JP2710470B2 - 突然変異菌株の検出法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は実質的に親株以上に高レ
ベルで外来タンパク質を発現する真菌類の菌株（例え
ば、（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅ）の開発に関する。

【０００２】

【従来の技術】改良された性質、例えば生育特性または
外来ポリペプチドの発現レベルをもつ酵母の菌株を調製
することが知られている。以前の方法では酵素アッセイ
または電気泳動ゲルにのせた抗体を使用した。例えばＥ
Ｐ−Ａ−２０１ ２０８は乳凝固アッセイを用いたＳ．
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの過剰分泌変異株を検出するスク
リーニング法を明らかにしており、ここではプロキモシ
ンが推定される過剰分泌変異株により発現され、分泌さ
れる。本発明は外来ポリペプチドの発現（および、好ま
しくは分泌）のレベルをもつ有用な変異株を同定する改
良法を供給する。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明のある解釈は、
外来ポリペプチドを発現することができる真菌のコロニ
一中での外来ポリペプチドの生産の相対的レベルを決定
する方法を提供し、この方法は固体培地に真菌細胞を植
えること、外来ポリペプチドに選択的に結合する手段を
応用すること、およびその結果できた複合体を視覚化す
ることからなる。

【０００４】「固体」培地は、酵母菌株を固定化するた
めに十分な固体の培地を意味し、それにより産物が視覚
化され、与えられた菌株のコロニーの特性であるとされ
る。液体培地が使用された場合、そのような属性は可能
ではない。適当な栄養を添加された寒天のようなゲルが
通常便利であろう。

【０００５】噴霧または針金を用いた塗布のような一般
に「プレートアウト」と呼ばれる適当な方法により、細
胞は培地上に植えられる。

【０００６】新規の真菌の菌株の選択は、外来タンパク
質、例えばヒトアルブミン（ＨＡ）の生産を含む。非常
に多くの個々の真菌コロニーを、高められたレベルの外
来タンパク質を生産する能力でスクリーニングすること
ができる方法が発見された。

【０００７】

【課題を解決するための手段】酵母によりポリペプチド
が分泌されると、細胞を溶解することなしに生産のレベ
ルを検出することができる。高レベルの生産は、細胞内
でポリペプチドを分泌する正常の能力と共役した高レベ
ルの発現、またはポリペプチドを分泌する強化された能
力に共役した正常レベルの発現、または両方の点で上昇
した能力を示す。ポリペプチドが分泌されないと、細胞
は（外側の薬剤の作用により、または酵母の生育の自然
の成りゆきとして）溶解される。この場合における高レ
ベルの生産は、高レベルの発現を示している。常に真実
であると予測することはできないが、適当な分泌リーダ
ーシグナルが準備されると、ポリペプチドの良好な発現
はまた、しばしば反対に良好な分泌となることを発見し
た。確かに、ポリペプチドを発現および／または分泌す
るための酵母の増加した能力は、ポリペプチド自身に依
存するとは思われない。

【０００８】「ヒトアルブミン（ＨＡ）」という用語
は、ここではヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）と区別でき
ない物質、または変種あるいはその断片、例えばたった
１個またはいくつかのアミノ酸残基が失われた、あるい
は保存された置換の原因となる形態、またはＥＰ−Ａ−
３２２ ０９４に示されたＨＳＡ類似体のような物質を
示すために用いられる。一般にＨＡの変種または断片
は、重量比で、少なくとも５０％（好ましくは、少なく
とも８０、９０または９５％）のＨＡリガンド結合活性
（例えば、ビリルビン結合）および少なくとも５０％
（好ましくは、８０、９０または９５％）のＨＡ腫瘍活
性をもつ。

【０００９】ＨＡを発現し、分泌する能力をもつ真菌の
菌株の遺伝物質は、標準的な手法の範囲のどれかにより
修飾される。これらは電磁放射線、好ましくは紫外部
（ＵＶ）での露光、または化学変異原物質、例えば１，
２，７，８−ジエポキシオクタン、エチルメタンスルホ
ン酸（ＥＭＳ）、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソーＮ−ニト
ロソグアニジン（ＮＴＧ）および４−ニトロ−キノリン
−Ｎ−オキサイド（ＮＱＯ）での処理を含み、これらの
処理は宿主に含まれるＤＮＡ配列を修飾する。これらの
変異のいくつかは致死的変異あるいはＨＡの発現および
／または分泌をなくす変異である。いくつかの変異はＨ
Ａの発現および分泌を高める能力をもつ。これらの有利
な変異をもつクローンは、ヒトアルブミン（ＨＡ）抗体
を含む固体栄養培地上に細胞がひろげられた場合、個々
の細胞が互いに分離するような方法で、検出され、単離
されるべきである。３０℃で７２から９６時間培養され
ると、単離コロニーが栄養培地上に観察される。理想的
には、それぞれのコロニーは単一の細胞から生じる。Ｈ
Ａを発現し、分泌する能力をもつコロニーはコロニーの
周辺に現われる不透明なハロにより検出される。この形
態は分泌されたＨＡと抗ＨＡ抗体との相互作用による。
ハロの大きさはコロニーにより分泌されるＨＡの量に比
例して変化する。

【００１０】ＨＡコーディング領域は好ましくは、プロ
モーター配列、プロモーターの転写支配下にあるＨＡを
コードするＤＮＡ配列および真核生物の転写終了シグナ
ルを含むＤＮＡ配列からなるハイブリッドプラスミドの
中に含まれる。ハイブリッドプラスミドはまた好ましく
は、例えばプラスミドで形質転換された細胞の増殖にお
いて他の機能を果たす付加的なＤＮＡ配列を含む。ＥＰ
−Ａ−２８６ ４２４の「非組み込み」ベクターは、用
いられているハイブリッドプラスミドの例である。

【００１１】例えば参考文献にあげられているＣｈａｒ
ｄの「ラジオイムノアッセイと関連技術慨説」（Ｅｌｓ
ｅｖｉｅｒ １９８２）に明らかにされているような既
知の方法で抗体は生産され、標識される。抗体はポリク
ローンまたは単クローンである。

【００１２】特に外来ポリペプチドがＨＡでないとする
と、抗体とは別の手段によりポリペプチドを視覚化する
ことができる。例えば、既知の方法で標識または印を付
けられたポリペプチドは補因子または補欠分子族（例え
ば、ビチオン、ヘムＦｅ^３＋、ＮＡＤまたはＦＡＤ）あ
るいは細胞表層レセプターのようなある天然のリガンド
に対して高い親和性をもつ。

【００１３】選択遺伝子マーカーは、マーカーの表現型
の発現のために、形質転換体の選択を容易にする遺伝子
である。真菌の適当なマーカーは特に、抗生物質耐性を
発現するもの、または栄養要求変異株の酵母の場合のよ
うに、宿主の欠失を補う遺伝子である。相当する遺伝子
は、例えば抗生物質のシクロヘキシミド耐性を与え、ま
たは栄養要求変異酵母、例えばＵＲＡ１、ＵＲＡ３、Ｌ
ＥＵ２、ＨＩＳ４、ＨＩＳ３、ＴＲＰ５およびＴＲＰ１
遺伝子に原栄養株を供給する。

【００１４】ＨＡ分泌のための適当なプロモーターは、
ホスフォグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ１）遺伝子、Ｇ
ＡＬ１およびＧＡＬ１０遺伝子、ＣＹＣ１、酸性ホスフ
ァターゼ（ＰＨ０５）、ＡＤＨ１、ＡＤＨ２、ＭＦα−
１フェロモン、ＧＢ−Ａ−２１９６ ６３５のプロモー
ターおよびＧＵＴ２（グリセロール−３−ホスフェート
デヒドロゲナーゼ、英国特許公示８９２３５２１．２、
ＳｐｒａｇｕｅとＣｒｏｎａｎ（１９７７）、Ｊ．Ｂａ
ｃｔ．１２９，１３３５−１３４２）に付随したプロモ
ーターである。好ましいプロモーターはＰＲＢ１遺伝子
のものである。

【００１５】Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅの液胞エンドプロテアーゼＢの構造遺伝子で
あるＰＲＢ１は、Ｍｏｅｈｌｅら（（１９８７）Ｇｏｎ
ｅｔｉｃｓ １１５、２５５−２６３）によりＭＫ４お
よびＦＰ８と呼ばれる２個のｐｒｂ１を補うプラスミド
を用いて単離された。酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅが振盪フラスコ培養で、グルコ
ース中で生育されると、プロテアーゼＢ活性は、細胞が
グルコースを代謝し、生育の間に蓄積したエタノールを
使うまで、殆ど全く検出されない（Ｓａｈｅｋｉ，
Ｔ．とＨｏｌｚｅｒ，Ｈ．（１９７５）、Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ３８４、２０３−２１
４；Ｊｏｎｅｓら、（１９８６）、ＵＣＬＡ Ｓｙｍ
ｐ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．Ｎｅｗ Ｓｅｒ．３
３、５０５−５１８）。これはグルコースが排出され、
培養がジオーキシックプラトーに入るまで、ｍＲＮＡの
蓄積を抑制する転写のコントロール機構の結果であると
信じられている（Ｍｏｅｈｌｅら（１９８７）、Ｇｅｎ
ｅｔｉｃｓ １１５，２５５−２６３）。プロテアーゼ
Ｂ（ｐｒｂ１⁻）欠損変異株を用いた研究は、ネガティ
ブの細胞が窒素および炭素源の飢餓状態にされたときに
生じるタンパク質分解におけるプロテアーゼＢを含む
（Ｗｏｌｆ，Ｄ．とＥｈｍａｎｎ，Ｃ．（１９７９）、
Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９８，３７５−３８４；
Ｚｕｂｅｎｋｏ，Ｇ．とＪｏｎｅｓ，Ｅ．（１９８
１）、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ９７，４５−６４）。

【００１６】ＰＲＢ１遺伝子のＤＮＡ配列は１５０ｂｐ
のＰＲＢ１プロモーターとして報告された（Ｍｏｅｈｌ
ｅら（１９８７（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７，４
３９０−４３９９）。より広範囲のＰＲＢ１プロモータ
ーのＤＮＡ配列はまた、ジーンバンクデータベースの受
け入れ番号Ｍ１８０９７、ローカスＹＳＣＰＲＢｌに入
ることで入手できる。

【００１７】ＰＲＢ１プロモーター全体が、または容易
に決定されるように、その小部分が用いられる。例え
ば、開始コドンから上流のＳｎａＢＩ部位までのおよそ
１ｋｂＰ配列が効果的である。

【００１８】適当なプロモーターが外来コーディング配
列がプロモーターの下流に位置し、翻訳開始コドンに関
して正しい読みとり枠であるような制限酵素部位に隣接
してクローニングベクターまたは発現ベクター上に置か
れる。開始コドンはベクター上に（例えば、プロモータ
ーのすぐ３′側）準備され、または外来コーディング配
列の５′端に挿入される。望むならば、本発明のプロモ
ーターと開始コドンの間にリンカーが準備される。好ま
しくは、ＤＮＡ構築物は、クローニングベクター中で構
築物の挿入とクローニングをさせるような合成オリゴヌ
クレオチドリンカーをもつ両端で準備される。プロモー
ター、ＤＮＡコーデイング配列および真菌の転写終了シ
グナルは、操作しやすく互いにつながっている。即ち、
それらはそれらの正常な機能が保持されるように並列さ
れる。それ故、その配列は、発現コントロール配列が適
当なコーティング配列の発現をもたらし、および転写終
了シグナルが適当な転写の終了およびポリアデニレーシ
ョンをもたらすようなものである。これらの配列のつな
ぎ目は、好ましくはエンドヌクレアーゼの認識配列をも
つ合成オリゴヌクレオチドリンカーによりもたらされ
る。

【００１９】適当なプロモーター、ＤＮＡ断片が前記プ
ロモーターの転写コントロール下にある目的のポリペプ
チドをコードするＤＮＡ配列および真核生物の転写終了
シグナルからなる１個または複数のＤＮＡ挿入をもつハ
イブリッドベクターが用いられる。

【００２０】発現コントロール配列とは別に、上記ＤＮ
Ａ断片および転写終了シグナルを含む配列が、プロモー
ターの機能にとって必須ではない、または殆ど重要では
ないが、即ち目的のポリペプチドの発現にとっては、例
えば前記ハイブリッドプラスミドを用いて形質転換され
た細胞の増殖に、重要な機能をはたす付加的なＤＮＡ配
列を含むハイブリッドプラスミドもまた用いられる。付
加的なＤＮＡ配列は原核および／または真核細胞に由来
し、染色体および／または染色体外ＤＮＡ配列を含む。
例えば、付加的なＤＮＡ配列は細菌のまたは真核生物の
プラスミドＤＮＡ、ウイルスＤＮＡおよび／または最
近、酵母または高等真核生物の染色体ＤＮＡのような染
色体ＤＮＡに由来する（または、を含む）。好ましいハ
イブリッドプラスミドは、細菌のプラスミド、特に大腸
菌プラスミドｐＢＲ３２２またはその関連プラスミド、
バクテリオファージ、酵母２μプラスミドおよび／また
は酵母染色体ＤＮＡに由来する付加的なＤＮＡ配列を含
む。

【００２１】好ましいハイブリッドプラスミドでは、付
加的なＤＮＡ配列は酵母の複製開始点および酵母の選択
遺伝マーカーをもつ。酵母の複製開始点、例えば自動複
製断片（ａｒｓ）を含むハイブリッドプラスミドは、染
色体とは別に酵母細胞内で、形質転換後保持され、自動
的に体細胞分裂時に複製される。酵母２μプラスミドに
相同な配列を含むハイブリッドプラスミドが同様に用い
られる。これらのハイブリッドプラスミドは、細胞内に
既に存在する２μプラスミドへ組換えにより組み込ま
れ、あるいは自動的に複製する。ＥＰ−Ａ−２５１ ７
４４の組込ベクターまたはＥＰ−Ａ−２８６ ４２４の
「非組み込み」ベクターが用いられる。

【００２２】都合の良いことに、ハイブリッドプラスミ
ドに存在する付加的なＤＮＡ配列もまた複製開始点およ
び細菌宿主、特に大腸菌に対しての選択遺伝マーカーを
含む。酵母のハイブリッドプラスミドにおいて、大腸菌
複製開始点および大腸菌マーカーの存在に伴う役にたつ
性質がある。第一に、多量のハイブリッドプラスミドＤ
ＮＡが大腸菌の生育および増幅により得られ、第二に、
ハイブリッドプラスミドの構築は、大腸菌に基づく全て
のクローニング技術を利用して、大腸菌で容易に行われ
る。ＰＢＲ３２２などのような大腸菌プラスミドは、大
腸菌複製開始点および抗生物質、例えばテトラサイクリ
ンおよびアンピシリンに耐性を与える大腸菌の遺伝マー
カーの両者を含み、酵母のハイブリッドベクターの一部
として都合良く用いられる。

【００２３】ハイブリッドベクターは、それぞれとりわ
け発現コントロール配列および目的タンパク質を暗号化
するＤＮＡ配列からなる１個または複数のＤＮＡ挿入を
含む。ハイブリッドベクターが複数のＤＮＡ挿入、例え
ば２から４個のＤＮＡ挿入を含むとすると、これらは直
列に配列して、またはハイブリッドベクターの異なる位
置に存在する。好ましいハイブリッドベクターは、１個
のＤＮＡ挿入または直列配列のＤＮＡ挿入を含む。ＤＮ
Ａ挿入は特に前から後ろへ配置される。

【００２４】ハイブリッドプラスミドは技術的に知られ
た方法により調製される。ハイブリッドベクターの調製
過程は、本発明のプロモーターを含む１個または複数の
ＤＮＡ構築物、ＤＮＡ断片が前記の発現コントロール配
列の転写コントロール下にある目的のポリペプチドをコ
ードするＤＮＡ配列からなるＤＮＡ断片および真菌の転
写終了シグナルを含むＤＮＡ配列を導入する、または前
記ＤＮＡ構築物の成分を連続的に先に決定した順序でベ
クターＤＮＡに導入することからなる。

【００２５】ハイブリッドプラスミドの構築は、従来の
連結法を応用して実施される。プラスミドの構成物は、
通常の制限酵素部位により、および／または合成リンカ
ー分子の手段により、および／または平滑末端連結によ
り連結される。

【００２６】本発明の方法に有効な真菌細胞は、Ｐｉｃ
ｈｉａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒ
ｏｍｙｃｅｓ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉ
ｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒ
ｏｍｙｃｅｓ、Ｃｉｔｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐａｃｈｙｓ
ｏｌｅｎ、Ｄｅｂａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｍｅｔｓｃｈｕｎ
ｉｋｏｗｉａ、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ、Ｌｅｕ
ｃｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ、Ｂｏｔｒｙｏａｓｃｕｓ、Ｓ
ｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ、Ｅｎｄｏｍｙｃｏｐｓｉｓ
などの属を含む。好ましい属は、これらの酵母のＤＮＡ
を操作する能力が、現在のところ上述の他の属よりも高
度に開発されているために、Ｐｉｃｈｉａ、Ｓａｃｃｈ
ａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｙａ
ｒｒｏｗｉａおよびＨａｎｓｅｎｕｌａからなるグルー
プから選択される。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓの例
は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ Ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｉｔａｌｉｃｕｓお
よびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｒｏｕｘｉｉであ
る。Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓの例は、Ｋｌｕｙｖｅ
ｒｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓおよびＫｌｕｙｖｅ
ｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓである。Ｈａｎｓｅｎｕ
ｌａの例は、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈ
ａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ａｎｏｍａｌａおよびＨａｎ
ｓｅｎｕｌａ ｃａｐｓｕｌａｔａである。Ｙａｒｒｏ
ｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａは適当なＹａｒｒｏｗｉ
ａ種の例である。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ
は繊維状真菌の例である。

【００２７】Ｐｉｃｈｉａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ
ｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｙａｒｒｏｗｉａお
よびＨａｎｓｅｎｕｌａ属の真菌細胞が細胞壁の酵素消
化によりスフェロプラストをつくることにより形質転換
されることが示された；スフェロプラストは形質転換Ｄ
ＮＡと混合され、カルシウムイオンおよびポリエチレン
グリコール存在下でインキュベートされた後、形質転換
されたスフェロプラストは再生培地で再生される。

【００２８】Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの形質転換の方
法は、ここで参考文献として全てあげられている、ＥＰ
２５１ ７４４、ＥＰ ２５８ ０６７およびＷＯ
９０／０１０６３の中で、一般的に教えられる。ハイブ
リッドベクターを用いた酵母の形質転換は、Ｈｉｎｎｅ
ｎらにより述べられた方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５，１９２９（１９７８）に
従って実施される。この方法は３段階に分けられる：

【００２９】（１）カタツムリの消化管のジュースのよ
うなグルコシダーゼの各種標品（例えば、グルスラーゼ
^Ｒまたはヘリカーゼ^Ｒ）または微生物から得られる酵素
の混合物（例えば、ザイモリアーゼ^Ｒ）を浸透圧を安定
させる溶液（例えば、１Ｍソルビトール）中で用いた酵
母細胞壁またはその部分の除去。

【００３０】（２）ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）
およびＣａ^２＋存在下でのＤＮＡベクターを用いた「裸
の」酵母細胞の処理。

【００３１】（３）寒天の固層での細胞壁の再生および
形質転換細胞の選択。この再生は、都合の良いことに
は、寒天中にスフェロプラストを埋め込むことにより行
われる。例えば、融解した寒天（約５０℃）がスフェロ
プラストと混合される。酵母の生育温度（約３０℃）ま
で溶液を冷却することにより固層が得られる。この寒天
層はスフェロプラストからの必須の巨大分子の急速な拡
散および損失を妨げるためであり、それにより細胞壁の
再生が容易になる。しかし、細胞壁の再生はまた、（低
効率ではあるが）スフェロプラストを予め形成しておい
た寒天層の表面にプレートすることにより得られる。

【００３２】好ましくは、再生寒天は形質転換細胞の再
生および選択が同時になされるような方法で調製され
る。アミノ酸生合成径路の酵素をコードする酵母の遺伝
子は、一般に選択マーカーとして用いられるので（−ｓ
ｕｐｒａ）、再生は好ましくは酵母の最少寒天培地で行
われる。非常に高い効率の再生が必要とされるならば、
次の２段階の方法が有利である：（１）栄養豊富な合成
培地での細胞壁の再生、および（２）細胞層の選択寒天
培地へのレプリカプレートによる形質転換紬胞の選択。

【００３３】ＤＮＡベクターが真核生物宿主細胞を形質
転換するために用いられる直鎖状ＤＮＡベクターである
場合、形質転換は好ましくは酵母の選択マーカーを含む
第２のベクターの存在下で行われる。このコトランスフ
ォーメーションは、直接的に選択されないＤＮＡを取り
込む宿主細胞を豊富にさせる。コンピテント細胞がどの
ような型のＤＮＡも取り込むので、選択ベクターで形質
転換された細胞の高パーセンテージのものもまた（上記
の直鎖状ＤＮＡベクターのような）付加的なＤＮＡをも
つ。形質転換された宿主細胞は、目的のポリペプチドの
生産に関して、技術的に知られた方法を用いた突然変異
および選択により改良される。突然変異は、例えばＵＶ
照射または適当な化学試薬によりもたらされる。プロテ
アーゼＡおよびＢを欠損した菌株が特に好ましい；その
ような菌株は一般に入手可能である。

【００３４】転写終了シグナルは転写終了およびポリア
デニレーションの適当なシグナルを含む真核生物遺伝子
の３′隣接配列である。適当な３′隣接配列は、例えば
発現コントロール配列に天然に連結した遺伝子のものが
ある。代わりになるものとして、それらは異なるもので
ある。好ましくは、終了シグナルはＳａｃｃｈａｒｏｍ
ｙｃｅｓ Ｃｅｒｅｖｉｓｉａ ＡＤＨ１遺伝子のもの
である。

【００３５】本発明の第二の性状は、外来ポリペプチド
を発現、分泌できる真菌の菌株を得る過程を供給する。
この過程は（１）変異株を作成するために、真菌細胞を
変異原物質にさらすこと、（２）請求項１から６までの
いずれかに従った方法により、外来ペプチドの分泌の相
対的レベルを決定すること、および（３）前記真菌細胞
以上のレベルの発現での目的レベルの外来ポリペプチド
を発現する菌株を分離することからなる。

【００３６】本発明の第三点は改良された真菌の菌株を
発酵させ、それにより発現されるペプチドを得る過程を
供給する。（用語はオリゴペプチドおよびポリペプチド
を含む）ペプチドは菌株選択段階で発現されるポリペプ
チドと同一または異なる。異なる場合、明らかに適当な
発現手段（適当なプロモーターおよびコーディング領域
等）が良く知られているように存在する。通常、元来の
ポリペプチドの発現手段が、新規の発現手段の前、間、
または後に除去される。

【００３７】外来ペプチドは、フィブロネクチンまたは
その部分（例えば、ＥＰ ２０７７５１に述べられてい
るコラーゲンまたはフィブリン結合部分）、ウロキナー
ゼ、ブロウロキナーゼ、ＣＤ４の１から３６８の部分
（Ｄ．Ｓｍｉｔｈら、（１９８７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３
２８、１７０４−１７０７）、血小板由来生長因子（Ｃ
ｏｌｌｉｎｓら、（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１６、
７４８−７５０）、形質転換生長因子β（Ｄｅｒｙｎｃ
ｋら、（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１６、７０１−７
０５）、Ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子の１から２
７２の部分（Ｂｏｎｔｈａｍら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．１４５ ７１２５−７１２７）、フィブロネ
クチンのカテプシンＤ断片（５８５−１５７８）、α_１
−アンチトリプシン、プラスミノーゲンアクチベーター
阻害剤、第ＶＩＩＩ因子、α−グロビン、β−グロビ
ン、ミオグロビン、神経生長因子ＬＡＣＩ（リポタンパ
ク質付随凝固阻害剤）、ラクトフェリンまたは血小板由
来内皮細胞生長因子（ＰＤＥＣＧＦ）またはこれらのい
ずれかの保存性の変種である。ポリペプチドはまた、Ｈ
ＳＡまたはそのＮ末端部分の融合および上記のようなそ
の他のポリペプチドである。

【００３８】ペプチドは好ましくは最初は、分泌リーダ
ー配列をもった融合体として発現される。これは例え
ば、天然のＨＡリーダー、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ｃｅｒｅｖｉｓｉａ ＭＦα−１のリーダー、Ｋｌｕ
ｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓのキラー毒素のリ
ーダー、天然ＨＡリーダーおよびＭＦα−リーダー配列
の融合、またはＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔ
ｉｓのキラーリーダーおよびＭＦα−１リーダー配列の
融合である。それ故、少なくとも酵母では、リーダーは
次のリーダー配列のいずれかである：

【００３９】

【表１】 または、

【００４０】

【表２】 またはＷＯ ９０／０１０６３に述べられているように
どちら下の配列の保存的な修飾された変種。

【００４１】形質転換真菌の発酵および目的ペプチド産
物の分離は、例えば「酵母のバイオテクノロジー」
（Ｄ．Ｒ．Ｂｅｒｒｙ， Ｉ．Ｒｕｓｓｅｌ ＆ Ｇ．
Ｇ．Ｓｔｅｗａｒｔ編、Ａｌｌｅｎ ＆ Ｕｎｗｉｎ）
に述べられている既知の手段により実施される。

【００４２】Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａ、Ｓｃｈｉｚｏｓ
ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅまたはＫｌｕｙ
ｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓのような他の酵母、
またはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ＳＰＰ．のような他の
真菌を用いた発明および新規プロモーターの変異の検出
方法が用いられる。

【００４３】発明の好ましい点は例および次の図に述べ
られている：

【００４４】図１から７は、ｐＡＹＥ３３３、ｐＡＹＥ
３３４、ｐＡＹＥ３２８、ｐＡＹＥ３３５、ｐＡＹＥ３
０９、ｐＳＡＣ３５およびｐＡＹＥ３１６のそれぞれの
プラスミド地図である。

【００４５】図８は２菌株、ＤＢ１ ｐＡＹＥ３１６お
よびＤＳ６５ ｐＡＹＥ３１６の振とうフラスコ培養で
観察されたＨＡ ｍＲＮＡの蓄積を述べたノーザンプロ
ットで、ＲＮＡはＡ）対数増殖期中期およびＢ）対数増
殖期後期の細胞から抽出された。

【００４６】図９はプラスミドｐＤＢＰ１、ｐＤＢＰ２
の構築を示す。

【００４７】図１０から１４は、ｐＤＢＰ５、ｐＤＢＰ
６、ｐＤＢＰ７、ｐＤＢＡ１およびＤＢＡ２のそれぞれ
のプラスミド地図である。

【００４８】標準的な組換えＤＮＡの方法は、Ｍａｎｉ
ａｔｉｓらにより述べられた「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａ
ｌ」（コールドスプリングハーバー研究所、コールドス
プリングハーバー、ニューヨーク）およびその第２版
（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）による。

【００４９】

【実施例】例１：ＨＡ分泌プラスミドの調製

【００５０】プロテアーゼＢプロモーターを含有する
１．４４０ｋｂｐ ＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ ＤＮ
Ａフラグメント（ＳＥＱ１）を、Ｍ１３バクテリオファ
ージｍＰ１８のポリリンカー中にクローン形成させ、
（Ｙａｎｉｓｈ−Ｐｅｒｒｏｎ等による（１９８５）Ｇ
ｅｍｅ３３、１０３〜１１９）、プラスミドＰＡＹＥ３
３３を生じさせる（図１）。プラスミドｐＡＹＥ３３３
を、ＳｍａＢ１による部分的消化によって、線状にし、
次いで二重鎖オリゴヌクレオチドリンカー１を、このＰ
ＲＢ１プロモーター内のＳｎａＢ１部位で、連結反応に
よって挿入する。

【００５１】

【表３】

【００５２】これによって、プロテアーゼＢプロモータ
ーの５′末端に、ＮｏｔＩ制限部位が生じる。このプロ
モーター要素を、製造者用説明書に従い、特定部位の突
然変異誘発によって、（オリゴヌクレオチド直接インビ
トロ突然変異誘発システム−バージョン２、Ａｍｅｒｓ
ｈａｍ）、さらに修飾する。３１−ｍｅｒ オリゴペプ
チド

【００５３】

【表４】 による突然変異誘発は、ＡＴＧ翻訳開始コドン：

【００５４】

【表５】 に近い、ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を導入する。

【００５５】プラスミドｐＡＡＨ５（Ｇｏｏｄｅｙ等に
よる、Ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｙ、４０１〜４２９頁（１９８７）、Ｂｅｒｒｙ，Ｄ．
Ｒ．，Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｉ．およびＳｔｅｗａｒｔ，
Ｇ．Ｇ．編集、Ａｌｌｅｒ ａｎｄ Ｕｎｗｉｎ出版）
を、ＢａｍＨＩによる部分的消化によって線状にした。
その５′突出末端をＴ４ ＤＮＡポリメラーゼおよびｄ
ＮＴＰｓでブラント末端形成させ、二重鎖オリゴヌクレ
オチド リンカー１と連結させた。ＡＤＨＩターミネー
ターの３′末端で、ＢａｍＨＩ部位がＮｏｔＩ制限部位
で置き換えられている組換えプラスミドｐＡＹＥ３３４
（図２）を選択した。

【００５６】プラスミドｐＡＴ１５３〔Ｔｗｉｇｇ ＆
ＳｈｅｒｒａｔｔによるＮａｔｕｒｅ ２８３、２１
６〜２１８頁（１９８０）〕を、ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨ
Ｉで消化させ、その大きい方の３．３６ｋｂｐ ＤＮＡ
フラグメントを精製した。５′突出末端は、Ｔ４ ＤＮ
ＡポリメラーゼおよびｄＮＴＰｓでプラント末端形成
し、次いで二重鎖オリゴヌクレオチド リンカー１で再
び環形成し、プラスミドｐＡＹＥ３２８（図３）を生成
させた。

【００５７】０．８ｋｂｐ ＮｏｔＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ
修飾プロテアーゼＢプロモーター配列を、プラスミドｐ
ＡＹＥ３２８に由来するｐＡＴ１５３上で、０．４５ｋ
ｂｐＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ ＡＤＨＩ転写ターミネ
ーターの上流に配置し、ｐＡＹＥ３３５（図４）を生成
させた。

【００５８】プラスミドｐＡＹＥ３０９（図５）は、Ｈ
ｉｎｄＩＩＩ線状ｐＡＹＥ３３５（図４）と二重鎖オリ
ゴヌクレオチド リンカー２（その５′−３′鎖はＳＥ
Ｑ５を構成している）

【００５９】

【表６】

【００６０】とＸｈｏＩ線状のｍｐ１９．７（ＥＰ−Ａ
−２０１２３９）から遊離された１．９ｋｂｐ ＨＡ
ｃＤＮＡフラグメントとの間で、３種連結させ、ＳＩヌ
クレアーゼでブラント末端形成し、次いでＨｉｎｄＩＩ
Ｉで消化させた。印を付けられているＡＴＧは、融合リ
ーダー分泌配列のためのオープンリーデング フレーム
の開始点を示している。

【００６１】プラスミドｐＡＹＥ３０９で作り出された
３．２ｋｂＰ ＮｏｔＩ制限フラグメントを次いで、ユ
ニークなＮｏｔＩ制限部位を含有する、適当な酵母菌複
製性ベクター（たとえば、ｐＳＡＣ３５、図６）に転移
し、プラスミドｐＡＹＥ３１６を作り出した（図７）。

【００６２】プラスミドｐＳＡＣ３５は、Ｃｈｉｎｅｒ
ｙおよびＨｉｎｃｈｌｉｆｆｅにより記載された（Ｃｕ
ｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１６、２１〜２５頁（１９８９）お
よびＥＰ２８６４２４）、ｐＳＡＣ３の誘導体である。
ＬＥＵ２選択性マーカーは、ｐＳＡＣ３のＳｎａＢＩ部
位に挿入された、ＹＥｐ１３〔Ｂｒｏａｃｈ，Ｊ．Ｒ．
等によるＣｅｌｌ １６、８２７〜８３９頁（１９７
９）〕からの、１．９５ｋｂｐ ＳａｌＩ−ＨｐａＩフ
ラグメントである。ＬＥＵ２遺伝子は、ユニークなＴｔ
ｈｌｌｌ Ｉ部位を有する。この酵素による消化の後
に、５′突出部位は、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼＩで処
理することによって満される。ＮｏｔＩ認識部位の挿入
によるｐＳＡＣ３５の生成は、このブラント末端線状Ｄ
ＮＡを二重鎖オリゴヌクレオチド リンカー１と連結す
ることによって達成される。

【００６３】プラスミドｐＡＹＥ３１６を、Ｈｉｎｎｅ
ｒ等によりＰ．Ｎ．Ａ．Ｓ．７５、１９２９頁（１９７
８）に記載された方法によって、サッカロマイセス セ
レビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅ）株ＤＢｌ（ＭＡＴａ、１ｅｕ２、〔ｃｉｒ
°〕）中に導入した。形質転換体は、ロイシンを含有し
ていない最小培地で選択した（酵母窒素基剤、Ｄｉｆｃ
ｏ）。形質転換体を、複合液状培地〔ＹＥＰ １％（Ｗ
／Ｖ）酵母エキス、２％（Ｗ／Ｖ）バクトペプトンおよ
び２％（Ｗ／Ｖ）ショ糖〕、あるいは規定液状培地
〔０．１５％（Ｗ／Ｖ）のアミノ酸および硫酸アンモニ
ウムを含有していない酵母窒素基剤、０．５％（Ｗ／
Ｖ）硫酸アンモニウム、０．１Ｍクエン酸／Ｎａ_２ＨＰ
Ｏ_４・１２Ｈ_２Ｏ、ｐＨ６．５、２％（Ｗ／Ｖ）ショ
糖〕のどちらかを１０ｍｌ含有する５０ｍｌフラスコ中
で、３０℃、２００ｒｐｍで、７２時間、増殖させる
と、細胞を含有していない培養物上澄液中に、ＳＤＳ−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって、および（ま
たは）ロケット免疫ゲル電気泳動によって、ＨＡを検出
することができた。

【００６４】 例２：ＨＳＡを使用する超分泌性菌株の調製 ＤＢＩ ｃｉｒ°（ｐＡＹＥ３１６）の突然変異株を、
当技術で既知の方法によって調製した。要約すると、Ｄ
ＢＩ ｃｉｒ°（ｐＡＹＥ３１６）を、規定培地におい
て、光学濃度ＯＤ_６０００．５〜１．０（中間対数増殖
期）まで増殖させた。この培養物２０ｍｌを、遠心処理
し、上澄液を捨て、細胞を、ショ糖を含有していない規
定培地２０ｍｌ中に再懸濁した。この細胞を次いで、利
用できる多くの化学的突然変異誘発物質のうちの一種
で、１０〜３０％の生存率が得られるように処理した。
この突然変異した細胞を次いで、２．５％（Ｖ／Ｖ）ウ
サギ抗ＨＡ抗体（Ｃａｍｂｉｏ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，
英国）を含有するＹＥＰ、２％ショ糖、１％（Ｗ／Ｖ）
アガロース板上に展延し、３０℃で少なくとも７２時間
インキュベートした。各培養板に適用した各細胞の数
を、１ｃｍ^２当りで１〜２個のコロニイが発現するよう
に調節した。コロニイの大きさが大きくなるに従い、コ
ロニイの周囲に、不透明な沈降素の輪が生じた。培地中
に、高められたレベルでＨＡを分泌するＤＢＩ ｃｉｒ
°（ｐＡＹＥ３１６）の突然変異株を、この沈降素の輪
の大きさの増加によって、直接に検出した。最大の輪を
生じるコロニイを同定し、規定培地寒天板上で継代培養
し、次いで上記の複合液状培地および規定液状培地でＨ
Ａを分泌する、それらの能力に関して評価した。

【００６５】超産生性の菌株を同定する場合には、この
プラスミドの株を固定し、次いでこの〔ｃｉｒ°〕突然
変異株をプラスミドｐＡＹＥ３１６により、ロイシン原
栄養株に戻す再形質転換を行なうことによって、この突
然変異の場所（染色体対エピソーム）を確立した。この
突然変異がゲノム中に局限化されている場合には、この
再形質転換された菌株は、高められたレベルでＨＡを分
泌する能力を保有する。

【００６６】発現する沈降素の輪は一般に、淡く、かつ
またぼんやりしている。従って、好ましくは、清明な培
地を使用する。従って、アガロースは寒天よりも好まし
い。固形培地（清明でない場合）の濃度およびそこに沈
着した細胞の密度は、最も明確な結果が得られるように
選択することができる。

【００６７】異種ポリペプチドが分泌されない場合で
も、細胞を機械的に、化学的に、または酵素的に、慎重
に溶解させることによって、あるいは自己消化を生起さ
せることによって、検出することができる。

【００６８】別の態様においては、細胞をアガロースま
たは他の適当な培地上で、平板培養し、次いで「Ｇｅｌ
ｂｏｎｄ」（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、スウェーデン国）な
どの親水性プラステイック シート上で乾燥させる。こ
の方法は、低レベルの発現が得られる場合に特に有用で
ある。この抗体−ＨＡ複合体は次いで、たとえばＣｏｏ
ｍａｓｓｉｅ Ｂｌｕｅで染色して、青色輪が見られる
ように、可視化することができる。

【００６９】超分泌性の菌株は、再度、突然変異させる
ことができる。突然変異を継続的に繰返すと、この菌株
の生産性は増大する。この方法で、一連の突然変異菌株
を発現させた（表１）。これらの突然変異の起源はいず
れも染色体にあった。ＤＳ３７ ｃｉｒ°（ｐＡＹＥ３
１６）は、元来、ＤＢＩ ｃｉｒ°（ｐＡＹＥ３１６）
の超分泌性突然変異株であることが見い出された。しか
しながら、この結果は、上記の複合液状培地中で評価し
た場合に、この菌株がＤＢＩ ｃｉｒ°（ｐＡＹＥ３１
６）よりも有意に高いレベルでは、ＨＡを分泌しなかっ
たことを示している。

【００７０】

【表７】

【００７１】この突然変異の正確な遺伝子座は知られて
いない。しかしながら、２回の突然変異の表現型効果は
部分的に特徴付けされている。親菌株ＤＢＩ ｃｉｒ°
（ｐＡＹＥ３１６）におけるＨＡ ｍＲＮＡの安定状態
レベルは、振盪フラスコ培養で増殖する間に見られるプ
ロテアーゼＢ ｍＲＮＡのレベルに反映する〔Ｍｏｅｈ
ｌｅによるＧｅｎｅｔｉｃｓ １１５、２５５〜２６３
頁（１９８７）〕。株ＤＳ６５ｃｉｒ°（ｐＡＹＥ３１
６）の増大した産生性をもたらす突然変異は明らかに、
対数増殖期間中のプロテアーゼＢ プロモーターからの
ＨＡ ｍＲＮＡの本質的な発現を可能にする（図８）。

【００７２】２回目の突然変異は明らかに、活性プロテ
アーゼＡの合成を壊滅させる。この突然変異で最初に同
定された菌株、ＤＳ２１２ｐｅｐ⁻ｃｉｒ°（ｐＡＹＥ
３１６）は、その親の菌株ＤＳ２１２ ｃｉｒ°（ｐＡ
ＹＥ３１６）と区別できないレベルでＨＡを分泌する。

【００７３】例３：ＰＡＩ−２の細胞内発現 ヒト単球様組織球リンパ腫セルラインＵ９３７（これ
は、ＣｌｏｎｔｅｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎ
ｃ．から得られる）の４−ホルボール−１２−ミリステ
ート−１３−アセテート刺激された細胞から単離され
た、ｍＲＮＡから構築されたラムダｇｔｌｌ ｃＤＮＡ
ライブラリイを、プラスミノーゲン アクチベーター
インヒビター タイプ２（ＰＡＩ−２）ｃＤＮＡ源とし
て使用した。このライブラリイを、ＰＡＩ−２タンパク
質のＮ−末端（オリゴ１）およびＣ−末端（アミノ酸４
００−４１０）をそれぞれコードするＤＮＡ配列に相当
する放射能ラベルを付けたオリゴヌクレオチド プロー
ブを用いて、スクリーニングした。

【００７４】

【表８】

【００７５】

【表９】

【００７６】推定上でポジティブのクローンから、完全
ＰＡＩ−２コード領域を含有するものと見做される１個
のクローン（ラムダｇｔｌｌ−１８６）を選択した。こ
れは、このクローン（ＳＥＱ８）中の挿入ＤＮＡの配列
を分折し、次いでＭｌ３ｍｐ１９に移し、ｐＤＢＰ１を
形成することによって確認した（図９）。ＳＥＱ８にお
いては、位置４２でＡＴＧがコード領域の開始を示し、
位置１２８７でＴＡＡが停止コドンである。

【００７７】発現ベクター中への挿入を容易にするため
に、制限酵素認識部位を、このＰＡＩ−２遺伝子の５′
末端および３′末端に作り出した。ＢｇｌＩＩ部位は、
オリゴヌクレオチドプライマーを使用し、この遺伝子の
５′末端に作り出し、

【００７８】

【表１０】

【００７９】下記に示すように、第二のコドンの第三の
位置で突然変異を生じさせた：

【００８０】

【表１１】 を、

【００８１】

【表１２】

【００８２】に変えた（ＳＥＱ１１は、示されているタ
ンパク質配列の開始点である）。ＡｆｌＩＩ日部位は、
オリゴヌクレオチドプライマーを使用して生じさせ：

【００８３】

【表１３】

【００８４】下記に示すように、最後のコドン（プロリ
ン）の三番目の位置と停止コドンの後の１番目の塩基
で、突然変異を生じさせた（ＳＥＱ１５は示されている
Ｃ−末端領域によってコードされるペプチドである）：

【００８５】

【表１４】 を、

【００８６】

【表１５】 に変える。

【００８７】これらの２種のオリゴヌクレオチドを、一
重鎖ｐＤＢＰ１にアニーリングし、次いで製造者用説明
書に従って行なわれた、インビトロ突然変異誘発法（Ａ
ｍｅｒｓｈａｍ ｐｌｃ）に使用した。この方法から誘
導され、正しい変化を有しているクローンを、ｐＤＢＰ
２と命名した（図９）。

【００８８】酵母Ｅ．Ｃｏｌｉシャトル ベクターｐＪ
ＤＢ２０７〔Ｂｅｇｇｓ，Ｊ．Ｄ．によるＭｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｉｎ Ｙｅａｓｔ，Ａｌｆ
ｒｅｄ Ｂｅｎｚｏｎ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ １６、３
８３〜３９５頁（１９８１）〕からの大型６．３８ｋｂ
ｐ ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを、Ｅ．
ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼのＫｌｅｎｏｗフラグメ
ントで処理し、ブラント末端を作り出し、次いで二重鎖
オリゴヌクレオチドリンカー１と連結させ（例１）、プ
ラスミドｐＤＢＰ５を生成させた（図１０）。プラスミ
ドｐＡＹＥ３３５（図４）からの１．２５ｋｂｐ Ｎｏ
ｔＩプロテアーゼＢプロモーター／ＡＤＨｌターミネー
ターカセットを、プラスミドｐＤＢＰ５の独特のＮｏｔ
Ｉ部位中に導入し、ｐＤＢＰ６を生成させた（図１
１）。

【００８９】ヒトＰＡＩ−２ｃＤＮＡを、発現プラスミ
ドｐＤＢＰ６中に挿入するために、２種の二重鎖オリゴ
ヌクレオチドリンカーを使用した。

【００９０】

【表１６】

【００９１】

【表１７】

【００９２】リンカー３とリンカー４とを、ｐＤＢＰ２
（図９）からの１．３４ｋｂｐ ＢｇｌＩＩ−ＡｆｌＩ
Ｉ ＰＡＩ−２ ｃＤＮＡとともに、ＨｉｎｄＩＩＩ線
状ｐＤＢＰ６中に連結させ、プラスミドｐＤＢＰ７（図
１０）を生成させた。

【００９３】Ｓ．セレビシアエ株ＤＢｌ ｃｉｒ°およ
びＤＳ５６９ｃｉｒ°によるｐＤＢＰ７の安定性の維持
は、生の状態の２μプラスミド〔Ｆｕｔｃｈｅｒ，Ａ．
Ｂ．によるＹｅａｓｔ ４、２７〜４０頁（１９８
８）〕上に存在するトランス作用機能が導入されるまで
得ることはできない。これは、ＤＢｌ ｃｉｒ°および
ＤＳ５６９ｃｉｒ°をｐＳＡＣ３〔Ｃｈｉｎｅｒｙ，
Ｓ．Ａ．およびＨｉｎｃｈｌｉｆｆｅ，Ｅ．によるＣｕ
ｒｒｅｎｔ Ｇｅｍｅｔｉｃｓ １６、２１〜２５頁
（１９８９）〕およびｐＪＤＢ２０７で、同時−形質転
換させ、次いでロイシンを含有していない最小培地上で
形質転換体に関して選択することによって、達成され
た。ｐＪＤＢ２０７プラスミドのＤＳ５６９ｃｉｒ°
（ｐＳＡＣ３／ｐＪＤＢ２０７）およびＤＢｌｃｉｒ°
（ｐＳＡＣ３／ｐＪＤＢ２０７）を固定すると、元の菌
株のｃｉｒ^＋誘導体が効果的に得られる。

【００９４】ＤＢｌｃｉｒ°（ｐＳＡＣ３）およびＤＳ
５６９ｃｉｒ°（ｐＳＡＣ３）を、プラスミドｐＤＢＰ
７で、ロイシン原栄養株に、再−形質転換させ、次いで
形質転換体を、ロイシンを含有していない最小培地で選
択した。ＤＳ５６９ｃｉｒ°（ｐＳＡＣ３）、ＤＳ５６
９ｃｉｒ°（ｐＳＡＣ３／ｐＤＢＰ７）、ＤＢｌｃｉｒ
°（ｐＳＡＣ３）およびＤＢｌｃｉｒ°（ｐＳＡＣ３／
ｐＤＢＰ７）を、振盪フラスコ内の複合培地１０ｍｌ
〔１％（Ｗ／Ｖ）酵母エキス、２％（Ｗ／Ｖ）バクトペ
プトンおよび２％（Ｗ／Ｖ）ショ糖〕中で、２００ｒｐ
ｍ、３０℃において、７２時間増殖させた。細胞を遠心
処理により採取し、溶解させ、次いで可溶性タンパク質
エキスを、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド ゲル電気泳動
によって分析した。ＰＡＩ−２発現性プラスミドｐＤＢ
Ｐ７（図１２）を含有する培養物中の可溶性タンパク質
エキス中にだけ、４６ＫＤの特別のタンパク質バンドが
見い出された。この特別のタンパク質バンドは、完全な
長さのヒトＰＡＩ−２に関する推定分子量のバンドであ
り、抗−ＰＡＩ−２抗体との反応によるＷｅｓｔｅｒｎ
ブロット分折法によって、ＰＡＩ−２としてのその正体
が証明された。培養上澄液中に、高められたレベルでヒ
ト アルブミンを分泌するということにもとづいて、初
めに選択された、ＤＳ５６９ｃｉｒ°株（ｐＳＡＣ３／
ｐＤＢＰ７）は、その先祖の菌株ＤＢｌｃｉｒ°（ｐＳ
ＡＣ３／ｐＤＢＰ７）に比較して、少なくとも１０倍高
いレベルで、ヒトＰＡＩ−２を蓄積する。

【００９５】例４：α_１ＡＴの細胞内発現 Ｇｅｎｂａｎｋデータベースに、受け入れ番号Ｋ０１３
９６遺伝子座ＨＵＭＡｌＡＴＭで記載されている配列と
同一の配列を有する、ヒトα_１−アンチトリプシン ｃ
ＤＮＡを、製造者用説明書に従い、ポリメラーゼ連鎖反
応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｍ Ｒｅａｃｔｉ
ｏｎ＝ＰＣＲ）によって、増幅させた。

【００９６】この配列をここで、ＳＥＱ１９として再生
成させる。

【００９７】２種の初めのＰＣＲオリゴヌクレオチドの
ＤＮＡ配列は下記のとおりであった

【００９８】

【表１８】

【００９９】

【表１９】

【０１００】このα_１−アンチトリプシン配列の５′末
端および３′末端を両方ともに、増幅させると、下記の
とおりに修飾された：

【０１０１】

【表２０】

【０１０２】

【表２１】

【０１０３】コードされたアミノ酸領域はそれぞれ、Ｓ
ＥＱ２３およびＳＥＱ２５であると見做す。

【０１０４】

【表２２】

【０１０５】

【表２３】

【０１０６】（上記Ｃ末端領域は、ＳＥＱ２７と見做
す）。これらの修飾は、２３アミノ酸シグナル配列を除
き、そしてｃＤＮＡの３′末端に、ＨｉｎｄＩＩＩ制限
部位を導入する。

【０１０７】１．１８ｋｂｐ修飾ｃＤＮＡを精製し、Ｈ
ｉｎｄＩＩＩで消化させ、ＢａｍＨＩを挿入し、次いで
Ｍ１３ｍｐ１９〔Ｙａｎｉｓｈ−Ｐｅｒｒｏｎ等による
Ｇｅｎｅ３３、１０３〜１１９頁（１９８５）〕のＨｉ
ｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ部位中にクローン形成させ、ｐ
ＤＢＡ１（図１３）を生成させた。そのヒトα_１−アン
チトリプシンの完全性は、ジデオキシヌクレオチド配列
によって確認した。

【０１０８】このヒトα_１−アンチトリプシンｃＤＮＡ
を酵母発現プラスミドｐＤＢＰ６（図１１）中に挿入す
るためには、二重鎖オリゴヌクレオチド リンカーを使
用した。

【０１０９】

【表２４】

【０１１０】リンカー５を、１．１８ｋｂｐ ＢａｍＨ
Ｉ−ＨｉｎｄＩＩＩヒトα_１−アンチトリプシンｃＤＮ
ＡとともにＨｉｎｄＩＩＩ線状ｐＤＢＰ６中に連結さ
せ、プラスミドｐＤＢＡ２（図１４）を生成させた。

【０１１１】ＤＢｌｃｉｒ°（ｐＳＡＣ３）およびＤＳ
５６９ｃｉｒ°（ｐＳＡＣ３）をプラスミドｐＤＢＡ２
でロイシン原栄養株に形質転換させ、形質転換体を、ロ
イシンを含有していない最小培地で選択した。ＤＢｌｃ
ｉｒ°（ｐＳＡＣ３／ｐＤＢＡ２）およびＤＳ５６９ｃ
ｉｒ°（ｐＳＡＣ３／ｐＤＢＡ２）を、振盪フラスコ培
養で、複合培地１０ｍｌ〔１％（Ｗ／Ｖ）酵母エキス、
２％（Ｗ／Ｖ）バクトペプトンおよび２％（Ｗ／Ｖ）シ
ョ糖〕中において、２００ｒｐｍ、３０℃で７２時間、
増殖させた。細胞を遠心処理によって採取し、溶解さ
せ、次いで可溶性タンパク質エキスを、ＳＤＳ−ポリア
クリルアミド ゲル電気泳動によって分析した。

【０１１２】ＤＳ５６９ｃｉｒ°（ｐＳＡＣ３／ｐＤＢ
Ａ２）の可溶性タンパク質エキス中に、α_１−アンチト
リプシンの強いタンパク質バンドが見い出される。この
特別のバンドは、α_１−アンチトリプシンに関する推定
分子量のバンドに相当する。α_１−アンチトリプシンは
また、ＤＢｌｃｉｒ°（ｐＳＡＣ３／ｐＤＢＡ２）の可
溶性タンパク質エキス中でも検出される。ＤＳ５６９ｃ
ｉｒ°（ｐＳＡＣ３／ＤＢＡ２）は、その先祖の菌株Ｄ
Ｂｌｃｉｒ°（ｐＳＡＣ３／ｐＤＢＡ２）に比較して、
少なくとも１０倍高いレベルで、α_１−アンチトリプシ
ンを蓄積する。

【０１１３】

【表２５】

【０１１４】

【表２６】

【０１１５】

【表２７】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、例１に記載のプラスミドｐＡＹＥ３３
３を示す摸式図である。

【図２】図２は、例１に記載のプラスミドｐＡＹＥ３３
４を示す模式図である。

【図３】図３は、例１に記載のプラスミドｐＡＹＥ３３
８を示す模式図である。

【図４】図４は、例１に記載のプラスミドｐＡＹＥ３３
５を示す模式図である。

【図５】図５は、例１に記載のプラスミドｐＡＹＥ３０
９を示す模式図である。

【図６】図６は例１に記載のプラスミドｐＳＡＣ３５を
示す模式図である。

【図７】図７は、例１に記載のプラスミドｐＡＹＥ３１
６を示す模式図である。

【図８】図８は、例２に記載の、突然変異がプロテアー
ゼＢプロモーターからのＨＡｍＲＮＡの本質的発現を可
能にすることを示すものである。

【図９】図９は、例３に記載のクローンλｇｔ１１−１
８６の確認方法およびそこで形成されるｐＤＢＰ１およ
びｐＤＢＰ２を示す模式図である。

【図１０】図１０は、例３に記載のプラスミドｐＤＢＰ
５を示す模式図である。

【図１１】図１１は、例３に記載のプラスミドｐＤＢＰ
６を示す模式図である。

【図１２】図１２は、例３に記載のプラスミドｐＤＢＰ
７を示す模式図である。

【図１３】図１３は、例４に記載のプラスミドｐＤＢＡ
１を示す模式図である。

【図１４】図１４は、例４に記載のプラスミドｐＤＢＡ
２を示す模式図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 グラハム ポール ベルフィールド イギリス国ノッテンガム，ビーストン, ロウアー ロード 46 (72)発明者 ダレル スリープ イギリス国ノッテインガム，ウェスト ブリッジフォード，レデイ ベイ ロー ド 60 (56)参考文献 特開 平１−132389（ＪＰ，Ａ) 特開 昭58−52563（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−180141（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−230058（ＪＰ，Ａ) 特表 昭63−502959（ＪＰ，Ａ)

Claims (8)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 菌類細胞を、異種ポリペプチドを発現す
   ることができる能力に基づいてその場で選択する方法で
   あって、複数の該菌類細胞を固体培地上に適用して該菌
   類細胞に上記異種ポリペプチドを発現させ、上記異種ポ
   リペプチドに選択的に結合して該菌類細胞の周囲の固体
   培地中にハロとして視認可能な複合体を形成する手段を
   該固体培地中に提供し、該手段と該異種ポリペプチドと
   の間で相互作用を起こさせて該菌類細胞の周囲の固体培
   地中に上記複合体を形成させ、該複合体のハロの大きさ
   を目視で比較することにより該菌類細胞の相対的な異種
   ポリペプチド発現能力を測定し、その比較結果に従って
   該菌類細胞を選択することからなる上記方法。
2. 【請求項２】 上記手段が、当該ポリペプチドに対する
   抗体であり、そして上記可視化工程が、沈殿した抗体／
   ポリペプチド複合体の輪を観測することよりなる、請求
   項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 上記固形培地が、菌類細胞を平板培養す
   る以前から、抗体を含有している、請求項２に記載の方
   法。
4. 【請求項４】 上記培地が、アガロースからなる、請求
   項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
5. 【請求項５】 菌類が、サッカロマイセス セレビシア
   エ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
   ｅ）である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方
   法。
6. 【請求項６】 異種ポリペプチドが、ヒトアルブミン、
   ヒトＰＡＩ−２またはヒトα_１−アンチトリプシンであ
   る、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
7. 【請求項７】 ポリペプチドが、菌類細胞から分泌され
   るものである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方
   法。
8. 【請求項８】 第一の異種ポリペプチドを産生すること
   ができる菌類株を得る方法であって、（１）菌類細胞
   を、突然変異誘発物質にさらし、突然変異体を生じさ
   せ、（２）第二の異種ペプチドの相対産生レベルを、請
   求項１〜７のいずれか一項に記載の方法によって測定
   し、次いで（３）所望のレベルの第一の異種ポリペプチ
   ドを産生する菌株を単離することを包含し、この所望の
   産生レベルは、上記菌類細胞よりも高いレベルであり、
   そしてこの方法において、第一のポリペプチドと第二の
   ポリペプチドとは、同一または異なることができる方
   法。