 2360 4‘) <3 Mg/1 CBS 2360 5') <3 Mg/1
Joistakin solu-uutteista löytyi hieman t-PA-aktiivisuut-.*··. ta ( <_ 3 yag/1) .
« • · · « ΓΊ Suoritettiin analyysit myös SDS-polyakryyliamidi- • · · ***.· geeleillä, jotka oli peitetty plasminogeeni/fibriini- • ·* agaroosigeelillä noudattamalla menetelmää Granelli-Pi- *·’.* perno ja Reich, J. Exp. Med. (1978) 148:223. 200 μΐ CBS 2360-viljelmän tai plasmidilla pGBtPAl transformoituneen CBS 2360-viljelmän emäliuosta saostettiin etanolilla ja uudelleensuspendoitiin 20 jihaan. näytepuskuria 62,5 mM Tris-HCl pH 6,8, 2 % natriumdodekyylisulfaattia, 10 % glyserolia, Bromop-henol Blue-väriä) . Näytteet si- • » joitettiin geeleihin ilman ennalta suoritettua keittämistä. Saadut tulokset (esitetty kuvassa 16) osoittavat, ’·*’· että K. lactis erittää ihmisen t-PA:ta. Lisäksi on selvää, että suurin osa erittyneestä materiaalista on glykosyloi-tunutta.
• · *. \ t-PA:n erittyminen varmistettiin myös käyttämällä 43 107939 ELISA-menetelmää ja siinä ihmisen t-PA:han kohdistuvaa monoklonaalista vasta-ainetta (ESP5, hankittu Biopool-firmasta) sekä kromogeenisellä aktiivisuusmäärityksellä (Kabi Vitrum-yhtiön kaupallinen testi).
Esimerkki 9 t-PA:n erittyminen Kluyveromyces lactiksen toimesta ihmisen seerumialbumiinin signaalisekvenssiä käyttäen A. Plasmidin pGBtPA2 rakentaminen
Muutaman kloonausvaiheen kautta rakennettiin plas-midi pGBtPA2 (ks. kuvaa 17 ja taulukkoa 11), joka sisältää seuraavat elementit: (1) pUCG418 katkaistuna Xbalrllä ja Hindlllrlla; (2) plasmidin pGB901 Xbal-Sall-fragmentti, joka sisältää laktaasin promoottorin; (3) synteettinen DNA, joka koodittaa ihmisen seerumialbumiinin prepro-aluetta; (4) t-PA:n cDNA:n 2,0 ke:n Bglll-fragmentti (ks. esimerkki 8); ... (5) synteettinen DNA, joka kattaa osan laktaasigee- • · *" nin koodittamattomasta 3'-alueesta.
* · · • · · · • · • · · • · · • · · · • · 1 • · · • « • · * · ♦ · · • · • « · « · ♦ « · • · ♦ · · « » · • · « 1 • · · • « « ·
V
• ♦ • · • · • · · • · · • · • · · « · · • · · • · 44 107939
Taulukko 11
Plasmidin pGBtPA2 kaavioesitys
Xbal v ..........pUCG418..........TCTAGA........laktaasipromoottori
Sali v
.............GTCGACAAAAAATGAAGTGGGTTACCTTCATCTCCTTGTTGTTCTT
Bglll
V
GTTCTCCTCCGCTTACTCCAGAGGTGTTTTCAGAAGAGGTGCTAGATCT..........
EcoRV
Bglll XhoI
V VV
t - PA C DNA.....................AGAT CTG ATATCTCG AGAATTTATACTTA
GATAAGTATGTACTTACAGGTATATTTCTATGAGATACTGATGTATACATGCATGATAA
Hindlll v TATTTAAAGCTT.............
Ill *...* Proteiinisynteesi alkaa alleviivatusta kodonista.
»Il : B. K. lactiksen transformointi ja transformanttien analyysi • · · · t .11 ....... — .-..-n 11 1 " • · t : .* CBS 2360-kannan transformointi plasmidilla pGBtPA2 • « :.V suoritettiin esimerkissä 8 kuvatulla tavalla. Trans- « « t^: formantteja ja vertailukantaa kasvatettiin samoin kuin edellisessä esimerkissä on selostettu. Hyytymänliuotus-määritysten tulokset on esitetty yhteenvetona taulukossa 12.
• t i · « « · · • · « · • · · • · » » « • φ « • · » « «· ·
• · I
• ·
« I
• · • · t 4 · « « · 45 107939
Taulukko 12 CBS-2360-viljelmien ja plasmidilla pGBtPA2 transformoituneiden CBS 2360-viljelmien hyytymänliuotusmääritys transforraantti_t-PA-aktiivisuus supernatantissa 1 25 μg/l 2 25 μg/l 3 <3 Mg/l 4 <3 Mg/l 5 6 Mg/l 6 12 μg/l 7 <3 μq/l 8 <3 μq/l 9 <3 μq/l 10 <3 μq/l CBS 2360 1*) <3 μg/l CBS 2360 2’) <3 μq/l CBS 2360 3*) <3 μq/l CBS 2360 4*) <3 μq/l CBS 2360 5*) <3 μg/l
Joistakin solu-uutteista löytyi hieman t-PA-aktiivsiuutta (<3 jig/l).
• •»I « · «*·*· · Esimerkki 10 •» · i » · • · \ Ihmisen seerumialbumiinin erittyminen Kluyveromyces *;*;* lactiksen toimesta t * * • · · A. HSA;n cDNA:n syntetisointi ja kloonaus
Ihmisen seerumialbumiinia koodittava cDNA valmistettiin julkaisussa Okayama ja Berg, Mol. Cell. Biol. (1982) 2:161 selostetulla menetelmällä käyttämällä ihmisen mak- » t · ! sasta valmistettua mRNArta. Tämä cDNA kloonattiin plas-
I « I
V. midista pBR322 johdettuun vektoriin ja sillä transformoi- "!*" tiin E. coli. Transformantit seulottiin käyttämällä ♦;··: oligodeoksiribonukleotidia, joka perustui julkaisussa ..V Lawn et ai., Nucleic Acids Res. (1981) 9:6103 esitettyyn » · *, *, HSA:n cDNA-kloonin sekvenssiin. Valittu cDNA-klooni sek- « · · » · * • · 46 107939 venssoitiin osittain ja tulosta verrattiin Lawn et ai:n sekvenssiin. Vertailu paljasti, että prepro-HSA:ta koodit-tavan alueen ensimmäiset 5 nukleotidia puuttuivat, mutta koodittavan alueen nukleotideissa 9-15 oleva BstEII-kohta oli jäljellä. Tätä BstEII-kohtaa ja koodittamattomalla 3'-alueella olevaa Hindlll-kohtaa (ks. Lawn et ai., edellä) käytettiin alakloonaamisessa ilmentämisvektoreihin.
B. Plasmidin pGBHSAl rakentaminen
Muutaman kloonausvaiheen kautta rakennettiin plas-midi pGBHSAl, joka sisältää seuraavat elementit: (1) pUCG418 (ks. esimerkki 8) katkaistuna Xbal:llä ja HindiII:11a; (2) plasmidin pGB901 (ks. esimerkki 1) Xbal-Sali-fragmentti ; (3) synteettinen DNA (SalI-Hindi11-fragmentti), joka kattaa osan laktaasigeenin koodittamattomasta 3'-alueesta.
Sekvenssi on esitetty taulukossa 13.
*···' Taulukko 13
Plasmidin pGBHSAl SalI-HindIII-fragmentin sekvenssi • *
EcoRV
Sali NotI Bglll XhoI
·.*.· VV V V V
: : : TCGACGCGGCCGCAGATCTGATATCTCGAGAATTTATACTTAGATAAGTATGTACTTACA
GCGCCGGCGTCTAGACTATAGAGCTCTTAAATATGAATCTATTCATACATGAATGT
Hindlll v
GGTATATTTCTATGAGATACTGATGTATACATGCATGATAATATTTAA .. CCATATAAAGATACTCTATGACTACATATGTACGTACTATTATAAATTTCGA
« · ♦ * * ·:··· C. Plasmidin pGBHSA2 rakentaminen vi Plasmidi pGBHSAl katkaistiin Sällillä ja EcoRV:llä ja mukaan liitettiin seuraava synteettinen DNA: • · • · I I · • · · 47 107939
Sali BstEII Stul v vv
TCGACAAAAATGAAGTGGGTAACCATCGATAGGCCTACTGGGCTCGAGATC GTTTTTACTTCACCCATTGGTAGCTATCCGGATGACCCGAGCTCTAG
Alleviivattu ATG-kodoni tarkoittaa aloituskodonia lopullisessa ilmentämisrakenteessa (pGBHSA3, ks. jäljempänä ) .
Nain saadulle plasmidille annettiin nimeksi pGBHSA2.
D. Plasmidin pGBHSA3 rakentaminen HSA:n cDNA-klooni katkaistiin Hindlll:11a ja porrastettu pää täytettiin käyttämällä Klenow DNA-polymeraa-sia I. Sitten DNA katkaistiin BstEII:llä ja BstEII-Hindlll(täytetty)-fragmentti, joka sisälsi lähes täydellisen HSArta koodittavan alueen, puhdistettiin. Plasmidi pGBHSA2 katkaistiin XhoI:llä, porrastetut päät täytettiin käyttämällä Klenow DNA-polymeraasia I ja sen jälkeen katkaistiin BstEII:11a. Näin saatuun vektoriin sijoitettiin HSA:ta koodittava fragmentti (BstEII-HindiII(täytetty). Näin saatu plasmidi pGBHSA3 on esitetty kuvassa 18.
E. Kluyveromyces lactiksen transformointi ja transfor- ’···’ mänttien analysointi • · · * I”! K. lactis-kannan CBS 2360 transformointi plasmidilla ·;·/ pGBHSA3 suoritettiin esimerkissä 2 kuvatulla tavalla.
'' Transformantteja ja kontrollikantaa CBS 2360 kasvatettiin YEPD-alustassa noin 64 tuntia 30°C:ssa. Solut erotet-:.V tiin kasvualustasta sentrifugoimalla. Emäliuoksista otet tiin 30 jj.l:n näytteet ja ne analysoitiin elektroforesoimal-la 10 %:sessa polyakryyliamidigeelissä julkaisun Laemmli, Nature (1970) 227:680 mukaisesti. Kuvassa 19 esitetyistä .·.'. tuloksista ilmenee, että plasmidilla pGBHSA3 transformoi- tuneet K. lactis-solut erittivät HSA:ta kasvualustaan.
·*. Ilmenee myös viitteitä siitä, HSA:ta tuottavissa soluissa • * on muiden proteiinien erittyminen vähäisempää.
Edellä esitetyt tulokset osoittavat, että eksogeeni-; set geenit voidaan saada tehokkaasti ja helposti ilmenty- 48 107939 mään Kluyveromyces-kannoissa. Lisäksi näyttävät Kluyvero-myces-kannat olevan erityisen käyttökelpoisia mitä erilaisimpien proteiinien erittäin tehokkaan erittymisen ja prosessoitumisen aikaansaamiseen, kuten prokymosii-nilla saavutetut tulokset osoittavat. Esillä oleva keksintö tarjoaa rakenteita ja vektoreita, jotka sallivat ekso-geenisen geenin sijoittamisen Kluyveromyces-hiivaan tehokkaiden promoottorien säätelyn alaisuuteen ja haluttaessa voi mukaan olla liitettynä signaalisekvenssi, joka saa aikaan eksogeenisen geenin tuotteen translokaation, erityisesti erittymisen. Näin ollen esillä oleva keksintö tarjoaa fermentointisysteemejä mitä erilaisimpien ekso-geenisten proteiinien kaupallista tuotantoa varten niin, että proteiinit ovat aktiivisessa tai aktivoitavissa olevassa muodossa.
Seuraavat organismit on talletettu American Type Culture Collection-kokoelmiin 30. kesäkuuta, 1987: 2UV21 ATCC No. 20855; KRN201-6 ATCC No. 20854; HB101 pAB307 ATCC No. 67454; HB101 pAB312 ATCC No. 67455.
Vaikka esillä olevaa keksintöä onkin edellä selos- tettu esimerkki- ja valaisumielessä jonkin verran yksityis- *;· kohtaisesti, on selvää, että tietyt muutokset ja muunnok- • · · · • sekt ovat mahdollisia liitteenä olevien patenttivaatimus- • · · · ten kattamissa rajoissa.
• · • · • · • · · • · • · • · 1 • · · • · • t • · · • » · • · ψ « · • · • · · · · • · · • ·

Claims (28)

107939
1. Menetelmä halutun polypeptidin tuottamiseksi Kluyvero-myces-isäntäsolussa, tunnettu siitä, että mainittuun isäntäsoluun tuodaan mainittua haluttua poly-peptidiä koodittava DNA-sekvenssi ja mainittua isäntäsolua, joka sisältää mainitun DNA-sek-venssin, kasvatetaan ravinnealustassa niin, että mainittu haluttu polypeptidi tai sen osa erittyy ravinnealustaan, ja mainittu haluttu polypeptidi tai sen osa eristetään ravinnealustasta.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu DNA-sekvenssi muodostaa osan DNA-rakenteesta, joka siirretään mainittuun isäntäsoluun, ja mainittu DNA-rakenne kattaa transkriptiosuunnassa lueteltuina transkriptionaloituksen säätelysekvenssin, joka toimii mainitussa isäntäsolussa, erittymistä varten sig-naalisekvenssin, joka on heterologinen mainitulle isäntä-solulle tai mainitulle halutulle polypeptidille tai mainitulle isännälle ja mainitulle halutulle polypeptidille, liitettynä lukuvaiheistukseen mainitun DNA-sekvenssin 5'-päähän, mainitun haluttua polypeptidiä koodittavan DNA- ·;· sekvenssin ja transkriptionlopetusta säätelevän alueen, • ;"· joka toimii mainitussa isäntäsolussa, jolloin mainittu isäntäsolu erittää mainittua haluttua polypeptidiä. ! 1
3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tun- ‘ 1 nettu siitä, että mainittu haluttu polypeptidi on ent syymi .
4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu • 1·· siitä, että mainittu entsyymi on kymosiini tai sen pre- : : kursori. • · • · I.!
5. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu »«1 ♦ 1 · « · · • · 107939 siitä, että mainittu entsyymi on plasminogeenin kudosak-tivaattori (t-PA) tai sen mutanttimuoto.
6. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu haluttu polypeptidi on ihmisen seerumialbumiini (HSA).
7. Jonkin patenttivaatimuksista 1-6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu isäntäsolu on Kluyvero-myces-hiivan teollisuuskanta.
8. Jonkin patenttivaatimuksista 1-7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu isäntäsolu on K. lactis tai K. fragills.
9. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu DNA-rakenne sisältää lisäksi vähintään yhden seuraavista: valintamerkki, replikaatiosystee-mi mainitun DNA-sekvenssin autonomista replikoitumista varten ja transformoitumistehokkuutta parantava sekvenssi .
10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnettu *···' siitä, että mainittu replikaatiosysteemi on autonomisesti ...: replikoituva sekvenssi (ARS). » t i
· : · : 11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu autonomisesti replikoituva sekvenssi on Kluyveroznyces-hiivan autonomisesti replikoituva sekvenssi (KARS).
12. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnettu .. siitä, että mainittu valintamerkki on G418-resistenssi.
\ 13. Kluyveromyces-hiivan käyttö isäntänä transformointiin : ! vieraalla geenillä ja tämän ilmentämiseen sekä mainitun 1 • · · · 107939 geenin koodittaman polypeptidin erittämiseen tai mainitun polypeptidin osan erittämiseen, jolloin mainittu haluttu polypeptidi tai sen osa eristetään ravinnealustasta.
14. Transformoitunut K2uyveromyces-isäntäsolu, tunnettu siitä, että se sisältää ilmentämiskasetin, jossa on transkriptiosuunnassa lueteltuina transkriptionaloitusta säätelevä alue, joka toimii mainitussa isäntäsolussa, erittymistä varten signaalisekvenssi, joka toimii mainitussa isäntäsolussa ja on liitettynä lukuvaiheistukseen haluttua polypeptidiä koodittavan DNA-sekvenssin kanssa, ja transkriptionlopetuksen säätelyalueen, joka toimii mainitussa isäntäsolussa, sillä edellytyksellä, että mainittu "erittymistä varten signaalisekvenssi, joka toimii mainitussa isäntäsolussa ja on liitettynä lukuvaiheistukseen haluttua polypeptidiä koodittavan DNA-sekvenssin kanssa" ei ole metionyyli-prokymosiinia, metio-nyyli-preprokymosiinia tai preprotaumatiinia koodittava rakennegeeni.
15. Patenttivaatimuksen 14 mukainen solu, tunnettu siitä, että mainittu signaalisekvenssi on heterologinen mainitulle isäntäsolulle tai mainitulle halutulle polypepti-dille tai mainitulle isäntäsolulle ja mainitulle halu- ·; tulle polypeptidille. » · · • · · ·
16. Patenttivaatimuksen 15 mukainen solu, tunnettu siitä, että mainittu signaalisekvenssi on Saccharomyces cere- .·.· visiae -hiivan a-tekijän signaalisekvenssi.
17. Patenttivaatimuksen 15 mukainen solu, tunnettu siitä, että mainittu signaalisekvenssi on Aspergillus awamorin amyloglukosidaasin signaalisekvenssi.
« ·.· 18. Jonkin patenttivaatimuksista 14-17 mukainen solu, .'.* tunnettu siitä, että mainittu haluttu polypeptidi on .··· kymosiini tai sen prekursori, t-PA tai HSA. • · I I · • · • I » · · · · 107939
19. Jonkin patenttivaatimuksista 14-18 mukainen solu, tunnettu siitä, että mainittuun ilmentämiskasettiin on liitetty vähintään yksi seuraavista: valintamerkki, rep-likaatiosysteemi mainitun DNA-sekvenssin autonomista replikoitumista varten ja transformoitumistehokkuutta parantava sekvenssi.
20. Patenttivaatimuksen 19 mukainen solu, tunnettu siitä, että mainittu replikaatiosysteemi on autonomisesti repli-koituva sekvenssi (ARS).
21. Patenttivaatimuksen 20 mukainen solu, tunnettu siitä, että mainittu autonomisesti replikoituva sekvenssi on Kluyveromyces-hiivan autonomisesti replikoituva sekvenssi (KARS).
22. Jonkin patenttivaatimuksista 19-21 mukainen solu, tunnettu siitä, että mainittu valintamerkki on G418-resistenssi.
23. Xluyveromyces-hiivassa käytettävä DNA-rakenne, tunnettu siitä, että se sisältää transkriptiosuunnassa lueteltuina transkriptionaloituksen säätelyalueen, joka toimii mainitussa isäntäsolussa, erittymistä varten ·· signaalisekvenssin, joka toimii mainitussa isäntäsolussa : ja on liitettynä lukuvaiheistukseen haluttua polypeptidiä ♦ · · · ·♦.· koodittavan DNA-sekvenssin kanssa, ja transkriptionlope- tusta säätelevän alueen, joka toimii mainitussa isäntä- I I solussa, sillä edellytyksellä, että mainittu "erittymistä • · • · • varten signaalisekvenssi, joka toimii mainitussa isäntäsolussa ja on liitettynä lukuvaiheistukseen haluttua polypeptidiä koodittavan DNA-sekvenssin kanssa" ei ole metionyyli-prokymosiinia, metionyyli-preprokymosiinia tai : preprotaumatiinia koodittava rakennegeeni. • · · « « .V
24. Patenttivaatimuksen 23 mukainen DNA-rakenne, tunnettu • · • · siitä, että mainittu signaalisekvenssi on heterologinen ♦ • · · • · • · · • « • · » · · · · • · 107939 mainitulle isäntäsolulle tai mainitulle halutulle poly-peptidille tai mainitulle isäntäsolulle ja mainitulle halutulle polypeptidille.
25. Patenttivaatimuksen 23 tai 24 mukainen DNA-rakenne, tunnettu siitä, että se sisältää lisäksi vähintään yhden seuraavista: valintamerkki, replikaatiosysteemi mainitun DNA-rakenteen autonomista replikoitumista varten ja transformoitumistehokkuutta parantava sekvenssi.
26. Jonkin patenttivaatimuksista 23-25 mukainen DNA-rakenne, tunnettu siitä, että signaalisekvenssiä ja haluttua polypeptidiä koodittava DNA-sekvenssi on liitetty lukuvaiheistuksessa geeniin, joka ilmentyy Kluyveromy-ces-hiivassa.
27. Patenttivaatimuksen 26 mukainen DNA-rakenne, tunnettu siitä, että mainittu DNA-sekvenssi on liitetty toiseen DNA-sekvenssiin, joka koodittaa laktaasigeenin ilmentämiä vähintään neljää N-pään mainohappoa.
28. Plasmidit, tunnetut siitä, että ne ovat pKS105, jonka rakenne on esitetty kuvassa 7, ja joka sisältää LAC4-promoottori/a-faktori-johtosekvenssi/proky- *: mosiini-fuusion, • · · · • ;1 pGB901, jonka rakenne on esitetty kuvassa 2, ja joka »«· :1.1 sisältää laktaasipromoottorin, prokymosiinia koodittavan • 1 geenin, laktaasiterminaattorin ja G418-antibioottiresis- • · tenssimerkkigeenin, * pGBTPAl, jonka rakenne on esitetty kuvassa 15, ja joka sisältää G418-antibioottiresistenssimerkkigeenin, pGB901:n osan, joka sisältää laktaasipromoottorin, Aspergillus awamorin amyloglukosidaasin signaalisekvenssiä • · . : 1 koodittavan synteettisen DNA:n, t-PA:n cDNA:n 2,0 kb • « · ·.· BglII-fragmentin, ja synteettisen DNA:n, joka sisältää .1.1 osan laktaasigeenin 3 1-ei-koodittavasta alueesta, ja • « .···. pGBHSA3, jonka rakenne on esitetty kuvassa 18, ja joka • · · «« « • · • · • · · · · 1 107939 sisältää G418-antibioottiresistenssimerkkigeenin, pGB901:n osan, joka sisältää laktaasipromoottorin, pre-proHSArta koodittavan cDNA-fragmentin ja synteettisen DNA:n, joka sisältää osan laktaasigeenin 3'-ei-kooditta-vasta alueesta. • 1 · ♦ 1 1 * « · • · « · • · * · • · » . •« » • · • « • · • « • · « · * · • · • · • « *·« ♦ · * » » · ♦ · • · • · · • · 1 • · · • -• · 1 ♦ · 107939
FI883540A 1987-07-28 1988-07-28 Kluyveromyces isäntäkantana FI107939B (fi)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US7853987 1987-07-28
US07/078,539 US4943529A (en) 1982-05-19 1987-07-28 Kluyveromyces as a host strain

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI883540A0 FI883540A0 (fi) 1988-07-28
FI883540A FI883540A (fi) 1989-01-29
FI107939B true FI107939B (fi) 2001-10-31

Family

ID=22144683

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI883540A FI107939B (fi) 1987-07-28 1988-07-28 Kluyveromyces isäntäkantana

Country Status (20)

Country Link
EP (1) EP0301670B2 (fi)
JP (1) JPH02476A (fi)
KR (1) KR970007024B1 (fi)
CN (1) CN1026994C (fi)
AR (1) AR247761A1 (fi)
AT (1) ATE97446T1 (fi)
AU (1) AU628018B2 (fi)
CA (1) CA1323850C (fi)
DE (1) DE3885668T3 (fi)
DK (1) DK175203B1 (fi)
ES (1) ES2061632T5 (fi)
FI (1) FI107939B (fi)
GR (1) GR3034358T3 (fi)
HU (1) HU208553B (fi)
IE (1) IE62458B1 (fi)
IL (1) IL87258A (fi)
NO (1) NO302485B1 (fi)
NZ (1) NZ225597A (fi)
PT (1) PT88133B (fi)
ZA (1) ZA885536B (fi)

Families Citing this family (41)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5010182A (en) * 1987-07-28 1991-04-23 Chiron Corporation DNA constructs containing a Kluyveromyces alpha factor leader sequence for directing secretion of heterologous polypeptides
FR2649991B2 (fr) * 1988-08-05 1994-03-04 Rhone Poulenc Sante Utilisation de derives stables du plasmide pkd1 pour l'expression et la secretion de proteines heterologues dans les levures du genre kluyveromyces
CA2017176A1 (en) * 1989-05-22 1990-11-22 Yoshitomi Pharmaceutical Industries Ltd. Albumin gene-containing plasmid, transformant carrying same, production of such transformant and production of albumin
FR2650598B1 (fr) * 1989-08-03 1994-06-03 Rhone Poulenc Sante Derives de l'albumine a fonction therapeutique
US5326700A (en) * 1990-11-06 1994-07-05 Eli Lilly And Company DNA sequences encoding t-PA derivatives with cleavable sites
FR2677996B1 (fr) * 1991-06-21 1993-08-27 Rhone Poulenc Rorer Sa Vecteurs de clonage et/ou d'expression preparation et utilisation.
FR2678636A1 (fr) * 1991-07-02 1993-01-08 Rhone Poulenc Rorer Sa Procede de production de proteines recombinantes et cellules hote utilisees.
IT1251435B (it) * 1991-09-04 1995-05-09 Sclavo Spa Vettore genetico per la integrazione multipla stabile di sequenze di dna nel genoma dei lieviti kluyveromyces lactis e saccharomyces cerevisiae e plasmidi che lo contengono.
FR2686899B1 (fr) 1992-01-31 1995-09-01 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
FR2692907B1 (fr) * 1992-06-25 1995-06-30 Rhone Poulenc Rorer Sa Levures kluyveromyces modifiees, preparation et utilisation.
FR2693475B1 (fr) * 1992-07-08 1994-09-02 Rhone Poulenc Rorer Sa Procédé d'identification et/ou de clonage de promoteurs transcriptionnels, et utilisation de ces promoteurs pour l'expression de gènes.
GB9526733D0 (en) 1995-12-30 1996-02-28 Delta Biotechnology Ltd Fusion proteins
GB9907461D0 (en) 1999-03-31 1999-05-26 King S College London Neurite regeneration
US6265186B1 (en) 1997-04-11 2001-07-24 Dsm N.V. Yeast cells comprising at least two copies of a desired gene integrated into the chromosomal genome at more than one non-ribosomal RNA encoding domain, particularly with Kluyveromyces
CN1059236C (zh) * 1997-04-24 2000-12-06 复旦大学 脆壁克鲁维酵母的高效转化系统
US8372620B2 (en) 1998-12-23 2013-02-12 Dupont Nutrition Biosciences Aps Bacterial xylanases
EP1832599A3 (en) 2000-04-12 2007-11-21 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
US6946134B1 (en) 2000-04-12 2005-09-20 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
GB0020498D0 (en) 2000-08-18 2000-10-11 Sterix Ltd Compound
NZ524814A (en) 2000-09-21 2004-08-27 Basf Ag Talaromyces xylanases
ES2220835T3 (es) 2000-12-07 2004-12-16 Dsm Ip Assets B.V. Metodo para la prevencion o reduccion del enturbiamiento en bebidas.
NZ526271A (en) 2000-12-07 2005-02-25 Dsm Ip Assets B Protein hydrolysates enriched in peptides having a carboxy terminal proline residue
GB0116453D0 (en) 2001-07-05 2001-08-29 Imp College Innovations Ltd Method
PT2279753E (pt) 2001-10-10 2016-01-15 Novo Nordisk As Remodelação e glicoconjugação de péptidos
EP2305311A3 (en) 2001-10-10 2011-07-20 BioGeneriX AG Glycoconjugation of peptides
EP2277910A1 (en) 2001-12-21 2011-01-26 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
AU2003228145B2 (en) 2002-06-07 2009-10-08 Dsm Ip Assets B.V. Improved method for the prevention or reduction of haze in beverages
TWI328612B (en) 2002-07-25 2010-08-11 Dsm Ip Assets Bv Genes and their encoded polypeptides involved in the biosynthetic pathway of vitamin b12, vectors and host cells comprising the genes, and process for producing vitamin b12
CA2522345A1 (en) 2003-04-09 2004-11-18 Neose Technologies, Inc. Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods
GB0403864D0 (en) 2004-02-20 2004-03-24 Ucl Ventures Modulator
ES2246175B1 (es) * 2004-07-30 2007-03-16 Felix Claverie Martin "procedimiento para producir quimosina caprina recombinante para la coagulacion de la leche de cabra en la fabricacion de queso".
BRPI0619381A2 (pt) 2005-11-28 2011-09-27 Dsm Ip Assets Bv preparações de enzimas que não alteram o paladar
GB0600406D0 (en) 2006-01-10 2006-02-15 Univ Bath Crystal
EP1816201A1 (en) 2006-02-06 2007-08-08 CSL Behring GmbH Modified coagulation factor VIIa with extended half-life
EP2333056B1 (en) 2006-04-13 2014-05-07 DSM IP Assets B.V. Liquid composition comprising an aspartic protease
ES2492469T3 (es) 2007-02-20 2014-09-09 Dsm Ip Assets B.V. Nueva sialidasa
WO2008113799A1 (en) 2007-03-22 2008-09-25 Dsm Ip Assets B.V. Novel lysyl oxidases
JP5435657B2 (ja) * 2008-03-18 2014-03-05 国立大学法人山口大学 凝集性酵母、及びその作製法
WO2011101339A2 (en) 2010-02-18 2011-08-25 Dsm Ip Assets B.V. Fermentation broth and filtration filter cake and uses thereof
WO2012007445A1 (en) 2010-07-13 2012-01-19 Dsm Ip Assets B.V. Mutarotase in crystallization
WO2012007446A1 (en) 2010-07-13 2012-01-19 Dsm Ip Assets B.V. Use of a mutarotase in the production of dried powders

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL66614A (en) * 1981-08-28 1985-09-29 Genentech Inc Method of constructing a dna sequence encoding a polypeptide,microbial production of human serum albumin,and pharmaceutical compositions comprising it
SU1662352A3 (ru) * 1982-05-05 1991-07-07 Генентек, Инк (Фирма) Штамм бактерий ЕSснеRIснIа coLI - продуцент активатора плазминогена тканевого типа
IL68733A (en) * 1982-05-19 1989-01-31 Gist Brocades Nv Kluyveromyces cells transformed by a dna sequence encoding a polypeptide,expression vectors containing said dna sequence and process for the transformation of kluyveromyces cells by said vector
EP0116201B1 (en) * 1983-01-12 1992-04-22 Chiron Corporation Secretory expression in eukaryotes
IT1203758B (it) * 1986-03-27 1989-02-23 Univ Roma Vettori di clonazione e di espressione di geni eterologhi in lieviti e lieviti trasformati con tali vettori

Also Published As

Publication number Publication date
IE882314L (en) 1989-01-28
HUT47637A (en) 1989-03-28
AR247761A1 (es) 1995-03-31
DK175203B1 (da) 2004-07-05
KR970007024B1 (ko) 1997-05-02
GR3034358T3 (en) 2000-12-29
IL87258A (en) 1994-02-27
EP0301670A1 (en) 1989-02-01
CN1026994C (zh) 1994-12-14
DK422188D0 (da) 1988-07-28
ES2061632T3 (es) 1994-12-16
AU2014888A (en) 1989-03-02
IL87258A0 (en) 1988-12-30
DE3885668T3 (de) 2000-08-17
FI883540A0 (fi) 1988-07-28
HU208553B (en) 1993-11-29
KR890002407A (ko) 1989-04-10
NO883347L (no) 1989-01-30
PT88133B (pt) 1995-03-01
CN1040052A (zh) 1990-02-28
FI883540A (fi) 1989-01-29
EP0301670B2 (en) 2000-06-14
EP0301670B1 (en) 1993-11-18
ATE97446T1 (de) 1993-12-15
PT88133A (pt) 1989-06-30
DE3885668D1 (de) 1993-12-23
CA1323850C (en) 1993-11-02
ES2061632T5 (es) 2000-12-16
AU628018B2 (en) 1992-09-10
DK422188A (da) 1989-01-29
ZA885536B (en) 1989-04-26
NO302485B1 (no) 1998-03-09
IE62458B1 (en) 1995-02-08
NO883347D0 (no) 1988-07-28
JPH02476A (ja) 1990-01-05
NZ225597A (en) 1991-08-27
DE3885668T2 (de) 1994-05-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI107939B (fi) Kluyveromyces isäntäkantana
US6602682B1 (en) Kluyveromyces as a host strain
FI101232B (fi) DNA-rakenteet, jotka sisältävät Kluyveromyces-hiivan alfa-tekijän joht osekvenssin ohjaamassa heterologisten polypeptidien erittymistä
JP3068139B2 (ja) 酵母よりヒト血清アルブミンおよびその他の異種蛋白質を微生物学的に生産する方法
EP0143081B1 (en) Synthesis of tissue plasminogen activator(tpa) by yeast
EP0100561A1 (en) Yeast hybrid vectors and their use for the production of polypeptides
EP0213593B1 (en) Repressible yeast promoters
EP0341215A2 (en) Improvements in the production of polypeptides
JP2710470B2 (ja) 突然変異菌株の検出法
Hinnen et al. Gene expression in recombinant yeast
EP0288435B1 (en) Process for the production of proteins
JPH0213377A (ja) デスルファトヒルジン化合物の製造方法
EP0672753B1 (en) Multicloning vector, expression vector, and production of foreign protein with expression vector
EP1192263B1 (en) Pichia methanolica glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 1 promoter and terminator
US6998260B1 (en) Recombinant proteolytic tryptases, active site mutants thereof, and methods of making same
WO1991002057A1 (en) Polypeptide production in fungi
JPS63152982A (ja) 新規ｄｎａおよびその用途
JPH07241195A (ja) リゾムコールペプシン様遺伝子およびヒトアポリポプロテインｅ様遺伝子を有する融合遺伝子、その遺伝子が挿入されているプラスミド並びにその用途
JPH03262487A (ja) ヒト血清アルブミンの安定な製造方法
JPH06253858A (ja) げっ歯類アポリポプロテインｅを有する融合遺伝子、それを挿入したプラスミドおよびその用途
WO2001018182A1 (en) Pichia methanolica glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 2 promoter and terminator

Legal Events

Date Code Title Description
GB Transfer or assigment of application

Owner name: DSM N.V.

FG Patent granted

Owner name: DSM IP ASSETS B.V.

MA Patent expired