JP2793215B2 - 先端を切断したα―因子リーダー配列を用いた酵母における異種タンパクの改良された発現および分泌 - Google Patents
先端を切断したα―因子リーダー配列を用いた酵母における異種タンパクの改良された発現および分泌Info
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Description
る。特に,本発明は酵母宿主細胞からの異種タンパクの
分泌を与える改良されたα−因子発現系に関する。
因子前駆体遺伝子をコードする遺伝子の最初のクローニ
ングおよび配列決定が開示されている。Kurjanら,米国
特許第4,546,082号にはまた,この遺伝子のクローニン
グが報告され,α−因子リーダー配列は酵母における異
種タンパクの分泌を導くように用いられ得ることを示唆
している。しかしながら,この特許には,酵母において
異種タンパクを発現および分泌させるα−因子リーダー
が成功裏に使用されたことを示すデータが含まれていな
い。
おける異種タンパク(表皮増殖因子)の発現および分泌
を導くα−因子リーダーを始めて成功裏に適用したこと
が開示されている。この研究に続いて,α−因子リーダ
ーを用いた酵母における異種タンパクの発現に関して
は,さらに報告がなされている。例えば,Elliottら(19
83)Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 80:7080−7084;Bitter
ら(1984)Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 81:5330−5334;S
mithら(1985)Science 229:1219−1229;欧州特許公開
第114,695号;第123,228号;第123,294号;第123,544
号;第128,773号;および第206,783号を参照されたい。
また,Brakeら,Protein Transport and Secretion,p.10
3(J.M.Gething編,1984)も参照されたい。
た全長のα−因子リーダーを生産する。上記の研究はα
−因子発現系が広範囲に有利であることを示している
が,個々の異種タンパクが成功裏に分泌され,プロセッ
シングを受け,そして生物学的に活性であるかどうかに
ついては,実験を行う前には一般に予測できない。例え
ば,欧州特許公開第206,783号(前出),pp2−5;Rothbla
ttら(1987)EMBO J.6:3455−3463;V.L.MacKay,“Secr
etion of Heterologous Proteins in Yeast"(印刷中)
を参照されたい。
ロ」領域(シグナルペプチドと最初のスペーサーとの
間)を欠失させると,異種構築物により形質転換した酵
母によって分泌された非酵母タンパクの量が減少すると
いういくつかの報告ある。Siduら(1987)Gene 54:175
−184には,全長α−因子リーダーおよび先端を切断し
たα−因子リーダーの両方を用いた異種構築物から酵母
酸性ホスファターゼ(PHO5)が培地に分泌されるが,そ
の発現レベルは異種リーダーの制御下ではPHO5遺伝子に
対して3〜4倍少ないことが報告されている。プレプロ
α−因子前駆体遺伝子における欠失が天然のα−因子ペ
プチドの分泌を実質的に減少させることが報告されてい
る。例えば,V.L.MacKay(前出);Rothblattら(前出)
を参照されたい。
生産されない非酵母タンパクに適用するためにはα−因
子発現系を改良する必要がある。
ー配列が酵母において異種ポリペプチドの発現および分
泌が効率的に導き得ることが見出された。特に驚くべき
ことは,先端を切断したα−因子リーダー配列が,全長
α−因子リーダーを用いた発現系に関して,このような
異種タンパクの発現の効率を実質的に改善するというこ
とである。すなわち,より多くの分子が生物学的に活性
である異種タンパクが,より高いレベルで正確にN末端
プロセッシングを受け,そして分泌されることなどであ
る。これらの結果は,特にα−因子前躯体のリーダー配
列からの失欠な活性なα−因子の分泌レベルを減少させ
るという報告を考慮すると,驚くべきことである。
を提供する。これらの構築物は,全長α−因子リーダー
構築物によっては効率的に発現されないか,あるいはこ
のような全長構築物によっては全く発現されない異種ポ
リペプチドの発現に特に有用である。ある実施態様で
は,本発明は非酵母タンパクの発現および分泌を与える
DNA構築物を含む酵母細胞を目的としている。該DNA構築
物は,酵母認識転写開始配列および終結配列の制御下に
あるコード配列を含んでいる。該コード配列は,リーダ
ー配列と,プロセッシング部位により連結された上記の
非酵母タンパクとから構成される前躯体ポリペプチドを
コードしている。そして,該プロセッシング部位は,該
前駆体ポリペプチドから上記の非酵母タンパクを開裂さ
せる。ここで,上記のリーダー配列は前躯体ポリペプチ
ドの約25〜約50個のn末端残基であり,酵母α−因子前
駆体のシグナルペプチドおよび唯一のグリコシル化部位
を含んでいる。
得る前駆体ポリペプチドをコードする領域を有する二本
鎖DNA分子を目的としている。該領域は,DNA鎖の一方に
関しては,次の構造を有する。
し;CHOはグリコシル化部位をコードし;Xnはグリコシル
化部位,または酵母によるインビボでの上記前駆体ポリ
ペプチドの開裂を与えるプロセッシング部位を含まず;
長さがn個のアミノ酸からなるポリペプチドをコード
し;nは0〜約30までの整数であり;遺伝子*は非酵母タ
ンパクをコードし;そしてSは上記の前躯体ポリペプチ
ドの開裂を与えるプロセッシング部位をコードする。
組換えタンパクを生産する方法,およびこれらの方法に
より生産される組換えタンパクの組成物を目的としてい
る。他の実施態様は,当業者に明白である。
の分子生物学,微生物学,および当該分野における組換
えDNA技術が用いられる。このような技術は,文献中に
詳細に説明されている。例えば,Maniatis,Fritsch & S
mabrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(198
2);DNA Cloning,第I巻および第II巻(D.N.Glover
編,1985);Oligonucle−otide Synthesis(M.J.Gait
編,1984)Transcription and Translation(B.D.Hames
& S.J.Higgins編,1984);Immobilized Cells and Enz
ymes(IRL Press,1986);B.Perbal,A PracticalGuide t
o Molecular Cloning(1984)を参照されたい。
す定義に従って用いる。
律単位として機能する(すなわち,それ自体の制御下で
複製可能な)あらゆる遺伝要素(例えば,プラスミド,
コスミド,染色体,ウイルス)である。
に,他のDNA部分を結合させ得るレプリコン(例えば,
プラスミド,ファージ,またはコスミド)である。
ン,グアニン,チミジン,またはシトシン)の多量体で
あって,通常の二本鎖らせん状ののものを意味する。こ
の用語は,分子の一次構造および二次構造のみを意味
し,特定の三次形態に限定されるものではない。従っ
て,この用語は,特に鎖状DNA分子(例えば,制限酵素
処理断片),ウイルス,プラスミド,および染色体で見
出される二本鎖DNAを包含する。特定の二本鎖DNA分子の
構造を考慮する場合,ここでは配列を,DNAの非転写鎖
(すなわち,特定のコード配列から生じるmRNAに相同的
な配列を有する鎖)に沿って5′から3′方向へ向かう
配列のみを与える通常の習慣に従って記述する。
置かれた場合に,インビボで転写され,ポリペプチドを
翻訳され得るDNA配列である。コード配列の境界は5′
(アミノ)末端における翻訳開始コドンと,3′(カルボ
キシル)末端における翻訳停止コドンとにより決定さ
れ,そしてこれらのコドンを含む。コード配列は,原核
生物のDNA配列,ウイルスのDNA配列,真核生物源(例え
ば,哺乳動物)のcDNAまたはゲノムDNA配列,および合
成DNA配列をも包含し得るが,これらには限定されな
い。
ド配列に隣接し,該コード配列に相同的なmRNAの酵母に
おける転写に関与する。該mRNAは,次いで,コード配列
によりコードされているポリペプチドに翻訳され得る。
転写開始配列には酵母プロモーター配列が含まれ,該酵
母プロモーター配列は,細胞内で酵母RNAポリメラーゼ
が結合し,下流(3′方向)のコード配列の転写を開始
し得るDNA制御配列である。本発明を定義する目的で
は,プロモーター配列は,その3′末端において,コー
ド配列の翻訳開始コドンにより境界が設けられ(そし
て,取り除かれる),上流(5′方向)に延びて,バッ
クグラウンド以上の検出可能なレベルで転写を開始する
のに必要な最小限の数のヌクレオチドまたは構成要素を
含んでいる。プロモーター配列の中には,転写開始部位
(S1ヌクレアーゼによるマッピンクにより便宜的に定義
される),および酵母RNAポリメラーゼの配合に関与す
るタンパク結合ドメイン(共通配列)が見出される。本
発明に有用なプロモーターには,野生型α−因子プロモ
ーター,および他の酵母プロモーターが含まれる。特
に,解糖系の酵素(例えば,ホスホグリコイソメラー
ゼ,ホスホフラクトキナーゼ,ホスホトリオースイソメ
ラーゼ,ホスホグルコムターゼ,エノラーゼ,ピルビッ
クキナーゼ,グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロ
ゲナーゼ,アルコールデヒドロゲナーゼ)に関連するプ
ロモーター,およびこれらのプロモーターのハイブリッ
ドが好ましい。例えば,欧州特許公開第120,551号およ
び第164,556号を参照されたい。転写開始配列にはま
た,プロモーターの調節または増幅に関与する他の調節
領域が含まれ得る。同様に,翻訳停止コドンに対して
3′側に位置する転写終結配列は,野生型α−因子転写
終結配列であるか,あるいは他の酵母認識終結配列(例
えば,上記の解糖系酵素に対する遺伝子からの配列)で
あり得る。
し,該コード配列をmRNAに転写し,転写終結配列で結合
させ,そして該mRNAが該コード配列によりコードされて
いるポリペプチドに翻訳される(すなわち,「発現」さ
れる)場合には,転写開始配列および終結配列の「制御
下」にある。本発明のコード配列がコードする前駆体ポ
リペプチドは,少なくとも一部(通常,リーダー配列の
ない非酵母タンパク)が細胞外へ輸送されて細胞増殖培
地に存在する場合には,「分泌」される。通常,リーダ
ー配列より下流の前躯体タンパク部分のみが分泌され,
そしてこの下流部分はまた,分泌の間に付加プロセッシ
ングを受ける(例えば,ペプチド鎖開裂,糖付加,折り
たたみ,S−S結合の形成など)。
外来DNAにより「形質転換」されている。外来DNAは,細
胞のゲノムを構成する染色体DNAに組み込まれる(共有
結合で連結される)こともあれば,組み込まれないこと
もある。外来DNAは,プラスミドのようなレプリコンで
染色体とは独立に保持される。外来DNAが染色体に組み
込まれると,染色体の複製によって娘細胞に遺伝され
る。染色体に組み込まれた外来DNAにより形質転換され
ている細胞は,「安定な」形質転換細胞と呼ばれる。
「クローン」または「クローン集団」とは,減数分裂に
より単一の細胞または共通の祖先から誘導された細胞の
集団である。
のうちで,ヌクレオチド配列の少なくとも約60%(好ま
しくは少なくとも約75%,最も好ましくは少なくとも約
90%)が一致している場合,これらのDNA配列は「実質
的に相同性を有する」という。実質的に相同性を有する
配列は,特定の系で定められるような選択的な厳密条件
下におけるサザンハイブリダイゼーション実験により同
定され得る。適切なハイブリダイゼーション条件の定義
は当該分野における技術範囲内にある。例えば,Maniati
sら(前出),DNA Cloning(前出)Nucleic Acid Hybri
dization(前出)を参照されたい。
連性のない巨大DNA分子内の同定可能なDNA部分である。
このように,非相同領域が哺乳動物タンパクをコードす
る場合には,該非相同領域は,通常,その起源となる生
物のゲノム内の哺乳動物DNA配列には隣接していないDNA
に隣接している。非相同コード配列の他の例は,コード
配列自体が自然界には存在しな構築物(例えば,ゲノム
コード配列がイントロンを含むcDNA,あるいは同一また
は類似のタンパクをコードする生物とは異なるコドンを
有する合成配列)である。対立遺伝子の変化,または自
然に発生する変異現象は,ここで用いられるようなDNA
の「非相同」領域を生じるものではない。
ゲナス酵母(Endmycetales),バシディオスポロゲナス
酵母,および不完全菌類に属する酵母(Blastomycete
s)が含まれる。アスコスポロゲナス酵母は,Spermophth
oraceaeおよびSaccharomycetaceaeという2つの科に分
類される。後者は,Schizosaccharomycoideae(例えば,S
chizosaccharomyces属),Nadsonioideae,Lipomycoidea
e,およびSccharomycoideae(例えば,Pichia属,Kluyvero
myces属,およびSaccharomyces属)の4つの亜科から構
成される。バシディオスポロゲナス酵母には,leucospor
idium属,Rhodosporidium属,sporidiobolus属,Filobasid
ium属,およびFilobasidiella属が含まれる。不完全菌
類に属する酵母は,Sporobolomycetaceae(例えば,Sporo
bolomyces属,およびBuller属)およびCryptococcaceae
(例えば,Candida属)の2つの科に分類される。本発明
に特に興味深いものは,Pichia属,Kluyveromyces属,Sacc
haromyces属,Schizosaccharomyces属,およびCandida属
である。中でも特に興味深いものは,Saccharomyces属の
S.cerevisiae,S.carlsbergensis,S.diastaticu
s,S.douglasii,S.kluykeri,S.norbensisおよ
びS.oviformisである。Kluyveromyces属の特に興味深
い種には,K.lactisがある。酵母の分類が将来変更さ
れることもあるので,本発明では,酵母は次の文献に記
載されているように定義する(Biology and Activities
of Yeast(F.A.Skinner,S.M.Passmore & R.R.Davenpo
rt編,1980)(Soc.App.Bacteriol.Symp.Series No.
9)。上記に加えて,当業者はおそらく酵母の生物学お
よび酵母の遺伝子操作に精通している。例えば,Bioche
mistry and Genetics of Yeast(M.Bacila,B.L.Horecke
r & A.O.M.Stoppani編,1978);The Yeasts(A.H.Rose
& J.S.Harrison編,第2版,1987);The Molecular B
iology of the Yeast Saccharomyces(Strathernら編,1
981)を参照されたい。上記の文献の開示内容は参照文
献としてここに採用する。
ーダー配列を使用する。α−因子は,約100個と200個と
の間(典型的には約120〜160個)の残基からなる大きな
前躯体ポリペプチド(プレプロ−α−因子)から生産さ
れる長さが約13残基のオリゴペプチド成熟フェロモンで
ある。該前躯体は,約20基残(例えば,約19〜23個,典
型的には約20〜22個)の疎水性「シグナル配列」と,後
に続く約60個の親水性残基(「プロ」領域)付加リーダ
ー領域と,該付加リーダー領域は,成熟フェロモンのタ
ンパク分解プロセッシングを与える短いオリゴペプチド
スペーサ領域(典型的には約6〜8残基)により分断さ
れる成熟フェロモン配列(典型的には約2〜6)のいく
つかのタンデム配列に連結している。
告されている。例えば,Kurjanら,米国特許第4,546,082
号,Singh(1983),Nucleic Acids Res.11:4049−4063;1
988年7月28日出願の特願昭63−189552を参照された
い。これらの文献の開示内容は参照文献としてここに採
用する。さらに,プレプロ−α−因子遺伝子をコードす
るDNA配列は,既知のプレプロ−α−因子配列由来のプ
ローブとのハイブリダイゼーションにより同定され得
る。例えば,Brakeら(1983)Molec.& Cell Biol.3:14
40−1450を参照されたい。α−因子はまた,酵母種より
精製し,配列を決定し,プレプロ−α−因子遺伝子をク
ローン化するためのプローブを設計する例えばMcCullou
ghら(1979)J.Bacteriol.138:146−154;Satoら(198
1)Agric.Biol.Chem.44:1451−1453;Singhら(1983),
(前出)を参照されたい。ある酵母種のα−因子リーダ
ー配列が他の酵母種においても機能し得ることが確認さ
れている。例えば,米国特許出願第078,551号(前出)
を参照されたい。このように,本発明は,一般的な酵母
由来のα−因子リーダー配列を使用することだけでな
く,異種酵母種において,このようなリーダー配列を使
用することをも意図している。しかし,前述を簡単にす
るために,本発明は,S.cerevisiae由来のプレポロ−
α−因子遺伝子MFalに関して考察する。例えば,Kurjan
ら,米国特許第4,546,083号;Singhら(1983),(前
出)を参照されたい。
ら成るハイブリッド前躯体ポリップチドをコードするキ
メラDNA構築物を使用する。本発明では,リーダー配列D
Naは,前駆体ポリペプチドのN末端開始コドン(メチオ
ニン)から始まり,リーダー配列と非酵母タンパクをコ
ードする配列との間を分断するプロセッシング部位前方
の最後のアミノ酸残基をコードするコドンまでの配列と
して定義する。本発明のリーダー配列は,先端を切断し
た形の酵母α−因子リーダー配列からなり,その典型的
な長さは,約25〜50個のアミノ酸残基である。このよう
に,本発明のリーダー配列は,典型的な全長α−因子リ
ーダーよりも短く,約30個のアミノ酸残基である。例え
ば,MFalは,83個のアミノ酸残基からなるリーダー配列
と,後に続く,酵母プロセッシング酵素により開裂をう
けるヘキサペプチドのスペーサ配列とを有する。リーダ
ー配列から欠失体を調製する場合には,充分な分泌を与
えるために,少なくとも1つのグリコシル化部位(−As
n−Y−Thr/Ser−)を保持することが重要である。
することが必要である。上で示したように,シグナルペ
プチドは,通常,長さが約20個のアミノ酸であり,疎水
性コア部分を有するという特徴がある。例えば,von Hei
jne,(1984)J.Mol.Biol.173:243−251を参照された
い。今日までに調べられた全てのプレプロ−α−因子配
列は,長さが約20残基の疎水性ペプチドをコードする。
分泌経路へ前躯体ポリペプチドを導くのに必要なシグナ
ルペプチドの正確な長さは決定されていないが,通常,
約19個と約23個との間の残基が必要である。必要とされ
る最小配列は欠失変異体を試験することにより,容易に
決定することができる。
個の残基,典型的には約33個と約58個との間の残基,さ
らに典型的には約48個と約58個との間の残基の範囲内の
欠失を考慮する。これらの欠失は,通常,26〜83番目の
残基の領域内(両端を含む)に生ずる。57〜59番目およ
び67〜69番目の残基におけるグリコシル化部位を含む欠
失が好ましい。欠失性α−因子リーダー配列は,必要に
応じて,その一部を非−α−因子リーダー配列で置換し
得る。これらの配列は,一般に,親水性アミノ酸残基は
コードするが,グリコシル化部位およびプロセッシング
部位はコードせず,リーダーの全長が約50個の残基また
はそれ以下,好ましくは約23〜40個の残基,最も好まし
くは約25〜35個の残基を保持するように選択すべきであ
る。
3′側の直く下流に,前躯体ポリペプチド内でリーダー
が融合された非酵母タンパク配列からリーダーを切断さ
せるプロセッシング部位を有する。本発明で用いられる
プロセッシング部位は,選択された工程(例えば,化学
的工程,酵素的工程など)による開裂に対して特異的に
認識される最小数のアミノ酸残基を定めるコドンとして
定義する。種々のプロセッシング部位が当該分野におい
て知られており,インビボおよびインビトロで活性なプ
ロセッシング部位が含まれる。例えば,プロセッシング
部位は,酵母宿主中には存在しないタンパク分解酵素の
切断部位をコードすることによりインビトロでのプロセ
ッシングを与える。回収した前躯体ポリペプチドは,次
いでタンパク分解酵素で処理して前躯体由来の非酵母タ
ンパクを開裂させる。他のインビトロプロセッシング部
位は,臭化シアンを用いた発現後処理により開裂を受け
るメチオニンコドンである。例えば,米国特許第4,366,
246号を参照されたい。
ク配列の発現を行う酵母タンパク分解酵素により認識さ
れるあらゆるペプチドシグナルから選択され得る。特に
好ましいプロセッシング部位は,天然のプレプロα−因
子のプロセッシングに関連する酵素が認識し得るもので
ある。例えば,ジペプチジルアミノペプチダーゼA(DP
APase A)は末端X−Ala−配列(ここで,XはCluまたはA
spである)を除去する。例えば,Juliusら(1983)Cell
32:839−852を参照されたい。KEX2遺伝子によりコード
されるエンドペプチダーゼは,Lys残基およびArg残基か
らなる塩基性ジプペチド(すなわち,Lys−Arg,Arg−Ar
g,Arg−Lys,およびLys−Lys)を開裂する。例えば,Full
erら,Micro−biology 1986,pp.273−278(1986)を参
照されたい。酵母では,α−因子前躯体は,まずKEX2エ
ンドペプチダーゼにより開裂され,次いでN末端がDPAP
ase Aにより整えられて成熟α−因子フェロモンを与え
る。後者のタンパク分解工程が律速段階であるので,プ
ロセッシング部位がKEX2エンドペプチダーゼに対するシ
グナルのみからなるように,DPAPase Aに対するシグナル
を除去することが好ましい。従って,このような実施態
様においては,リーダー配列は,KEX2エンドペプチダー
ゼの二塩基性ペプチド認識部位(例えばLys−Argまたは
Arg−Arg)により非酵母タンパク配列に連結される。
は非酵母タンパクである。この部分をコードするDNA配
列は,プロセッシング部位の最後のコドンの下流(3′
方向)にある最初のコドンから始まり,前躯体ポリペプ
チドのカルボキシル末端を定める翻訳停止コドンまでの
配列として定義される。このDNA配列は,酵母が発現す
るポリペプチドに対して実質的に相同性を有さないポリ
ペプチドを定める場合,「非酵母タンパク」をコードす
ると考えられる。一般に,好ましい非酵母タンパクは哺
乳動物タンパク配列(その類似体,すなわち「突然変異
タンパク」,断片などを含む)である。従って,ここで
定義されているように,非酵母タンパクには,哺乳動物
および酵母の配列からなる融合タンパク,ならびに成熟
哺乳動物タンパクの「プロ」形が含まれ得る。
よりクローン化された配列であり得る。また,これらの
DNA配列は,合成配列,通常,酵母に適したコドンを用
いて調製された合成配列であり得る。通常,非酵母タン
パクは,少なくとも長さが約8個のアミノ酸であり,約
100,000ダルトンまたはそれ以上までのポリペプチドを
包含し得る。通常,非酵母ポリペチド配列は約300,000
ダルトンより小さく,より一般的には約150,000ダルト
ンより小さい。特に興味深いものは約5,000〜約150,000
ダルトンのポリペプチドであり,さらに興味深いものは
約5,000〜約100,000ダルトンのポリペプチドである。興
味深い非酵母タンパクの例としては,成長ホルモン,ソ
マトメジン,表皮成長因子,黄体形成ホルモン,甲状腺
刺激ホルモン,オキシトシン,インシュリン,バソプレ
ッシン,レニン,カルシトニン,卵胞刺激ホルモン,プ
ロラクチン,エリスロポエチン,コロニー刺激因子,リ
ンフォカイン(例えば,インターロイキシン2),グロ
ビン,免疫グロブリン,インターフェロン(例えば,a,
b,またはq),酵素,b−エンドルフィン,エンケファリ
ン,ダイノルフィン,インシュリン様増殖因子などのホ
ルモンや因子が挙げられる。
チドをコードするDNA構築物は,5′−AF−CHO−Xn−S−
遺伝子*−3′の構造を有する。ここで,AFは,酵母の
α−因子のシグナルペプチドをコードし,CHOは,グリコ
シル化部位をコードし;Xnは,グリコシル化部位もしく
はプロセッシング部位(インビボで,酵母宿主により前
駆体ポリペプチドを開裂させる)を含有しない長さのn
個のアミノ酸のポリペプチドをコードし;nは,0から約30
までの整数であり;遺伝子*は,非酵母タンパクをコー
ドし;そして,Sは,上記前駆体ポリペプチドを開裂させ
るプロセッシング部位をコードする。
同じα−因子シグナルペプチドである。それは,長さに
して約20残基(例えば,約19〜23残基)であり,そして
それは,前躯体ポリペプチドを,酵母分泌経路へ誘導す
るのに十分な長さである。正確な最少もしくは最大の長
さは,一連の欠失構築物のスクリーニングによって特定
のα−因子について決定され得る。
コードする。それは一般的に,長さにして9個のヌクレ
オチドであり,アミノ酸Asn−Y−Y′に対応する3つ
のコドンを含む。ここでYは,任意のアミノ酸残基,そ
して,Y′は,スレオニンもしくはセリンである。
因子リーダー部分もしくは無関係のアミノ酸配列をコー
ドする。一般に,Xnは,最大約30アミノ酸残基であり,
より好ましくは最大約20残基,そしてもっとも好ましく
は最大約10残基である。Xnは,いかなるポリペプチドを
もコードする必要はない(つまりn=0)が,グリコシ
ル化部位CHOとプロセッシング部位Sとの間に,あるス
ペースを有することが,次の条件下において望ましい。
つまり,グリコシル化部位での糖の付加によるプロセッ
シング部位を開裂する物質が接近するのを立体的に阻害
するとい条件下において,望ましい。そのような場合に
は,nは,通常,最少の約1であり,より好ましくは最少
の約2であり,そして最も好ましくは最少の約3であ
る。
コシル化部位もしくは酵母宿主によって認識されて開裂
するプロセッシング部位をも含んでいないことが好まし
い。さらに,α−因子リーダー中に見い出される配列か
ら外れる場合には,親水性アミノ酸残基を選択するのが
好ましい。Xnの長さが,非酵母性タンパクの発現および
分泌の効率に影響する。発現を最適にするためのXnの適
当な長さの選択は,種々の大きさの構築物をスクリーニ
ングすることによりなされ得る。
Sによりコードされるプロセッシング部位は,上記のと
おりである。
安定に保持され得るレプリコン中に,通常,保持され
る。レプリコン(通常,プラスミドである)は,1もしく
はそれ以上の複製系,好ましくは2つの複製系を含有
し,発現のための酵母宿主およびクローニングのための
原核生物宿主でのレプリコンの維持を許容する。そのよ
うな酵母−細菌シャトルベクターの例としては,YEp24
(Botsteinら,(1979)Gene 8:17−24)pC1/1(Brake
ら,(1984))Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:4642−4646
およびYRp17(Stinchombら,(1982)J.Mol.Biol.158:1
57)が包含される。さらに,プラスミド発現ベクター
は,高もしくは低コピー数のプラスミドであり得,その
コピー数は,一般に約1から約200の範囲である。高コ
ピー数の酵母ベクターでは,単一宿主中で一般に少なく
とも10,好ましくは少なくとも20であり,そして通常,
約150コピーを越えない。選択された非酵母タンパクに
依存して,高もしくは低コピー数のベクターのいずれか
が望ましく,それは,ベクターの効果および宿主の外来
タンパク依存している。例えば,Brakeら(前出)を参照
されたい。本発明のDNA構築物もまた,組み込みベクタ
ーによって酵母ゲノム中に組み込まれれる。そのような
ベクターの例は,当該分野で知られている。例えば,Bot
stein(前出)を参照されたい。
主の選択は,当業者の技術範囲内にある。発現のための
酵母宿主を選択する場合,好適な宿主は,特に,良好な
分泌能力,低いタンパク溶解活性,そして総合的な強健
さを持つことを示すものが包含され得る。酵母および他
の微生物は,一般に,種々の供給源から入手可能であ
る。その供給源には,カルフォルニア州バークレーのカ
リフォルニア大学の生物物理学および医学物理学科のイ
ースト ジェネティック ストック センター:および
メリーランド州ロックウィルのアメリカンタイプ カル
チャー コレクションが包含される。
野で既知である。酵母を形質転換するための広範な種々
の方法がある。例えば,スフェロプラスト形質転換が,
例えば(Hinnenら,(1978)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 7
5;1919−1933,およびStinchcombら,ヨーロッパ特許公
開45,573号により教示される。形質転換体を適切な栄養
培地中で増殖させ,そして,適切であるなば,外来DNA
の保持を保証する選択圧の下で保持される。発現が誘導
性である場合には,酵母宿主に増殖を行ない,高密度の
細胞を生じさせると発現が誘導される。分泌され,加工
された非酵母性のタンパク質は,従来のあらゆる方法に
よっても回収され,そしてクロマトグラフィー,電気泳
動,透析,溶媒−溶媒抽出などによって精製されうる。
であり,本発明の範囲を限定するものではない。生物学
的出発材料の寄託は,本発明の実施に際し,必要でない
と考えられる。なぜなら同一のもしくは同等の材料は,
公に入手可であるためである。
される修飾されたα−因子構築物で得られる発現および
分泌のレベルの比較を行なっている。3つの構築物は,
全長のα−因子リーダー配列を用いている。そのひとつ
は3つの天然のグリコシル化部位を持つα−因子リーダ
ー配列を有し,他のひとつは,3つのグリコシル化部位の
すべてが除去されており,そして,さらに他のひとつ
は,23位のアスパラギンを除いてすべてのグリコシル化
部位が除去されている。第4の構築物は,23位のAsnに単
一のグリコシル化部位を保持する先端を切断されたα−
因子リーダー配列である。
α−因子リーダー配列(Brakeら,(1984)Proc.Natl.A
cad.Sci.USA 81:4642−4646;ヨーロッパ特許公開第116,
201号)をコードする。このプロインシュリンは,酵母
に好適なコドン(第1図)によりつくられる合成遺伝子
によってコードされる。α−因子リーダー配列,合成プ
ロインシュリン遺伝子,そしてα−因子ターミネータ配
列は,pYBCA5由来であり,その構築物は,第1図に示さ
れている。転写は,404bpのBamH I−Nco I GAPDHプロモ
ータ断片(Travisら,(1985)J.Biol.Chem.260:4384
−4389)によって媒介される。GAPDHプロモータ,プロ
インシュリンに結合したα−因子をコードする配列,お
よびα−因子ターミネータからなる1206bpのBamH I発現
カセットを,酵母シャトルベクターpAB24(後述)もし
くはpC1/1の唯一のBamH I部位中に,GAPDHのプロモータ
配列がベクターのSal I部位に近くなるようにクローニ
ングすると,プラスミドpYGAI1−AB24もしくはpYGAI1−
C1/1が得られる。1206bpのBamH I発現カセットをまた,p
BR322の誘導体(pBR 322(WEcoR I−Sal I)BamH I;Tra
visら,(前出))の唯一のBamH I部位中にサブクロー
ン化した。このプラスミドは,pGAI1と命名された。
h,Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces,Vo
l.1,p.445(1981))とpBR322配列とを有する酵母シャ
トルベクターである。それはまた,プラスミドYEp24(B
otsteinら,(1979)Gene 8:17)由来の酵母URA 3遺伝
子およびプラスミドpC1/1由来の酵母LEU 2d遺伝子も含
む。ヨーロッパ特許公開第116,201号参照。プラスミドp
AB24は,YEp24をEcoR Iで消化し,ベクターを再連合して
部分的に2m配列を除去することによって構築される。得
られプラスミドYEp24WRIは,Cla I消化によって2直線化
され,そしてCla Iで直線化された完全な2mプラスミド
を連結される。得られたプラスミド,pCBouを,次に,Xba
Iで消化し,そして8605bpのベクター断片を,ゲル分離
した。この分離したXba I断片を,pC1/1から分離したLEU
2d遺伝子を含有する4460bpのXba I断片に連結した。LE
U 2d遺伝子の方向は,URA3遺伝子と同じ方向である。
ードしている点でpYGAI1と異る。この修飾α−因子リー
ダー配列においては,第23,57,および67番目の残基のAs
nのコドンがGlnに変化している。そのことによりN結合
グリコシル化のためのすべての信号が除去されている。
ー配列とプロインシュリンのN末端の13アミノ酸とを合
成オリゴヌクレオチドの連結によって構築し,5′Nco I
突出部分と3′Hind III突出部分を持つ294bpを得た。
その配列を第2図に示す。適切なオリゴヌクレオチドの
配列を合成の間に改変したので,天然のα−因子リーダ
ー配列の第23,57,および67位のアスパラギンに特異的な
コドンは,今や同じ位置に存在するグリタミンに特定す
る。プロインシュリンのN末端13アミノ酸を特定するDN
A配列は,pYGAI1中のそれと同一であった294bpの合成DNA
(Nco I−Hind III)断片を,類似の断片であるpGAI1お
よびpYGI1−C1/1に置換し,プラスミドpGAI3およびpYGA
I3を得た。
つを除去されたα−因子リーダー配列をコードするDNA
を有する。第57および67位のアスパラギンを,グルタミ
ンに修飾した。得られたプラスミドは第23位のアスパラ
ギンに唯一の単一のグリコシル化部位を持っている。pY
GAI8は以下のように調製された。
現カセットから分離し,次にBamH Iで切断し,そしてGA
PDHプロモータを含有する504bp断片とα−因子リーダー
配列の1から33残基をコードする配列をゲル分離した。
次に,グリコシル化部位を欠失しているα−因子リーダ
ー配列にコードするプラスミドpYGAI3もまた,連続的に
Hpa IIおよびBamH Iで切断した。分離した702bpの断片
は,34〜83残基の修飾α−因子リーダー配列,Lys Argプ
ロセッシング部位,プロインシュリン配列およびα−因
子ターミネータを有する。この断片を,次に,pGAI1由来
の504bp断片に連結し,BamH Iで切断し,そして1206bp断
片を分離した。
プロインシュリン/α−因子ターミネータ発現カセット
を含有する1.2kb BamH I断片を,次に,BamH I切断およ
びホスファターゼ処理pBR322(WEcoR I−Sal I)BamH I
中に連結させてプラスミドpGAI8を得,それをE. Coliに
クローニングした。
て除去し,そして,その断片をゲル分離した。それを,B
amH I切断し,そしてホスファターゼ処理した酵母シャ
トルベクターpAB24中に連結した。発現カセットの挿入
は,pBR322配列の唯一のBamH I部位にGAPDHプロモータ
が,そのベクターの唯一Sal I部位に近くなるように,
行なわれた。このプラスミドがpYGAI8であった。
ー配列とヒトプロインシュリンに対する合成遺伝子とを
コードするDNAを有する。α−因子リーダー配列が短縮
されているので,それはα−因子の1から35アミノ酸配
列だけをコードし,それゆえ,第23位のアスパラギンの
グリコシル化のための単一部位を含む。この酵母発現ベ
クターを,以下のように構築した。
リンカーを次の構造物に付加した。: リンカーを付加後,直線状にしたプラスミドを,BamH I
で切断し,そして558bpのHpa II−BamH I断片をゲル分
離した。この断片は,リジン−アルギニンのプロセッシ
ング部位に直接に結合したα−因子リーダー配列の34〜
35残基をプロインシュリン配列のコドンとを含有する。
α−因子のリーダー配列の35番目の残基のコドンと,プ
ロインシュリン配列に直接隣接するプロセッシング部位
との間には,介在する配列はない。
断片をゲル分離した。この断片は,GAPDHプロモータとα
−因子リーダー配列の1から33位のアミノ酸をコードす
るヌクレオチドを含有し,3′末端は,上述の588bpのHpa
II−BamH I断片の5′末端に相補的なHpa II部位で終
結する。これら2つの断片を,一緒に連結し,そしてBa
mH Iで切断し,GAPDHプロモータ,リジン−アルギニンプ
ロセッシング部位に直接に結合する1〜35残基を含有す
る修飾されたα−因子リーダー配列をコードする配列,
プロインシュリン遺伝子,およびα−因子ターミネータ
を有する発現カセットを得る。次に,そのカセットを,p
BR322(WEcoR I−Sal I)BamH IのBamH I部位に連結
し,そしてE. coli中にクローニングし,プラスミドpGAI
7を得た。
セットをゲル分離した。その発現カセットを,pAB24のBa
mH I部位に連結し,プラスミドpYGI7を得た。
7およびpYGAI8を,Saccharomyces cerevisiae AB103.1
株(Mata,leu2−3,112,ura3−52,his4−580,pep4−3
[cir゜])(Hinnenら,(1978)Proc.Natl.Acad.Sci.
USA 75:1929−1933.に本質的に記述されている)中に形
質転換した。pYGAI1−C1/1およびpYGAI3の形質転換体に
ついては,ロイシンの栄養要求性について選抜し,他の
プラスミドの形質転換体については,ウラシルの栄養要
求性について選択した。
ーダー配列(nYGAI1−C1/1)もしくは23,57および67位
のアスパラギンの位置を置換したグリタミンを持つα−
因子リーダー配列(pYGAI3)によって媒介されるプロイ
ンシュリンの分泌を比較している。接種溶媒物(個々の
形質転換体0.2ml)を,ロイシンを欠失した合成完全培
地(SD−leu;Shermanら,Methods in Yeast Genetics,
p.62(Cold Spring Harbor Laboratory,1982))中で48
時間増殖し,そして同時培地中に20倍に希釈した。培養
物を,48から72時間増殖させ,遠心分離により培養上清
を調製し,そして125I標識されたインシュリンによる競
合放射性免疫検定により免疫性交差反応インシュリン様
物質(ILM)についての分析を行なった。表1に見られ
るように,α−因子リーダー配列からの3つのグリコシ
ル化部位を除去した結果,天然のα−因子リーダー配列
により媒介されるものに比べ,インシュリン様物質は本
質的に分泌されなくなった。
物質の分泌能力について,pYGAI1−pA24(完全長の天然
のα−因子リーダー配列),pYGAI8(グリコシル化部位
を23位のAsnに1ヵ所のみ有する完全長のα−因子リー
ダー配列),そしてpYGAI7(グリコシル化部位を23位の
Asnに1ヵ所のみ有する先端を切断したα−因子リーダ
ー配列)の形質転換体を比較する。各形質転換体をSD−
Leu中で30℃で0.48時間増殖させた接種培養物0.2流を遠
心分離によりペレット化し,洗浄し,そしてura−培地
中に20から50倍に希釈した。この培地は,0.67%の酵母
窒素ベース,1%コハク酸,0.35%水酸化ナトリム,0.5%
カザミノ酸,2%グリコース,0.005%アデニン,0.01%ト
リプトファン,および0.02%スレオニンを含有する。培
養物を,30℃で48〜72時間培養し,そして培養上清を調
製し上記のように分析した。表2に示されるデータによ
ると,23位のアスパラギンに単一のグリコシル化部位を
保持する先端を切断したα−因子リーダー配列をもつ構
築物を有する形質転換体は,完全長の天然のα−因子リ
ーダー配列を持つ構築物を有する形質転換体が分泌する
よりも通常,より多くの免疫反応性のインシュリン様物
質を分泌した。同じ単一のグリコシル化(Asn23)を持
つ完全長のα−因子リーダー配列を併有する構築物をも
つ形質転換体は,完全長の天然のα−因子リーダー配列
もしくは先端を切断したα−因子リーダー配列をもつ形
質転換体が分泌するよりもはるかに少ない量のインシュ
リン交差反応物質を分泌した。
る完全長α−因子リーダー構築物の発現と,Asn23に1つ
だけグコシル化部位を保持している先端を切断したα−
因子配列を用いた構築物の発現とを比較する。この実施
例で用いられている非酵母性タンパクは,ヒトプロイン
シュリン類似体であり,接続している“C"ヘプチドが酵
母KEX2エンドペプチダーゼ開裂部位により置換されてい
る。
bpを,合成Hind III−Sal I遺伝子断片(第3図に示
す)と置換することにより調製された。このpGAI1のHin
d III−Sal I断片は,B鎖の14〜30アミノ酸,Cペプチド,A
鎖,および2つの翻訳停止コドンをコードする。そして
上記合成Hind III−Sal遺伝子断片は,B鎖の14〜30アミ
ノ酸,Lys−Arg KEX2エンドペプチダーゼ開裂部位,A鎖,
および翻訳停止コドンをコードする。プラスミドpGAIC3
はpGAIC3から下記のようにして調製した。
現カセット(GAPDHプロモータ,プロインシュリン類似
体に連結したα−因子リーダーをコードする配列,α−
因子転写終結因子を有する)を単離し,BamH I消化およ
びフォスフアターゼ処理したpAB24に連結させ,次に,
E. coliにクローニングした。プラスミドpYGAIC3は,GAPD
Hプロモータがベクターの唯一のSal I部位に隣接するよ
うな向きに発現カセットがおくようにして得られた。
したα−因子リーダーをコードするDNAが,プロインシ
ュリン類似体配列(上記pYGAIC3で記載)に連結したも
のを有する。
を単離した。この断片は,プロインシュリン類似体の最
初の12コドンを除いた全てのコード配列を有する。それ
をHind III−Sal I消化したpGAI7由来の4640bpゲル単離
断片に連結させ,プラスミドpafL7C3を得る。E. Coliク
ローニングした後,このプラスミドをBamH Iで切断し,1
062bpのBamH I断片をゲル単離した。
代わりにプロインシュリン類似体をもったPGAI7の先端
を切断し,α−因子リーダー構築物を含んでいる。次
に,この発現カセットを,上述のように,pAB24のBamH I
部位に連結し,pYafL7C3を得た。
7C3について測定した。AB103.1株は実施例Iで記述して
いる。AB110−4株は,pep4遺伝子の中に欠失が導入さ
れているSaccharomyces cerevisiae AB110株の誘導体
(Mata,leu2,ura3−52,Pep4−3,his4−580[cir
゜])である。これらの株を,プラスミドpYGAIC3およ
びpYafL7C3で上述のように,形質転換し,ura原栄養株を
選択した。接種培養物をSD−Leu[Shermanら,前述]で
30℃にて24〜28時間,増殖させ,次に,遠心によりペレ
ット化し,洗浄し,そしてura-培地(上述)中に20倍に
希釈し,30℃で48〜72時間で増殖させた。無細胞状態の
培養培地を,拮抗インシュリン放射免疫検定での検定を
目的として,遠心により調製した。
切断したα−因子構築物は天然のα−因子リーダー配列
に比べて,免疫反応し得るプロインシュリン類似体分泌
の増加を媒介する。
因子リーダーにより媒介されるプロインシュリン類似体
構築物からのILMの分泌 1)最小限3つの独立した形質転換体を試験した。
125I−標識インシュリンおよびインシュリン標準品を用
いた競合放射免疫測定法により測定した。結果を培養液
1ml当りのILMの量,および1ml当りの分泌された量を650
nm波長での吸光度=1としたときの細胞密度に標準化し
た値として示す。
の発現レベルの増加を媒介する,先端を切断したα−因
子発現ベクターの構築を記述した。
るコード配列をコードするDNA配列を調製した。合成配
列を,製造者の指示に従って,Applied Biosystems 380A
DNA合成装置を用いて標準方法により調製した。14のDN
A配列を22から57塩基長の範囲で合成し,PAGEにより精製
しATPの存在下でT4キナーゼにより個々にリン酸化し
た。次に,その配列アニールさせ,標準方法により連結
した。
子断片をNco I/Sal I処理したpBS100にクローン化した
(後述)。生じたプラスミドをpBS100TafL IGF1と命名
した。
ーン化された酵母発現カセットを含む。この発現カセッ
トはハイブリットADH−2/GAPDHプロモータ及び必須でな
い遺伝子の断片に隣接しているGAPDHターミネータを含
む。
単離された1200bpのBamH I−Nco I断片であり,そしてG
APDHターミネータはプラスミドpPAG1から単離した900bp
のSal I−BamH I断片である。ヨーロッパ特許出願第16
4,556号。プラスミドpBS100もまた,目的とする遺伝子
断片により置き換えられた,Nco IおよびSal I部位間の
必須ではない断片を含む。発現カセットは,BamH Iで分
解することによりpBS100から除去され得,酵母シャトル
ベクターへクローン化し,酵母細胞へ導入され得る。
を含むプラスミドpJ103は次のように構築された。その
プロモータのADH−2部分はプラスミドpADR2[Beier
ら,(1982)Nature 300:724〜728]由来の野生型ADH2
遺伝子を含むプラスミドを制限酸素EcoR5で切断するこ
とによって構築された。この制限酵素は,ATG開始コドン
に対して+66の位置で切断を行い,そして,ADH2領域の
外側であってpADR2中の2つの他の部位での切断を行な
う。得られたベクター断片と2つの小断片との混合物
は,Bal31エキソヌクレーアーゼと反応させ,約300bpが
除去された。合成Xho IリンカーはBal31で処理されたDN
Aに連結された。その結果生じたDNAリンカーベクター断
片(約5kb)は,カラムクロマトグラフィーによってリ
ンカーから分離され,制限酵素Xho Iで切断され,再連
結され,そして大腸菌をアンピシリン耐性に形質転換す
るために用いられた。Xho Iリンカーの位置はDNAの配列
決定により決定された。ADH2遺伝子の5′非転写領域
(ATGから−232の位置)の範囲内にXho Iリンカーを含
む1つのプラスミドは,制限酵素Xho Iで切断され,ヌ
クレアーゼS1で処理され,次に制限酵素EcoR Iで処理さ
れ,Xho Iリンカーの部位およびEcoR I末端で1つの平滑
未端を持つ直線状のベクター分子が得られる。そのプロ
モータのGAPDH部分は,プラスミドpPGAP[ヨーロッパ特
許公開第164,556号]を酵素BamH IおよびEcoR Iで切断
した後,0.4kbpのDNA切断を単離することによって構築さ
れた。それから,この精製された断片は,酵素Alu Iで
完全に分解され,約200bpの断片が単離された。このGAP
DHプロモータ断片は,上記の直線ベクターに存在するAD
H−2断片に連結され,プラスミドpJS103が得られた。
た。この断片は,ADH−1/GAPDHプロモータ,先端を切断
したα−因子リーダー(アミノ酸1〜25,81〜83),リ
ジン−アルギニンプロセッシング部位,IGF1のコード配
列およびGAPDHターミネータ配列を含んでいる。このBam
H I断片は,次に,あらかじめBamH Iで分解されたpAB24
にクローン化された。陽性クローンが選択され,pYLUIGF
1−55と命名された(これは最初,プラスミド18.5と呼
ばれていた)(第6図参照)。
法によって調製された。制限酵素地図を第7図に示す。
このベクターは,3つのグリコシル化部位を持ち,分泌を
指示する完全長のα−因子リーダー(実施例I,A.項と比
較されたい);およびα−因子ターミネーターを持って
いることを除いてpYLUIGF1−55と類似している。
は,従来のスフェロプラスト化技術[Hinnenら(1978)
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75:1919〜1933]を用い,pYLUI
GF1−55およびpYLUIGF1−24で形質転換され,そして,
発現が比較された。
の発現は非構成的である。IFG1発現の誘導は,発育培地
中に低濃度のグルコースを持ちこむことによって達成さ
れる。標準条件下で,振とうフラスコ培養物(25ml)は
植菌後18〜24時間で培地中のグルコースを完全に利用す
る。このように,AB110(pYLUIGF1−55)およびAB110(p
YLUIGF1−24)の培養物(25ml)を,標準条件下で72時
間増殖した。植菌後49時間および72時間で上澄み試料が
採取され,IGF1生物学的活性(RRA)および抗IGF1抗体と
の免疫反応性(RIA)を分析した。表からわかるよう
に,先端を切断したα−因子リーダーを有するpYLUIGE1
−55は,その実質上の主画分が生物学的に活性であるタ
ンパクを分泌した。pYLUIGF1−24はIGF1抗体との反応性
を示すより多くのタンパクを分泌したが,このタンパク
のほとんどが生物学的に活性ではなかった。
A)により,IGF−1がその受容体に結合する能力が測定
される。IGF−1がその受容体を通じてその活性の全て
に生じさせると考えられているので,上記測定は,組み
換え体ポリペプチドの生物学的活性の測定に相当する。
このレセプタ測定法は,Marshallら(1974),J.Clin.End
orinol.Metab.19:283−292に記載されている。放射免疫
測定法(RIA)は,生物学的に活性であろうとなかろう
と,天然のIGF−1と抗原的に交互反応するタンパクの
量を測定する競合的測定法である。その測定法は,Zapf
ら,(1981),J.Clin.Invest.68:1321−1230に記載され
ている。
子リーダーによって媒介されるIGF1の分泌 生物物質の寄託 次の発現ベクターは,American Type Culture Collect
ion(ATCC),12301 Parklawn Drive,Rockville,Marylan
d,U.S.A.に寄託され,ブダベスト条約の規定により維持
されている。その寄託番号および寄託日は,次のとおり
である。
これらの寄託は,その寄託物が本発明を実行するために
要求される承認ではなく,また,同等の実施態様が,本
発明の開示にもとづく見地から当該分野の技術の範囲外
であるという承認でもない。これらの寄託物が公に利用
できるということは,この特許または他の特許のもとに
おいて,その寄託物を作り,使用し,売ることのための
ライセンスを認可することではない。その寄託物のヌク
レオチド配列は参考のために本明細書に記載されてお
り,ここに記述されたどの配列とも一致しない場合に
は,一致するようにコントロールされる。
が,その改変および修飾は,添付の請求の範囲内で当業
者によって実施され得ることが明らかである。
該発現系は,α−因子シグナルペプチドと1つのグリコ
シル化部位とを含む先端を切断したリーダー配列を有す
る。該リーダー配列は,プロセッシング部位により,非
酵母タンパクのコード配列に連結されている。
で用いた合成プロインシュリン遺伝子のヌクレオチド配
列およびアミノ酸配列を示す図である。構築に用いられ
る種々の合成オリゴヌクレオチドは黒点で示した。配列
上の矢印は,B,C,およびAプロインシュリン鎖の始めと
終わりとを示す。枠で囲んだ部分は二塩基性のプロセッ
シング部位を示す。 第2図は修飾されたα−因子リーダーと,実施例IでpY
GAI3を構築するのに用いたプロインシュリン遺伝子の最
初の13個のアミノ酸とをコードする合成オリゴヌクレオ
チドのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す図で
ある。修飾されたα−因子リーダーは,Asn23,57,67に対
するコドンを,Gln(枠で囲んだもの)をコードするよう
に変更することにより除去されたグリコシル化部位を有
する。矢印は,KEX2エンドペプチターゼ部位をコードす
る配列と,ヒトプロインシュリンのN末端との間の接合
部分を示す。 第3図はプロインシュリン類似体をコードする断片pYGA
IC3の合成遺伝子を示す図である。ここで,KEX2エンドペ
チターゼ部位はCペプチド(枠で囲んだ部分)で置換さ
れている。実施例IIで述べる合成133bp断片はヌクレオ
チド配列を通じて縦線および横線で定義している。 第4図は酵母シャトルベクターpAB24の制限酵素地図で
ある。 第5図は実施例IIIで述べるIGF1をコードする合成遺伝
子のDNA配列を示す図である。 第6図は先端を切断したα−因子リーダーの制御下にあ
るIGF1をコードする発現ベクターであって,実施例III
で述べる発現ベクターpYLUIGF1−55の制限酵素地図であ
る。 第7図は3個のグリコシル化部位を有する全長α−因子
リーダーの制御下にあるIGF1をコードする発現ベクター
であって,実施例IIIで述べる発現ベクターpYLUIGF1−2
4の制限酵素地図である。
Claims (28)
- 【請求項1】非酵母タンパクの発現および分泌を与える
DNA構築物を含む酵母細胞であって、該DNA構築物が、 酵母認識転写開始配列の制御下のコード配列の5′側に
連結される酵母認識転写開始配列;および 該コード配列の3′側に連結される酵母認識終結配列を
含み、 ここで、該コード配列がプロセッシング部位により連結
されたリーダー配列および該非酵母タンパクから構成さ
れる前駆体ポリペプチドをコードしており、該プロセッ
シング部位が該前駆体ポリペプチドからの該非酵母タン
パクの切断を与え、 ここで、該リーダー配列が、酵母α−因子リーダーポリ
ペプチドにおける約25〜約50個のN末端残基であり、ア
ミノ酸配列Asn−Y−Y′(ここでYは任意のアミノ酸
であり、そしてY′はThrまたはSerである)を含む唯一
のグリコシル化部位を含み、そしてα−因子前駆体の最
初の約19〜約23個のN末端残基を含む該酵母α−因子前
駆体のシグナルペプチドを含む、細胞。 - 【請求項2】前記非酵母タンパクが哺乳動物タンパクで
ある、特許請求の範囲第1項に記載の細胞。 - 【請求項3】前記哺乳動物タンパクがヒト・インシュリ
ンの前躯体である、特許請求の範囲第2項に記載の細
胞。 - 【請求項4】ヒト・インシュリンの前記前駆体がヒト・
プロインシュリンである、特許請求の範囲第3項に記載
の細胞。 - 【請求項5】ヒト・インシュリンの前記前駆体が、イン
ビボで切断される酵母認識プロセッシング部位によって
結合されたインシュリンa鎖およびインシュリンb鎖を
有する、特許請求の範囲第3項に記載の細胞。 - 【請求項6】前記プロセッシング部位がサッカロマイセ
ス(Saccharomyces)のKEX2遺伝子産物によって切断さ
れる、特許請求の範囲第5項に記載の細胞。 - 【請求項7】前記哺乳動物タンパクがインシュリン様成
長因子Iである、特許請求の範囲第2項に記載の細胞。 - 【請求項8】前記酵母細胞がサッカロマイセス(Saccha
romyces)属に由来する、特許請求の範囲第1項に記載
の細胞。 - 【請求項9】前記酵母細胞がサッカロマイセス・セレビ
シエ(S.cerevisiae)である、特許請求の範囲第8項に
記載の細胞。 - 【請求項10】前記酵母α−因子前躯体がサッカロマイ
セス・セレビシエ(S.cerevisiae)MFalである、特許請
求の範囲第8項に記載の細胞。 - 【請求項11】酵母宿主により分泌され得る前駆体ポリ
ペプチドをコードしている領域を含む二本鎖DNA分子で
あって、 該領域がその二本鎖のうちの一方に関して次の構造を有
する、二本鎖DNA分子: 5′−AF−CHO−Xn−S−遺伝子*−3′ ここで、AFは酵母α−因子シグナルをコードし;CHOはグ
リコシル化部位をコードし;Xnはn個のアミノ酸からな
るポリペプチドをコードしており、グリコシル化部位、
またはインビボで酵母による該前駆体ポリペプチドの切
断を与えるプロセッシング部位を含まず;nは0〜約30ま
での整数であり:遺伝子*は非酵母タンパクをコードし
ており;そしてSは該前躯体ポリペプチドの切断を与え
るプロセッシング部位をコードしている、DNA分子。 - 【請求項12】前記AFが約19〜23個のアミノ酸からなる
ポリペプチドをコードしている、特許請求の範囲第11項
に記載のDNA分子。 - 【請求項13】前記nが約0〜約20の整数である、特許
請求の範囲第11項に記載のDNA分子。 - 【請求項14】前記nが約0〜約10の整数である、特許
請求の範囲第11項に記載のDNA分子。 - 【請求項15】前記nが約3〜約10の整数である、特許
請求の範囲第11項に記載のDNA分子。 - 【請求項16】前記酵母宿主がサッカロマイセス(Sach
aromyces)である、特許請求の範囲第11項に記載のDNA
分子。 - 【請求項17】前記酵母α−因子シグナルペプチドがサ
ッカロマイセス・シグナルペプチドである、特許請求の
範囲第11項に記載のDNA分子。 - 【請求項18】前記Sが前記酵母宿主によりインビボで
認識されるプロセッシング部位をコードしている、特許
請求の範囲第11項に記載のDNA分子。 - 【請求項19】前記SがKEX2エンドペプチダーゼにより
認識されるジペプチドをコードしている、特許請求の範
囲第18項に記載のDNA分子。 - 【請求項20】前記ジペプチドが5′−リジン−アルギ
ニン−3′または5′−アルギニン−アルギニン−3′
である、特許請求の範囲第19項に記載のDNA分子。 - 【請求項21】レプリコンを有する、特許請求の範囲第
11項に記載のDNA分子。 - 【請求項22】前記前躯体ポリペプチドをコードしてい
る前記領域が酵母認識転写開始配列および終結配列の制
御下にあり、そして前記レプリコンが酵母レプリコンで
ある、特許請求の範囲第21項に記載のDNA分子。 - 【請求項23】前記レプリコンがプラスミドである、特
許請求の範囲第22項に記載のDNA分子。 - 【請求項24】前記レプリコンが染色体である、特許請
求の範囲第22項に記載のDNA分子。 - 【請求項25】酵母α−因子前駆体の約25〜約50の連続
するN末端アミノ酸をコードし、そしてアミノ酸配列As
n−Y−Y′(ここでYは任意のアミノ酸であり、そし
てY′はThrまたはSerである)を含む唯一のグリコシル
化部位を含むヌクレオチド配列を包含するDNA分子であ
って、ここで該DNA分子は酵母成熟α−因子フェンロモ
ン配列の縦列反復配列を含まない、DNA分子。 - 【請求項26】前記ヌクレオチド配列が酵母α−因子前
駆体の約25〜約40の連続するN末端アミノ酸をコードす
る、特許請求の範囲第25項に記載のDNA分子。 - 【請求項27】前記ヌクレオチド配列が酵母α−因子前
駆体の約35の連続するN末端アミノ酸をコードする、特
許請求の範囲第25項に記載のDNA分子。 - 【請求項28】前記ヌクレオチド配列が酵母α−因子前
駆体のアミノ酸1〜25および81〜83をコードする、特許
請求の範囲第25項に記載のDNA分子。
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